Streszczenie

Dehydorogenazę alkoholową (ADH) klasy III stanowi izoenzym zbudowany z dwóch podjednostek c

, kodowany przez gen ADH5, umiejscowiony w tkankach wszystkich narządów. Izoenzym ten ma dużą zdolność utleniania długołańcuchowych alkoholi alifatycznych, przy jednocześnie bardzo małym powinowactwie do etanolu. Homologiczna sekwencja aminokwasowa i takie same właściwości kinetyczne wskazują, że klasa III dehydrogenazy alkoholowej i dehydrogenaza formal dehydowa są identycznymi enzymami. ADH III odgrywa ważną rolę w metabolizmie aldehydu mrówkowego w organizmie człowieka.

Słowa kluczowe:izoenzym klasy III dehydrogenazy alkoholowej • aldehyd mrówkowy

Summary

Class III alcohol dehydrogenase is composed of two c

 subunits, encoded by the ADH5 gene and existing in all tissues examined. It possesses a great ability to metabolize long-chain alcohols, while its capacity to oxidize ethanol is very limited. The amino-acid sequence homology and identical structural and kinetic properties indicate that class III alcohol dehydrogenase and formaldehyde dehydrogenase are identical enzymes. ADH III plays a significant role in the metabolism of formaldehyde in the human body.

Key words:class III alcohol dehydrogenase • formaldehyde

Dehydrogenaza alkoholowa (ADH, oksydoreduktaza, alkohol: NAD⁺, EC 1.1.1.1.) jest dimerem zbudowanym z dwóch podjednostek różnego typu (a, b, g, p, c

 oraz µ), z których każda składa się z 373 reszt aminokwasowych. W skład cząsteczki ADH wchodzi także jon cynku, pełniący rolę kofaktora, w związku z czym dehydrogenaza alkoholowa jest zaliczana do metaloenzymów [14,23]. Dotychczas stwierdzono istnienie kilku izoenzymów dehydrogenazy alkoholowej podzielonych na sześć głównych klas (u człowieka wykryto pięć klas), różniących się między sobą sekwencją aminokwasów w cząsteczce, ruchliwością elektroforetyczną, właściwościami kinetycznymi i immunologicznymi, swoistością substratową oraz wrażliwością na inhibitory [1,21]. U ssaków podjednostki poszczególnych izoenzymów są kodowane przez różne geny umiejscowione na długim ramieniu chromosomu 4 [2]. Loci genowe ADH1, ADH2 i ADH3 kodują odpowiednio podjednostki a, b

 i g

, które łącząc się tworzą dimeryczne cząsteczki izoenzymów klasy I dehydrogenazy alkoholowej [14]. Szczegółowe badania wykazały, że geny ADH2 i ADH3 są polimorficzne, dzięki czemu kodują różne podjednostki b

 (b

1, b

2 i b

3) oraz g

 (g

1 i g

2) [16,20]. Izoenzymy klasy I ADH występują przede wszystkim w wątrobie, ale są również obecne w przewodzie pokarmowym, płucach i nerkach [18]. Klasa II dehydrogenazy alkoholowej umiejscowiona jedynie w wątrobie, jest utworzona przez izoenzymy złożone z podjednostek p

, kodowane przez gen ADH4 [22]. Izoenzym ADH III zbudowany z podjednostek c

 kodowanych przez gen ADH5, występuje we wszystkich narządach [1,4]. Kolejną klasę izoenzymów dehydrogenazy alkoholowej (ADH IV), odpowiadającą za metabolizm etanolu w żołądku zidentyfikowano i opisano jednocześnie przez Yin i wsp. [27] oraz Moreno i Paresa [15]. Izoenzym ten kodowany przez gen ADH7 składa się z dwóch podjednostek µ zwanych też s

. W wątrobie i w nabłonku błony śluzowej żołądka stwierdzono obecność izoenzymu klasy V ADH, który wykazuje podobieństwo rzędu 67% do klasy VI dehydrogenazy alkoholowej. ADH VI wykryto u szczurów, przede wszystkim w wątrobie i w minimalnej ilości w nerkach, ale dotychczas nie znaleziono u człowieka [7].

Dehydrogenaza alkoholowa stanowi główny enzym uczestniczący w metabolizmie alkoholu etylowego, katalizując odwracalną reakcję utleniania etanolu do aldehydu octowego. Jednak nie wszystkie izoenzymy ADH w jednakowym stopniu biorą udział w przemianach alkoholu etylowego. Dominującą rolę w tym procesie odgrywają izoenzymy klasy I i II w wątrobie oraz klasy IV w żołądku [26]. Udział klasy V i VI dehydrogenazy alkoholowej w metabolizmie alkoholu etylowego pozostaje nadal niewyjaśniony [19]. Natomiast klasa III ADH – ze względu na swoje właściwości – właściwie nie uczestniczy w oksydacji etanolu w organizmie człowieka, ale odgrywa istotną rolę w wielu przemianach innych związków [5].

CHARAKTERYSTYKA IZOENZYMU KLASY III ADH

Klasę III izoenzymów dehydrogenazy alkoholowej stanowią dimery podjednostek typu c

, z których każdy ma masę cząsteczkową około 43 kDa [25]. Gen ADH5 kodujący ADH III jest zbudowany tak jak inne geny ADH i zawiera 9 eksonów rozdzielonych przez 8 intronów, których pozycje są takie same jak w genach ADH1-ADH7. Analiza składu aminokwasowego łańcuchów polipetydowych ADH III pozwoliła stwierdzić, że są one utworzone z 373 aminokwasów. Izoenzym ten zawiera także 4 mole Zn²⁺/mol białka. Istotnymi pozycjami w strukturze łańcucha klasy III są Cys-44 i His-66, wiążące katalityczny jon cynku. W procesie tym biorą także udział Cys-173, Glu-67 oraz cząsteczka wody [17]. Podjednostki c 

mają o dwie cząsteczki tryptofanu więcej niż podjednostki tworzące inne izoenzymy. Następstwem tego jest zwiększona absorbancja przy długości fali 280 nm [12]. Ponadto większa ilość aminokwasów o charakterze kwaśnym warunkuje odmienną ruchliwość w polu elektromagnetycznym w stosunku do pozostałych izoenzymów. Różnice w budowie łańcuchów wiążą się także z częstością występowania centrum katalitycznego i miejsc wiązania koenzymu, którym jest jon cynku. Analiza sekwencji aminokwasowej monomeru c

 ADH III i sekwencji podjednostek występujących w innych klasach ludzkiej ADH wskazuje na 60% podobieństwo. Kluczowe w strukturze dehydrogenaz alkoholowych miejsca wiążące jony cynku oraz obszar wiązania koenzymu są takie same lub tylko częściowo zmienione, mimo różnic w sekwencjach aminokwasowych poszczególnych typów podjednostek tworzących dimeryczną cząsteczkę enzymu [12]. Stosując technikę elektroforetyczną rozdzielono klasę III na dwie postaci anodowe c

1 i c

2. Dalsze badania wykazały, że postać c

2 o mniejszej aktywności, ma taką samą strukturę pierwszorzędową jak postać c

1 (bardziej aktywna), ale jest mniejsza i wędruje szybciej w polu elektromagnetycznym. Z kolei stosując techniki ogniskowania izoelektrycznego wyizolowano trzy postaci różniące się punktem izoelektrycznym. Dwie postaci anodowe c

1 i c

2 mają pI odpowiednio w pH 6,3–6,4 oraz 5,9–6,0. Natomiast postać katodowa c

3 ma punkt izoelektryczny w pH 5,6 [12]. Najwyższą aktywność enzymatyczną wykazuje najbardziej zasadowa główna postać c

1. Aktywność ta jest ponad 3 razy wyższa w porównaniu z pozostałymi postaciami. Prawdopodobnie słabsza postać c

2 powstała w wyniku postranslacyjnej modyfikacji silniejszej podjednostki c

1, co zostało potwierdzone badaniami genetycznymi [21].

ADH klasy III początkowo znajdowano tylko w ludzkim mózgu i jądrach. Obecnie wiadomo, że występuje także w wątrobie i wielu innych narządach człowieka [9,10].

WŁAŚCIWOŚCI KATALITYCZNE ADH III

Właściwości katalityczne izoenzymu klasy III dehydrogenazy alkoholowej przedstawia tabela 1. W tabeli podano podstawowe cechy opisujące aktywność enzymu, takie jak stała katalityczna (k_cat), stała Michaelisa (K_m) wobec NAD i etanolu, stała inhibicji (K_i) dla swoistego inhibitora enzymu – 4-metylopirazolu oraz optymalna wartość pH [11].

Tabela 1. Właściwości katalityczne ADH klasy III [11]

Analizując dane można stwierdzić, że ADH III ma niewielką wartość stałej katalitycznej i bardzo dużą wartość stałej Michalisa wobec etanolu. Izoenzym ten cechuje się więc bardzo małym powinowactwem do alkoholu etylowego i w związku z tym etanol właściwie nie jest utleniany in vivo przez ADH III. Podobnie jak większość izoenzymów dehydrogenazy alkoholowej, klasa III wykazuje optimum pH w środowisku zasadowym.

Poszczególne izoenzymy dehydrogenazy alkoholowej różnią się wrażliwością na swoisty inhibitor, jakim jest pirazol i jego pochodna 4-metylopirazol. ADH klasy III nie jest hamowana przez ten związek nawet w stężeniu 12 mmol/l, podczas gdy np. w wypadku ADH klasy I stężeniu 4-metylopirazol, już stężeniu około 2 µmol/l, powoduje obniżenie aktywności o ponad 90% [6]. Mechanizm inhibicyjnego działania pirazolu polega na łączeniu się atomu azotu pirazolu z miejscem wiązania cynku, pełniącym rolę kofaktora. Cynk wiąże się z enzymem w tym samym miejscu co substrat. W wyniku zablokowania tego miejsca przez pirazol dochodzi do współzawodnictwa z etanolem w wiązaniu do kompleksu ADH-NAD. Wzrost stopnia zahamowania aktywności ADH przez 4-metylopirazol jest proporcjonalny do siły wiązania apolarnej części inhibitora do miejsca aktywnego enzymu [5]. Lepszym inhibitorem ADH klasy III jest o-fenantrolina, tworząca kompleksy z aktywnym miejscem wiązania atomu cynku, blokując w ten sposób miejsce wiązania substratów [24].

Miarą zdolności utleniania różnych alkoholi przez dehydrogenazę alkoholową jest stosunek stałej katalitycznej k_cat do stałej Michaelisa (K_m). Wartość k_cat/K_m dla izoenzymów ADH III przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2. Wartość k_cat/K_m ADH III dla różnych alkoholi w pH 10,0 (min^–1 × M^–1) [24]

ADH klasy III wykazuje bardzo małe powinowactwo do krótkołańcuchowych alkoholi alifatycznych. Etanol lub propanol nawet w stężeniu 2 mol/l nie powodują wysycenia enzymu. Powinowactwo cc

-ADH do utlenianych alkoholi wzrasta wraz ze zwiększeniem długości łańcucha, zmniejsza się bowiem wartość K_m, przy nieznacznych wahaniach k_cat. Co najmniej 8-węglowe alkohole alifatyczne, takie jak np. alkohol kaprylowy stanowią dobre substraty dla tego izoenzymu. Wartości stałej Michaelisa ADH III dla oktanolu i 12-hydroksydodekanolu wynoszą odpowiednio 0,50 mmol/l i 0,10 mmol/l [24].

W tabeli 3 porównano zdolności ADH III do utleniania różnych alkoholi w pH 9,6 w obecności NAD o stężeniu 1,2 mmol/l przy założeniu, że zdolność oksydacji oktanolu wynosi 100%. Z przedstawionych danych wynika, że najlepszym substratem spośród badanych alkoholi alifatycznych jest 12-hydroksydodekanol. Należy również zauważyć, że roztwór pirazolu o stężeniu 10 mmol/l nie hamuje, a dodanie glutationu nie zwiększa w istotnym stopniu aktywności ADH III.

Tabela 3. Aktywność ADH III w stosunku do alkoholi alifatycznych [13]

Swoista aktywność klasy III dehydrogenazy alkoholowej dla roztworu alkoholu kaprylowego o stężeniu 1mmol/l wynosi 1,1 U/mg białka, podczas gdy dla aldehydu mrówkowego jest znacznie wyższa i wynosi 3 U/mg białka [13]. Formaldehyd jest więc lepszym substratem i udział ADH klasy III w jego metabolizmie stanowi jedną z głównych funkcji tego enzymu w organizmie człowieka.

ROLA ADH III W ORGANIZMIE CZŁOWIEKA

Główną funkcją dehydrogenazy alkoholowej klasy III jest udział w eliminowaniu endogennego aldehydu mrówkowego, który jest bardzo toksycznym związkiem, powstającym podczas fizjologicznych przemian metabolicznych. W organizmie człowieka formaldehyd pojawia się również przy zatruciu alkoholem metylowym. Ponadto niektóre napoje alkoholowe zawierają domieszkę metanolu nawet powyżej 0,15 g/l i wówczas ADH III odgrywa rolę w metabolizmie tego alkoholu [8]. W amerykańskiej whiskey zawartość metanolu wynosi 0,26 g/l [3]. Alkohol metylowy pod wpływem ADH I ulega utlenieniu do formaldehydu, który jest następnie eliminowany z udziałem izoenzymu klasy III dehydrogenazy alkoholowej w reakcji, w której dodatkowym substratem jest glutation. Stwierdzono, że ADH klasy III ma identyczną strukturę i właściwości katalityczne, jak glutationozależna dehydrogenaza formaldehydowa [13]. Oba enzymy mają zdolność katalizowania poniższej reakcji:

Bezpośrednim substratem ADH III lub dehydrogenazy formaldehydowej nie jest jednak wolny aldehyd mrówkowy, ale hemitioacetal S-hydroksymetyloglutation, powstały z nieenzymatycznej syntezy formaldehydu i glutationu. Grupa hydroksylowa S-hydroksymetyloglutationu zostaje następnie utleniona z wytworzeniem S-formyloglutationu. Związek ten ulega nieodwracalnej hydrolizie z uwolnieniem glutationu i kwasu mrówkowego w reakcji katalizowanej przez hydrolazę S-formyloglutationową. Dehydrogenaza alkoholowa klasy III utlenia S-hydroksymetyloglutation dużo bardziej wydajnie niż alkohole alifatyczne. Wartość stałej Michaelisa (K_m) ADH III dla tego substratu wynosi 0,92 µmol/l, jest więc ponad 100 razy mniejsza niż K_m dla 12-hydroksydodekanolu, który stanowi najlepszy substrat spośród alkoholi długołańcuchowych. Należy jednak zauważyć, że utlenianie S-hydroksymetyloglutationu zachodzi tylko w pH 7,5, stanowiącym optymalne środowisko dla tej reakcji. Natomiast oksydacja alkoholi alifatycznych pod wpływem ADH III w tym właśnie pH jest bardzo mało wydajna, dużo mniejsza niż w pH około 10,5 [11].

Przypuszczalnie izoenzym klasy III ADH ma znaczenie w utlenianiu długołańcuchowych alkoholi, szczególnie w

-hydroksykwasów tłuszczowych, będących pośrednimi produktami metabolizmu lipidów [6].

ADH III ze względu na małe powinowactwo do etanolu może go utleniać tylko przy jego odpowiednio wysokim stężeniu. W organizmie człowieka takie stężenie alkoholu może występować w żołądku po bezpośrednim spożyciu etanolu. W związku z tym, że dehydrogenaza alkoholowa klasy III wykazuje w błonie śluzowej żołądka stosunkowo dużą aktywność (około 5 nmol/min/mg białka) prawdopodobnie uczestniczy ona w metabolizmie pierwszego przejścia alkoholu etylowego (FPM) w żołądku, choć w dużo mniejszym stopniu niż klasa IV ADH [9].

PODSUMOWANIE

Izoenzym klasy III dehydrogenazy alkoholowej wykazuje zbliżoną budowę do pozostałych izoenzymów ADH, ale zupełnie inne właściwości katalityczne i w związku z tym spełnia odmienne funkcje w organizmie człowieka. ADH III uczestniczy w metabolizmie formaldehydu oraz katalizuje reakcje utleniania długołańcuchowych w-hydroksykwasów tłuszczowych.

PIŚMIENNICTWO

[1] Agarwal D.P.: Genetic polymorphisms of alcohol metabolizing enzymes. Pathol. Biol., 2001; 49: 703-709
[PubMed]  

[2] Crabb D.W., Matsumoto M., Chang D., You M.: Overview of the role of alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase and their variants in the genesis of alcohol-related pathology. Proc. Nutr. Soc., 2004; 63: 49-63
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Franke A., Teyssen S., Harder H., Singer M.V.: Effect of ethanol and some alcoholic beverages on gastric emptying in humans. Scand. J. Gastroenterol., 2004; 39: 638-644
[PubMed]  

[4] Galter D., Carmine A., Buervenich S., Duester G., Olson L.: Distribution of class I, III and IV alcohol dehydrogenase mRNAs in the adult rat, mouse and human brain. Eur. J. Biochem., 2003; 270: 1316-1326
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[5] Haseba T., Duester G., Shimizu A., Yamamoto I., Kameyama K., Ohno Y.: In vivo contribution of class III alcohol dehydrogenase (ADH3) to alcohol metabolism through activation by cytoplasmic solution hydrophobicity. Biochim. Biophys. Acta, 2006; 1762: 276-283
[PubMed]  

[6] Holmes R.S.: Alcohol dehydrogenases: a family of isozymes with differential functions. Alcohol Alcohol.Suppl., 1994; 2: 127-130
[PubMed]  

[7] Hoog J.O., Brandt M., Hedberg J.J., Stromberg P.: Mammalian alcohol dehydrogenase of higher classes: analyses of human ADH5 and rat ADH6. Chem. Biol. Interact., 2001; 130-132: 395-404
[PubMed]  

[8] Hoog J.O., Hedberg J.J., Stromberg P., Svensson S.: Mammalian alcohol dehydrogenase – functional and structural implications. J. Biomed. Sci., 2001; 8: 71-76
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[9] Jelski W., Chrostek L., Szmitkowski M., Łaszewicz W.: Activity of class I, II, III, and IV alcohol dehydrogenase isoenzymes in human gastric mucosa. Dig. Dis. Sci., 2002; 47: 1554-1557
[PubMed]  

[10] Jornvall H.: The alcohol dehydrogenase system. EXS, 1994; 71: 221-229
[PubMed]  

[11] Julia P., Boleda M.D., Farres J., Pares X.: Mammalian alcohol dehydrogenase: characteristics of class III isoenzymes. Alcohol Alcohol Suppl., 1987; 1: 169-173
[PubMed]  

[12] Kaiser R., Holmquist B., Vallee B.L., Jornvall H.: Human class III alcohol dehydrogenase/glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase. J. Protein. Chem., 1991; 10: 69-73
[PubMed]  

[13] Koivusalo M., Baumann M., Uotila L.: Evidence for the identity of glutathione- dependent formaldehyde dehydrogenase and class III alcohol dehydrogenase. FEBS Lett., 1989; 257: 105-109
[PubMed]  

[14] Matsushima T.: Alcohol dehydrogenase (ADH). Nippon Rinsho., 2004; 62, Suppl.11: 438-441
[PubMed]  

[15] Moreno A., Pares X.: Purification and characterization of a new alcohol dehydrogenase from human stomach. J. Biol. Chem., 1991, 266, 1128-1133
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[16] Sakata R.: A case-control study of association between life-style, alcohol dehydrogenase 2 and aldehyde dehydrogenase 2 genotype and idiopathic osteonecrosis of the femoral head. Kurume Med. J., 2003; 50: 121-130
[PubMed]  

[17] Sanghani P.C., Robinson H., Bennett-Lovsey R., Hurley T.D., Bosron W.F.: Structure-function relationships in human class III alcohol dehydrogenase (formaldehyde dehydrogenase). Chem. Biol. Interact., 2003; 143-144: 195-200
[PubMed]  

[18] Sreekumar R., Rosado B., Rasmussen D., Charlton M.: Hepatic gene expression in histologically progressive nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology, 2003; 38: 244-251
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[19] Stromberg P., Hoog J.O.: Human class V alcohol dehydrogenase (ADH5): A complex transcription unit generates C-terminal multiplicity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000; 278: 544-549
[PubMed]  

[20] Stromberg P., Svensson S., Berst K.B., Plapp B.V., Hoog J.O.: Enzymatic mechanism of low-activity mouse alcohol dehydrogenase 2. Biochemistry, 2004; 43: 1323-1328
[PubMed]  

[21] Strydom D.J., Vallee B.L.: Characterization of human alcohol dehydrogenase isozymes by high-performance liquid chromatographic peptide maping. Anal. Biochem., 1982; 123: 422-429
[PubMed]  

[22] Svensson S., Stromberg P., Sandalova T., Hoog J.: Class II alcohol dehydrogenase (ADH2) – adding the structure. Chem. Biol. Interact., 2001; 130-132: 339-350
[PubMed]  

[23] Umulis D.M., Gurmen N.M., Singh P., Fogler H.S.: A physiologically based model for ethanol and acetaldehyde metabolism in human beings. Alcohol, 2005; 35: 3-12
[PubMed]  

[24] Wagner F.W., Pares X., Holmquist B., Vallee B.L.: Physical and enzymatic properties of a class III isozyme of human liver alcohol dehydrogenase: c

 -ADH. Biochemistry 1984; 23: 2193-2199
[PubMed]  

[25] Yang Z.N., Bosron W.F., Hurley T.D.: Structure of human chi chi alcohol dehydrogenase: a glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase. J. Mol. Biol., 1997; 265: 330-343
[PubMed]  

[26] Yin S.J., Chou C.F., Lai C.L., Lee S.L., Han C.L.: Human class IV alcohol dehydrogenase: kinetic mechanism, functional roles and medical relevance. Chem. Biol. Interact., 2003; 143-144: 219-227
[PubMed]  

[27] Yin S.J., Wang M.F., Liao C.S., Chen C.M., Wu C.W.: Identification of human stomach alcohol dehydrogenase with distinctive kinetic properties. Biochem. Int., 1990; 22: 829-835
[PubMed]  

Full text