Streszczenie

Rodzina białek MCM (minichromosome maintenance proteins) została po raz pierwszy ziden­tyfikowana w komórkach drożdży, Saccharomyces cerevisiae. MCM to konserwatywne białka, które występują u wszystkich organizmów eukariotycznych. Grupa obejmuje białka MCM 2-9, które charakteryzują się obecnością domeny ATP-az (MCM box), a także dwa dodatkowe biał­ka: MCM 1 i MCM 10, które uczestniczą w replikacji DNA, lecz nie mają tej domeny. MCM 2-9 natomiast mają charakterystyczną domenę MCM. Podstawową funkcją jaką białka MCM pełnią w komórce jest współudział w molekularnym mechanizmie tworzenia widełek replikacyjnych i regulacji syntezy DNA. MCM tworzą kompleks o kształcie pierścienia. Nabywa on aktywność w obecności dodatkowych czynników. MCM 2-7 są jednym ze składników kompleksu prerepli­kacyjnego. Dołączenie się kompleksu MCM 2-7 do miejsca inicjacji replikacji zapoczątkowu­je powstawanie widełek replikacyjnych. Białka MCM odgrywają także rolę w utrzymywaniu in­tegralności genomu, zapobiegając ponownej duplikacji fragmentów DNA w tym samym cyklu komórki. W komórkach proliferujących MCM jest znaczna ilość, nie wykrywa się ich w komór­kach w stanie spoczynku, różnicowania i starzenia się. Mogą więc służyć jako potencjalne mar­kery proliferacji komórek. Ostatnie badania wskazują na przydatność białek MCM do oceny na­silenia stopnia proliferacji komórek nowotworowych, ze względu na obserwację ich wzmożonej ekspresji w komórkach różnych typów guzów. Praca jest próbą przedstawienia stanu aktualnej wiedzy na temat udziału białek MCM w syntezie DNA, a także potencjalnych możliwości wy­korzystania ich jako markerów proliferacji komórek nowotworowych.

Słowa kluczowe:białka MCM • replikacja DNA • komórki nowotworowe

Summary

The MCM (minichromosome maintenance protein) protein family was identified for the first time in budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. The subgroup consists of MCM proteins 2-9, that possess the characteristic ATPase domain (MCM box). There are also MCM1 and MCM10, which are important in DNA replication, but they do not possess the specific MCM box. The main function of MCM proteins is cooperation with other factors in molecular mechanisms that form the replication fork and in regulation of DNA synthesis. MCM proteins form a ring-sha­ped complex, which is activated when other factors are bound. MCM 2-7 complex is one of the pre-replication factors. Association of MCM 2-7 complex is a crucial moment initiating the re­plication fork. MCM proteins play a role in maintaining genome integrity and prevent re-repli­cation once per cell cycle. Proliferating cells have high levels of MCM, whereas they are not de­tected in quiescent, differentiated or senescent cells. They are also potential useful markers of cell proliferation. Recent studies suggested that MCMs are good markers of proliferation acti­vity degree, because they are highly expressed in a variety of tumors. The aim of this work is to summarize current knowledge about the role of MCM proteins in DNA replication and potential diagnostic markers of proliferating cancer cells.

Key words:MCM proteins • DNA replication • cancer cell

Wykaz skrótów:

AAA+ – rodzina ATP-az (ATPases associated with various cellular activities); Cdc6 – białko 6 cyklu podziałowego komórki (cell division cycle 6); CDK – kinazy zależne od cyklin (cyclin denpendent kinases); Cdt1 – czynnik 1 licencjonujący replikację DNA (chromatin licensing and DNA replication factor 1); CMG – kompleks Cdc45-MCM-GINS; DDK – kompleks białka Dbf4 i Cdc7; GINS – kompleks białek Sld5-Psf1-Psf2-Psf3 (Go-Ichi-Nii-San); HPV – wirus brodawczaka ludzkiego (human papilloma virus); HR-HPV – wirus brodawczaka ludzkiego z grupy wysokiego ryzyka (high risk – human papilloma virus); MCM – białka licencjonujące replikację (minichromosome maintenance proteins); MCM 2-7 – kompleks MCM 2-MCM 3-MCM 4-MCM 5-MCM 6-MCM 7; NLS – sygnał warunkujący import do jądra (nuclear localization signal); NTP – trifosforany nukleotydów (nucleotide triphosphate); ORC – kompleks naznaczający miejsca inicjacji replikacji (origin recognition complex of proteins); PCNA – jądrowy antygen komórek proliferujących (proliferation cell nuclear antygen); pRB – białko retinoblastoma (retinoblastoma protein); Pre-IC – kompleks preinicjujący (preinitiation complex); Pre-RC – kompleks przedreplikacyjny (prereplication complex).

Wstęp

Ciągle poszerzana wiedza na temat molekularnych mecha­nizmów regulujących proliferację komórkową może być przydatna do wykrywania złośliwych zmian w różnych na­rządach ludzkich. Białka regulujące proliferację komórko­wą są użyteczne jako markery, uwidoczniające stopień ak­tywności wzrostu guza. Badania nad wykorzystaniem tych białek są prowadzone dlatego, że w komórkach nowotwo­rowych wiele mechanizmów regulujących proliferację zo­staje zaburzonych. Obserwowany jest wzrost ilości białek regulacyjnych oraz podwyższenie poziomu ekspresji ko­dujących je genów. Wzrost ekspresji genów odpowiedzial­nych za regulację proliferacji komórkowej w guzach no­wotworowych, jest związany z gorszym rokowaniem dla chorych. Najczęściej używanymi i klasycznymi markerami proliferacji komórkowej są białka Ki-67 i PCNA [26,73].

Przez ostatnie lata bardzo intensywnie badano i poznawano dokładny mechanizm regulacji syntezy DNA. Molekularne mechanizmy regulujące replikację DNA komórek ludzkich wymagają współdziałania wielu komponentów. Składnikami „niezbędnej maszynerii” są białka, mające za zadanie za­inicjować proces duplikacji DNA. Mogą one być poten­cjalnymi markerami proliferujących komórek. Ponadto mogą także uwidoczniać te komórki, które mają poten­cjał do replikacji, natomiast ich materiał genetyczny nie został jeszcze zduplikowany. Jednymi z takich czynników są białka z rodziny MCM (białka licencjonujące replika­cję, minichromosome maintenance proteins), których funk­cja i przydatność jako nowych markerów proliferacji ko­mórkowej była intensywnie badana przez ostatnie lata [6].

Rodzina białek MCM 2-9

Do rodziny MCM zalicza się obecnie osiem białek: MCM 2-9. Najpóźniej odkryto MCM 8 i MCM 9. Znane są także MCM 1 i MCM 10, które uczestniczą w replikacji DNA, lecz nie mają swoistej dla grupy MCM domeny NTP-az [38]. Rodzinę białek MCM zidentyfikowano po raz pierw­szy w komórkach drożdży (Saccharomyces cerevisiae). Badania wykazały, że MCM 2-9 to bardzo konserwatyw­ne białka, których ekspresja zachodzi u wszystkich orga­nizmów eukariotycznych. Wyższe eukarionty zawierają homologiczne do drożdży białka MCM, które wchodzą w skład kompleksu MCM 2-7 [14,29].

Grupę tych białek wyodrębniono na podstawie funkcji, jaką pełnią w komórce, budowy łańcucha białkowego i obec­ności charakterystycznej dla nich domeny MCM. Każde z białek MCM należy do szerszej rodziny AAA+, czy­li ATP-az, pełniących różne funkcje w komórce (NTP-azy/helikazy) [67]. Swoista domena MCM zawiera mo­tywy charakterystyczne dla ATP-az: Walker A i Walker B (w rodzinie ATP-az stanowią one domenę AAA). Te dwa obszary umożliwiają wiązanie i hydrolizę cząsteczek ATP. W grupie białek MCM motywy Walker A i Walter B różnią się od klasycznych pojedynczymi aminokwasa­mi. W domenie MCM występuje także motyw „palca ar­gininowego” [19,69].

Białka MCM biorą udział w wielu procesach komórko­wych. Uważa się, że są one niezbędne do rozpoczęcia syntezy DNA oraz zapobiegają zajściu ponownej repli­kacji podczas trwania tego samego cyklu komórki. Są to czynniki, które inicjują i limitują replikację DNA w ko­mórkach eukariotycznych [5]. Obecność MCM umożli­wia inicjację replikacji i wydłużanie nowo powstających cząsteczek DNA. Obecnie wiadomo, że biorą one udział w powstawaniu widełek replikacyjnych. Mechanizm dzia­łania białek MCM nie został dobrze poznany, mimo ich istotnej roli w komórce [42].

Poszczególne białka MCM mają dodatkowe funkcje. Uczestniczą w rearanżacji struktury chromatyny, utrzy­mywaniu stabilności genomu, odpowiedzi komórkowej związanej z punktami kontrolnymi cyklu komórkowego oraz pomagają w regulacji transkrypcji. Przypuszcza się, że wybrane białka MCM mogą brać także udział w pro­cesie kancerogenezy [29,43].

Białka MCM biorą udział w procesie syntezy DNA. Tworzą one kompleks zbudowany z sześciu podjednostek, w skład którego wchodzą MCM 2, 3, 4, 5, 6, 7 [29]. Heteroheksamer (MCM 2-7) o kształcie pierścienia jest nieaktywną helika­zą DNA, która w obecności dodatkowych czynników naby­wa zdolność przyłączania się do miejsca inicjacji replikacji i rozplatania podwójnej helisy DNA. Powstanie pojedyn­czych nici DNA z podwójnej helisy jest reakcją zależną od energii. Reakcja katalizowana jest przez enzymy – heli­kazy. Enzymy te są białkami motorycznymi, które czerpią energię z hydrolizy NTP (trifosforany nukleotydów), aby przemieścić jedną nić DNA w stosunku do komplementar­nej nici [69]. Wiadomo, że kompleks MCM 2-7 in vitro nie wykazuje aktywności helikazowej. Natomiast rdzeń (MCM 4, 6, 7) w warunkach in vitro ma słabą aktywność helika­zową, która jest hamowana przez podjednostki MCM 2, 3 i 5. W kompleksie prereplikacyjnym formuje się rdzeń – katalityczne centrum, które jest zbudowane z podjedno­stek: MCM 4, MCM 6 i MCM 7. Centrum katalityczne od­powiada za aktywność helikazową kompleksu. Pozostałe MCM 2, MCM 3 i MCM 5 prawdopodobnie są podjed­nostkami regulacyjnymi helikazy MCM 2-7 [29,42,69].

Rola białek MCM w procesie replikacji DNAkomórki

Replikacja chromosomalnego DNA w komórkach euka­riotycznych to proces kontrolowany przez liczne czynniki [14]. Synteza DNA zależy od kompleksów składających się z wielu białek, które są dołączane do miejsc inicjacji replikacji w dwóch etapach [2].

Pierwszym etapem inicjacji replikacji jest formowanie się pre-RC (kompleksu pre-replikacyjnego). Komponenty pre-RC są przyłączane do chromatyny. W skład tego komplek­su wchodzi m.in. heteroheksamer MCM 2-7. Nieaktywny heteroheksamer MCM 2-7 jest dołączany do pre-RC na końcu mitozy i początku fazy G1 [32]. Jest on wyłapywa­ny z macierzy jądrowej i przyłączany w miejscach inicjacji replikacji [19]. Czynniki, które wpływają na przyłączanie się go do chromatyny przedstawiono na ryc. 1. Obszary, w których zaczyna się synteza nowych cząsteczek DNA są oznaczone kompleksami białek ORC (origin recogni­tion complex of proteins). Przyłączają się one jako pierw­sze do miejsc inicjacji replikacji i stanowią „platformę”, na której umieszczane są kolejne komponenty [6]. Podczas przejścia komórki z fazy spoczynkowej G0 do fazy G1 (przygotowującej do replikacji DNA), do ORC dołączane są białka Cdc6 i Cdt1 [22,34,38]. Te dwa czynniki są od­powiedzialne za przyłączenie gotowego kompleksu MCM 2-7 [20]. Prawdopodobnie Cdc6 i Cdt1 powodują otwar­cie się pierścienia heksameru MCM 2-7 i zaciskanie się go dookoła nici DNA [6].

Ryc. 1. Czynniki regulujące przyłączanie się kompleksu MCM 2-7 do chromatyny; (A) Faza G1- kompleks ORC jest związany z chromatyną w miejscach inicjacji replikacji. (B) Przyłączenie białek CDT1 i CDC6.(C) związanie się kompleksu MCM 2-7 z chromatyną. Przyłączenie się czynników powoduje utworzenie kompleksu pre-RC i przejście komórki do fazy replikacji DNA. (D) Faza S, G2 i M – po wejściu w fazę S kompleks pre-RC ulega rozkładowi. Duże stężenie cykliny A-CDK 2 powoduje ufosforylowanie kompleksu MCM 2-7 i białka CDC6 i ich oddysocjonowanie od chromatyny. CDC6 jest transportowane z jądra do cytoplazmy. CDT1 jest degradowane przez proteolizę lub unieczynnione przez związanie gemininy – inhibitora replikacji DNA (wg [22] zmodyfikowano)

Drugim etapem przygotowania do replikacji DNA jest uak­tywnienie kompleksu MCM 2-7. Sposób, w jaki dochodzi do mobilizacji MCM 2-7 i przekształcenia go w aktyw­ną helikazę, nie został jeszcze w pełni wyjaśniony [38]. Obecnie uważa się, że kompleks MCM 2-7 jest przekształ­cany w część składową aktywnej helikazy poprzez mody­fikacje potranslacyjne, takie jak fosforylacja jego poszcze­gólnych podjednostek [1,22]. Do zmiany konformacji oraz aktywacji MCM 2-7 dochodzi pod wpływem połączonego działania kinazy DDK oraz kinazy CDK [20].

Ostatnie doniesienia wskazują na istnienie zespołu białek CMG, który ma aktywność helikazową. Odpowiada on za rozplatanie DNA i jest częścią widełek replikacyjnych [42,51]. CMG składa się z: MCM 2-7, Cdc45 i GINS (na­zwa pochodzi od liczebników japońskich, Go, Ichi, Nii, San) [3]. Modyfikacje powstające pod wpływem działania kinaz umożliwiają połączenie się poszczególnych składni­ków kompleksu CMG. Wiadomo, że kinaza DDK (Dbf4 – Cdc7) fosforyluje podjednostkę MCM 4 i MCM 2 uła­twiając przyłączenie się Cdc45 i kompleksu GINS [2,67]. Uważa się, że zdolność do rozplatania DNA przez MCM 2-7 przejawia się jedynie w obecności Cdc45 i kompleksu GINS. Są to niezbędne kofaktory MCM 2-7, które praw­dopodobnie odpowiadają za stabilizację jego połączenia z chromatyną oraz przesuwania się powstających widełek replikacyjnych [1,3,42]. Czynnik Cdc45 wpływa także na asocjację polimerazy DNA α do miejsca inicjacji replika­cji oraz zaznacza przejście kompleksu pre-RC w pre-IC, czyli zespół białek inicjujących [39].

Rola białek MCM w zachowaniu stabilności genomu

Istotą replikacji DNA jest precyzyjne powielenie geno­mu komórki. Genom komórki powinien być zduplikowa­ny jedynie raz w ciągu cyklu komórkowego. Ludzki ge­nom nie jest jedną ciągłą nicią DNA, lecz jest podzielony na 46 chromosomów (w diploidalnej komórce). Każdy z chromosomów zawiera tysiące miejsc inicjacji replika­cji. W komórce niezbędny jest system kontroli repliso­mów, aby mogła ona zachować integralność genomu [64]. Zaburzenia w procesie syntezy DNA prowadzą do niesta­bilności genomu oraz transformacji nowotworowej komó­rek. Wielokrotne zduplikowanie DNA może być przyczy­ną amplifikacji genów. Niebezpieczne dla komórki może być również pominięcie podczas replikacji pewnej części DNA, np. wybranego genu supresorowego. Taki błąd może doprowadzić również do zapoczątkowania procesu trans­formacji nowotworowej komórek [44,64].

Konserwatywne mechanizmy zapobiegają ponownej repli­kacji DNA w czasie trwania jednego cyklu komórkowego. W komórce występuje mechanizm pozytywnej kontroli – licencjonowania replikacji. Regulacja pozytywna odbywa się poprzez naznaczenie miejsca inicjacji replikacji przez komponenty kompleksu pre-RC, m.in. MCM 2-7. Duplikacja DNA zachodzi jedynie wtedy, gdy w komórce zasocjują się składniki pre-RC i powstaną widełki replikacyjne.

W komórce istnieją także mechanizmy represjonujące – re­gulacja negatywna. Zabezpieczają one przed duplikacją frag­mentów DNA, które zostały już wcześniej powielone. Są przynajmniej trzy takie mechanizmy, zapobiegające zjawi­sku ponownej replikacji w komórkach eukariotycznych [7]. Pierwszy to utrzymywanie dużego stężenia cykliny A-CDK2, która działa na białka MCM podczas fazy G1. CDK powo­dują inaktywację tych białek oraz ich przemieszczenie poza macierz jądrową [39,46]. Drugi mechanizm to destabiliza­cja połączenia białek regulatorowych i chromatyny [39].

Trzeci mechanizm represji jest charakterystyczny dla wyższych eukariontów. Jest to represja poprzez inhibitor replikacji DNA – gemininę (geminin) [31,75]. Blokuje ona aktywność czynnika Cdt1 i powoduje dysocjację MCM 2-7 od chromatyny (ryc. 1D) [39,41]. W komórkach drożdży dołączanie Cdc6 do ORC pobudza wiązanie MCM 2-7 z chromatyną. Wskazuje to, że aby MCM 2-7 utworzyły połączenie, niezbędne jest utworzenie ATP-azy poprzez związanie Cdc6 do ORC. Natomiast czynnik Cdt1 służy jako ogniwo łączące MCM 2-7 i ATP-azę ORC- Cdc6 [57]. Dysregulacja ekspresji Cdc6, Cdt1 i gemininy może pro­wadzić do amplifikacji genów. Cdc6 i Cdt1 są dlatego po­tencjalnie ważnymi onkogenami, które podobnie jak MCM 2-7 są pod kontrolą czynnika transkrypcyjnego E2F [6,22].

Kompleks MCM 2-7 stopniowo oddysocjowuje od chroma­tyny w miarę postępowania fazy S. Odłączenie się go wraz z czynnikiem Cdc6 zabezpiecza komórkę przed ponownym replikowaniem DNA w tym samym cyklu [26]. Natomiast czynnik Cdt1 jest unieczynniony przez gemininę [38,39].

Kontrola ekspresji genów MCM

W komórkach ssaków mechanizm transkrypcji genów MCM odgrywa ważną rolę w regulacji aktywności białek MCM [50]. Ekspresja genów MCM jest regulowana przez czyn­niki transkrypcyjne E2F (E2F1, E2F2, E2F3) [35]. Analiza sekwencji DNA genu MCM 5 wykazała istnienie moty­wu, który jest potencjalnym miejscem wiążącym czynnik transkrypcyjny z rodziny E2F. Czynnik ten reguluje trans­krypcje genów MCM w fazie G1 i podczas przejścia do fazy S [26]. Po pobudzeniu komórki do wyjścia z fazy G0, obserwuje się gwałtowny wzrost stężenia mRNA i białka MCM na granicy faz G1-S [68]. Ekspresja genów MCM jest regulowana nie tylko przez czynniki transkrypcyjne, ale także przez stymulację wzrostu komórki egzogennymi czynnikami wzrostu [50]. Według Leone i wsp. [35] geny MCM można podzielić na dwie grupy. Pierwsza to geny kodujące MCM 4, MCM 5, MCM 7, które są regulowane jedynie przez stymulacje wzrostu komórki. Natomiast eks­presja drugiej grupy genów, kodujących MCM 2 i MCM 6 (podobnie jak genów kodujących PCNA, Cdk2, Cdc6 i cyklinę E), jest kontrolowana przez czynniki cyklu ko­mórkowego oraz dodatkowo poprzez stymulacje wzro­stu komórki [35]. Istnieją dowody na to, że niektóre geny MCM są intensywniej przepisywane podczas fazy G1 i S w dzielących się komórkach. Mimo to w wielu badaniach wykazano, że poziom ekspresji białek MCM nie zmienia się podczas cyklu komórkowego [45]. Białka te występu­ją w komórce w dużej ilości. Podczas trwania fazy S tylko część z nich jest połączona z chromatyną [19].

Goodwin i wsp. [23] udowodnili, że onkoproteina E7 wi­rusa HPV łączy się z hiperfosforylowanym białkiem pRb i przez to destabilizuje kompleks pRb/E2F oraz powiąza­nych białek p107 i p130 [58]. Uwolnienie czynnika trans­krypcyjnego E2F, od którego zależna jest transkrypcja m.in. genów MCM, powoduje zwiększenie ekspresji tych białek [35,36].

Charakterystyka białek z rodziny MCM

Białka MCM 1 i MCM 10 nie są zaliczane do rodziny MCM, ponieważ nie mają wyżej opisanej domeny MCM. Są bardzo konserwatywne i występują u wyższych euka­riontów [38]. Białko MCM 1 należy do rodziny czynników transkrypcyjnych MADS. Regulują one ekspresję genów po­przez oddziaływania z kofaktorami, łączącymi się z różny­mi sekwencjami DNA. Białko MCM 1 wpływa na replika­cję, bezpośrednio łącząc się z miejscami inicjacji replikacji oraz pośrednio poprzez regulację ekspresji czynników kom­pleksu pre-RC, takich jak Cdc6 i MCM 2-7 [18]. Natomiast MCM 10 wydaje się bezpośrednio związane z przyłącza­niem polimerazy DNA a/prymazy do chromatyny i stabi­lizowaniem tego połączenia [54].

Białko MCM 2 jest jedną z podjednostek regulujących aktywność kompleksu MCM 2-7 [42]. Ekspresja białka MCM 2 jest intensywnie badana w różnych nowotworach. Większość badań potwierdza podwyższenie stężenia tego białka w komórkach guzów nowotworowych. Ponadto ba­dano również korelację MCM 2 i Ki-67. Stężenie białka MCM 2 w komórce koreluje z ekspresją cykliny A [10]. Podwyższone stężenie MCM 2 wykryto m.in. w raku kory nadnerczy [61], okrężnicy [21], żołądka [66].

Nie udowodniono związku MCM 2 z przeżywalnością chorych [10,53]. MCM 2 jest jednak uznawane za czyn­nik związany z niekorzystnym rokowaniem u chorych z in­wazyjnym rakiem piersi [53].

MCM 3 – tylko MCM 2 i MCM 3 mają domenę NLS, któ­ra wskazuje na ich jądrowe umiejscowienie [19]. Ponadto białko MCM 3 może ulegać potranslacyjnej modyfikacji, ponieważ ma motyw homologiczny do miejsca wiążące­go acetylotransferazę w acetylo-CoA [19,33]. Takei i wsp. [65] zaobserwowali istnienie acetylotransferazy MCM3AP, która działa na białko MCM 3. Wydaje się, że MCM 3 po modyfikacji hamuje przejście komórki do fazy S [33,65].

Wykryto także m.in. korelację między ekspresją białka MCM 3 i stopniem złośliwości gruczolakoraków sutka oraz włókniakomięsaków tkanek miękkich u psów [48].

MCM 4 to białko, jako jedyne z rodziny MCM, ma w łań­cuchu peptydowym na N-końcu domenę wiążącą CDK [19]. Jest fosforylowane przez kinazę DDK, co powoduje zmianę jego właściwości. Po ufosforylowaniu wiąże ono czynnik Cdc45, który uaktywnia właściwości helikazowe kompleksu MCM 2-7 [2].

MCM 5 i Cdc6 wydają się swoistymi markerami prolife­racji komórkowej. W komórkach w fazie spoczynku lub różnicowania kompleks MCM 5 – Cdc6 nie jest aktywny. Kompleks replikacyjny ulega rozkładowi w trakcie trwa­nia syntezy DNA, aby zapobiec ponownej amplifikacji [72]. W dysplastycznych komórkach szyjki macicy MCM 5 – Cdc6 jest stale aktywny. Nadekspresję MCM 5 – Cdc6 stwierdza się w komórkach transformowanych wirusem HR-HPV, które znajdują się w fazie S (replikacja DNA) [74]. Ekspresja białka MCM 5, badana metodami immunohisto­chemicznymi, jest podwyższona w komórkach dysplastycz­nych i nowotworowych. Potwierdziły to także badania eks­presji mRNA MCM 5 [44]. Prawdopodobnie w przyszłości dzięki badaniom immunohistochemicznym z wykorzysta­niem swoistych przeciwciał anty MCM 5 można będzie odzwierciedlić nasilenie stopnia dysplazji komórek [36].

MCM 7, ze względu na budowę biochemiczną i interak­cje z różnymi czynnikami, ma dodatkowe funkcje. MCM 7 jest powiązane z wybranymi białkami uczestniczący­mi w regulacji cyklu komórkowego i proliferacji komó­rek, takimi jak: pRb [58], Mat-1 [71], FLH [11] i wiru­sową onkoproteiną HPV-E6 [60]. Transkrypcja MCM 7 jest regulowana przez czynnik E2F oraz przez onkogeny C-myc i N-MYC [29]. Ludzkie białko MCM 7 jest umiej­scowione w jądrze w komórkach interfazowych. Podczas mitozy proteina jest równomiernie rozprowadzana po ca­łej komórce [68]. MCM 7 wydaje się swoistym markerem nowotworowym. Badania wykazały, że podwyższoną eks­presję MCM7 wykrywa się w rakach szyjki macicy [8,40], prostaty [52], trzustki [25], głowy i szyi [15], jelita grube­go [47]. Wykazano również wysoką korelacje między eks­presją białka MCM 7 i znanego markera proliferacji ko­mórkowej Ki-67 [47,52].

K. Strati i wsp. [60] wykazali, podczas badań prowadzo­nych na modelu mysim, że białko MCM 7 jest obecne w większej ilości w guzach myszy transformowanych on­koproteiną E6 i E7 wirusa HPV 16, niż w tych pobranych z nietransformowanych myszy. To doświadczenie wykaza­ło dodatkowo, że MCM 7 może być markerem odróżniają­cym nowotwory głowy i szyi o etiopatogenezie wirusowej od wywoływanych przez inne czynniki. Strati i wsp. [60] sugerują, że nadekspresja MCM 7 w zmienionych komór­kach, w których wykryto wirusa HPV, jest dobrym wskaź­nikiem aktywności onkoproteiny E7 [60]. Brake i wsp. [8] zaobserwowali, że MCM 7 jest markerem syntezy DNA indukowanej przez E7 w cyklu życiowym wirusa. E7 jest odpowiedzialna za przeprogramowywanie keratynocytów warstwy powierzchniowej nabłonka płaskiego oraz ich po­nowne wejście w cykl komórkowy. Wznawiana jest wte­dy synteza DNA, co umożliwia wegetatywną amplifikację genomu wirusa [8]. Przeprowadzono również badania im­munohistochemiczne z użyciem przeciwciał anty-MCM 7 i anty-p16 na materiale z nowotworów szyjki macicy. Oba markery wykazują podobne nasilenie ekspresji wyżej wy­mienionych białek. MCM 7 w tych badaniach jest uwidocz­nione jedynie w jądrach komórek w przeciwieństwie do białka p16, które zaobserwowano zarówno w jądrach ko­mórek jak i w cytoplazmie [8].

MCM 8 to białko, które odkryto w komórkach ludzkich hepatocytów. Wykazano, że gen MCM 8 jest powiązany z karcynogenezą nowotworów wątroby. Jest on miejscem docelowym, w które wbudowuje się wirus zapalenia wą­troby typu B. MCM 8 jest bardzo konserwatywny, ale nie występuje u drożdży. Tłumaczy to, dlaczego został odkry­ty później niż geny MCM 2-7 [24].

Mimo to, że białko MCM 8 odkryto zupełnie niezależ­nie od MCM 2-7, ma ono podobne właściwości jak białka z rodziny MCM. W jego strukturze biochemicznej obec­na jest domena MCM, a także motyw palca cynkowego. Jest umiejscowione w jądrach komórkowych, ale nie ma domeny NLS. Sugeruje to, że łączy się ono z innym biał­kiem jądrowym [24]. MCM 8 nie uczestniczy w tworze­niu kompleksu MCM 2-7. Przyłącza się do chromatyny po dołączeniu do niej kompleksu MCM 2-7 [38].

MCM 9 – Podczas przeszukiwania baz danych, w celu zbadania sekwencji genów MCM 2-8, zidentyfikowano nowy gen należący do tej grupy. Doniesiono o istnieniu genu MCM 9 i kodowanego przez niego białka. MCM 9 jest aktywny w różnych typach tkanek mysich i ludzkich. Rola, jaką pełni to białko w syntezie DNA nie została do­tychczas wyjaśniona [37,38].

MCM jako markery nowotworowe

W prawidłowym nabłonku wielowarstwowym płaskim eks­presja białek MCM jest widoczna w jądrach komórek war­stwy podstawnej oraz w komórkach warstwy parabazalnej [36]. Większość keratynocytów warstwy powierzchnio­wej nabłonka przeszła proces różnicowania. Te keratyno­cyty nie powinny wykazywać obecności MCM w jądrze. Wzór ekspresji białek MCM w nabłonku płaskim zmienia się pod wpływem procesu nowotworowego. W takim przy­padku zauważalna jest ekspansja komórek proliferujących w warstwach nabłonka, w których w warunkach prawidło­wych nie występują [64]. Zarówno wzrost liczby komórek proliferujących oraz ich nietypowe rozmieszczenie w war­stwach nabłonka, a także spadek histologicznego stopnia zróżnicowania zmiany przednowotworowej, można sko­relować z pojawieniem się MCM-pozytywnych komórek [4,36,64]. Taki wzór ekspresji MCM wykryto w dyspla­zjach i nowotworach złośliwych nabłonków szyjki maci­cy [43,44], krtani [12,13,56], jamy ustnej [63], okrężnicy [21,55], przełyku [30], gruczołów ślinowych [70], dróg moczowych [59], sromu [16]. Na zdjęciach zamieszczo­nych na ryc. 2 widoczna jest ekspresja białka MCM 3 w ra­kach krtani o różnych stopniach złośliwości (reakcja im­munohistochemiczna).

Ryc. 2. Ekspresja białka MCM 3 w komórkach proliferujących; reakcja immunohistochemiczna (jądra komórek wybarwione na kolor brązowy); (A) Prawidłowy nabłonek wielowarstwowy płaski – komórki proliferujące wykazujące ekspresję MCM 3 znajdują się w warstwie bazalnej. (B) Rak płaskonabłonkowy krtani – ekspresja MCM 3 w licznych proliferujących komórkach nowotworowych. (C) Rak płaskonabłonkowy krtani – widoczne naciekanie podścieliska (tkanka łączna) z obecnością proliferujących komórek nowotworowych

Immunohistochemiczne badania ekspresji MCM 2, MCM 5 i MCM 7 wykazują, że obecność tych białek jest ograni­czona do regionów proliferujących naskórka, błony śluzo­wej jelita i tkanki limfatycznej [28]. Wzrost ekspresji za­uważa się w guzach litych i stanach przednowotworowych [74]. Występowanie białek MCM w komórkach nowotwo­rowych i dysplastycznych sugeruje ich kliniczną użytecz­ność w diagnozowaniu raków przedinwazyjnych i inwazyj­nych szyjki macicy, pęcherza moczowego i prostaty [52].

Wiele badań potwierdza także tezę, że dzięki białkom MCM możliwe jest rozróżnianie stadiów kancerogenezy z więk­szą dokładnością (np. w raku prostaty czy szyjki macicy) w porównaniu do antygenu Ki-67 [8,52].

Większość komórek ludzkiego ciała znajduje się poza cyklem podziałowym, w stadium spoczynku (faza G0). Komórki, które aktywnie się dzielą są umiejscowione w szczególnych miejscach w tkankach o dużym potencja­le proliferacyjnym: nabłonki np. szyjki macicy, skóry, bło­ny śluzowej przewodu pokarmowego oraz komórki szpiku kostnego. Egzogenne czynniki wzrostu stymulują komórki do przejścia z fazy spoczynku (G0) do pierwszej fazy cyklu (G1). Podczas późnej fazy G1 komórki są przygotowywane do replikacji DNA, która zachodzi w fazie S, poprzedza­jącej fazę G2 i podział (M). Progresja cyklu komórki i jej podziału jest możliwa dzięki zmieniającemu się stosun­kowi ekspresji cyklin i kinaz zależnych od cyklin (CDK). Fazę G1 regulują kompleksy cyklina D-CDK4, cyklina D-CDK6 i cyklina E-CDK2. Progresja fazy G2 oraz wej­ście komórki na drogę podziału mitotycznego jest inicjo­wane przez parę cyklina A-CDK2 i cyklina B-CDK1 [22].

MCM łączą się z chromatyną w początkowej fazie replika­cji. W czasie trwania procesu syntezy DNA białka MCM zostają odłączone od chromatyny. Są jednak ciągle obecne w jądrze komórek proliferujących [33]. MCM stają się nie­aktywne, gdy komórka opuszcza cykl podziału i przecho­dzi w fazę spoczynku, różnicowania lub starzeje się [22]. Utrata aktywności następuje w ciągu kilku dni od przej­ścia w fazę spoczynku lub różnicowania. Kompleks pre-RC, w którym uczestniczą białka MCM 2-7, jest rozkłada­ny szybciej, gdy komórka zaczyna się różnicować, niż gdy przechodzi w stan spoczynku [36]. Białka MCM w tej fa­zie nie są wykrywane przez przeciwciała skierowane prze­ciwko ich antygenom. Natomiast w komórce będącej w cy­klu podziałowym antygeny białka MCM są bardzo stabilne i są aktywne podczas wszystkich faz G1, S, G2 i M [28,74]. Ta obserwacja zapoczątkowała prace badawcze nad wy­korzystaniem przeciwciał przeciwko białkom MCM, jako markerów proliferacji komórkowej w diagnostyce histo­patologicznej. Istotne jest zwłaszcza zweryfikowanie, czy z użyciem przeciwciał anty-MCM można odróżnić komórki nowotworów złośliwych oraz komórki stanów przednowo­tworowych w fazie spoczynku i różnicowania [22,33,36].

W wielu badaniach wykazano, że zmiana regulacji eks­presji kompleksu MCM 2-7 jest charakterystyczna dla wczesnych etapów karcynogenezy. Te ważne czynniki inicjujące replikację DNA mogą być użyte jako markery diagnostyczne różnych zmian przednowotworowych oraz nowotworowych. Ponadto przeciwciała przeciwko polipep­tydom MCM nie wykrywają komórek, które przechodzą proces naprawy DNA [36]. Tradycyjne markery prolife­racji komórkowej, takie jak Ki-67 czy PCNA, są dobrymi wykładnikami nasilenia proliferacji w różnych typach no­wotworów [17,48,50,62,73], jednak ocena stadiów cyklu komórkowego przez te markery jest ograniczona. PCNA jest koenzymem potrzebnym polimerazie DNAδ nie tyl­ko w procesie replikacji DNA, ale także podczas naprawy DNA [27]. Badania immunohistochemiczne z wykorzysta­niem markera PCNA wykazują, że wykrywa on nie tylko komórki dzielące się, lecz także populacje komórek będą­cych w stanie spoczynku. Natomiast antygen Ki-67 uczest­niczy w rybosomalnej biosyntezie, ale okazuje się, że nie jest głównym czynnikiem odpowiedzialnym za prolifera­cję komórek [9]. Odkrycie i użycie do diagnozy oraz oceny rokowniczej białek, które są głównymi czynnikami regulu­jącymi replikację DNA może być skutecznym sposobem na wykazanie odsetka proliferujących komórek nowotwo­rowych w guzie [36]. Postępem w diagnostyce niektórych nowotworów (rak szyjki macicy, rak sutka i in.) mogłoby być ulepszenie dotychczasowych testów bazujących na wy­mazach cytologicznych, tak aby wykrywały zmiany moż­liwie dokładnie, rozróżniając stadia rozwoju zmian, były mało inwazyjne i obiektywne. To znacznie ułatwiłoby mo­nitorowanie zagrożonej populacji oraz zmniejszyło koszt badań diagnostycznych oraz leczenia [56].

Mukherjee i wsp. [43] zbadali przydatność białek MCM 2 i MCM 5 w wykrywaniu nieprawidłowych komórek po­wierzchniowej warstwy nabłonka szyjki macicy. Wykonane wymazy cytologiczne wykorzystano do przeprowadze­nia badań immunocytochemicznych. Porównywano test Papanicolaou (Pap) z testem przeprowadzonym z wykorzy­staniem przeciwciał anty-MCM. Barwienie Pap jest trady­cyjną metodą używaną w diagnozowaniu zmienionych ko­mórek nabłonka szyjki macicy. Diagnoza wykonywana za pomocą testu Pap jest bardzo subiektywna. Jeśli pobranie materiału zostało przeprowadzone niewłaściwie, to może dawać błędne wyniki. Mukherjee i wsp. [43] wykazali, że immunocytochemia z wykorzystaniem przeciwciał anty-MCM jest czułą i bardzo swoistą metodą, umożliwiającą wykrywanie nowotworów szyjki macicy. Wartość progno­styczna testu MCM wyniosła 100% w przypadku stadiów CIN1 i 79% dla CIN3. Immunocytochemiczna ocena z uży­ciem przeciwciał anty-MCM nie daje fałszywie pozytyw­nych wyników. Nie jest konieczne wykonywanie dalszych badań i biopsji, jeżeli wynik testu MCM jest negatywny. Konieczna jest tylko ocena wyniku reakcji immunocyto­chemicznej oraz morfologii komórek z pozytywną reak­cją przez doświadczonego cytopatologa [43].

Stoeber i wsp. [59] przeprowadzili ilościowe badanie cyto­immunofluorymetryczne, którego celem było opracowanie metody wykrywania białka MCM 5 w komórkach wystę­pujących w osadzie moczu. Wykazano, że taka diagnosty­ka jest czuła, swoista i umożliwia wczesne, proste i niein­wazyjne wykrywanie pierwotnych i nawracających guzów nowotworowych pęcherza moczowego. Cytometria prze­pływowa oceniająca komórki MCM5 dodatnie okazała się czulszą metodą w porównaniu do badań cytologicznych dróg moczowych w diagnostyce zmian nowotworowych [36,59].

Podsumowanie

Białka z rodziny MCM są intensywnie badane ze wzglę­du na ich zastosowanie jako markery proliferacji komórek. Wykorzystanie tych białek może umożliwić sprecyzowanie diagnozy, prognozowanie i ocenę odpowiedzi na leczenie w wielu powszechnie występujących typach nowotworów. Białka MCM mogłyby być także użyteczne w projektowa­niu nowych terapii antynowotworowych, ukierunkowanych na regulację replikacji DNA.

PIŚMIENNICTWO

[1] Akman G., MacNeill S.A.: MCM-GINS and MCM-MCM interactions in vivo visualised by bimolecular fluorescence complementation in fission yeast. BMC Cell Biol., 2009; 10: 12
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[2] Aparicio T., Guillou E., Coloma J., Montoya G., Méndez J.: The human GINS complex associates with Cdc45 and MCM and is essential for DNA replication. Nucleic Acids Res., 2009; 37: 2087-2095
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Aparicio T., Ibarra A., Méndez J.: Cdc45-MCM-GINS, a new power player for DNA replication. Cell Div., 2006; 1: 18
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[4] Baldwin P., Laskey R., Coleman N.: Translational approaches to improving cervical screening. Nat. Rev. Cancer, 2003; 3: 217-226
[PubMed]  

[5] Będkowska G.E, Ławicki S., Szmitkowski M.: Molecular markers of carcinogenesis in the diagnostics of cervical cancer. Post. Hig. Med. Dośw., 2009; 63: 99-105
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[6] Blow J.J., Gillespie P.J.: Replication licensing and cancer – a fatal entanglement? Nat. Rev. Cancer, 2008; 8: 799-806
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[7] Blow J.J., Hodgson B.: Replication licensing – defining the proliferative state? Trends Cell Biol., 2002; 12: 72-78
[PubMed]  

[8] Brake T., Connor J.P., Petereit D.G., Lambert P.F.: Comparative analysis of cervical cancer in women and in a human papillomavirus-transgenic mouse model: identification of minichromosome maintenance protein 7 as an informative biomarker for human cervical cancer. Cancer Res., 2003; 63: 8173-8180
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[9] Brown D.C., Gatter K.C.: Monoclonal antibody Ki-67: its use in histopathology. Histopathology, 1990; 17: 489-503
[PubMed]  

[10] Bukholm I.R., Bukholm G., Holm R., Nesland J.M.: Association between histology grade, expression of HsMCM2, and cyclin A in human invasive breast carcinomas. J. Clin. Pathol., 2003; 56: 368-373
[PubMed]  

[11] Chan K.K., Tsui S.K., Ngai S.M., Lee S.M., Kotaka M., Waye M.M., Lee C.Y., Fung K.P.: Protein-protein interaction of FHL2, a LIM domain protein preferentially expressed in human heart, with hCDC47. J. Cell. Biochem., 2000; 76: 499-508
[PubMed]  

[12] Chatrath P., Scott I.S., Morris L.S., Davies R.J., Bird K., Vowler S.L., Coleman N.: Immunohistochemical estimation of cell cycle phase in laryngeal neoplasia. Br. J. Cancer, 2006; 95: 314-321
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[13] Chatrath P., Scott I.S., Morris L.S., Davies R.J., Rushbrook S.M., Bird K., Vowler S.L., Grant J.W., Saeed I.T., Howard D., Laskey R.A., Coleman N.: Aberrant expression of minichromosome maintenance protein-2 and Ki67 in laryngeal squamous epithelial lesions. Br. J. Cancer, 2003; 89: 1048-1054
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[14] Costa A., Onesti S.: The MCM complex: (just) a replicative helicase? Biochem. Soc. Trans., 2008; 36: 136-140
[Full Text PDF]  

[15] Cromer A., Carles A., Millon R., Ganguli G., Chalmel F., Lemaire F., Young J., Dembélé D., Thibault C., Muller D., Poch O., Abecassis J., Wasylyk B.: Identification of genes associated with tumorigenesis and metastatic potential of hypopharyngeal cancer by microarray analysis. Oncogene, 2004; 23: 2484-2498
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[16] Davidson E.J., Morris L.S., Scott I.S., Rushbrook S.M., Bird K., Laskey R.A., Wilson G.E., Kitchener H.C., Coleman N., Stern P.L.: Minichromosome maintenance (Mcm) proteins, cyclin B1 and D1, phosphohistone H3 and in situ DNA replication for functional analysis of vulval intraepithelial neoplasia. Br. J. Cancer, 2003; 88: 257-262
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[17] Dziegiel P., Salwa-Zurawska W., Zurawski J., Wojnar A., Zabel M.: Prognostic significance of augmented metallothionein (MT) expression correlated with Ki-67 antigen expresion in selected soft tissue sarcomas. Histol. Histopathol., 2005; 20: 83-89
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[18] Fitch M.J., Donato J.J., Tye B.K.: Mcm7, a subunit of the presumptive MCM helicase, modulates its own expression in conjunction with Mcm1. J. Biol. Chem., 2003; 278: 25408-25416
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[19] Forsburg S.L.: Eukaryotic MCM proteins: beyond replication initiation. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2004; 68: 109-131
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[20] Forsburg S.L.: The MCM helicase: linking checkpoints to the replication fork. Biochem. Soc. Trans., 2008; 36: 114-119
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[21] Giaginis C., Georgiadou M., Dimakopoulou K., Tsourouflis G., Gatzidou E., Kouraklis G., Theocharis S.: Clinical significance of MCM-2 and MCM-5 expression in colon cancer: association with clinicopathological parameters and tumor proliferative capacity. Dig. Dis. Sci., 2009; 54: 282-291
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[22] Gonzalez M.A., Tachibana K.E., Laskey R.A., Coleman N.: Control of DNA replication and its potential clinical exploitation. Nat. Rev. Cancer, 2005; 5: 135-141
[PubMed]  

[23] Goodwin E.C., DiMaio D.: Repression of human papillomavirus oncogenes in HeLa cervical carcinoma cells causes the orderly reactivation of dormant tumor suppressor pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000; 97: 12513-12518
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[24] Gozuacik D., Chami M., Lagorce D., Faivre J., Murakami Y., Poch O., Biermann E., Knippers R., Bréchot C., Paterlini-Bréchot P.: Identification and functional characterization of a new member of the human Mcm protein family: hMcm8. Nucleic Acids Res., 2003; 31: 570-579
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[25] Grützmann R., Pilarsky C., Ammerpohl O., Lüttges J., Böhme A., Sipos B., Foerder M., Alldinger I., Jahnke B., Schackert H.K., Kalthoff H., Kremer B., Klöppel G., Saeger H.D.: Gene expression profiling of microdissected pancreatic ductal carcinomas using high-density DNA microarrays. Neoplasia, 2004; 6: 611-622
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[26] Ha S.A., Shin S.M., Namkoong H., Lee H., Cho G.W., Hur S.Y., Kim T.E, Kim J.W.: Cancer-associated expression of minichromosome maintenance 3 gene in several human cancers and its involvement in tumorigenesis. Clin. Cancer Res., 2004; 10: 8386-8395
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[27] Hall P.A., Levison D.A., Woods A.L., Yu C.C., Kellock D.B., Watkins J.A., Barnes D.M., Gillett C.E., Camplejohn R., Dover R., Waseem N.H., Lane D.P.: Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunolocalization in paraffin sections: an index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms. J. Pathol., 1990; 162: 285-294
[PubMed]  

[28] Hiraiwa A., Fujita M., Nagasaka T., Adachi A., Ohashi M., Ishibashi M.: Immunolocalization of hCDC47 protein in normal and neoplastic human tissues and its relation to growth. Int. J. Cancer, 1997; 74: 180-184
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[29] Honeycutt K.A., Chen Z., Koster M.I., Miers M., Nuchtern J., Hicks J., Roop D.R., Shohet J.M.: Deregulated minichromosomal maintenance protein MCM7 contributes to oncogene driven tumorigenesis. Oncogene, 2006; 25: 4027-4032
[PubMed]  

[30] Kato H., Miyazaki T., Fukai Y., Nakajima M., Sohda M., Takita J., Masuda N., Fukuchi M., Manda R., Ojima H., Tsukada K., Asao T., Kuwano H.: A new proliferation marker, minichromosome maintenance protein 2, is associated with tumor aggressiveness in esophageal squamous cell carcinoma. J. Surg. Oncol., 2003; 84: 24-30
[PubMed]  

[31] Kulartz M., Knippers R.: The replicative regulator protein geminin on chromatin in the HeLa cell cycle. J. Biol. Chem., 2004: 279: 41686-41694
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[32] Labib K., Gambus A.: A key role for the GINS complex at DNA replication forks. Trends Cell Biol., 2007; 17: 271-278
[PubMed]  

[33] Laskey R.: The Croonian Lecture 2001 Hunting the antisocial cancer cell: MCM proteins and their exploitation. Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci., 2005; 360: 1119-1132
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[34] Lei M., Tye B.K.: Initiating DNA synthesis: from recruiting to activating the MCM complex. J. Cell Sci., 2001; 114: 1447-1454
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[35] Leone G., DeGregori J., Yan Z., Jakoi L., Ishida S., Sanders Williams R., Nevins J.R.: E2F3 activity is regulated during the cell cycle and is required for the induction of S phase. Genes Development, 1998; 12: 2120-2130
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[36] Liu H., Takeuchi S., Moroi Y., Lin N., Urabe K., Kokuba H., Imafuku S., Dainichi T., Uchi H., Furue M., Tu Y.: Expression of minichromosome maintenance 5 protein in proliferative and malignant skin diseases. Int. J. Dermatol., 2007; 46: 1171-1176
[PubMed]  

[37] Lutzmann M., Maiorano D., Méchali M.: Identification of full genes and proteins of MCM9, a novel, vertebrate-specific member of the MCM2-8 protein family. Gene, 2005; 362: 51-56
[PubMed]  

[38] Maiorano D., Lutzmann M., Méchali M.: MCM proteins and DNA replication. Curr. Opin. Cell Biol., 2006; 18: 130-136
[PubMed]  

[39] Maiorano D., Rul W., Méchali M.: Cell cycle regulation of the licensing activity of Cdt1 in Xenopus laevis. Exp. Cell Res., 2004; 295: 138-149
[PubMed]  

[40] Malinowski D.P.: Molecular diagnostic assays for cervical neoplasia: emerging markers for the detection of high-grade cervical disease. Biotechniques, 2005; 38(Suppl. 4): S17-S23
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[41] McGarry T.J., Kirschner M.W.: Geminin, an inhibitor of DNA replication, is degraded during mitosis. Cell, 1998; 93: 1043-1053
[PubMed]  

[42] Moyer S.E., Lewis P.W., Botchan M.R.: Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 10236-10241
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[43] Mukherjee G., Muralidhar B., Bafna U.D., Laskey R.A., Coleman N.: MCM immunocytochemistry as a first line cervical screening test in developing countries: a prospective cohort study in a regional cancer centre in India. Br. J. Cancer, 2007; 96: 1107-1111
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[44] Murphy N., Ring M., Heffron C.C., Martin C.M., McGuinness E., Sheils O., O’Leary J.J.: Quantitation of CDC6 and MCM5 mRNA in cervical intraepithelial neoplasia and invasive squamous cell carcinoma of the cervix. Mod. Pathol., 2005; 18: 844-849
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[45] Musahl C., Holthoff H.P., Lesch R., Knippers R.: Stability of the replicative Mcm3 protein in proliferating and differentiating human cells. Exp. Cell Res., 1998; 241: 260-264
[PubMed]  

[46] Nguyen V.Q., Co C., Li J.J.: Cyclin-dependent kinases prevent DNA re-replication through multiple mechanisms. Nature, 2001; 411: 1068-1073
[PubMed]  

[47] Nishihara K., Shomori K., Tamura T., Fujioka S., Ogawa T., Ito H.: Immunohistochemical expression of geminin in colorectal cancer: Implication of prognostic significance. Oncol. Rep., 2009; 21: 1189-1195
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[48] Nowak M., Madej J.A., Dziegiel P.: Correlation between MCM-3 protein expression and grade of malignancy in mammary adenocarcinomas and soft tissue fibrosarcomas in dogs. In Vivo, 2009; 23: 49-53
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[49] Nowak M., Madej J.A., Podhorska-Okołów M., Dzięgiel P.: Expression of extracellular matrix metalloproteinase (MMP-9), E-cadherin and proliferation- associated antigen Ki-67 and their reciprocal correlation in canine mammary adenocarcinomas. In Vivo, 2008; 22: 463-469
[PubMed]  

[50] Ohtani K., Iwanaga R., Nakamura M., Ikeda M., Yabuta N., Tsuruga H., Nojima H.: Cell growth-regulated expression of mammalian MCM5 and MCM6 genes mediated by the transcription factor E2F. Oncogene, 1999; 18: 2299-2309
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[51] Pacek M., Tutter A.V., Kubota Y., Takisawa H., Walter J.C.: Localization of MCM2-7, Cdc45, and GINS to the site of DNA unwinding during eukaryotic DNA replication. Mol. Cell, 2006; 21: 581-587
[PubMed]  

[52] Padmanabhan V., Callas P., Philips G., Trainer T.D., Beatty B.G.: DNA replication regulation protein Mcm7 as a marker of proliferation in prostate cancer. J. Clin. Pathol., 2004; 57: 1057-1062
[PubMed]  

[53] Pierzchała R.P., Paszwalczak G., Jeziorski A.: Nowe czynniki rokownicze w raku piersi – przegląd piśmiennictwa. Współczesna Onkologia, 2004; 8: 429-434

[54] Ricke R.M., Bielinsky A.K.: Mcm10 regulates the stability and chromatin association of DNA polymerase-α. Mol. Cell, 2004; 16: 173-185
[PubMed]  

[55] Scarpini C., White V., Muralidhar B., Patterson A., Hickey N., Singh N., Mullerat J., Winslet M., Davies R.J., Phillips M.L., Stacey P., Laskey R.A., Miller R., Nathan M., Coleman N.: Improved screening for anal neoplasia by immunocytochemical detection of minichromosome maintenance proteins. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 2008; 17: 2855-2864
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[56] Scott I.S., Odell E., Chatrath P., Morris L.S., Davies R.J., Vowler S.L., Laskey R.A., Coleman N.: A minimally invasive immunocytochemical approach to early detection of oral squamous cell carcinoma and dysplasia. Br. J. Cancer, 2006; 94: 1170-1175
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[57] Speck C., Chen Z., Li H., Stillman B.: ATPase-dependent cooperative binding of ORC and Cdc6 to origin DNA. Nat. Struct. Mol. Biol., 2005; 12: 965-971
[PubMed]  

[58] Sterner J.M., Dew-Knight S., Musahl C., Kornbluth S., Horowitz J.M.: Negative regulation of DNA replication by the retinoblastoma protein is mediated by its association with MCM7. Mol. Cell. Biol., 1998; 18: 2748-2757
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[59] Stoeber K., Swinn R., Prevost A.T., de Clive-Lowe P., Halsall I., Dilworth S.M., Marr J., Turner W.H., Bullock N., Doble A., Hales C.N., Williams G.H.: Diagnosis of genito-urinary tract cancer by detection of minichromosome maintenance 5 protein in urine sediments. J. Natl. Cancer Inst., 2002; 94: 1071-1079
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[60] Strati K., Pitot H.C., Lambert P.F.: Identification of biomarkers that distinguish human papillomavirus (HPV)-positive versus HPV-negative head and neck cancers in a mouse model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103; 14152-14157
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[61] Szajerka A., Dziegiel P., Szajerka T., Zabel M., Winowski J., Grzebieniak Z.: Immunohistochemical evaluation of metallothionein, Mcm-2 and Ki-67 antigen expression in tumors of the adrenal cortex. Anticancer Res., 2008; 28: 2959-2965
[PubMed]  

[62] Szczuraszek K., Mazur G., Jeleń M., Dziegiel P., Surowiak P., Zabel M.: Prognostic significance of Ki-67 antigen expression in non-Hodgkin’s lymphomas. Anticancer Res., 2008; 28: 1113-1118
[PubMed]  

[63] Szelachowska J., Dziegiel P., Jelen-Krzeszewska J., Jelen M., Matkowski R., Pomiecko A., Spytkowska B., Jagas M., Gisterek I., Kornafel J.: Mcm-2 protein expression predicts prognosis better than Ki-67 antigen in oral cavity squamocellular carcinoma. Anticancer Res., 2006; 26: 2473-2478
[PubMed]  

[64] Tachibana K.E., Gonzalez M.A., Coleman N.: Cell-cycle-dependent regulation of DNA replication and its relevance to cancer pathology. J. Pathol., 2005; 205: 123-129
[PubMed]  

[65] Takei Y., Swietlik M., Tanoue A., Tsujimoto G., Kouzarides T., Laskey R.: MCM3AP, a novel acetyltransferase that acetylates replication protein MCM3. EMBO Rep., 2001; 2: 119-123
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[66] Tokuyasu N., Shomori K., Nishihara K., Kawaguchi H., Fujioka S., Yamaga K., Ikeguchi M., Ito H.: Minichromosome maintenance 2 (MCM2) immunoreactivity in stage III human gastric carcinoma: clinicopathological significance. Gastric Cancer, 2008; 11: 37-46
[PubMed]  

[67] Tsuji T., Ficarro S.B., Jiang W.: Essential role of phosphorylation of MCM2 by Cdc7/Dbf4 in the initiation of DNA replication in mammalian cells. Mol. Biol. Cell, 2006; 17: 4459-4472
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[68] Tsuruga H., Yabuta N., Hashizume K., Ikeda M., Endo Y., Nojima H.: Expression, nuclear localization and interactions of human MCM/P1 proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997; 236: 118-125
[PubMed]  

[69] Tye B.K., Sawyer S.: The hexameric eukaryotic MCM helicase: building symmetry from nonidentical parts. J. Biol. Chem., 2000; 275: 34833-34836
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[70] Vargas P.A., Cheng Y., Barrett A.W., Craig G.T., Speight P.M.: Expression of Mcm-2, Ki-67 and geminin in benign and malignant salivary gland tumours. J. Oral Pathol. Med., 2008; 37: 309-318
[PubMed]  

[71] Wang Y., Xu F., Hall F.L.: The MAT1 cyclin-dependent kinase-activating kinase (CAK) assembly/targeting factor interacts physically with the MCM7 DNA licensing factor. FEBS Lett., 2000; 484: 17-21
[PubMed]  

[72] Wentzensen N., Vinokurova S., Von Knebel Doeberitz M.: Molecular markers of cervical squamous cell cancer precursor lesions. CME J. Gynecol. Oncol., 2006; 11: 30-40
[Full Text PDF]  

[73] Whitfield M.L., George L.K., Grant G.D., Perou C.M.: Common markers of proliferation. Nat. Rev. Cancer, 2006; 6: 99-106
[PubMed]  

[74] Williams G.H., Romanowski P., Morris L., Madine M., Mills A.D., Stoeber K., Marr J., Laskey R.A., Coleman N.: Improved cervical smear assessment using antibodies against proteins that regulate DNA replication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95: 14932-14937
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[75] Wohlschlegel J.A., Dwyer B.T., Dhar S.K., Cvetic C., Walter J.C., Dutta A.: Inhibition of eukaryotic DNA replication by geminin binding to Cdt1. Science, 2000; 290: 2309-2312
[PubMed]  

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Full text