Streszczenie

Substancje lizosomotropowe to związki biologicznie czynne, znajdujące zastosowanie jako sub­stancje bakteriobójcze, fungicydy oraz leki. Są to najczęściej słabe organiczne zasady, które gromadzą się w kompartmentach komórkowych o niskim pH, takich jak lizosomy lub wakuole. Mechanizm ich działania jest różnorodny, zależny od budowy chemicznej związku, oraz rodza­ju komórki, z którą oddziałuje.
Badania nad wpływem związków lizosomotropowych na mikroorganizm eukariotyczny – droż­dże Saccharomyces cerevisiae przyczyniły się w znacznym stopniu do wyjaśnienia mechanizmu działania tych związków. Wykazano, że związki te mogą wbudowywać się w błony komórkowe i hamować aktywność H⁺-ATPazy. Innym mechanizmem działania jest typowe zachowanie lizo­somotropowe, tzn. związki te gromadzą się w wakuolach drożdży, powodują ich rozpad, a uwol­nione enzymy wakuolarne indukują autolizę komórki. Wykazano również, że niektóre związki lizosomotropowe są substratami ABC transporterów u drożdży.

Słowa kluczowe: związki lizosomotropowe • Saccharomyces cerevisiae • surfaktanty

Summary

Lysosomotropic agents have antitumor, antifungal and antimicrobial properties. These small, amphiphilic compounds, as weak bases, readily penetrate the lipid bilayer and diffuse into aci­dic subcellular compartments such as lysosomes or vacuoles. The mechanism of action of lyso­somotropic compounds can be distinct, depending on their chemical structure and/or the kind of cells influenced. Our investigations of the influence of lysosomotropic agents on Saccharomyces cerevisiae have lead to a partial explanation of their mechanism of action. The amphiphilic cha­racter enables the compounds to penetrate the lipid bilayer and disturb its structure and functions and can inhibit the activity of plasma membrane H⁺ATPase. The accumulation of the compo­unds in yeast vacuoles, disrupting them and killing yeast cells, is another mechanism of action. Lysosomotropic agents can be substrates for ABC transporters in Saccharomyces cerevisiae cells.

Key words: lysosomotropic agents • Saccharomyces cerevisiae • surfactant

Wykaz skrótów:

ABC – ATP-Binding Cassette; DM-11 – chlorowodorek estru 2-(dimetyloamino)etylowego kwasu laurynowego; DMAL-12 – chlorowodorek N,N-dimetyloalaninianu n-dodecylowego; DMAL-12s – szczawian N,N-dimetyloalaninianu n-dodecylowego; DMG-12 – chlorowodorek N,N-dimetyloglicynianu n-dodecylowego; NBD-PE – N-(7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol-4-yl)-1,2-diheksadekanoyl-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina sól trietyloamoniowa; Pdr5, Snq2 i Yor1 – transportery występujące u drożdży Saccharomyces cerevisiae; PYG-12 – chlorowodorek a-pirolidynooctanu n-dodecylowego; rho+ – drożdże z prawidłowym procesem oddechowym; rhoo – mitochondrialne mutanty oddechowe pozbawione całkowicie mitochondrialnego DNA i niezdolne do oddychania na glicerolu lub etanolu; TMA-DPH – (1-(4-trimetyloaminofenylo)-6-fenylo-1,3,5-heksatrien) p-toluenosulfonian.

1. Związki lizosomotropowe

Substancje lizosomotropowe to pojęcie wprowadzone przez de Duve’a i wsp. [10], do określenia związków chemicznych, mogących wnikać do komórki i gromadzić się w kompartmentach komórkowych o niskim pH, takich jak lizosomy komórek zwierzęcych czy wakuole komórek roślinnych lub grzybowych.

Związki lizosomotropowe to najczęściej słabe organicz­ne zasady, zazwyczaj trzeciorzędowe aminy o wartościach stałej dysocjacji kwasowej pKa mieszczących się w prze­dziale 5-9. Przy tych wartościach pKa są one najszybciej transportowane do lizosomów lub wakuoli. Po osiągnięciu lizosomu, amina wychwytuje proton i przechodzi w formę związku amfifilowego i – jeżeli ma odpowiednią strukturę – wykazuje właściwości kationowego surfaktantu oddziału­jąc na błonę lizosomalną (lub wakuolarną) i białka błonowe. Jednocześnie następuje podniesienie wewnątrzlizosomalne­go pH nawet o 1,7 jednostki, co ma duży wpływ na procesy transportowe i funkcjonowanie lizosomu [13]. Substancje li­zosomotropowe mają bardzo różną strukturę, a wspólnym jej fragmentem jest atom azotu nadający cząsteczce słabo za­sadowy charakter [16]. Zalicza się do nich np. chlorek amo­nowy, N-dodecyloimidazol, fungicydy (dodyna) oraz wiele znanych leków nasercowych (verapamil) [1,16,19].

Związki lizosomotropowe mają zastosowanie jako leki lizosomotropowe, substancje odwracające skutki oporności wielolekowej i fungicydy. Od lat substancje lizosomotropowe są badane w terapiach przeciwnowotworowych pod kątem zdolności ułatwiania działania cytostatyków, ponieważ wewnątrzlizosomalne pH komórek nowotworowych jest prawie o 0,5 jednostki niższe niż w komórkach zdrowych [42]. Sprzyja to gromadzeniu się substancji lizosomotropowych głównie w komórkach nowotworowych [4].

Dzięki zdolności do przekraczania bariery krew-mózg związki lizosomotropowe są stosowane w terapii choro­by Creutzfeldta-Jakoba i innych chorobach prionowych. Wykazano, że substancje o charakterze lizosomotropo­wym, takie jak kwinakryna, chlorokwina czy suramina, hamują proces akumulacji patologicznych protein w ko­mórkach nerwowych przez ich konwersję do postaci nie­patologicznych. Inny możliwy mechanizm działania tych związków to destabilizacja nieprawidłowo sfałdowanego białka na skutek podwyższenia lizosomalnego pH [11].

Inną funkcją tego rodzaju substancji może być przeciw­działanie oporności wielolekowej, która polega m.in. na wydalaniu antybiotyków lub cytostatyków z komórki przez transportery ABC [14,20]. Przeciwdziałanie tej oporności jest uważane za najważniejszy problem w walce z nowotwo­rami. Związki lizosomotropowe (np. N-dodecyloimidazol) zmieniając przepuszczalność błony lizosomalnej prowadzą do uwalniania do cytoplazmy enzymów lizosomowych (np. katepsyn – na ich działanie szczególnie wrażliwe są mło­de komórki), co w konsekwencji prowadzi do śmierci tych komórek [4,13,14].

2. Znane związki lizosomotropowe, jako substancje przeciwdrobnoustrojowe

Jednym z lepiej znanych i opisanych w literaturze nauko­wej związków lizosomotropowych, który wykazuje ak­tywność bakteriobójczą i grzybobójczą jest chlorokwina (CQ). Jest to 9-aminoquinolina znana od 1934 roku jako lek przeciwmalaryczny [41]. Mechanizm działania chlo­rokwiny jest uzależniony od rodzaju patogenu, na który ten związek oddziałuje, chociaż nie wszystkie mikroorga­nizmy są wrażliwe na chlorokwinę. Związek ten przenika do wnętrza komórek, gdzie następuje jego uprotonowanie zgodnie z regułą Hendersona-Hasselbalcha [39]. Znane są dwa mechanizmy działania chlorokwiny: alkalizacja kwa­śnych kompartmentów w komórkach zakażonych bakteria­mi lub grzybami albo potranslacyjne zmiany syntetyzowa­nych białek w komórkach zakażonych wirusami. Po raz pierwszy chlorokwiny użyto jako środka przeciwko prze­wlekłej gorączce Q. Alkalizacja wakuoli zawierających bakterie Coxiella burnetti (odpowiedzialnych za gorącz­kę Q) przywracała aktywność antybiotyków w komórkach [27]. Wiele innych bakterii czy grzybów ma zdolność roz­woju w kwaśnych wakuolach i wstępne badania wskazu­ją na potencjalną przydatność chlorokwiny w zwalczaniu wywołanych przez nie chorób. Na przykład chlorokwina hamuje wewnątrzkomórkowe namnażanie się Legionella pneumophila, bakterii wywołującej chorobę legionistów. W tym przypadku chlorokwina blokuje degradację ferry­tyny przez kwaśne proteazy, zakłócając metabolizm żela­za, niezbędny do namnażania Legionella pneumophila [5]. Chlorokwina hamuje również wewnątrzkomórkowy roz­wój Mycobacetrium tuberculosis, nie tylko przez podnie­sienie wewnątrzkomórkowego pH, ale również – podobnie jak w przypadku Legionella – zakłócając metabolizm że­laza tych drobnoustrojów [5]. Ponadto wykazano działanie chlorokwiny przeciw takim bakteriom jak np.: Salmonella typhi, Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus czy Listeria monocytogenes [2,18,29,37] i grzy­bom Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus [21,26].

Pochodne imidazolu, triazolu i dodyna znalazły zastosowanie jako fungicydy. Ich działanie polega na zahamowaniu biosyntezy steroli [17]. Inne substancje lizosomotropowe, takie jak chlorek amonu, prokaina, feniramina wykazują również aktywne działanie wobec wirusów [7]. Związki lizosomotropowe stają się alternatywą dla silnych utleniaczy stosowanych w procesie oczyszczania wód. Zastosowanie chloramin o właściwościach surfaktantów zamiast chloru daje silny efekt bakteriobójczy i grzybobójczy, przy znacznym obniżeniu szkodliwości dla środowiska [6].

3. Mechanizm działania związków lizosomotropowych na przykładzie drożdży Saccharomyces cerevisiae

Mechanizm toksycznego działania substancji lizosomo­tropowych nie został w pełni wyjaśniony. Wiadomo, że związki te wbudowując się w błonę lizosomu, zmieniają jej przepuszczalność, a w dużych stężeniach powodują jej zniszczenie. Prowadzi to do wypływu lizosomalnych, hy­drolitycznych enzymów i autolizy komórki [28].

W komórkach grzybów istnieją analogiczne do lizosomów struktury – wakuole, co pozwala przypuszczać, że grzyby powinny być zabijanie przez surfaktanty lizosomotropowe w podobny sposób jak komórki ssaków. Hussain i wsp. [19] badali wpływ N-dodecyloimidazolu na komórki drożdży Saccharomyces cerevisie. Wykazali oni, że efektywność jego działania na drożdże zależy od: pH podłoża (w pH 8,0 N-dodecyloimidazol bardziej uwrażliwia komórki drożdży niż w pH 5,0); fazy wzrostu – większą wrażliwość wykazują komórki we wczesnej fazie logarytmicznej niż w fazie stacjonarnej i od stężenia związku. Pod wpływem wysokich stężeń tego związku obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym zniszczenie wakuoli w komórkach drożdży

Badania nad wpływem na komórki drożdży Saccharomyces cerevisiae nowych pod względem struktury związków lizosomotropowych, wyjaśniły w dużej mierze mechanizm działania tych substancji. Trzeciorzędowe aminoalkohole zestryfikowane kwasem tłuszczowym są to przeważnie chlorowodorki i związki te występują w takiej formie krystalicznej . Są stabilne w trakcie przechowywania, dobrze rozpuszczalne w wodzie i przez to wygodne w badaniach (ryc. 1).

Ryc. 1. Struktury chemiczne związków lizosomotropowych: a – chlorowodorek estru 2-(dimetyloamino)etylowego kwasu laurynowego (DM-11); b – chlorowodorek N,N-dimetyloglicynianu n-dodecylowego (DMG-n); c – chlorowodorek N,N-dimetyloalaninianu n-dodecylowego (DMAL-12); d – szczawian N,N-dimetyloalaninianu n-dodecylowego (DMAL-12s); e – chlorowodorek α-pirolidynooctanu n-dodecylowego (PYG-12), gdzie n=10, 12, 14, 16 jest liczbą atomów węgla w łańcuchu alkilowym

Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że minimalne hamujące stężenie (MIC) było najniższe dla związku DM-11 o 11-węglowym łańcuchu alkilowym. Znacznie większą aktywność uzyskano w pH=8,0 w porównaniu do jego ak­tywności w pH=6,0 (tabela 1). Taka właściwość jest cha­rakterystyczna dla związków lizosomotropowych [19].

Tabela 1. Minimalne hamujące stężenie (MIC) aminoestru DM-11 dla szczepu Saccharomyces cerevisiae prawidłowo oddychającego (rho⁺) i mitochondrialnego mutanta oddechowego rho^o [31]

Związki lizosomotropowe wykazują działanie grzybostatyczne, co przejawia się hamowaniem wzrostu grzybów, a po dłuższym czasie inkubacji – jego wznowieniem przy ich wyższych stężeniach. Wzrost ten może być spowodowany rozcinaniem wiązania estrowego w cząsteczce związku lizosomotropowego przez esterazy syntetyzowane i wydzielane przez drożdże [25,36].

Ponadto wykazano, że aminoester DM-11 hamuje aktywność H⁺-ATPazy błony komórkowej in vivo (ryc. 2) i in vitro, jak również transport aminokwasów ([¹⁴C] leucyny) do komórki drożdży [31,35,43].

Ryc. 2. Aktywność H⁺-ATPazy błony komórkowej drożdży Saccharomyces cerevisiae (in vivo) w obecności DM-11 (70 µM). Strzałki wskazują kolejne dodawanie substratów (w stężeniach końcowych): Y – komórki drożdży (2 mg suchej masy), G – glukoza (200 mM), DM-11 (70 µM), KCl (100 mM). Gruba linia – pH, cienka linia – stężenie [H⁺] [31]

Związki lizosomotropowe, takie jak np. wolne trzeciorzędowe aminoestry znajdują się w stanie równowagi dynamicznej ze swoimi uprotonowanymi formami w pK_a. Równowaga ta jest zależna od pH roztworu. W środowisku kwaśnym (tj. przy niższym pH) preferowana jest forma uprotonowana. W środowisku alkalicznym aminoestry występują w formie nieuprotonowanej i mogą swobodnie przenikać przez błonę komórkową, umiejscowiając się w kwaśnych kompartmentach komórki drożdży (np. wakuolach) [16,19].

Związki lizosomotropowe, takie jak np. wolne trzeciorzędowe aminoestry znajdują się w stanie równowagi dynamicznej ze swoimi uprotonowanymi formami w pKa. Równowaga ta jest zależna od pH roztworu. W środowisku kwaśnym (tj. przy niższym pH) preferowana jest forma uprotonowana. W środowisku alkalicznym aminoestry występują w formie nieuprotonowanej i mogą swobodnie przenikać przez błonę komórkową, umiejscowiając się w kwaśnych kompartmentach komórki drożdży (np. wakuolach) [16,19].

Badania nad aminoestrami (ryc. 1) – pochodnymi glicyny i alaniny (chlorowodorek N,N-dimetyloglicynianu n-dodecylowego (DMG-12) i chlorowodorek N,N-dimetyloalaninianu n-dodecylowego (DMAL-12)) wykazały, że związki te w kwaśnym pH (uprotonowane) działają na H⁺-ATPazę błony komórkowej drożdży. Najaktywniejsze są związki z 12-węglowym łańcuchem alkilowym (tabela 2) [32]. Natomiast te same aminoestry nie wykazują hamują­cego działania wobec ATPazy mitochondrialnej lub jej ak­tywność jest hamowana dopiero w wysokich stężeniach tych związków. Można to wyjaśnić tym, że w wyższym pH (pH 9,0), w którym aktywność ATPazy mitochondrialnej droż­dży była testowana, aminoestry są w przeważającej części w nieuprotonowanej formie nieaktywnej. Można zatem su­gerować, że wolne aminoestry nie działają na ATPazę mito­chondrialną, a nieznaczny poziom inhibicji może być zależny od uprotonowanych form obecnych jako mniejszy ilościo­wo składnik w zrównoważonej mieszaninie (tabela 2) [32].

Tabela 2. Wpływ aminoestrów DMG-n i DMAL-n na aktywność H⁺-ATPazy błony komórkowej i ATPazy mitochondrialnej drożdży Saccharomyces cerevisiae (in vitro), gdzie n=10, 12, 14, 16 atomów węgla w łańcuchu alifatycznym [32]

Hamujące działanie aminoestrów na H⁺-ATPazę błony ko­mórkowej drożdży [32,33,34] zostało również potwierdzone w teście in vivo wg Kotyka [22]. Po dodaniu do zawiesiny komórek drożdży glukozy (która indukuje transport pro­tonów przez H⁺-ATPazę błony komórkowej drożdży), ob­serwowany był spadek pH środowiska zewnętrznego. Jest on miarą aktywności tego enzymu [22]. Dodanie amino­estru (40 µM DMG-12) powodowało zahamowanie wyrzu­cania protonów przez H⁺-ATPazę błony komórkowej droż­dży (ryc. 3a), a przy wyższym stężeniu (80 µM DMG-12) również niewielki wzrost pH środowiska (ryc. 3b).

Ryc. 3. Aktywność H⁺-ATPazy błony komórkowej drożdży Saccharomyces cerevisiae (in vivo) w obecności: A – DMG-12 (40 µM); B – DMG-12 (80 µM). Strzałki wskazują kolejne dodawanie substratów (w stężeniach końcowych): Y – komórki drożdży (2 mg suchej masy), G – glukoza, (200 mM), DMG-12 (40 lub 80 µM), KCl (100 mM). Gruba linia – pH, cienka linia – stężenie [H⁺] [34]

Wykazano również, że aminoestry są inhibitorami transpor­tu [¹⁴C] leucyny do komórki drożdży. Związek DMAL-12s w stężeniu dwa razy wyższym niż MIC (160 µM) hamował transport tego aminokwasu w około 60%. Natomiast w obecności 320 µM badanego związku hamowanie trans­portu [¹⁴C] leucyny wynosiło 97% (ryc. 4) [33].

Ryc. 4. Transport [¹⁴C] leucyny w komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae w obecności aminoestru DMAL-12s (szczawianu N,N-dimetyloalaninianu n-dodecylowego) [33]

Podczas badań wpływu aminoestrów na pH w cytoso­lu i wakuoli u drożdży, stwierdzono, że w zależności od struktury, związki te działają w dwojaki sposób: mogą wywoływać wzrost fluorescencji kwinakryny (jednego ze wskaźników pH) w całej komórce (to znaczy obniżać pH), jak w przypadku DM-11 [40] lub typowo dla związ­ków lizosomotropowych, powodować alkalizację wakuoli, jak PYG-12 (ryc. 5) [24].

Ryc. 5. Mikrofotografie komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae (kontrast Nomarskiego A i C) i odpowiadające jej mikrofotografie fluorescencyjne (B i D) – komórki poddane działaniu aminoestrów lizosomotropowych (A, B – PYG-12 i C, D – DM-11) i wybarwione kwinakryną [23]

Zakwaszenie cytosolu prawdopodobnie jest spowodowane zahamowaniem aktywności H⁺-ATPazy błony komórkowej drożdży przez aminoestry i zablokowaniu wypompowywania protonów z komórki (tabela 3). Te związki, które powodowały wzrost pH w wakuolach, oddziaływały na wakuolarną ATPazę blokując transport protonów do wakuoli (ryc. 5) [23].

Tabela 3. Wpływ aminoestrów PYG-12 i PYG-14 na aktywność H⁺-ATPazy błony komórkowej i ATPazy mitochondrialnej drożdży Saccharomyces cerevisiae (in vitro)

Zmiany morfologiczne w komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae pod wpływem działania ami­noestru DMAL-12 (chlorowodorku N,N-dimetyloalaninianu n-dodecylowego) w pH 6,0 analizowano na elektrono­gramach z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (ryc. 6) [30]. W komórkach drożdży obserwowano zmia­ny w strukturze wakuoli, tj. duże nagromadzenie wtrętów wewnątrzcytoplazmatycznych, być może kropli lipidowych. Takich zmian nie obserwuje się w komórkach inkubowa­nych bez dodatku tego związku (kontrola). Natomiast w ko­mórkach drożdży namnażanych w pH 8,0, w obecności ba­danego aminoestru wakuole (prawdopodobnie w starszych komórkach), ulegają dezintegracji, podczas gdy w młodych komórkach mają jednolitą elektronowo gęstą strukturę.

Ryc. 6. Elektronogramy komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae z transmisyjnego mikroskopu elektronowego [30]. Komórek drożdży inkubowanych w YPG: A – w pH 6,0 bez suplementacji związku DMAL-12 (kontrola); B – w obecności 40 µM DMAL-12; C – w pH 8,0 bez związku DMAL-12 (kontrola); D – w obecności 5 µM DMAL-12; v – wakuola; l – krople lipidowe; N – jądro komórkowe; m – mitochondria

Związki o charakterze amfifilowym, mają w swojej strukturze część hydrofilową i hydrofobową, mogą wbudowywać się w dwuwarstwę lipidową błon komórkowych. Aminoestry lizosomotropowe zostały przebadane pod kątem zdolności wbudowywania się w błonę liposomową, składającą się z lipidów wyizolowanych z plazmalemy drożdży Saccharomyces cerevisiae. W badaniach tych zastosowano znaczniki fluorescencyjne, umiejscowiające się w różnych regionach dwuwarstwy lipidowej: NBD-PE i TMA-DPH [12]. Związek DM-11 o 11 atomach węgla w łańcuchu alkilowym wbudowywał się w dwuwarstwę lipidową na poziomie TMA-DPH, czyli poniżej czwartego węgla łańcuchów alkilowych fosfolipidów błonowych. Wraz z wydłużaniem się lub skracaniem długości łańcucha alkilowego w cząsteczce aminoestru, obserwowane zmiany fluorescencji TMA-DPH były mniejsze. Sądzi się, że związek DM-9 nie wnikał w głębsze regiony dwuwarstwy liposomowej, co potwierdziła również wyższa wartość zmian intensywności fluorescencji sondy NBD-PE, umiejscowiającej się w regionie przypowierzchniowym dwuwarstwy (ryc. 7).

Ryc. 7. Zależność zmian intensywności fluorescencji TMA-DPH i NBD-PE od rodzaju wbudowywanych do błony liposomowej (zbudowanej z lipidów z plazmalemy drożdży) aminoestrów lizosomotropowych

Na podstawie uzyskanych wyników można rozpatrywać kil­ka możliwych mechanizmów działania badanych związków lizosomotropowych na aktywność H⁺-ATPazy błony ko­mórkowej drożdży.

Po pierwsze aminoestry jako związki o charakterze am­fifilowym mogą wbudowywać się swoim łańcuchem hy­drofobowym w podwójną warstwę lipidową błony komór­kowej, wówczas część hydrofilowa, zawierająca dodatnio naładowany atom azotu, pozostając na powierzchni błony komórkowej i konkurując z protonami transportowanymi przez H⁺-ATPazę błony komórkowej o miejsce w części polarnej dwuwarstwy, hamuje aktywność tego enzymu.

Po drugie aminoestry lizosomotropowe mogą bezpośred­nio oddziaływać na H⁺-ATPazę błony komórkowej drożdży, blokując hydrolizę ATP i transport protonów z komórki.

Po trzecie, na skutek wnikania aminoestrów w dwuwarstwę lipidową, błona komórkowa staje się bardziej przepuszczal­na dla protonów i innych jonów, a w związku z tym różnica potencjałów między wewnętrzną a zewnętrzną stroną błony może ulegać zmianie, co z kolei może być przyczyną hamo­wania aktywności H⁺-ATPazy błony komórkowej drożdży. Za tą hipotezą przemawia to, że dodanie aminoestrów do zawiesiny drożdży powoduje nie tylko zahamowanie spad­ku pH spowodowane naturalną aktywnością H⁺-ATPazy błony komórkowej drożdży, ale także jego wzrost, czasem aż do wartości wyjściowej (ryc. 2). Oznaczałoby to obniże­nie ładunku dodatniego na zewnątrz błony, prawdopodob­nie na skutek przenoszenia protonów do wnętrza komórki.

Zmianę ładunku powierzchniowego błony liposomowej udowodniono w pomiarach zmian fluorescecji fluoresce­iny-PE pod wpływem aminoestrów. Związki te powodo­wały zmniejszenie dodatniego ładunku na powierzchni liposomów, co świadczyło o wzroście lokalnego, przybło­nowego odczynu środowiska.

Białka genów PDR (pleiotropic drug resistance) tworzące u Saccharomyces cerevisiae złożoną sieć pomp ABC i re­gulatorów transkrypcyjnych, kontrolujących ich ekspre­sję, które są analogami ssaczych białek MDR odpowia­dających m.in. za zjawisko oporności wielolekowej [3]. Związki lizosomotropowe, mogą hamować aktywność transporterów ABC [38]. Inhibitory transporterów ABC mogą oddziaływać na pompy jonowe w dwojaki sposób, poprzez specyficzne oddziaływanie z tymi białkami, za­kłócając ich aktywność lub wpływając na źródło energii dla pomp (syntezę ATP). Ponadto mogą hamować aktyw­ność H⁺-ATPazy poprzez wpływ na fosfolipidy błonowe i zwiększenie przepuszczalności błony dla małych nieelek­trolitów i kationów [8,9,15].

Przetestowano wiele związków lizosomotropowych pod względem ich toksyczności dla mutantów delecyjnych Saccharomyces cerevisiae pozbawionych zarówno pojedynczych pomp ABC – Pdr5, Snq2 oraz Yor1, jak również z delecjami podwójnymi i potrójnymi w różnych kombinacjach. Niektóre związki lizosomotropowe, na przykład DM-11 lub DM-13 są substratami poszczególnych pomp, które wypompowują je poza komórkę [38,44].

Uzyskane przez nas wyniki wykazały, że związki lizoso­motropowe hamują wzrost drożdży, aktywność H⁺-ATPazy błony komórkowej, transport aminokwasów oraz są sub­stratami wybranych transporterów ABC.

Przedstawiony stan badań w pracy wskazuje na możliwość zastosowania substancji lizosomotropowych zarówno w medycynie: jako leki w terapii przeciwnowotworowej, fungicydy i środki dezynfekcyjne w zwalczaniu patogenów oraz w rolnictwie jako środki ochrony roślin.

PIŚMIENNICTWO

[1] Agostinelli E., Seiler N.: Lysosomotropic compounds and spermine enzymatic oxidation products in cancer therapy. Int. J. Onc., 2007; 31: 473-484
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[2] Artestein A.W., Opal S.M., Cristofaro P, Palardy J.E., Parejo N.A., Green M.D., Jhung J.W.: Chloroquine anhances survival in Bacillus anthraci intoxication. J. Infect. Dis., 2004; 190: 1655-1660
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Bauer B.E., Wolfger H., Kuchler K.: Inventory and function of yeast ABC proteins: about sex, stress, pleiotropic drug and heavy metal resistance. Biochim. Biophys. Acta, 1999; 1461: 217-236
[PubMed]  

[4] Boyer M.J., Horn I., Firestone R.A., Steele-Norwood D., Tannock I.F.: pH dependent cytotoxicity of N-dodecylimidazole: a compound that acquires detergent properties under acidic conditions. Br. J. Cancer., 1993; 67: 81-87
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[5] Byrd T.F., Horwitz M.A.: Chloroquine inhibits the intracellular multiplication of Legionella pneumophila by limiting the availability of iron. A potencial new mechanism for the therapeutic effect of chloroquine against intracellular pathogens. J. Clin. Invest., 1991; 88: 351-357
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[6] Caravelli A., Giannuzzi L., Zaritzky N.: Inhibitory effect of a surfactant on pure cultures of a filamentous and a floc forming micro-organism. Environ. Technol., 2007; 28: 137-146
[PubMed]  

[7] Castilla V., Mersich S.E., Damonte E.B.: Lysosomotropic compounds inhibiting the multiplication of Junin virus. Rev. Argent. Microbiol., 1991; 23: 86-89
[PubMed]  

[8] Conseil G., Decottignies A., Jault J.M., Comte G., Barron D., Goffeau A., Di Pietro A.: Prenyl-flavonoids as potent inhibitors of the Pdr5p multidrug ABC transporter from Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry, 2000; 39: 6910-6917
[PubMed]  

[9] Conseil G., Perez-Victoria J.M., Jault J.M., Gamarro F., Goffeau A., Hofmann J., Di Pietro A.: Protein kinase C effectors bind to multidrug ABC transporters and inhibit their activity. Biochemistry, 2001; 40: 2564-2571
[PubMed]  

[10] de Duve C., de Barsy T., Poole B., Trouet A., Tulkens P., Van Hoof F.: Lysosomotropic agents. Biochem. Pharmacol., 1974; 23: 2495-2531
[PubMed]  

[11] Doh-Ura K., Iwaki T., Caughey B.: Lysosomotropic agents and cysteine protease inhibitors inhibit scrapie-associated prion protein accumulation. J. Virol., 2000; 74: 4894- 4897
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[12] Driessen A.J., van den Hooven H.W., Kuiper W., van de Kamp M., Sahl H.G., Konings R.N., Konings W.N.: Mechanistic studies of lantibiotic-induced permeabilization of phospholipid vesicles. Biochemistry, 1995; 34: 1606-1614
[PubMed]  

[13] Dubowchik G.M., Gawlak S.L., Firestone R.A.: The in vitro effects of three lysosomotropic detergents against three human tumor cell lines. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1995; 5: 893-898

[14] Dubowchik G.M., Padilla L., Edinger K., Firestone R.A.: Reversal of doxorubicin resistance and catalytic neutralization of lysosomes by a lipophilic imidazole. Biochim. Biophys. Acta, 1994; 1191: 103-108
[PubMed]  

[15] Egner R., Rosenthal F.E., Kralli A., Sanglard D., Kuchler K.: Genetic separation of FK506 susceptibility and drug transport in the yeast Pdr5 ATP-binding cassette multidrug resistance transporter. Mol. Biol. Cell, 1998; 9: 523-543
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[16] Firestone R.A., Pisano J.M., Bonney R.J.: Lysosomotropic agents. 1. Synthesis and cytotoxic action of lysosomotropic detergents. J. Med. Chem., 1979; 22: 1130-1133
[PubMed]  

[17] Hassall, K.A.: The Biochemistry and uses of pesticides: structure, metabolism, mode of action, and uses in crop protection, 2nd ed.; Macmillan Press, London (UK) 1990: 335

[18] Horowitz H., Carbonaro C.A.: Inhibition of the Salmonella typhi oral vaccine oral vaccine strain, Ty21a, by mefloquine and chloroquine.. J. Infect. Dis., 1992; 166:1462-1464
[PubMed]  

[19] Hussain M., Leibowitz M.J., Lenard J.: Killing of Saccharomyces cerevisiae by the lysosomotropic detergent N-dodecylimidazole. Antimicrob. Agents Chemother., 1987; 31: 512-517
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[20] Jaffrezou J.P., Laurent G.: The intriguing link between modulation of both multidrug resistance and ligand-toxin conjugate cytotoxicity. FEBS Lett., 1993; 323: 191-197
[PubMed]  

[21] Jahn B., Langfelder K., Schneider U., Schindel C., Brakhage A.A.: PKSP-dependent of phagolysosome fusion and intracellular kill of Aspergillus fumigatus conidia by human monocyte-derived macrophages. Cell Microbiol., 2002; 4: 793-803
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[22] Kotyk A.: Mechanisms of extracellular acidification by yeast. Romanian J. Biophys., 1993; 3: 17-26

[23] Krasowska A., Chmielewska L., Adamski R., Łuczyński J., Witek S., Sigler K.: The sensitive of yeast and yeast-like cells to new lysosomotropic agents. Cell. Mol. Biol. Lett., 2004; 9: 675-683
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[24] Krasowska A., Chmielewska L., Łuczyński J., Witek S., Sigler K.: The dual mechanizm of the antifungal effect of New lysosomotropic agents on the Saccharomyces cerevisiae RXII strain. Cell. Mol. Biol. Lett., 2003; 8: 111-120
[PubMed]  

[25] Kroon P.A., Faulds C.B., Brezillon C., Williamson G.: Methyl phenylalkanoates as substrates to probe the active sitesb of esterases. Eur. J. Biochem., 1997; 248: 245-251
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[26] Levitz S.M., Harrison T.S., Tabuni A., Liu X.: Chloroquine induces human mononuclear phagocytes to inhibit and kill Cryptococcus neoformans by a mechanism independent of iron deprication. J. Clin. Invest., 1997; 100: 1640-1646
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[27] Maurin M., Benoliel A.M., Bongrand P., Raoult D.: Phagolysosomal alkalinization and the bactericidal effect of antibiotics: the Coxiella burnetii paradigm. J. Infect. Dis., 1992; 166: 1097-1102
[PubMed]  

[28] Miller D.K., Griffiths E., Lenard J., Firestone R.A.: Cell killing by lysosomotropic detergents. J. Cell. Biol., 1983; 97: 1841-1851
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[29] Nguyen H.A., Greller J., Paillard D., Dubois V., Quentin C., Saux M.C.: Factors influencing the intracellular activity of fluoroquinolones: A study using levofloxacin in a Staphylococcus aureus THP-1 monocyte model. J. Antimicrob. Chemother., 2006; 57: 883-890
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[30] Obłąk E., Adamski R., Lachowicz T.M.: pH dependent influence of a quaternary ammonium salt and aminoester on the yeast Saccharomyces cerevisiae ultrastructure. Cell. Mol. Biol. Lett., 2003; 8: 105-110
[PubMed]  

[31] Obłąk E., Krasowska A.: The influence of organic nitrogen compounds on melanoma, bacterial and fungal cells. Advan. Clin. Exper. Med., 2010; 19: 65-75

[32] Obłąk E., Lachowicz T.M., Łuczyński J., Witek S.: Lysosomotropic N,N-dimethyl α-aminoacid n-alkyl esters and their quaternary ammonium salts as plasma membrane and mitochondrial ATPases inhibitors. Cell. Mol. Biol. Lett., 2002; 7: 1121-1129
[PubMed]  

[33] Obłąk E., Lachowicz T.M., Łuczyński J., Witek S.: The aminoesters as inhibitors of plasma membrane H⁺-ATPase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Cell. Mol. Biol. Lett., 2004; 8: 755-763
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[34] Obłąk E., Lachowicz T.M., Łuczyński J., Witek S.: Comparative studies of the biological activities of the lysosomotropic aminoesters and quaternary ammonium salts on the yeast Saccharomyces cerevisiae. Cell. Biol. Mol. Lett., 2001; 6: 871-880
[PubMed]  

[35] Obłąk E., Łuczyński J., Witek S.: Wpływ struktury fragmentu kwasowego wybranych aminoestrów na zdolność inhibicyjną H+-ATPazy błony komórkowej drożdży Saccharomyces cerevisiae. Monografia: Błony biologiczne pod redakcją J. Gabrielskiej i P. Misiaka, Wyd. Uniwersytet Przyrodniczy, Wrocław, 2008; 263-267

[36] Parkkinen E., Oura E., Soumalainen H.: The esterases of baker’s yeast. I. Activity and localization in the yeast cell. J. Inst. Brew., 1978; 84: 5-8

[37] Prada-Delgado A., Carrasco-Marin E., Pena-Macarro C., Del Cerro-Vadillo E, Fresno-Escudero M, Leyva-Cobián F, Alvarez-Dominguez C.: Inhibition of Rab5a exchange activity is a key step for Listeria monocytogenes survival. Traffic, 2005; 6: 252-265
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[38] Rogers B., Decottignies A., Kolaczkowski M., Carvajal E., Balzi E., Goffeau A.: The pleiotropic drug ABC transporters from Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2001; 3: 207-214
[PubMed]  

[39] Savarino A., Lucia M.B., Rastrelli E.: Anti-HIV effects of chloroquine: inhibition of viral particle glycosilation and synergism with protease inhibitors. J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 2004; 35: 223-232
[PubMed]  

[40] Umemoto N., Yoshihisa T., Hirata R., Anraku Y.: Roles of the VMA₃ gene product, subunit c of the vacuolar membrane H⁺-ATPase, on vacuolar acidification and protein transport. A study with VMA₃-disrupted mutants of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 1990; 265: 18447-18453
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[41] Wellems T.E., Plowe C.V.: Chloroquine-resistant malaria. J. Infect. Dis., 2001; 184: 770-776
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[42] Wike-Hooley J.L., Havemann J., Reinhold J.S.: The relevance of tumor pH to the treatment of malignant disease. Radiother. Oncol., 1984; 2: 343-366
[PubMed]  

[43] Witek S., Goffeau A., Nader J., Łuczyński J., Lachowicz T.M., Kuta B., Obłąk E.: Lysosomotropic aminoesters acid as H⁺-ATPase inhibitors in yeast. Folia Microbiol., 1997; 42: 252-254
[PubMed]  

[44] Witek S., Kolaczkowski M., Lachowicz T.M., Kolaczkowska A., Łuczyński J., Goffeau A.: Soft lysossomotropic compounds as new substrates of the yeast PDR Network. Folia Microbiol., 1998; 43: 214-216
[PubMed]  

Autorki deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Full text