Streszczenie

U pałeczek Salmonella obserwuje się więcej niż jedną fazę antygenów rzęskowych, co jest uwa­runkowane występowaniem jednego, dwóch lub trzech genów, które niezależnie od siebie kodują białko strukturalne witki rzęski o właściwościach antygenowych. Gen fliC koduje antygen rzęsko­wy pierwszej fazy, natomiast gen fljB – drugiej fazy. Trzecia faza antygenu rzęskowego związana jest z genem umiejscowionym na plazmidzie. Ekspresja genów fliC i fljB regulowana jest mecha­nizmem inwersji sekwencji fragmentu operonu hinfljBA. Gen hin, kodujący inwertazę Hin, flan­kowany przez dwa regiony hixL i hixR, odwracany jest przez tetramer złożony z dimerów białek Hin i Fis. Proces ten włącza lub wyłącza ekspresję operonu hinfljBA. Kiedy operon podlega eks­presji (jest włączony) wytwarzane są białka strukturalne witki rzęski FljB oraz białko FljA, które jest potranskrypcyjnym inhibitorem ekspresji genu fliC. Oznacza to, że na powierzchni komórki pałeczki Salmonella mogą występować rzęski tylko pierwszej lub drugiej fazy. Czasem w wyni­ku mutacji w jednym z wymienionych genów, u bakterii dwufazowej dochodzi do unieczynnie­nia jednego z genów kodujących antygeny rzęskowe, w efekcie czego bakteria wytwarza anty­gen rzęskowy tylko jednej fazy (jednofazowe pałeczki Salmonella). W większości przypadków obserwuje się prawidłową ekspresję genu fliC. W Europie w ostatnich latach najczęściej wystę­pującą jednofazową postacią są pałeczki Salmonella o wzorze antygenowym 1, 4 [5], 12: i.

Słowa kluczowe:Salmonella • antygen rzęskowy • faza antygenów rzęskowych • szczep jednofazowy • regulacja ekspresji

Summary

In the Salmonella antigenic pattern, more than one phase of flagellar antigen is observed. The phase of flagellar antigen depends of the gene which encodes the protein building the filament of flagella. The fliC gene encodes the 1^st phase of flagellar antigen and the fljB gene encodes the 2^nd phase of flagellar antigen. The third phase of flagellar antigen is encoded by one of the genes localized on the plasmid. Expression of the fljB gene (part of the hinfljBA operon) is regulated by a mechanism of DNA fragment sequence inversion. The hin gene, which encodes Hin inver­tase, flanked by two regions – hixL and hixR – is inverted by Hin invertase together with Fis pro­tein. This process turns on or turns off of the hinfljBA operon. When this operon is turned on, FljB protein is produced (structural protein of flagella filament), and also FljA protein, which is a transcriptional repressor of the fliC gene. This means that one Salmonella cell could have only one phase flagellar antigen – 1^st or 2^nd phase. Sometimes, due to mutation in one of the mentio­ned genes, naturally diphasic Salmonella strains have the ability to produce only one phase of flagellar antigen. Mostly monophasic Salmonella with an active fliC gene are observed. In recent years such a strain, Salmonella enterica with the antigenic formula 1,4,[5],12: i: -, is one of the most often isolated strains from human cases in many European countries.

Key words:Salmonella • flagellar antigen • flagellar antigen phase • monophasic strain • regulation of expression

Wykaz skrótów:

AFLP – amplified fragments length polymorphism; MLEE – multilocus enzyme electrophoresis; LPS – lipopolisacharyd; SSR – site-specific DNA recombination; WHO GFN – Global Foodborne Infections Network.

Wstęp

Pałeczki Salmonella enterica subsp. enterica są drugim co do częstości patogenem bakteryjnym, wywołującym zakażenie przewodu pokarmowego. Zróżnicowanie antygenów soma­tycznych i rzęskowych występujących wśród przedstawicieli tego podgatunku, pozwoliło na wyodrębnienie ponad 1500 serologicznych typów o odmiennej strukturze antygenowej i zróżnicowanej chorobotwórczości dla ludzi i zwierząt [8].

Antygeny somatyczne pałeczek Salmonella

Pałeczki Salmonella enterica subsp. enterica ze względu na zróżnicowanie antygenów somatycznych zostały podzie­lone na grupy serologiczne (serogrupy), które początko­wo określano kolejnymi dużymi literami alfabetu. Jednak wraz ze wzrostem liczby odkrywanych grup serologicz­nych zrezygnowano z zapisów literowych na rzecz ozna­czeń cyfrowych – kolejnych numerów tzw. cząstkowych antygenów somatycznych charakterystycznych dla danej grupy, np. O: 4 dla grupy BO [8].

Antygen somatyczny pałeczek Salmonella, podobnie jak i u innych przedstawicieli rodziny Enterobacteriaceae, ma charakter łańcucha polisacharydowego wchodzące­go w skład lipopolisacharydu (LPS) ściany komórkowej. Z antygenem tym związana jest cecha „szorstkości” szcze­pu bakteryjnego (tzw. faza R), spowodowana utratą czę­ści lub wszystkich ogniw łańcucha polisacharydowego. Fenotypowo objawia się to zwiększoną skłonnością do wy­stąpienia w zawiesinie tych drobnoustrojów autoaglutynacji.

Antygeny rzęskowe pałeczek Salmonella

Szczepy pałeczek Salmonella należące do tej samej grupy serologicznej, tj. o wspólnym cząstkowym antygenie so­matycznym są różnicowane na poszczególne typy serolo­giczne ze względu na występowanie określonych antyge­nów rzęskowych. Antygeny te są białkami strukturalnymi włókna (filamentu) rzęski [8,11].

Analizując strukturę antygenową pałeczek Salmonella wy­różnia się trzy fazy antygenów rzęskowych, za wytwarzanie których odpowiedzialne są geny umiejscowione w różnych miejscach genomu bakteryjnego. Jednak nie wszystkie pa­łeczki Salmonella wykazują trój-, czy bardziej powszechną dwufazowość antygenów rzęskowych. Przykładem szczepu, który wykazuje obecność trzeciej fazy antygenów rzęsko­wych jest Salmonella Typhi. Wśród przedstawicieli tego typu serologicznego notuje się występowanie różnych wa­riantów antygenów rzęskowych, w tym obecność antygenu trzeciej fazy oznaczonego symbolem „z66″ [1]. Na podsta­wie wyników badań genomu pałeczek Salmonella meto­dą MLEE, jak i AFLPwykazano, iż cecha wielofazowości pojawiła się jako końcowy etap różnicowania się w obrę­bie gatunku (ryc. 1) [12]. Jednak nawet wśród przedstawicieli pod­gatunku I (S. enterica subsp. enterica), który jak wynika z analizy rozwoju filogenetycznego rodzaju Salmonella po­winien grupować pałeczki, u których wystepują antygeny rzęskowe dwóch lub trzech faz, a także pałeczki wykazu­jące stałą cechę jednofazowości – brak antygenów rzęsko­wych jednej z faz [8].

Ryc. 1. Drzewo filogenetyczne pałeczek Salmonella, obrazujące podział na pałeczki jedno i wielofazowe [12]

Geny kodujące antygeny rzęskowe

Geny kodujące białka strukturalne włókna rzęski, mające właściwości antygenowe, znajdują się w dwóch lub trzech miejscach genomu komórki. Dwa pierwsze – kodujące antygeny rzęskowe I i II fazy, zlokalizowane są w obrę­bie chromosomu. Natomiast białko najrzadziej występu­jącego antygenu rzęskowego III fazy kodowane jest przez gen występujący w obrębie DNA plazmidowego, np. flpA u trójfazowych wariantów S. Rubislaw, czy fljB^z66 niektó­rych u S. Typhi [1,18]. Geny kodujące rzęski III fazy pod­legają regulacji ekspresji niezależnej od regulacji ekspre­sji genów antygenów rzęskowych I i II fazy. W przypadku szczepów S. Typhi o wzorze antygenowym 9,12[Vi]: -: -: z₆₆, za występowanie dodatkowego nietypowego antygenu od­powiedzialny jest gen fljB^z6 umiejscowiony na plazmidzie. Gen ten jest odpowiednikiem genu fljB, kodującego biał­ko strukturalne rzęsek II fazy, których brak, podobnie jak i genu u typowych przedstawicieli tego serotypu o wzorze antygenowym 9,12[Vi]: d: – [1,8].

Geny kodujące białka strukturalne antygenów rzęskowych I i II fazy znajdują się na chromosomie bakteryjnym w ob­rębie operonu fli – gen fliC (I faza) w miejscu 40′ oraz operonu flj – gen fljB (II faza) – w miejscu 56′ (ryc. 2, 3). Ekspresja obu genów podlega koregulacji, przy nadrzędnej roli operonu flj. W skład tego operonu wchodzą trzy geny: hin – kodujący białko biorące udział w regulacji ekspre­sji operonu hinfljBA, gen fljB oraz fljA. Ten ostatni koduje białko, które jest inhibitorem transkrypcji genu fliC [17].

Ryc. 2. Budowa operonu hinfljBA, z zaznaczeniem lewego (hixL) i prawego (^hixR) miejsca odwróconych powtórzeń oraz miejscem stymulującym rekombinację (recombinational enhancer – RE), do którego wiąże się białko Fis [3,17]

Ryc. 3. Przebieg procesu inwersji sekwencji regionu zawartego pomiędzy hixL i hixR. (A) do rozpoczęcia procesu konieczne jest DNA w formie super zwiniętej. (B) do regionów hixLR przyłączają się białka Hin, do regionu RE białko Fis. (C) białko HU inicjuje zmianę konformacji przestrzennej DNA, z udziałem białek Hin i Fis. (D) w wyniku oddziaływania inwertaz Hin odwróceniu ulega sekwencja pomiędzy regionami

Wspomniane uprzednio pałeczki należące do typu sero­logicznego S. Typhi, jak i wielu innych, np. S. Reading, S. Bovismorbificans, S. Panama charakteryzują się moż­liwością występowania antygenu rzęskowego w fazie R (szorstki antygen rzęskowy). Zbieżność nazwy z fenoty­pem R dla antygenu somatycznego wynika z podobnego mechanizmu powstawania zjawiska. Polega ono na dele­cji, u niektórych szczepów, fragmentu genu kodującego dany antygen rzęskowy, co objawia się brakiem wybra­nych epitopów wchodzących w skład kompleksu antyge­nowego rzęski. W sekwencji genu fliC oraz fljB wyróż­nia się początkowy obszar konserwatywny. W przypadku wspomnianych pałeczek S. Typhi zjawisko to polega na delecji fragmentu genu fliC o wielkości 261pz, co wywo­łuje zmianą fenotypu H: d na H: j [7]. Natomiast w przy­padku niektórych szczepów należących do innych typów serologicznych, u których może występować „szorstkość” antygenu rzęskowego, obserwuje się dodatni wynik reak­cji aglutynacji ze wszystkimi surowicami dla kompleksu antygenów rzęskowych 1, np. surowicami H: 1,2, H: 1,5 itd. Brak jest jednak aglutynacji w surowicach dla antyge­nów cząstkowych H: 2, H: 5 itd. Również i w tym przy­padku zjawisko to związane jest z delecją w obrębie genu kodującego antygen rzęskowy, lecz tym razem – II fazy – genu fljB. Antygen rzęskowy takich szczepów opisuje się symbolem „R1″ [8].

Regulacja ekspresji operonu hinfljBA

Ekspresja operonu hinfljBA podlega kontroli na zasadzie zmiany orientacji sekwencji genu hin poprzez mechanizm swoistej miejscowo rekombinacji DNA – SSR. Zjawisko to polega na rozkręceniu superkolistego DNA i ponownym jego skręceniu w ten sposób, iż tworzą się pętle, powodu­jące wzajemne zbliżenie się, umiejscowionych w obrębie operonu hinfljBA, dwóch 14-nukleotydowych regionów hixL oraz hixR zawierających odwrócone powtórzenia (ryc. 2). To zaś doprowadza do rekombinacji tych regionów, cze­go następstwem jest zmiana orientacji sekwencji zawartej między regionami hixL i hixR.

W opisanym wyżej procesie (ryc. 3), bierze udział pro­dukt genu hin – białko Hin, będące swoistą miejscowo rekombinazą serynową (inwertazą) wiążącą się w posta­ci dimeru z DNA w regionach hixLR genu hin. Białko to wytwarzane jest na stałym konstytutywnym poziomie, co umożliwia zmianę orientacji genu hin, gdy znajduje się w orientacji niekodującej. Innym istotnym czynnikiem biorącym udział w procesie inwersji jest białko Fis – swo­iście wiążące się z 65-nukleotydowym regionem stymu­lującym rekombinację (recombinational enhancer – RE), który znajduje się w odległości około 100 nukleotydów od regionu hixL. Utworzenie kompleksu białek złożone­go z tetrameru Hin, dimeru Fis doprowadza do przecięcia nici DNA w obrębie regionów hixLR i rekombinacji po­przez skręcenia powstałej helisy typu E. W wyniku tego procesu zmienia się orientacja łańcucha DNA zawartego między regionem hixL i hixR, co doprowadza do włącze­nia lub wyłączenia genu hin [3].

„Włączony” gen hin umożliwia ekspresję znajdujących się w tej samej ramce odczytu dwóch kolejnych genów – fljB i fljA. Efektem tego jest wytwarzanie białka antygenu rzę­skowego II fazy oraz białka FljA, które jest czynnikiem wybiórczo hamującym ekspresję genu fliC. Proces ten pole­ga na łączeniu się białka FljA z mRNA genu fliC, co unie­możliwia jego translację i doprowadza do jego degradacji. Następuje zablokowanie wytwarzania białka FliC – budu­jącego filament rzęski I fazy [11,23]. Powstające w tym samym czasie białko Hin przy następnym cyklu replika­cji doprowadza do zmiany orientacji sekwencji genu hin i jego wyłączenia, co z kolei uniemożliwia ekspresję po­zostałych genów, co skutkuje wytwarzaniem białka two­rzącego włókno rzęski I fazy [3].

Sekwencje odwrotnie powtórzone (hixLR) znajdują się na zewnątrz od regionu kodującego białko, aczkolwiek wy­kazano, iż miejsce przyczepu rybosomów genu hin nakła­da się z sekwencją hixL [17]. Mutacja w obrębie regionów hixLR nie wpływa na ekspresję genu fljB, jeśli sekwencja genu hin znajduje się w orientacji, gdy gen jest „włączo­ny”. Badania nad sekwencją regionu podlegającego zmianie orientacji wykazały, iż zarówno miejsce wiązania ryboso­mów, jak i kodon start genu fljB znajduje się poza regio­nem oflankowanym przez regiony hixL i hixR [17]. Produkt ekspresji genu hin jest białkiem promotorowym dla genu fljB, które jak już wspomniano, jest białkiem struktural­nym włókna rzęski.

Występowanie u pałeczek Salmonella antygenów rzęskowych wielu faz

Jak wynika z drzewa filogenetycznego pałeczek Salmonella (ryc. 1), zdolność do wytwarzania antygenów rzęsko­wych drugiej fazy została nabyta późno w toku rozwo­ju filogenetycznego rodzaju Salmonella. Zjawisko to wią­że się prawdopodobnie z rozszerzeniem przez pałeczki Salmonella zakresu gospodarzy. Nowa cecha – wielo­fazowość antygenów rzęskowych, umożliwiła adaptację bakteriom do zwierząt stałocieplnych [12,16]. U zwierząt zmiennocieplnych pałeczki Salmonella stanowią natural­ny składnik flory jelitowej. U zwierząt stałocieplnych pa­łeczki Salmonella w zależności od serotypu i gospodarza mogą być bakteriami chorobotwórczymi lub niechorobo­twórczymi. Mechanizmem obrony gospodarza przed zaka­żeniem jest wytwarzanie przeciwciał skierowanych prze­ciwko antygenom drobnoustroju, np. antygenom rzęsek, które są istotnym czynnikiem chorobotwórczości pałeczek Salmonella. Odpowiedzią pałeczek Salmonella było wy­kształcenie cechy „ucieczki antygenowej”, czyli zjawisko zmienności faz antygenów rzęskowych [12].

Według teorii McQuinstona i wsp. [12], dotyczącej dwufa­zowości pałeczek Salmonella, wykształcenie w toku ewolu­cji zdolności do wytwarzania rzęsek drugiej fazy pozwoliło tym drobnoustrojom na zajęcie nowej niszy ekologicz­nej w postaci nowych gospodarzy. Zdaniem tych autorów obecność w szczepie Salmonella antygenów rzęskowych tylko jednej fazy może ograniczać zdolność do wywoły­wania zakażenia niektórymi pałeczkami Salmonella tyl­ko do ściśle określonych gospodarzy. Na przykład mogą to być pałeczki S. Typhi – chorobotwórcze dla ludzi, czy pałeczki S. Gallinarum – chorobotwórcze dla kur [12]. Jednak zdaniem autora niniejszej pracy, teoria ta nie znaj­duje pełnego uzasadnienia. Dowodem na to jest wiele ty­pów serologicznych pałeczek Salmonella, których przed­stawiciele są naturalnie jednofazowi, tak jak S. Enteritidis (1,9,12: g,m: -), czy S. Dublin (1,9,12[Vi]: g,p: -), a także wiele innych szczepów izolowanych zarówno od człowie­ka jak i wielu gatunków zwierząt. Innym przykładem są pałeczki S. Paratyphi B, niezużywające do swego wzro­stu winianu sodowo-potasowego (fenotyp winian -), u któ­rych stwierdza się obecność dwóch faz antygenów rzęsko­wych (1,4,[5],12: b: 1,5), a których chorobotwórczość jest ściśle ograniczona do ludzi, podczas gdy przedstawiciele tego serotypu o fenotypie winian (+) – S. Paratyphi B var. Java są izolowani od ludzi, jak i od przedstawicieli wielu gatunków zwierząt [6].

McQuinston i wsp. wykazują również, iż wykształcenie ce­chy wielofazowości antygenów rzęskowych przez pałeczki Salmonella może mieć związek z obroną tych drobnoustro­jów przed ich naturalnymi wrogami, jakimi są niektóre pier­wotniaki występujące w przewodzie pokarmowym zwierząt. Zmienność antygenowa oraz zmienna ruchliwość ma istot­ne znaczenie w obronie pałeczek Salmonella przed pier­wotniakami, co wykazali Wildschutte i wsp. [22]. Baker i wsp. wykazali również, iż wykształcenie antygenu H: z66 zamiast H: d u pałeczek Salmonella Typhi może się raczej wiązać z oddziaływaniem pierwotniaków na te bakterie, niż układu immunologicznego człowieka [1].

Jednofazowość pałeczek Salmonella

Wśród pałeczek Salmonella z podgatunku I, II, IIIb i VI obserwuje się drobnoustroje, u których stwierdza się obec­ność antygenów rzęskowych dwóch lub nawet trzech faz, jak i bakterie, u których naturalnie występują antygeny tyl­ko jednej fazy kodowane przez gen fliC [8]. W codziennej praktyce laboratoryjnej spotyka się również szczepy pa­łeczek Salmonella, u których nie można stwierdzić jednej z faz antygenów rzęskowych, mimo że należą do serotypu naturalnie dwufazowego. Częściej obserwuje się sytuację, gdy szczep wykazuje brak antygenu II fazy lub słabą re­akcję aglutynacji w surowicy diagnostycznej dla tego an­tygenu. Zdecydowanie rzadziej obserwuje się analogicz­ną sytuację w odniesieniu do antygenu I fazy. Zjawisko to spowodowane jest różnicami w mechanizmach regulacji ekspresji genów kodujących antygeny obu faz. Regulacja ekspresji operonu hinfljBA jest procesem zależnym od wie­lu innych czynników, co sprawia iż łatwiej może dojść do zaburzenia prawidłowego funkcjonowania tego procesu wskutek mutacji w jednym z uwikłanych genów. Ponadto nawet całkowite unieczynnienie operonu nie będzie mia­ło takiego wpływu na funkcjonowanie komórki, jak mia­łoby w przypadku zmian w obrębie operonu fli. Ten bo­wiem, poza genem fliC, zawiera geny kodujące białka innych elementów strukturalnych rzęski. Mutacje w tych genach mogą doprowadzić do całkowitej blokady wytwa­rzania rzęsek, co zdecydowanie wpłynie na chorobotwór­czość bakterii [11]. Można więc postawić tezę, jak zrobili to McQuinston i wsp., iż w genomie pałeczek Salmonella, geny kodujące białko strukturalne II fazy włókna rzęski znalazły się jako „koło zapasowe” właściwego mechani­zmu kodowania strukturalnego białka I fazy rzęsek [12].

Przykładem jednofazowych wariantów pałeczek Salmonella, należących do naturalnie dwufazowych serotypów, mogą być pałeczki Salmonella o wzorze antygenowym 9,12: l,v: – zaobserwowane na terenie Bułgarii, Danii i USA, opisane przez Petrova i wsp. [15]. Autorzy wraz z badaczami z wy­mienionych krajów, przeprowadzili analizy sekwencji genu fljB tych szczepów, a także inne badania porównawcze ge­nomu. Pałeczki Salmonella o wzorze antygenowym 9,12: l,v: – mogą należeć do 4 różnych typów serologicznych: S. Mendoza (9,12: l,v: 1,2), S. Panama (9,12: l,v: 1,5), S. Kapemba (9,12: l,v: 1,7), S. Zaiman (9,12: l,v: e,n,x) oraz S. Goettingen (9,12: l,v: e,n,z15) [8]. Badania całkowite­go DNA genomowego metodą PFGE nie dały jednoznacz­nej odpowiedzi na pytanie do jakiego typu serologicznego należą badane jednofazowe pałeczki Salmonella. Dopiero analiza sekwencji genu fljB wykazała, iż szczepy te mają gen, którego sekwencja jest w 100% zgodna z opublikowa­ną uprzednio sekwencją genu fljB, kodującego kompleks antygenowy H: e,n,z15 [13]. Pozwoliło to na stwierdze­nie, iż szczepy te są jednofazowym wariantem pałeczek Salmonella Goettingen [15].

Analizując częstość występowania serotypów pałeczek Salmonella na terenie Europy, można stwierdzić, iż naj­częściej występującym jednofazowym wariantem pałe­czek Salmonella są te o wzorze antygenowym 1,4,[5],12: i: -. Zgodnie z danymi publikowanymi przez WHO GFN, pałeczki Salmonella o takim wzorze antygenowym zna­lazły się wśród 10 najczęściej występujących typów se­rologicznych pałeczek Salmonella izolowanych od ludzi w 2010 r. [21]. Pałeczki Salmonella o wzorze antygeno­wym 1,4,[5],12: i: – stały się najczęściej izolowanym od lu­dzi typem serologicznym w Luksemburgu [14].

Pałeczki Salmonella o wzorze antygenowym 1,4,[5],12: i: – jako szczep epidemiczny na terenie Europy zostały po raz pierwszy opisane przez Echeitę i wsp. [4]. W wy­niku analizy sekwencji operonu hinfljB, a zwłaszcza se­kwencji insercyjnej IS200 umiejscowionej w przestrzeni międzygenowej genów fljB i fljA stwierdzono, iż szcze­py te są jednofazowym wariantem pałeczek Salmonella Typhimurium [5]. Badania przeprowadzone przez Soyera i wsp. z użyciem PFGE i MLST wykazały, iż szczepy pa­łeczek Salmonella o takim wzorze antygenowym, izolowa­ne na terenie USA i Europy są niejednorodne pod wzglę­dem genetycznym [19]. Podobne wyniki uzyskali Hopkins i wsp., badając szczepy pałeczek Salmonella o wzorze an­tygenowym 1,4,[5],12: i: – izolowane od zwierząt i ludzi na terenie Europy [10]. Często szczepy te są nośnikami wyspy genetycznej, odpowiedzialnej za zwiększoną oporność na leki przeciwbakteryjne [9,10,20].

Obecnie pałeczki Salmonella o wzorze antygeno­wym 1,4,[5],12: i: – nazywane są czasem „Salmonella Typhimurium-like”, ze względu na brak możliwości odróż­nienia ich od typowych, dwufazowych pałeczek Salmonella Typhimurium, a także innych typów serologicznych pałe­czek Salmonella z grupy BO, z antygenem H: i w pierw­szej fazie. Przepisy prawa europejskiego nakazują trak­towanie takich szczepów jako Salmonella Typhimurium (Rozporządzenie Komisji (UE) nr 517/2011).

Laboratoryjna identyfikacja antygenów rzęskowych

Oznaczając antygeny rzęskowe dwufazowego szczepu metodą aglutynacji szkiełkowej, z użyciem surowic mo­nowalentnych, w populacji bakterii stanowiących poje­dynczą kolonię, zwykle stwierdza się z tym samym na­sileniem aglutynację antygenów obu faz. Jednak opisane wyżej mechanizmy regulujące ekspresję antygenów rzę­skowych I i II fazy wykazują, iż na jednej komórce bakte­ryjnej występują antygeny rzęskowe tylko jednej fazy, tj. takie, których białko kodowane jest przez gen fliC lub gen fljB [2,11]. Stwierdzenie występowania w populacji bakterii antygenów rzęskowych obu faz jednocześnie, jest wynikiem obecności komórek bakteryjnych, u których aktywny jest gen kodujący antygen I fazy i komórek z aktywnym genem kodującym antygen II fazy, mniej więcej w stosunku 1:1.

Analizując zróżnicowanie antygenów rzęskowych pałeczek Salmonella można zauważyć, iż w wielu przypadkach dla jednej fazy stwierdza się występowanie kompleksu anty­genów, np. kompleks G, do którego zalicza się antygeny G zawierające epitop „g”, takie jak: „g,m”, „f,g”, „g,z₅₁” lub kompleks „1″, do którego zalicza się antygeny „1,2″, czy „1,5″. Wiadomo jednak, że mająca właściwości antygeno­we flagellina, jest polimerem pojedynczego białka kodowa­nego przez jeden konkretny gen [11]. Oznacza to, iż wystę­powanie kompleksów odpowiada obecności kilku epitopów w obrębie jednego antygenu, co ma bezpośrednie uzasad­nienie w sekwencji genów kodujących antygeny rzęskowe. W sekwencji genu fliC, jak i fljB obserwuje się występo­wanie niezmiennej części konserwatywnej, odpowiadającej głównemu epitopowi np. „g”, oraz części zmiennej odpo­wiadającej pozostałym epitopom z danego kompleksu [13].

Wiedza na temat opisanego wyżej mechanizmu regulacji ekspresji genów kodujących antygeny rzęskowe, wykorzy­stywana jest w procedurze inwersji faz, kiedy to poprzez presję środowiska (obecność surowicy przeciw konkret­nemu antygenowi rzęskowemu) selekcjonuje się popula­cję bakterii tak, aby pozostały tylko te bakterie (lub ich znacząca przewaga), u których eksprymowany jest tylko gen jednej pożądanej fazy. W celu uzyskania inwersji faz rutynowo stosowany jest posiew na podłoże Garda z do­datkiem surowicy przeciwko antygenom, których ekspre­sję chce się zahamować. Istnieją dwie odmiany tej meto­dy. Pierwsza z nich polega na posiewie szczepu na podłoże Garda na płytce o średnicy 5 cm i posiewie szczepu w cen­tralnej części podłoża. Po rozejściu się szczepu na całą płyt­kę, pobiera się materiał z jej obrzeża. Powinien on zawie­rać bakterie, u których ekspresja danego antygenu uległa zahamowaniu. W przekonaniu autora, skuteczniejsza jest druga odmiana metody, w której podłoże Garda z surowi­cą dla hamowanego antygenu wlewa się do probówki bak­teriologicznej z zanurzoną rurką Craiga. Szczep do inwer­sji posiewa się do środka rurki, a po przejściu na zewnątrz rurki pobrany materiał będzie zawierać wyselekcjonowa­ną populację bakterii z ograniczoną ekspresją lub brakiem ekspresji jednego z antygenów rzęskowych, przeciwko któremu stosowana była surowica. Doświadczenie autora wykazuje, iż proces ten trzeba czasami powtarzać wielo­krotnie, a do kolejnych pasaży dodawać co raz to większą objętość surowicy. Jednocześnie należy podkreślić, iż nie­możliwy jest proces zahamowania ekspresji pojedyncze­go antygenu znajdującego się w kompleksie z innym anty­genem. Nie jest możliwe zahamowanie ekspresji antygenu H: 1 tak, aby uzyskać ekspresję antygenu H: 5. Związane jest to z tym, iż oba antygeny są kodowanane przez jeden i ten sam gen. Zahamowanie ekspresji jednego, zahamuje również ekspresję drugiego.

Podsumowanie

Przedstawiona wiedza na temat molekularnych aspektów biosyntezy antygenów rzęskowych pałeczek Salmonella ma bezpośredni wpływ na jakość pracy laboratoryjnej wy­konywanej celem określenia przynależności serologicznej badanego szczepu. Zrozumienie mechanizmów regulacji biosyntezy antygenu rzęskowego pozwala na dobór wła­ściwej metody badania (np. inwersja faz na podłożu z suro­wicą dla konkretnego antygenu) oraz prawidłową interpre­tację uzyskanych wyników (szczepy jednofazowe, szczepy z szorstkim antygenem rzęskowym, czy też szczepy z in­nym antygenem, niż I lub II fazy).

PIŚMIENNICTWO

[1] Baker S., Hardy J., Sanderson K.E., Quail M., Goodhead I., Kingsley R.A., Parkhill J., Stocker B., Dougan G.: A novel linear plasmid mediates flagellar variation in Salmonella Typhi. PLoS Pathog., 2007; 3: e59
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[2] Bonifield H.R., Hughes K.T.: Flagellar phase variation in Salmonella enterica is mediated by a posttranscriptional control mechanism. J. Bacteriol., 2003; 185: 3567-3574
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Dhar G., Heiss J.K., Johnson R.C.: Mechanical constraints on Hin subunit rotation imposed by the Fis/enhancer system and DNA supercoiling during site-specific recombination. Mol. Cell, 2009; 34: 746-759
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[4] Echeita M.A., Aladuena A., Cruchaga S., Usera M.A.: Emergence and spread of an atypical Salmonella enterica subsp. enterica serotype 4,5,12:i:2 strain in Spain. J. Clin. Microbiol., 1999; 37: 3425
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[5] Echeita M.A., Herrera S., Usera M.A.: Atypical, fljB-negative Salmonella enterica subsp. enterica strain of serovar 4,5,12:i:- appears to be a monophasic variant of serovar Typhimurium. J. Clin. Microbiol., 2001; 39: 2981-2983
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[6] European Food Safety Authority; European Centre for Disease Prevention and Control.: The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2009. W: EFSA J. EFSA, p. 22-107
http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/2090.htm

[7] Frankel G., Newton S.M., Schoolnik G.K., Stocker B.A.: Intragenic recombination in a flagellin gene: characterization of the H1-j gene of Salmonella typhi. EMBO J., 1989; 8: 3149-3152
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[8] Grimont P.A., Weill F.X.: Antigenic formulae of the Salmonella serovars. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Institut Pasteur, Paris, France. 2007

[9] Guerra B., Soto S.M., Argüelles J.M., Mendoza M.C.: Multidrug resistance is mediated by large plasmids carrying a class 1 integron in the emergent Salmonella enterica serotype [4,5,12:i:-]. Antimicrob. Agents Chemother., 2001; 45: 1305-1308
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[10] Hopkins K.L., Kirchner M., Guerra B., Granier S.A., Lucarelli C., Porrero M.C., Jakubczak A., Threlfall E.J., Mevius D.J.: Multiresistant Salmonella enterica serovar 4,[5],12:i:- in Europe: a new pandemic strain? Euro Surveill., 2010; 15: 19580
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[11] Macnab R.M.: Flagella and Motility. W: Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, red.: Neidhardt F.C. Washington DC: ASM Press, 1996, p. 123-145

[12] McQuiston J.R., Fields P.I., Tauxe R.V., Logsdon J.M. Jr.: Do Salmonella carry spare tyres? Trends Microbiol., 2008; 16: 142-148
[PubMed]  

[13] McQuiston J.R., Parrenas R., Ortiz-Rivera M., Gheesling L., Brenner F., Fields P.I.: Sequencing and comparative analysis of flagellin genes fliC, fljB, and flpA from Salmonella. J. Clin. Microbiol., 2004; 42: 1923-1932
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[14] Mossong J., Marques P., Ragimbeau C., Huberty-Krau P., Losch S., Meyer G., Moris G., Strottner C., Rabsch W., Schneider F.: Outbreaks of monophasic Salmonella enterica serovar 4,[5],12:i:- in Luxembourg, 2006. Euro Surveill., 2007; 12: E11-E12
[PubMed]  

[15] Petrov P., Hendriksen R.S., Kantardjiev T., Asseva G., Sorensen G., Fields P., Mikoleit M., Whichard J., McQuiston J.R., Torpdahl M., Aarestrup F.M., Angulo F.J.: Occurrence and characterization of Salmonella enterica subspecies enterica serovar 9,12:l,v:- strains from Bulgaria, Denmark, and the United States. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2009; 28: 473-479
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[16] Porwollik S., Wong R.M., McClelland M.: Evolutionary genomics of Salmonella: gene acquisitions revealed by microarray analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002; 99: 8956-8961
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[17] Simon M., Zieg J., Silverman M., Mandel G., Doolittle R.: Phase variation: evolution of a controlling element. Science, 1980; 209: 1370-1374
[PubMed]  

[18] Smith N.H., Selander R.K.: Molecular genetic basis for complex flagellar antigen expression in a triphasic serovar of Salmonella. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991; 88: 956-960
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[19] Soyer Y., Moreno Switt A., Davis M.A., Maurer J., McDonough P.L., Schoonmaker-Bopp D.J., Dumas N.B., Root T., Warnick L.D., Gröhn Y.T., Wiedmann M.: Salmonella enterica serotype 4,5,12:i:-, an emerging Salmonella serotype that represents multiple distinct clones. J. Clin. Microbiol., 2009; 47: 3546-3556
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[20] Trüpschuch S., Laverde Gomez J.A., Ediberidze I., Flieger A., Rabsch W.: Characterisation of multidrug-resistant Salmonella Typhimurium 4,[5],12:i:- DT193 strains carrying a novel genomic island adjacent to the thrW tRNA locus. Int. J. Med. Microbiol., 2010; 300: 279-288
[PubMed]  

[21] WHO Global Foodborne Infections Network: GFN Country Databank (15.05.2012)
http://thor.dfvf.dk/portal/page?_pageid=53,1&_dad=portal&_schema=PORTAL

[22] Wildschutte H., Wolfe D.M., Tamewitz A., Lawrence J.G.: Protozoan predation, diversifying selection, and the evolution of antigenic diversity in Salmonella. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004; 101: 10644-10649
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[23] Yamamoto S., Kutsukake K.: FljA-mediated posttranscriptional control of phase 1 flagellin expression in flagellar phase variation of Salmonella enterica serovar Typhimurium. J. Bacteriol., 2006; 188: 958-967
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

Autor deklaruje brak potencjalnych konfliktów interesów.

Full text