Streszczenie

Autofagia jest wewnątrzkomórkowym procesem degradacji makrocząsteczek i organelli komór­kowych odgrywającym ważną rolę w utrzymaniu homeostazy oraz odpowiedzi na wiele bodźców uszkadzających. W ciągu ostatnich kilku lat pojawiło się wiele danych wskazujących na wyraźne nasilenie autofagii w neuronach po niedokrwieniu mózgu. W pracy przedstawiono biosyntezę au­tofagosomów oraz znaczenie i molekularne mechanizmy neuronalnej autofagii podstawowej i in­dukowanej. Omówiono także ostatnio opublikowane prace dotyczące potencjalnej roli autofagii w niedokrwieniu mózgu. Wyniki badań eksperymentalnych zarówno in vivo, jak i in vitro suge­rują, iż szlaki sygnałowe związane z autofagią mogą stanowić punkt wyjścia dla nowych strate­gii neuroprotekcyjnych.

Słowa kluczowe:autofagia • apoptoza • nekroza • niedokrwienie • mózg

Summary

Autophagy is an intracellular process of macromolecule and organelle degradation, which plays an important role both in maintaining homeostasis and in responding to various harmful stimu­li. Recent studies clearly indicate upregulation of autophagy in neurons challenged with brain ischemia. In this paper we present biosynthesis of autophagosomes as well as the role and mole­cular mechanisms of basal and induced neuronal autophagy. We have also reviewed recently pu­blished papers concerning the potential role of autophagy in brain ischemia. Results of both in vivo and in vitro experimental studies indicate that signaling pathways related to autophagy mi­ght become a target of new neuroprotective strategies.

Key words:autophagy • apoptosis • necrosis • ischemia • brain

Wykaz skrótów:

3-MA – 3-metyloadenina; Akt/PKB – kinaza białkowa B; AMP – adenozynomonofosforan; AMPK – kinaza aktywowana AMP; ATP – adenozynotrifosforan; CaMKK – kinaza kinaz kalmodulino-zależnych; CREB – czynnik transkrypcyjny regulujący ekspresję genów zależnych od cAMP; eIF2α – eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 2α; ER – retikulum endoplazmatyczne; GTP – guanozynotrifosforan; HIF-1 – czynnik transkrypcyjny indukowany niedotlenieniem; Ire1 – enzym zależny od inozytolu; JNK – kinaza białkowa fosforylująca N-koniec białka Jun; LKB1 – serynowo-treoninowa kinaza 1; MAP1B – białko związane z mikrotubulami 1B; mLST8/GβL – białko podobne do podjednostki β białka G; mTOR – ssaczy cel rapamycyny; mTORC1 – kompleks 1 kinazy mTOR składający się z kinazy mTOR oraz białek Raptor i mLST8/GβL; mTORC2 – kompleks 2 kinazy mTOR składający się z kinazy mTOR oraz białek Rictor, mLST8/GβL i mSin1; mSIN1 – ssacze białko oddziałujące z białkową kinazą zależną od stresu; OUN – ośrodkowy układ nerwowy; PCD – programowana śmierć komórki; PDK1 – kinaza białkowa zależna od fosfatydyloinozytoli; PE – fosfatydyloetanoloamina; PERK – kinaza białkowa umiejscowiona w retikulum endoplazmatycznym; PI – jodek propidyny; PI3K – kinaza 3-fosfatydyloinozytolu; PIP3 – fosfatydyloinozytolo trifosforan; PKCα – kinaza białkowa Cα; Raptor – białko regulatorowe związane z mTOR; RFT – reaktywne formy tlenu; Rheb – homolog białka Ras wzbogacony w mózgu; Rictor – białko niewrażliwe na rapamycynę towarzyszące mTOR; rt-PA – rekombinowany tkankowy aktywator plazminogenu; TRAF2 – czynnik związany z receptorem TNF; TSC1 – hamartyna; TSC2 – tuberyna; UPR – odpowiedź na nieprawidłowo złożone białka; Vps34 – kinaza 3-fosfatydyloinozytolu.

Wstęp

Autofagia (samostrawienie) jest definiowana jako wyso­ce zachowawczy filogenetycznie mechanizm, w przebie­gu którego komórka degraduje uszkodzone, obumarłe bądź zużyte elementy swej struktury [54]. W tym złożo­nym procesie angażującym układ endosomalno-lizosomal­ny trawione są wytworzone w nadmiarze, stare lub niepo­trzebne makrocząsteczki (w tym białka o długim okresie półtrwania) oraz organella komórkowe (mitochondria, pe­roksysomy, fragmenty aparatu Golgiego i retikulum endo­plazmatycznego) [77].

Autofagię obserwuje się zarówno podczas prawidłowego wzrostu i różnicowania komórek, jak i w sytuacjach pato­logicznych, tj. głodzenia, infekcji bakteryjnych, powsta­wania źle pofałdowanych białek czy obecności uszkodzo­nych komórkowych elementów strukturalnych [35,38,68]. W wielu badaniach wykazano, że skuteczna autofagia może chronić przed apoptozą [74]. Mimo iż autofagia odgrywa ważną prożyciową rolę i warunkuje homeostazę komórki może także prowadzić do jej śmierci [13]. Z tego powo­du autofagia jest często opisywana jako typ II programo­wanej śmierci komórki (type II programmed cell death – PCD II) – w odróżnieniu od apoptozy, czyli PCD I [40,76].

Ostatnie lata przyniosły wiele danych wskazujących, że zaburzenia autofagii mogą odgrywać istotną rolę w pato­genezie schorzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w tym choroby Alzheimera, Parkinsona, Huntingtona czy niedokrwienia/niedotlenienia mózgu [3,63].

Udar niedokrwienny (zawał) mózgu stanowi trzecią co do częstości przyczynę śmierci osób dorosłych w krajach wy­sokorozwiniętych oraz główny powód trwałego inwalidz­twa osób po 40 roku życia [11,39]. Niedokrwienie OUN jest także częstym urazem okołoporodowym, mogącym doprowadzić do znacznych zaburzeń w rozwoju funkcji kognitywnych i motorycznych na skutek permanentnego uszkodzenia mózgu [19]. Rozmiar i charakter uszkodzeń spowodowanych niedokrwieniem zależą od jego zasięgu i czasu trwania oraz stopnia rozwoju mózgu [91]. Obecnie jedyną skuteczną terapią farmakologiczną udaru niedo­krwiennego mózgu jest leczenie trombolityczne z uży­ciem rekombinowanego tkankowego aktywatora plazmi­nogenu (rt-PA). Terapia trombolityczna charakteryzuje się jednak dużym ograniczeniem ze względu na wąskie – trzy­godzinne – okno terapeutyczne [32]. Dlatego też uwaga badaczy i klinicystów skupia się na poszukiwaniu alterna­tywnych możliwości terapeutycznych. Badania prowadzo­ne są w dwóch zasadniczych kierunkach: (i) przywrócenia prawidłowego przepływu krwi (reperfuzji) w obszarze ob­jętym ischemią oraz (ii) neuroprotekcji, której celem jest zapobieganie występowaniu niekorzystnych zmian bioche­micznych w wyniku kaskady niedokrwiennej [22].

Z literatury przedmiotu wynika, iż w patomechanizmie nie­dokrwienia mózgu istotną rolę odgrywać może autofagia [1,33,91]. Rola jaką autofagia odgrywa w komórkach ner­wowych narażonych na ischemię jest dyskusyjna. Nie ulega jednak wątpliwości, że poznanie zarówno szlaków sygna­lizacyjnych prowadzących do autofagii w niedokrwieniu, jak i mechanizmów regulujących współzależność: autofa­gia-apoptoza może się przyczynić do opracowania nowych strategii terapeutycznych.

Biosynteza autofagosomów

Termin autofagia oznaczający dosłownie „samozjadanie” wprowadzono w latach sześćdziesiątych XX wieku [31]. Obecnie, zależnie od mechanizmu dostarczania do lizoso­mów materiału przeznaczonego do degradacji, wyróżnia się trzy podstawowe postaci autofagii: makroautofagię, mikroautofagię oraz autofagię zależną od chaperonów. Podmiotem przedstawionych niżej rozważań jest makro­autofagia – prototypowa postać autofagii polegająca na formowaniu, dojrzewaniu oraz degradacji przez lizosomy wakuoli autofagicznych (nazywanych autofagosomami). Dlatego też termin „autofagia” używany w niniejszej pra­cy odnosi się jedynie do makroautofagii.

Autofagia jest czteroetapowym procesem obejmującym kolejno fazy: (i) indukcji polegającej na odgrodzeniu czę­ści cytoplazmy przez błonę izolującą zwaną fagoforem (nukleacja); (ii) przekształcenia fagoforu w zamknięty i otoczony podwójną błoną autofagosom, który zawiera część cytoplazmy i organelle; (iii) dojrzewania autofago­somu poprzez fuzję jego zewnętrznej błony z lizosomem i utworzenie autofagolizosomu (nazywanego także auto­lizosomem); (iv) degradacji wewnętrznej błony autofago­somu, a następnie jego zawartości przez enzymy lizoso­malne [18,58] (ryc. 1).

Ryc. 1. Biosynteza autofagosomów

Za kontrolę procesu odpowiadają produkty rodziny wyso­ce zachowawczych ewolucyjnie genów Atg (AuTophaGy-related). Z dotychczas opisanych 32 przedstawicieli bia­łek Atg u drożdży [21], 14 wykazuje homologię z białkami ssaków [30]. Zdecydowana większość produktów genów Atg uczestniczy w procesie indukcji i formowania autofa­gosomu (Atg1-Atg10, Atg12-Atg14, Atg16-Atg18, Atg29, Atg31). Przebieg autofagii zależny jest od kaskady białek Atg i mechanizmu ich współdziałania [82].

Powstanie fagoforu inicjowane jest najprawdopodobniej w retikulum endoplazmatycznym (ER) pozostającym w dy­namicznej równowadze z aparatem Golgiego i późnymi en­dosomami [4,86]. W obszarze indukcji obserwuje się na­gromadzenie kompleksów białek Atg [70]. Główną rolę w tej fazie autofagii odgrywa transbłonowe białko Atg9.

Wykazano, że krąży ono pomiędzy siecią trans aparatu Golgiego, a późnymi endosomami dostarczając składników lipidowych niezbędnych do formowania i wydłużania błon fagoforu [61]. Atg9 nie stwierdza się w dojrzałych i w pełni ukształtowanych autofagosomach [28]. W mechanizm usu­wania Atg9 z obszaru formowania fagoforu zaangażowana jest kinaza serynowo-treoninowa Atg1 (u ssaków funkcjo­nalnym homologiem jest kinaza Ulk1). Aktywność Atg1 podlega regulacji przez interakcje białko-białko, zwłasz­cza z fosfoproteiną Atg13 [62,70]. W prawidłowych wa­runkach (np. podczas wzrostu) Atg13 występuje w postaci hiperufosforylowanej i wykazuje niewielkie powinowactwo do Atg1. Natomiast podczas głodzenia, hipoksji, niedobo­ru energii lub czynników wzrostowych Atg13 jest szybko defosforylowana, co skutkuje większym powinowactwem do Atg1 i indukcją autofagii z powodu uruchomienia ka­skady białek Atg. Formowanie fagoforu (nukleacja) na­stępujące po indukcji jest regulowane przez Atg1, Atg9 oraz kompleks zawierający kinazę 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K) klasy III (Vps34), Beklinę 1 i p150. Kinaza Vps34 jest zaangażowana w proces autofagii tylko wówczas, gdy występuje w kompleksie z Bekliną 1 i innymi białkami re­gulatorowymi. Interakcje te nasilają jej aktywność katali­tyczną i powodują zwiększone wytwarzanie fosfatydylo­inozytolo trifosforanu (PIP3) – niezbędnego do elongacji fagoforu i przyłączania do niego kolejnych białek Atg [26].

Na etap elongacji składają się dwa procesy koniugacji, przy­pominające proteosomalną ścieżkę ubikwitynylacji białek. Pierwszy z nich inicjuje formowanie wiązania izopeptydo­wego pomiędzy C-końcową glicyną Atg12, a wewnętrzną lizyną Atg5 [78]. W procesie tym pośredniczy Atg7, który powoduje zależną od ATP aktywację Atg12, a zatem dzia­ła homologicznie do enzymu E1 podczas ubikwitynylacji. Atg12 jest następnie przenoszone na Atg10 (działające po­dobnie do E2), co prowadzi do związania Atg12 z Atg5 [21]. Po niekowalencyjnym przyłączeniu dimeru Atg16L do powstałych kompleksów Atg12-Atg5 powstają multi­mery Atg12-Atg5-Atg16L [5]. Sugeruje się, że multime­ry te odpowiadają za zakrzywienie powstającego fagoforu przez zaangażowanie drugiego systemu koniugacji, pole­gającego na przyłączeniu fosfatydyloetanoloaminy (PE) do białka LC3 przy alternatywnym udziale proteaz Atg4, Atg7 (enzym E1) lub Atg3 (enzym E2) [47]. W procesie tym dochodzi do konwersji LC3 z rozpuszczalnej, cyto­plazmatycznej postaci LC3-I w postać lipofilną LC3-II, co umożliwia wbudowanie go do błon autofagosomu i auto­fagolizosomu. Ponieważ ekspresja LC3-II jest ściśle sko­relowana z ilością autofagosomów, stąd też jest uważana za najbardziej wiarygodny marker aktywnych autofagosomów i autofagolizosomów [87]. W wyniku kaskady po­wyższych zdarzeń z fagoforu powstaje w pełni ukształto­wany autofagosom, którego wielkość w komórkach ssaków jest zróżnicowana i utrzymuje się w zakresie 0,5-1,5 µm [54]. LC-II pozostaje przyłączone do błony autofagoso­mu aż do fuzji z lizosomem, po której powstaje dojrza­ły autofagolizosom. W fuzji biorą udział białka SNARE i Rab, a zwłaszcza Rab7, które jest niezbędne dla dojrze­wania autolizosomu [18].

Autofagia podstawowa w neuronach

Mizushima [53] zaproponował subklasyfikację autofagii w zależności od roli jaką pełni na podstawową (fizjolo­giczną) i indukowaną. W większości komórek, autofagia podstawowa utrzymuje się na niskim poziomie i z fizjolo­gicznego punktu widzenia jest istotna dla konstytutywnego obrotu białek i innych składników cytoplazmy oraz selek­tywnej eliminacji organelli uszkodzonych lub zbytecznych (np. mitochondriów lub peroksysomów) [77]. Przykładem autofagii podstawowej jest także eliminacja nadmiaru ko­mórek podczas rozwoju zarodkowego. Ponadto sugeruje się, że może ona determinować długość życia organizmu [85].

Mimo iż podstawowy poziom autofagii jest niewątpliwie istotny do utrzymania homeostazy komórkowej, neurony w stanie fizjologicznym wykazują stosunkowo niewielką liczbę autofagosomów i prawdopodobnie powolną ich bio­syntezę [89]. Niski poziom autofagii podstawowej w neu­ronach może być związany ze zdolnością tych komórek do wykorzystywania jako źródła energii nie tylko glukozy, ale także ciał ketonowych [7]. Ponadto, w warunkach sil­nego niedoboru substratów energetycznych (tj. ischemia), tymczasowym źródłem energii dla neuronów są przyległe astrocyty przekształcające glukozę do mleczanów w proce­sie glikolizy oraz zawierające zapasy glikogenu. Komórki astrocytarne działają protekcyjnie wobec neuronów rów­nież ze względu na intensywne wydzielanie czynników promujących przeżycie, tj. czynniki wzrostu i neuropepty­dy [20]. Niski poziom neuronalnej autofagii podstawowej jest także warunkowany obecnością pewnych, swoistych dla neuronów białek. Przykładem może być występujące w znacznych ilościach w neuronach białko związane z mi­krotubulami 1B (MAP1B), które z dużym powinowac­twem wiąże LC3 i hamuje formowanie autofagosomów [89]. Należy jednak wspomnieć o alternatywnej tezie, któ­ra zakłada że neuronalna autofagia podstawowa zachodzi z taką samą intensywnością jak w innych komórkach, ale nowo wytworzone autofagosomy są efektywnie eliminowa­ne przez szybką fuzję z lizosomami. Dlatego też w neuro­nach nie dochodzi do akumulacji „struktur przejściowych” autofagii, a detekcja autofagosomów i innych markerów autofagii jest utrudniona [6].

Autofagia neuronalna podlega regulacji przez kilka rów­noległych wewnątrzkomórkowych szlaków przekaźnictwa sygnałów, które są zaangażowane w przejście procesu z po­ziomu podstawowego (swoistego dla neuronów) w wysoce konserwowany stan indukowany (nazywany także aktywa­cją). Niedawno opublikowane wyniki badań na pierwot­nych hodowlach neuronów korowych wskazują, iż taką rolę pełni sygnalizacja insulinowa [88]. Zidentyfikowano także potencjalne białkowe regulatory autofagii w neuro­nach, tj. proteiny DJ-1/PARK7 i p53. Krebiehl i wsp. [37] w modelu in vitro choroby Parkinsona stwierdzili, iż mu­tacja E64D genu kodującego DJ-1/PARK7 prowadzi do znacznego osłabienia autofagii podstawowej oraz aku­mulacji uszkodzonych mitochondriów [37]. Z kolei biał­ko p53 w regulacji autofagii zdaje się wykazywać swoistą dychotomię: w prawidłowych warunkach metabolicznych jest regulatorem negatywnym, a pod wpływem czynników stresogennych – aktywującym proces. Jak wykazano w eks­perymencie in vitro na kilku ludzkich i mysich liniach ko­mórkowych (w tym neuroblastoma SH-SY5Y) podstawową rolą p53 w warunkach fizjologicznych jest supresja auto­fagii [73]. Natomiast w warunkach genotoksycznych, on­kogenicznych lub deprywacji troficznej p53 pełni funkcję induktora autofagii [41].

Zaburzenia w prawidłowo zachodzącej neuronalnej auto­fagii podstawowej mogą stanowić podłoże chorób neuro­degeneracyjnych [10]. Potwierdzają to wyniki badań prze­prowadzonych na myszach transgenicznych, u których zablokowano autofagię przez swoistą dla neuronów delecję genów Atg5 lub Atg7. U zwierząt obserwowano deficyty w rozwoju funkcji motorycznych, będących skutkiem po­stępującej neurodegeneracji związanej z gromadzeniem się nieprawidłowych białek, a następnie formowaniem agrega­tów i wtrętów wewnątrzkomórkowych [23,34]. Podstawowa autofagia w neuronach może mieć zatem dużo większe znaczenie biologiczne, niż początkowo przypuszczano. Obecnie uważa się, iż sprawne oczyszczanie rozproszo­nych białek cytoplazmatycznych w procesie fizjologicz­nej autofagii zapobiega akumulacji nieprawidłowych bia­łek, które zakłócają prawidłowe funkcjonowanie neuronów i ostatecznie prowadzą do neurodegeneracji.

Autofagia indukowana w neuronach

Oprócz niedokrwienia/niedotlenienia bodźcami wyzwa­lającymi autofagię w mózgu są m.in.: deprywacja pokar­mowa, neurotoksyny, ekscytotoksyczność czy zamknię­te urazy głowy [41,52,89]. Podstawową funkcją autofagii jest zapewnienie prawidłowej odpowiedzi komórkowej na ograniczoną podaż składników odżywczych przez urucho­mienie mechanizmu degradacji: autofagosom-lizosom. Podczas aktywacji procesu, w neuronach zachodzą zmia­ny polegające na deregulacji mechanizmów kontrolujących prowadzące do przejścia z poziomu podstawowego w in­dukowany, na którym dochodzi do znacznej intensyfika­cji biosyntezy autofagosomów [89].

Zgromadzone dotąd dowody bezsprzecznie wykazują, że autofagia podlega kontroli przez regulatory, których in­dukcja zależy od dostępności składników odżywczych. Należą do nich: insulina, aminokwasy i kinaza aktywo­wana AMP (AMPK) działające poprzez białkową kinazę serynowo-treoninową mTOR (mammalian target of rapa­mycin) [90] (ryc. 2).

Ryc. 2. Autofagia indukowana w neuronach; –> aktywacja, ! blokowanie

Według obecnego stanu wiedzy nadrzędną rolę w kontro­li autofagii przypisuje się kinazie mTOR. Pełni ona w ko­mórkach OUN wiele funkcji związanych z regulacją ich żywotności i różnicowania, transkrypcji, translacji, degrada­cji białek, organizacji cytoszkietetu i autofagii [24]. W ko­mórkach ssaków mTOR występuje w postaci dwóch, funk­cjonalnie odrębnych kompleksów białkowych: mTORC1 i mTORC2. Kompleks mTORC1 odgrywa rolę w regula­cji autofagii, jest wysoce wrażliwy na rapamycynę (swo­istego inhibitora mTOR). Natomiast mTORC2 charakte­ryzuje się niewrażliwością na rapamycynę i odpowiada za regulację cytoszkieletu aktynowego oraz aktywność ki­naz PKCα i Akt. Składnikami obu kompleksów są kina­za mTOR i białko mLST8/GβL (G protein β-subunit like protein). Dodatkowo w skład kompleksu mTORC1 wcho­dzi białko Raptor (regulatory associated protein of mTOR), a w skład mTORC2 białka Rictor (rapamycin-insensitive companion of mTOR) i mSin1 [81].

Mechanizm, przez który mTOR działa jako negatywny re­gulator autofagii nie jest do końca poznany. Wydaje się, iż głównym szlakiem prowadzącym do aktywacji mTOR jest stymulowany przez insulinę szlak kinazy 3-fosfatydy­loinozytolu (PI3K). Kinaza PI3K zwiększa wytwarzanie PIP3, który wpływa na przemieszczenie się do błony ko­mórkowej kinazy białkowej zależnej od fosfatydyloinozy­toli (PDK1) oraz kinazy Akt. Aktywacja tej ostatniej za­chodzi za pośrednictwem fosforylacji dwóch aminokwasów – treoniny 308 (Thr308) przez PDK1 i seryny 473 (S473) przez kompleks mTORC2. Aktywna kinaza Akt hamuje przez fosforylację aktywność kompleksu białek hamarty­ny (TSC1) i tuberyny (TSC2) (tuberous sclerosis complex, TSC1/TSC2), czyli głównego inhibitora szlaku sygnałowe­go mTOR. Inaktywacja kompleksu TSC1/TSC2 skutku­je osłabieniem aktywności GTP-azowej małego białka G – Rheb (homolog białka Ras wzbogacony w mózgu; Ras homolog enriched in brain). Jak wykazały liczne badania in vivo i in vitro, to właśnie białko Rheb związane z GTP jest silnym stymulatorem kinazy mTOR [57]. Ale oprócz szlaku insulinowego, kinaza mTOR może także ulegać aktywacji przez aminokwasy w podobnym mechanizmie polegającym na osłabieniu GTP-azowej aktywności biał­ka Rheb [12]. Stąd też przyjmuje się, że zarówno sygna­lizacja insulinowa uruchamiająca szlak kinazy PI3K, jak i bezpośrednia fosforylacja indukowana przez aminokwa­sy są niezbędne do pełnej efektywności enzymatycznej ki­nazy mTOR i supresji autofagii.

Przeciwnie do insuliny i aminokwasów działa aktywna kinaza AMPK, która na skutek hamowania sygnalizacji zależnej od mTOR pobudza proces autofagii (ryc. 2 i 3). AMPK reguluje szlaki metaboliczne włączając procesy wytwarzające energię, a wyłączając procesy ją zużywają­ce optymalizując tym samym wewnątrzkomórkowe proce­sy energetyczne i pozwalając przetrwać okresy stresu ko­mórkowego [75]. Wzrastający komórkowy poziom AMP lub (w mniejszym stopniu) spadek wytwarzania ATP pro­wadzi do aktywacji AMPK w wyniku fosforylacji treoni­ny 172 (Thr172) przez kinazy nadrzędne, do których nale­żą serynowo-treoninowa kinaza 11 (LKB1) i kinaza kinaz kalmodulino-zależnych (CaMKK) [75]. Aktywna AMPK nasila autofagię hamując kompleks mTORC1 poprzez bez­pośrednią fosforylację co najmniej dwóch białek: TSC2 na resztach serynowych różnych od miejsc docelowych innych kinaz oraz składowej kompleksu mTORC1 – białka Raptor [42]. Według ostatnich doniesień, AMPK może również aktywować autofagię bezpośrednio wpływając na kaskadę białek Atg. Kim i wsp. [29] wykazali bowiem, że w wa­runkach deprywacji glukozy AMPK indukuje autofagię poprzez fosforylację kinazy Ulk1 (ssaczy homolog kina­zy Atg1) na resztach serynowych S317 i S777, co skutku­je kaskadą białek Atg [29].

Ryc. 3. Czynniki indukujące autofagię w niedokrwieniu mózgu

Udział AMPK w aktywacji autofagii potwierdzono m.in. w eksperymencie in vitro, w którym czasowo wyciszono ekspresję genu kodującego AMPK w wyniku transfekcji krótkich interferujących RNA (siRNA) [49]. Świadczą o nim także wyniki badania nad autofagią aktywowaną wzrostem wapnia wewnątrzkomórkowego ([Ca²⁺]_i), w któ­rym obserwowano supresję procesu w warunkach in vitro po zastosowaniu swoistego inhibitora AMPK – compound c (6-[4-(2-piperydyno-1-yl-etoksy)-fenylo)]-3-pirydyno-4-yl-pirazolono[1,5-a] pirymidyna) [25].

Ostatnio pojawia się coraz więcej danych wskazujących, iż w obrębie komórki silnymi czynnikami aktywującymi autofagię jest stres retikulum endoplazmatycznego (stres ER) i dysfunkcja mitochondriów (ryc. 2 i 3). Zaburzenia w prawidłowym funkcjonowaniu ER, polegające na obni­żeniu zdolności do modyfikacji potranslacyjnych i wła­ściwej kontroli przebiegu fałdowania białek określa się powszechnie jako odpowiedź na nieprawidłowo złożone białka (unfolded protein response – UPR). Wszystkie wy­mienione na początku podrozdziału czynniki wyzwalają­ce autofagię (w tym niedokrwienie/niedotlenienie mózgu) są zidentyfikowane także jako bodźce indukujące stres ER [26]. Obecnie przyjmuje się, iż dwa szlaki sygnalizacyjne UPR są zaangażowane w sygnalizację autofagii indukowa­ną stresem ER: PERK/eIF2α oraz Ire1/TRAF2/JNK [45]. Prawdopodobnie eIF2α (eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 2α) ostatecznie aktywuje autofagię poprzez wzrost ekspresji białka Atg12 oraz nasilenia konwersji LC3-I do LC3-II [36]. Ponadto wzrost stężenia wolnego wapnia w cytosolu ([Ca²⁺]_C), na skutek stresu ER, może aktywo­wać autofagię w szlaku CaMKK/AMPK/mTORC1 [26].

Autofagia indukowana stresem ER może zostać zaha­mowana przez umiejscowioną w błonach retikulum antyapoptotyczną proteinę Bcl-2 [26]. Zaproponowano dwa mechanizmy inhibicji autofagii przez Bcl-2. Jeden z nich polega na obniżeniu stężenia stacjonarnego wap­nia w ER ([Ca²⁺]_ER) i przez to ilości wolnych jonów Ca²⁺ uwalnianych z ER po bodźcu stresowym. Nie docho­dzi wtedy do aktywacji CaMKK i uruchomienia ścieżki CaMKK/AMPK/mTORC1. Drugi natomiast zakłada, że Bcl-2 może wstrzymywać autofagię na skutek wiązania Bekliny 1, usuwając ją tym samym z kompleksu z PI3K niezbędnego dla etapu nukleacji [26].

Liczne badania sugerują także ścisły związek między dys­funkcją mitochondriów a autofagią. Zaburzenia funkcji mitochondriów i związane z nimi generowanie znacznych ilości reaktywnych form tlenu (RFT) są jednym z głów­nych czynników wyzwalających autofagię w następstwie udarów, urazów oraz w przebiegu chorób neurodegenera­cyjnych (ryc. 3).

RFT powodują uszkodzenie DNA, peroksydację lipidów mitochondrialnych oraz rozpad/wzrost przepuszczalności błon lizosomalnych [84]. Zaburzenie integralności lizoso­mów umożliwia interakcję uwolnionych z nich katepsyn z proapoptotycznymi białkami rodziny Bcl-2 (Bax, Bak, tBid) prowadząc do indukcji mitochondrialnego szlaku apoptozy oraz aktywacji kaspaz i DNazy II [72]. Nadmiar RFT może również wpływać na mechanizm molekularny odpowiedzialny za regulację autofagii. Na przykład H₂O₂ generowany w warunkach stresu oksydacyjnego powoduje inaktywację proteazy cysteinowej Atg4, co promuje kon­wersję białka LC3, akumulację postaci lipidowej LC3-II w błonie fagoforu i formowanie autofagosomu [64].

Autofagia a apoptoza i nekroza w niedokrwieniu mózgu

Objawy uszkodzenia mózgu powstałe w wyniku niedo­krwienia na skutek zakrzepu lub zatoru tętnic mózgo­wych są konsekwencją masowej śmierci komórek w ob­szarze ogniska niedokrwiennego. Zaledwie kilka sekund po zatrzymaniu mózgowego przepływu krwi dochodzi do uruchomienia tzw. kaskady niedokrwienia obejmującej kolejne zmiany biochemiczne, prowadzące do degradacji struktur i błon komórkowych i ostatecznie do śmierci ko­mórek mózgowych [80]. U chorych dotkniętych ostrym udarem niedokrwiennym obserwuje się utratę około 120 milionów neuronów na godzinę [39]. Uszkodzeniu pod­legają jednak nie tylko obszary mózgowia bezpośrednio dotknięte niedokrwieniem, ale także tkanka z nim grani­cząca określana jako strefa tzw. penumbry czyli półcienia niedokrwiennego [55]. Obszar penumbry stanowi cel po­tencjalnych strategii neuroprotekcyjnych. Mimo bowiem, iż czynność komórek strefy półcienia zanika, to jednak nie następują w nich natychmiastowe i trwałe zmiany morfo­logiczne [27].

Śmierć komórek w wyniku niedokrwienia może przebiegać w wyniku nekrozy i apoptozy. Obecność markerów obu tych procesów zaobserwowano wielokrotnie w eksperymental­nych modelach niedokrwienia mózgu zarówno in vivo, jak i in vitro [43]. Te dwie postaci śmierci komórkowej różnią się od siebie pod względem morfologicznym i molekular­nym. Nekrozę charakteryzuje gwałtowny obrzęk komór­ki i organelli oraz utrata integralności błony komórkowej, co prowadzi do uwalniania substancji aktywujących pro­ces zapalny i uszkadzających sąsiednie tkanki. Natomiast podczas apoptozy dochodzi do obkurczania się jądra ko­mórkowego i fragmentacji DNA, a następnie rozpadu ko­mórki na ciałka apoptotyczne otoczone błoną. Apoptozie nie towarzyszy zatem stan zapalny ani uszkodzenie komó­rek sąsiadujących [71]. Procesy te różni także zapotrzebo­wanie energetyczne. Nekroza jest uznawana za śmierć pa­sywną, natomiast wkroczenie komórki na drogę apoptozy wymaga nakładów energetycznych [59].

Wydaje się jednak, że zarówno mechanizmy leżące u pod­staw poischemicznej śmierci neuronów, jak i ich kinetyka są znacznie bardziej złożone niż mogłoby się wydawać. Stwierdzono bowiem, że oprócz cech charakterystycznych apoptozy i nekrozy, niektóre komórki w obszarze objętym niedokrwieniem wykazują obecność białkowych marke­rów autofagii: Bekliny 1 i LC3-II [91]. Zwiększoną licz­bę autofagosomów oraz ekspresję białek autofagicznych wykazano w eksperymentalnych modelach niedokrwie­nia ogniskowego [1,79] oraz przemijającego mózgu [44]. Autofagię wywołaną niedokrwieniem ogniskowym obser­wowano u zwierząt doświadczalnych w korze mózgu, hi­pokampie i prążkowiu [1,60]. Podobne wyniki otrzyma­no w eksperymentach in vitro na pierwotnych hodowlach neuronów narażonych na ischemię [51] oraz na linii unie­śmiertelnionych mysich neuronów hipokampa (komórki HT22) hodowanej w medium pozbawionym surowicy [69].

O zróżnicowanej odpowiedzi komórek nerwowych na nie­dokrwienie świadczyć może zaobserwowana w niektórych z nich jednoczesna aktywacja szlaków charakterystycznych dla autofagii i apoptozy. W modelu przemijającej, ogni­skowej ischemii u szczura stwierdzono, że pewna subpo­pulacja neuronów kory i prążkowia wykazuje jednocze­śnie zwiększoną ekspresję Bekliny 1 i aktywację kaspazy 3 [60]. Również Carloni i wsp. [8] w modelu neurodege­neracji indukowanej niedoborem tlenu (hipoksją/ischemią) u noworodków szczurzych stwierdzili w części komórek kory mózgowej współwystępowanie podwyższonej ekspresji Bekliny 1 i markerów typowych dla apoptozy. Najwięcej ko­mórek z jednoczesną aktywacją autofagii i apoptozy bada­cze zidentyfikowali w powierzchniowych warstwach kory. Natomiast znacznie mniej takich cech wykazywały komór­ki jej głębszych warstw oraz regionu CA1 hipokampa. Co istotne, tylko w kilku neuronach regionów CA1 i CA2 hi­pokampa stwierdzono kolokalizację Bekliny 1 i jodku pro­pidyny (PI) – znacznika nekrozy – co sugeruje, że wzrost ekspresji białka występuje głównie w komórkach induku­jących program apoptozy [8]. Na podstawie opublikowa­nych danych oraz badań własnych nad niedokrwieniem mó­zgu Rami i Kögel [59] wprowadzili termin „apofagia” na określenie apoptotycznej śmierci komórek z jednoczesną nadekspresją Bekliny 1 i aktywacją kaspazy 3.

Rola autofagii w niedokrwieniu mózgu

Na obecnym etapie wiedzy nie można jednoznacznie od­powiedzieć na pytanie, czy autofagia indukowana niedo­krwieniem mózgu przyczynia się do śmierci neuronów, czy też działa jako endogenny mechanizm neuroprotekcyjny, a może jest jedynie epifenomenem apoptozy i nekrozy? Na podstawie dostępnych danych literaturowych można jed­nak wskazać trzy główne sugestie formułowane obecnie o potencjalnym wpływie autofagii na ischemiczne neurony.

Po pierwsze wydaje się, iż autofagia może się przyczy­niać do degeneracji neurytów w niedokrwieniu mózgu. Potwierdzeniem tej tezy jest stwierdzona przez Adhamiego i wsp. [1] szybka i masywna degeneracja aksonów neu­ronów korowych myszy 24 godz. po ischemii/hipoksji. Wykazano także związek między autofagią uruchomioną w wyniku aktywacji AMPK, a powiększeniem się obszaru niedokrwienia i gorszym rokowaniem [16,42]. Znaczną re­dukcję rozmiaru uszkodzeń poischemicznych oraz zmniej­szoną liczbę martwych komórek obserwowano natomiast u myszy z delecją neuronalną genu Atg7 [33]. Stwierdzono ponadto, że zahamowanie autofagii 3-metyloadeniną (3-MA) – swoistym inhibitorem kinazy Vps34 – powodo­wało wzrost żywotności neuronów w modelu ischemii in vitro [51]. W badaniach in vivo u szczurów z niedokrwie­niem ogniskowym po podaniu 3-MA również obserwo­wano mniejsze uszkodzenia związane z redukcją obrzęku mózgu i deficytem funkcji motorycznych [79].

Po drugie, wielokrotnie wykazano jednak istotny udział au­tofagii w ochronie komórek neuronalnych przed śmiercią indukowaną hipoksją/ischemią. Efekt cytoprotekcyjny ob­serwowano m.in. w mysim modelu traumatycznego uszko­dzenia mózgu [17], mózgach noworodków szczurzych na­rażonych na niedokrwienie/niedotlenienie [8] oraz mysich neuronach hipokampa linii HT22 hodowanych w medium pozbawionym surowicy [69]. Najbardziej istotnym mecha­nizmem neuroprotekcyjnego działania efektywnej autofagii w ischemii jest przypuszczalnie eliminacja uszkodzonych mitochondriów (tzw. mitofagia) i przerwanie apoptozy. Selektywną eliminację mitochondriów stwierdzono w ko­mórkach eukariotycznych po zablokowaniu kaspaz, a za­tem sekwestracja organelli może być mechanizmem zapo­biegającym wejściu komórki w apoptozę [83]. Natomiast znikaniu mitochondriów częściowo zapobiegało podawanie bafilomycyny A1 – inhibitora fuzji autofagosomów z lizo­somami – co potwierdza udział autofagii w tym procesie [83]. Ponadto, degradacja nieprawidłowo funkcjonujących mitochondriów w autofagolisomach może być przejawem adaptacji metabolicznej komórki do warunków hipoksji re­gulowanej przez indukowany hipoksją czynnik transkryp­cyjny (HIF-1) [66]. Mitofagia w niedotlenieniu jest zatem uważana za mechanizm przystosowawczy komórki na po­ziomie metabolicznym, niezbędny do utrzymania home­ostazy redoks i przeżycia [66].

Sekwestracji w autofagosomach ulegają także fragmen­ty ER uszkodzone na skutek działania RFT, co zapobie­ga uwolnieniu do cytoplazmy zgromadzonych tam zaso­bów wapnia oraz aktywacji apoptozy zależnej od kaspazy 11 [15]. Niezmiernie istotne z punktu widzenia endogen­nych mechanizmów neuroprotekcyjnych uruchamianych po przejściowym niedokrwieniu mózgu jest także usuwa­nie białek uszkodzonych i/lub agregatów białkowych po­przez autofagię. Niewydolność procesu „samostrawienia” może skutkować ich akumulacją, zwiększając tym samym poziom stresu komórkowego i w perspektywie przyczyniać się do opóźnionej śmierci neuronów [44].

Za pozytywnym wpływem autofagii przemawiają także liczne dowody wskazujące na neuroprotekcyjne działa­nie rapamycyny – farmakologicznego aktywatora proce­su [48,56]. Carloni i wsp. [9] stwierdzili nasilenie neuro­nalnej autofagii z jednoczesnym osłabieniem apoptozy i wyraźnym zmniejszeniem uszkodzenia mózgu po po­daniu rapamycyny noworodkom szczurzym narażonym na ischemię/hipoksję. Badacze obserwowali także silną fosforylację kinazy Akt oraz czynnika transkrypcyjnego CREB (cAMP response element binding protein), co po­twierdza udział szlaku PI3K/Akt/mTOR w autofagii indu­kowanej niedokrwieniem.

Na podstawie ostatnio opublikowanych danych wskazuje się także, iż u podstaw neuroprotekcyjnego wpływu har­towania ischemicznego (preconditioning) leży aktywacja autofagii [46,67].

Po trzecie, ze względu na to, iż autofagia jest procesem katabolicznym może opóźniać początek nekrozy przez utrzymanie homeostazy jonowej [2]. Nie bez znaczenia jest tu także przypisanie kinazie mTOR – głównego re­gulatora autofagii – roli czujnika zmian w wewnątrzko­mórkowym poziomie ATP [14]. Prawdopodobnie zmia­ny w ATP są przekazywane do mTOR za pośrednictwem aktywnej AMPK, ponieważ nawet niewielkie obniżenie cytosolowego stężenia ATP skutkuje relatywnie dużym wzrostem AMP potęgowanym dodatkowo aktywnością ki­nazy adenylanowej. Aktywacja AMPK hamuje ścieżki sy­gnałowe zależne od mTOR, indukuje autofagię i wyłącza szlaki metaboliczne zależne od ATP [12]. Warto w tym miejscu wspomnieć o idealnym umiejscowieniu w obrę­bie mitochondriów dwóch enzymów: mTOR na błonie ze­wnętrznej i kinazy adenylanowej w przestrzeni między­błonowej, co umożliwia szybką i zintegrowaną reakcję komórki na zmiany w stosunku ATP/AMP [50,65]. Jeśli jednak nie dojdzie do zmniejszenia deficytów energetycz­nych podczas reperfuzji, przedłużający się okres „stresu autofagicznego” może prowadzić do masywnej aktywa­cji enzymów lizosomalnych i ostatecznie nekrotycznej śmierci neuronu [2].

Na podstawie przytoczonych wyżej danych można przy­puszczać, że autofagia, apoptoza i nekroza współwystę­pują w obszarze objętym niedokrwieniem, prowadząc do śmierci komórkowej o mieszanych cechach biochemicz­nych i morfologicznych, a autofagia jest procesem decy­dującym o losach neuronów.

Podsumowanie

W literaturze pojawia się coraz więcej danych wskazują­cych na udział autofagii w patomechanizmie niedokrwie­nia mózgu. Kwestią dyskusyjną pozostaje czy aktywacja autofagii jest przejawem endogennego mechanizmu neu­roprotekcyjnego, czy wręcz przeciwnie przyczynia się do śmierci komórek. Dominuje jednak pogląd, że efektywna autofagia jest procesem ochronnym aktywowanym wcze­śnie w odpowiedzi na czynniki apoptogenne. Co więcej, uważa się, iż szlaki sygnałowe związane z autofagią mogą być podstawą nowych strategii neuroprotekcyjnych.

PIŚMIENNICTWO

[1] Adhami F., Liao G., Morozov Y.M., Schloemer A., Schmithorst V.J., Lorenz J.N., Dunn R.S., Vorhees C.V., Wills-Karp M., Degen J.L., Davis R.J., Mizushima N., Rakic P., Dardzinski B.J., Holland S.K., Sharp F.R., Kuan C.Y.: Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol., 2006; 169: 566-583
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[2] Adhami F., Schloemer A., Kuan C.Y.: The roles of autophagy in cerebral ischemia. Autophagy, 2007; 3: 42-44
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[3] Alirezaei M., Kemball C.C., Whitton J.L.: Autophagy, inflammation and neurodegenerative disease. Eur. J. Neurosci., 2011; 33: 197-204
[PubMed]  

[4] Axe E.L., Walker S.A., Manifava M., Chandra P., Roderick H.L., Habermann A., Griffiths G., Ktistakis N.T.: Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J. Cell. Biol., 2008; 182: 685-701
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[5] Barth S., Glick D., Macleod K.F.: Autophagy: assays and artifacts. J. Pathol., 2010; 221: 117-124
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[6] Boland B., Kumar A., Lee S., Platt F.M., Wegiel J., Yu W.H., Nixon R.A.: Autophagy induction and autophagosome clearance in neurons: relationship to autophagic pathology in Alzheimer’s disease. J. Neurosci., 2008; 28: 6926-6937
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[7] Boland B., Nixon R.A.: Neuronal macroautophagy: from development to degeneration. Mol. Aspects Med., 2006; 27: 503-519
[PubMed]  

[8] Carloni S., Buonocore G., Balduini W.: Protective role of autophagy in neonatal hypoxia-ischemia induced brain injury. Neurobiol. Dis., 2008; 32: 329-339
[PubMed]  

[9] Carloni S., Girelli S., Scopa C., Buonocore G., Longini M., Balduini W.: Activation of autophagy and Akt/CREB signaling play an equivalent role in the neuroprotective effect of rapamycin in neonatal hypoxia-ischemia. Autophagy, 2010; 6: 366-377
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[10] Cherra S.J.3rd, Dagda R.K., Chu C.T.: Autophagy and neurodegeneration: survival at a cost? Neuropathol. Appl. Neurobiol., 2010; 36: 125-132
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[11] Chu C.T.: Eaten alive: autophagy and neuronal cell death after hypoxia-ischemia. Am. J. Pathol., 2008; 172: 284-287
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[12] Codogno P., Meijer A.J.: Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death. Cell Death Differ., 2005; 12: 1509-1518
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[13] Cuervo A.M.: Autophagy: in sickness and in health. Trends Cell Biol., 2004; 14: 70-77
[PubMed]  

[14] Dennis P.B., Jaeschke A., Saitoh M., Fowler B., Kozma S.C., Thomas G.: Mammalian TOR: a homeostatic ATP sensor. Science, 2001; 294: 1102-1105
[PubMed]  

[15] Ding W.X., Ni H.M., Gao W., Yoshimori T., Stolz D.B., Ron D., Yin X.M.: Linking autophagy to ubiquitin-proteasome system is important for the regulation of endoplasmic reticulum stress and cell viability. Am. J. Pathol., 2007; 171: 513-524
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[16] Du L., Hickey R.W., Bayir H., Watkins S.C., Tyurin V.A., Guo F., Kochanek P.M., Jenkins L.W., Ren J., Gibson G., Chu C.T., Kagan V.E., Clark R.S.: Starving neurons show sex difference in autophagy. J. Biol. Chem., 2009; 284: 2383-2396
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[17] Erlich S., Alexandrovich A., Shohami E., Pinkas-Kramarski R.: Rapamycin is a neuroprotective treatment for traumatic brain injury. Neurobiol. Dis., 2007; 26: 86-93
[PubMed]  

[18] Eskelinen E.L.: Maturation of autophagic vacuoles in mammalian cells. Autophagy, 2005; 1: 1-10
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[19] Ferrari D.C., Nesic O., Perez-Polo J.R.: Perspectives on neonatal hypoxia/ischemia-induced edema formation. Neurochem. Res., 2010; 35: 1957-1965
[PubMed]  

[20] Gabryel B., Trzeciak H.I.: Role of astrocytes in pathogenesis of ischemic brain injury. Neurotox. Res., 2001; 3: 205-221
[PubMed]  

[21] Glick D., Barth S., Macleod K.F.: Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J. Pathol., 2010; 221: 3-12
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[22] Green A.R., Shuaib A.: Therapeutic strategies for the treatment of stroke. Drug. Discov. Today, 2006; 11: 681-693
[PubMed]  

[23] Hara T., Nakamura K., Matsui M., Yamamoto A., Nakahara Y., Suzuki-Migishima R., Yokoyama M., Mishima K., Saito I., Okano H., Mizushima N.: Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice. Nature, 2006; 441: 885-889
[PubMed]  

[24] Harris T.E., Lawrence J.C.Jr.: TOR signaling. Sci STKE, 2003; 2003: re15
[PubMed]  

[25] Hoyer-Hansen M., Jäättelä M.: AMP-activated protein kinase: a universal regulator of autophagy? Autophagy, 2007; 3: 381-383
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[26] Hoyer-Hansen M., Jäättelä M.: Connecting endoplasmic reticulum stress to autophagy by unfolded protein response and calcium. Cell Death Differ., 2007; 14: 1576-1582
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[27] Joźwiak-Bębenista M., Bednarek K., Nowak J.Z.: Działanie neuroprotekcyjne PACAP, VIP oraz pochodnych w niedokrwieniu mózgu. Postępy Hig. Med. Dośw., 2008; 62: 478-489
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[28] Kim J., Huang W.P., Stromhaug P.E., Klionsky D.J.: Convergence of multiple autophagy and cytoplasm to vacuole targeting components to a perivacuolar membrane compartment prior to de novo vesicle formation. J. Biol. Chem., 2002; 277: 763-773
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[29] Kim J., Kundu M., Viollet B., Guan K.L.: AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1. Nat. Cell Biol., 2011; 13: 132-141
[PubMed]  

[30] Klionsky D.J.: Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2007; 8: 931-937
[PubMed]  

[31] Klionsky, D.J.: Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy; 2008, 4: 740-743
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[32] Kobayashi A., Członkowska A.: Leczenie trombolityczne w udarze niedokrwiennym mózgu. Farmakoter. Psychiatr. Neurol., 2005; 1: 5-18
[Full Text PDF]  

[33] Koike M., Shibata M., Tadakoshi M., Gotoh K., Komatsu M., Waguri S., Kawahara N., Kuida K., Nagata S., Kominami E., Tanaka K., Uchiyama Y.: Inhibition of autophagy prevents hippocampal pyramidal neuron death after hypoxic-ischemic injury. Am. J. Pathol., 2008; 172: 454-469
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[34] Komatsu M., Waguri S., Chiba T., Murata S., Iwata J., Tanida I., Ueno T., Koike M., Uchiyama Y., Kominami E., Tanaka K.: Loss of autophagy in the central nervous system causes neurodegeneration in mice. Nature, 2006; 441: 880-884
[PubMed]  

[35] Komatsu M., Waguri S., Ueno T., Iwata J., Murata S., Tanida I., Ezaki J., Mizushima N., Ohsumi Y., Uchiyama Y., Kominami E., Tanaka K., Chiba T.: Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J. Cell Biol., 2005; 169: 425-434
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[36] Kouroku Y., Fujita E., Tanida I., Ueno T., Isoai A., Kumagai H., Ogawa S., Kaufman R.J., Kominami E., Momoi T.: ER stress (PERK/eIF2alpha phosphorylation) mediates the polyglutamine-induced LC3 conversion, an essential step for autophagy formation. Cell Death Differ., 2007; 14: 230-239
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[37] Krebiehl G., Ruckerbauer S., Burbulla L.F., Kieper N., Maurer B., Waak J., Wolburg H., Gizatullina Z., Gellerich F.N., Woitalla D., Riess O., Kahle P.J., Proikas-Cezanne T., Krüger R.: Reduced basal autophagy and impaired mitochondrial dynamics due to loss of Parkinson’s Disease-Associated Protein DJ-1. PLoS One, 2010; 5: e9367
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[38] Kuma A., Hatano M., Matsui M., Yamamoto A., Nakaya H., Yoshimori T., Ohsumi Y., Tokuhisa T., Mizushima N.: The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature, 2004; 432: 1032-1036
[PubMed]  

[39] Lakhan S.E., Kirchgessner A., Hofer M.: Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: therapeutic approaches. J. Transl. Med., 2009; 7: 97
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[40] Lamparska-Przybysz M., Motyl T.: Autofagia – narzędzie śmierci czy przeżycia komórki nowotworowej. Postępy Biol. Kom., 2005; 32: 13-22
[Abstract]  

[41] Levine B., Abrams J.: p53: the Janus of autophagy? Nature Cell Biol., 2008; 10: 637-639
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[42] Li J., McCullough L.D.: Effects of AMP-activated protein kinase in cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow. Metab., 2010; 30: 480-492
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[43] Lipton P.: Ischemic cell death in brain neurons. Physiol. Rev., 1999; 79: 1431-1568
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[44] Liu C., Gao Y., Barrett J., Hu B.: Autophagy and protein aggregation after brain ischemia. J. Neurochem., 2010; 115: 68-78
[PubMed]  

[45] Liu L., Cash T.P., Jones R.G., Keith B., Thompson C.B., Simon M.C.: Hypoxia-induced energy stress regulates mRNA translation and cell growth. Mol. Cell, 2006; 21: 521-531
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[46] Liu X.Q., Sheng R., Qin Z.H.: The neuroprotective mechanism of brain ischemic preconditioning. Acta Pharmacol. Sin. 2009; 30: 1071-1080
[PubMed]  

[47] Maiuri M.C., Zalckvar E., Kimchi A., Kroemer G.: Self-eating and self-killing: crosstalk between autophagy and apoptosis. Nature Rev. Mol. Cell Biol., 2007; 8: 741-752
[PubMed]  

[48] Malagelada C., Jin Z.H., Jackson-Lewis V., Przedborski S., Greene L.A.: Rapamycin protects against neuron death in in vitro and in vivo models of Parkinson’s disease. J. Neurosci., 2010; 30: 1166-1175
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[49] Matsui Y., Takagi H., Qu X., Abdellatif M., Sakoda H., Asano T., Levine B., Sadoshima J.: Distinct roles of autophagy in the heart during ischemia and reperfusion: roles of AMP-activated protein kinase and Beclin 1 in mediating autophagy. Circ. Res., 2007; 100: 914-922
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[50] Meijer A.J., Dubbelhuis P.F.: Amino acid signalling and the integration of metabolism. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004; 313: 397-403
[PubMed]  

[51] Meloni B.P., Meade A.J., Kitikomolsuk D., Knuckey N.W.: Characterisation of neuronal cell death in acute and delayed in vitro ischemia (oxygen-glucose deprivation) models. J. Neurosci. Methods., 2011; 195: 67-74
[PubMed]  

[52] Mizushima N.: Autophagy: process and function. Genes Dev., 2007; 21: 2861-2873
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[53] Mizushima N.: The pleiotropic role of autophagy: from protein metabolism to bactericide. Cell Death. Differ., 2005; 12, Suppl. 2: 1535-1541
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[54] Mizushima N., Ohsumi Y., Yoshimori T.: Autophagosome formation in mammalian cells. Cell Struct. Funct., 2002; 27: 421-429
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[55] Obrenovitch T.P.: The ischemic penumbra: twenty years on. Cerebrovasc. Brain Metab. Rev., 1995; 7: 297-323
[PubMed]  

[56] Pan T., Kondo S., Zhu W., Xie W., Jankovic J., Le W.: Neuroprotection of rapamycin in lactacystin-induced neurodegeneration via autophagy enhancement. Neurobiol. Dis., 2008; 32: 16-25
[PubMed]  

[57] Perycz M., Świech Ł., Malik A., Jaworski J.: mTOR w fizjologii i patologii układu nerwowego. Postępy Biol. Kom., 2007; 34: 511-525
[Abstract]  [Full Text PDF]  

[58] Rami A.: Review: autophagy in neurodegeneration: firefighter and/or incendiarist? Neuropathol. Appl. Neurobiol., 2009; 35: 449-461
[PubMed]  

[59] Rami A., Kögel D.: Apoptosis meets autophagy-like cell death in the ischemic penumbra: Two sides of the same coin? Autophagy, 2008; 4: 422-426
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[60] Rami A., Langhagen A., Steiger S.: Focal cerebral ischemia induces upregulation of Beclin 1 and autophagy-like cell death. Neurobiol. Dis., 2008; 29: 132-141
[PubMed]  

[61] Reggiori F., Shintani T., Nair U., Klionsky D.J.: Atg9 cycles between mitochondria and the pre-autophagosomal structure in yeasts. Autophagy, 2005; 1: 101-109
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[62] Reggiori F., Tucker K.A., Stromhaug P.E., Klionsky D.J.: The Atg1-Atg13 complex regulates Atg9 and Atg23 retrieval transport from the pre-autophagosomal structure. Dev. Cell., 2004; 6: 79-90
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[63] Rubinsztein D.C., DiFiglia M., Heintz N., Nixon R.A., Qin Z.H., Ravikumar B., Stefanis L., Tolkovsky A.: Autophagy and its possible roles in nervous system diseases, damage and repair. Autophagy, 2005; 1: 11-22
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[64] Scherz-Shouval R., Shvets E., Fass E., Shorer H., Gil L., Elazar Z.: Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate the activity of Atg4. EMBO J., 2007; 26: 1749-1760
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[65] Schieke S.M., Phillips D., McCoy J.P. Jr., Aponte A.M., Shen R.F., Balaban R.S., Finkel T.: The mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway regulates mitochondrial oxygen consumption and oxidative capacity. J. Biol. Chem., 2006; 281: 27643-27652
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[66] Semenza G.L.: Mitochondrial autophagy: life and breath of the cell. Autophagy, 2008; 4: 534-536
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[67] Sheng R., Zhang L.S., Han R., Liu X.Q., Gao B., Qin Z.H.: Autophagy activation is associated with neuroprotection in a rat model of focal cerebral ischemic preconditioning. Autophagy, 2010; 6: 482-494
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[68] Shintani T., Klionsky D.J.: Autophagy in health and disease: a double-edged sword. Science, 2004; 306: 990-995
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[69] Steiger-Barraissoul S., Rami A.: Serum deprivation induced autophagy and predominantly an AIF-dependent apoptosis in hippocampal HT22 neurons. Apoptosis, 2009; 14: 1274-1288
[PubMed]  

[70] Suzuki K., Kubota Y., Sekito T., Ohsumi Y.: Hierarchy of Atg proteins in pre-autophagosomal structure organization. Genes Cells, 2007; 12: 209-218
[PubMed]  

[71] Taoufik E., Probert L.: Ischemic neuronal damage. Curr. Pharm. Des., 2008; 14: 3565-3573
[PubMed]  

[72] Tardy C., Codogno P., Autefage H., Levade T., Andrieu-Abadie N.: Lysosomes and lysosomal proteins in cancer cell death (new players of an old struggle). Biochim. Biophys. Acta, 2006; 1765: 101-125
[PubMed]  

[73] Tasdemir E., Maiuri M.C., Galluzzi L., Vitale I., Djavaheri-Mergnt M., D’Amelio M., Criollo A., Morselli E., Zhu C., Harper F., Nannmark U., Samara C., Pinton P., Vicencio J.M., Carnuccio R., Moll U.M., Madeo F., Paterlini-Brechot P., Rizzuto R., Szabadkai G., Pierron G., Blomgren K., Tavernarakis N., Codogno P., Cecconi F., Kroemer G.: Regulation of autophagy by cytoplasmic p53. Nat. Cell. Biol., 2008; 10: 676-687
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[74] Thorburn A.: Apoptosis and autophagy: regulatory connections between two supposedly different processes. Apoptosis, 2008; 13: 1-9
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[75] Towler M.C., Hardie D.G.: AMP-activated protein kinase in metabolic control and insulin signaling. Circ. Res., 2007; 100: 328-341
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[76] Uchiyama Y.: Autophagic cell death and its execution by lysosomal cathepsins. Arch. Histol. Cytol., 2001; 64: 233-246
[PubMed]  

[77] Uchiyama Y., Shibata M., Koike M., Yoshimura K., Sasaki M.: Autophagy-physiology and pathophysiology. Histochem. Cell Biol., 2008; 129: 407-420
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[78] Wang C.W., Klionsky D.J.: The molecular mechanism of autophagy. Mol. Med., 2003; 9: 65-76
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[79] Wen Y.D., Sheng R., Zhang L.S., Han R., Zhang X., Zhang X.D., Han F., Fukunaga K., Qin Z.H.: Neuronal injury in rat model of permanent focal cerebral ischemia is associated with activation of autophagic and lysosomal pathways. Autophagy, 2008; 4: 762-769
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[80] Werner C., Engelhard K.: Pathophysiology of traumatic brain injury. Br. J. Anaesth., 2007; 99: 4-9
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[81] Wullschleger S., Loewith R., Hall M.N.: TOR signaling in growth and metabolism. Cell, 2006; 124: 471-484
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[82] Xie Z., Klionsky D.J.: Autophagosome formation: core machinery and adaptations. Nat. Cell Biol., 2007; 9: 1102-1109
[PubMed]  

[83] Xue L., Fletcher G.C., Tolkovsky A.M.: Mitochondria are selectively eliminated from eukaryotic cells after blockade of caspases during apoptosis. Curr. Biol., 2001; 11: 361-365
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[84] Yamashima T., Oikawa S.: The role of lysosomal rupture in neuronal death. Prog. Neurobiol., 2009; 89: 343-358
[PubMed]  

[85] Yang Z., Klionsky D.J.: An overview of the molecular mechanism of autophagy. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2009; 335: 1-32
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[86] Ylä-Anttila P., Vihinen H., Jokitalo E., Eskelinen E.L.: 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy, 2009; 5: 1180-1185
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[87] Yorimitsu T., Klionsky D.J.: Autophagy: molecular machinery for self-eating. Cell Death Differ., 2005; 12, Suppl. 2: 1542-1552
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[88] Young J.E., Martinez R.A., La Spada A.R.: Nutrient deprivation induces neuronal autophagy and implicates reduced insulin signaling in neuroprotective autophagy activation. J. Biol. Chem., 2009; 284: 2363-2373
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[89] Yue Z., Friedman L., Komatsu M., Tanaka K.: The cellular pathways of neuronal autophagy and their implication in neurodegenerative diseases. Biochim. Biophys. Acta, 2009; 1793: 1496-1507
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[90] Zeng X., Overmeyer J.H., Maltese W.A.: Functional specificity of the mammalian Beclin-Vps34 PI 3-kinase complex in macroautophagy versus endocytosis and lysosomal enzyme trafficking. J. Cell Sci., 2006; 119: 259-270
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[91] Zhu C., Wang X., Xu F., Bahr B.A., Shibata M., Uchiyama Y., Hagberg H., Blomgren K.: The influence of age on apoptotic and other mechanisms of cell death after cerebral hypoxia-ischemia. Cell Death Differ., 2005; 12: 162-176
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Full text