Streszczenie

Oporność wielolekowa jest poważnym problemem w leczeniu infekcji bakteryjnych i grzybiczych. Jednym z głównych mechanizmów oporności jest aktywne usuwanie leków z komórki. U bakte­rii eksport substancji toksycznych z komórek odbywa się za pośrednictwem białek należących do pięciu rodzin: MFS, SMR, ABC, RND i MATE. Substratami pomp mogą być m.in. antybiotyki, chemioterapeutyki i detergenty. Geny oporności na te związki mogą się umiejscawiać na chro­mosomach bądź elementach ruchomych (plazmidy, transpozony, integrony). Obecność genów oporności na elementach ruchomych umożliwia bakteriom łatwe ich przekazywanie z komórki do komórki i rozprzestrzenianie oporności wielolekowej. Obecnie trwają badania nad związka­mi wykazującymi działanie inhibicyjne względem transporterów wyrzutu leków. Białka warun­kujące wielolekooporność występują również u grzybów. Należą głównie do rodziny transpor­terów ABC, do podrodziny PDR. Białka te są powszechnie badane u drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Słowa kluczowe:systemy wyrzutu leków • oporność wielolekowa • antybiotyki

Summary

Multidrug resistance is a major problem in the treatment of infectious diseases caused by bacte­ria and fungi. One of the basic mechanisms of resistance is active efflux of distinct drugs from cells. Export of toxic compounds from bacterial cells is mediated by proteins of 5 distinct fami­lies: MF, SMR, ABC, RND and MATE. The substrate spectrum of efflux pumps includes an­tibiotics, chemotherapeutics and detergents. Genes that determine resistance can be located on chromosomes or mobile elements (plasmids, transposons, integrons). The presence of resistance genes on mobile elements enables bacteria to transfer those genes between cells and spread the multidrug resistance phenotype. There are several inhibitors of efflux pumps that are currently in the experimental phase. Proteins that mediate multidrug resistance are also present in fungal cells. They belong mainly to the ABC superfamily of transporters and PDR subfamily. These ef­flux pumps are widely investigated in Saccharomyces cerevisiae.

Key words:efflux pumps • multidrug resistance • antibiotics

Wykaz skrótów:

ABC – kaseta wiążąca ATP (ATP-binding cassette); MATE – multidrug and toxic compound extrusion; MF – major facilitator; MFP – białko łączące błony (membrane fusion protein); MIC – minimalne stężenie hamujące (minimal inhibitory concentration); OMP – białko błony zewnętrznej (outer membrane protein); PDR – oporność wielolekowa (pleiotropic drug resistance); QRDR – region determinujący oporność na chinolony (quinolone-resistance-determining region); RND – resistance-nodulation-cell division; SMR – small multidrug resistance.

1. Wprowadzenie

Odkrycie i zastosowanie antybiotyków umożliwiło walkę z groźnymi infekcjami bakteryjnymi. Jednak wraz z roz­powszechnieniem się antybiotyków, bakterie wykształciły różne mechanizmy oporności na te środki. Jednym z nich jest aktywny wyrzut leków z komórki. Biorą w nim udział białka, które eksportują antybiotyki i inne środki antybak­teryjne z wnętrza komórki do środowiska zewnętrznego. Transportery te należą do pięciu niespokrewnionych rodzin: MF (major facilitator), SMR (small multidrug resistance), MATE (multidrug and toxic compound extrusion), RND (re­sistance-nodulation-cell division) i ABC (ATP-binding cas­sette) (ryc. 1). Transportery należące do rodzin MF, SMR i RND, jako źródło energii do aktywnego eksportu leków z komórki wykorzystują siłę protonomotoryczną. Transport leków przez białka MATE warunkowany jest gradientem stę­żenia jonów Na+, natomiast białka należące do rodziny ABC wykorzystują energię pochodzącą z hydrolizy ATP [40].

Ryc. 1. Schemat budowy i działania błonowych transporterów lekowych

Transportery lekowe mogą mieć szeroką swoistość substra­tową i odpowiadać za wyrzut antybiotyków należących do różnych klas lub mogą być lekoswoiste i eksportować kon­kretną, charakterystyczną dla danego białka, klasę związków antybakteryjnych. Geny kodujące białka odpowiedzialne za wyrzut leków mogą występować zarówno na chromo­somie bakteryjnym, jak i na mobilnych elementach geno­mu, takich jak plazmidy czy transpozony.

W związku z dużą rolą systemów usuwania leków w warunko­waniu wielolekooporności drobnoustrojów potencjalnie groź­nych dla zdrowia ludzi i zwierząt, stale prowadzone są badania nad ich budową, mechanizmem działania, fizjologiczną rolą w komórce, jak i związkami hamującymi ich działanie [42].

2. Transport aktywny

Opisane w pracy systemy usuwania leków należą do ukła­dów transportu aktywnego. Transport aktywny to termody­namicznie niesamorzutny, endoergiczny strumień substancji przechodzący przez błonę komórkową sprzężony z procesem egzoergicznym dostarczającym energii dla tego transportu (np. hydroliza ATP, ale też bierne transporty innych substan­cji). Siłami napędowymi egzoergicznych biernych procesów transportowych mogą być gradienty elektrochemiczne róż­nych jonów (np. gradient protonowy, gradient Na⁺). System tranportujący jedną substancję nazywamy uniportem, nato­miast transporty sprzężone dwu substancji mogą być sym­portem (w tym samym kierunku) lub antyportem (w przeciw­nych kierunkach). Systemy transportu aktywnego nazywane są pompami, gdyż mogą translokować substancję w okre­ślonym kierunku (np. wyrzut z komórki) niezależnie od kie­runku ich gradientu chemicznego lub elektrochemicznego.

Systemy aktywnego transportu stanowią białkowo-lipidowe układy (kompleksy) umiejscowione w błonach komórko­wych. Strumienie substancji są wielkościami ukierunkowa­nymi (wektorowymi). Sprzężenie procesów ukierunko­wanych z reakcjami chemicznymi lub innymi systemami transportowymi nie może być realizowane w środowisku izotropowym, wymaga środowiska anizotropowego. Błona komórkowa, jako miejsce lokalizacji tych układów, stanowi barierę między komórką i jej otoczeniem, a także tworzy środowisko anizotropowe niezbędne dla tego sprzężenia transportu z reakcją chemiczną lub innym ukierunkowa­nym transportem. Opisane systemy transportowe wyrzutu rozmaitych leków należą do różnych grup zróżnicowanych pod względem rodzajów transportu aktywnego i mechani­zmów wykorzystania energii dla ich funkcji.

Różne pod względem sprzężenia z egzoergicznymi procesami systemy transportowe mogą być hamowane inhibitorami ak­tywności ATP-azowej lub czynnikami rozprzęgającymi współ­transport, czyli sprzężony transport dwóch substancji w tym samym bądź przeciwnym kierunku (symport lub antyport).

3. Systemy usuwania leków z komórek bakterii Gram-dodatnich

U bakterii Gram-dodatnich występuje wiele transporterów błonowych promujących usuwanie leku z komórki, aby zapobiec jego akumulacji w komórce, co w konsekwencji mogłoby doprowadzić do śmierci bakterii. Białka trans­portujące leki u bakterii Gram-dodatnich należą do trzech niespokrewnionych rodzin: MF (major facilitator), SMR (small multidrug resistance) i ABC (ATP-binding cassette) [26]. Ich obecność zapewnia bakteriom oporność na wiele związków antybakteryjnych, tj. fluorochinolonów, tetracy­klin oraz antybiotyków należących do rodziny MLS (ma­krolidy, linkozamidy i streptograminy). Niektóre własno­ści tych białek zebrano w tabeli 1.

Tabela 1. Rodziny systemów usuwania leków z komórek bakteryjnych

3.1. Rodzina MF transporterów błonowych

Wiele transporterów błonowych, występujących u bakte­rii Gram-dodatnich, należy do rodziny MF (major facili­tator). Jest to duża i różnorodna rodzina. Należące do niej transportery błonowe bakterii Gram-dodatnich funkcjonu­ją jako jednopodjednostkowa pompa [23]. Białka te skła­dają się z około 400 reszt aminokwasowych zorganizo­wanych w 12 lub 14 transbłonowych helis [4]. Pomiędzy helisą 6 i 7 występuje duża pętla cytoplazmatyczna łączą­ca obie połowy transportera [5]. Transport substratu przez systemy wyrzutu należące do rodziny MF odbywa się na zasadzie uniportu, symportu z jednoczesnym wypływem jonów H⁺ lub Na⁺, antyportu z jednoczesnym napływem jonów wodorowych lub antyportu z jednoczesnym napły­wem substancji rozpuszczonej [23]. Energię do transpor­tu białka te czerpią z gradientu protonów po obu stronach błony [51]. Do grona transporterów leków, należących do rodziny MF, zalicza się m.in. białko NorA. Występuje ono u Staphylococcus aureus i charakteryzuje się szero­ką swoistością dla leków hydrofilnych [4]. Gen kodujący białko NorA znajduje się na chromosomie, co zapewnia wrodzoną oporność tego gatunku na fluorochinolony, ta­kie jak norfloksacyna i ciprofloksacyna [44]. Oporność uzależniona jest od zwiększenia ekspresji genu norA, któ­ra może być wynikiem mutacji. Takie zjawisko występuje w opornych na fluorochinolony szczepach klinicznych S. aureus, u których mutacja występuje w promotorze genu norA [30]. Kolejnym przykładem transportera, należącego do rodziny MF, jest Bmr występujący u Bacillus subtilis.

Jest to transporter wielolekowy, homologiczny do NorA. Ekspresja tego białka jest regulowana przez białko regula­torowe BmrR. W swojej strukturze ma ono kieszeń, która wiąże kationy hydrofobowe, aktywując tym samym eks­presję białka Bmr. Każda dodatnio naładowana cząstecz­ka, mogąca dopasować się do kieszeni, może być ligan­dem dla BmrR [38]. Badania wykazały, że transporter Bmr odpowiada za usuwanie z komórki antybiotyków, takich jak chloramfenikol, puromycyna i fluorochinolony [33]. U B. subtilis występuje również białko transporterowe Blt, będące homologiem Bmr. Oba białka mają podobny zakres substratowy, jednak różnią się drogami ekspresji. W przeciwieństwie do genu bmr, blt nie ulega ekspresji u szczepów dzikich [42]. U bakterii Gram-dodatnich po­wszechnie występuje również transporter MefA, opisa­ny u Streptococcus pyogenes oraz MefE, występujący u Streptococcus pneumoniae. Geny obu białek zidentyfi­kowano wewnątrz transpozonu, występującego na chro­mosomie. Zarówno białko MefA, jak i MefE mają wąski zakres substratowy, ograniczony do makrolidów. Poznane dotychczas systemy usuwania leków z komórek bakterii Gram-dodatnich zebrano w tabeli 2.

Tabela 2. Systemy usuwania leków z komórek bakterii Gram-dodatnich

Do transporterów z rodziny MF, występujących u wie­lu bakterii Gram-dodatnich, należą dwa białka promują­ce eksport tetracykliny: TetK i TetL. Są one przykładem transporterów o wąskiej swoistości substratowej. Obecność TetL opisano u B. subtitis, natomiast TetK u S. aureus [33]. Przedstawione wyżej determinanty oporności na tetracy­kliny są kodowane chromosomowo, natomiast ekspresja tych białek jest regulowana przez białko TetR. Regulator ten ma kieszeń, w której polarne aminokwasy i związane cząsteczki wody tworzą gęstą sieć wiązań tetracyklina-Mg²⁺ za pomocą wiązań wodorowych i sił van der Waalsa [38].

Kolejnym przykładem systemu usuwania leków, zaklasyfi­kowanego do rodziny MF, jest białko LmrB. Wykazano, że spontaniczne mutanty B. subtilis, oporne na linkomycynę i puromycynę, wykazywały podwyższoną ekspresję genu lmrB, występującego w operonie z genem lmrA, kodują­cym prawdopodobnie białko represorowe [42].

3.2. Rodzina SMR transporterów błonowych

Transportery należące do rodziny SMR składają się z około 110 reszt aminokwasowych i w swojej strukturze zawierają cztery segmenty transbłonowe. W związku z niewielkimi rozmiarami białek należących do tej rodziny, prawdopodob­nie funkcjonują one jako kompleksy oligomeryczne [33].

Źródłem energii do aktywnego usuwania substratów jest siła protonomotoryczna [23]. Mimo że transportery SMR są wielolekowe, ich zakres substratowy ograniczony jest do lipofilnych leków, środków antyseptycznych i dezyn­fekcyjnych [30]. Transportery należące do tej rodziny po raz pierwszy opisano u S. aureus, ale występują również u innych gronkowców. Należy tu białko Smr, kodowane przez gen smr, który znajduje się zarówno na plazmidach koniugacyjnych, jak i niekoniugacyjnych. Białko Smr po­średniczy w wymianie leku na proton na zasadzie anty­portu. Analiza sekwencyjna plazmidów ujawniła obecność także dwóch innych białek, w dużym stopniu homologicz­nych do Smr, QacG i QacH. Podobnie jak Smr, transpor­tery te promują eksport m.in.: bromku etydyny i czwarto­rzędowych soli amonowych [44].

3.3. Rodzina ABC transporterów błonowych

Kolejną rodziną transporterów lekowych, występujących u bakterii Gram-dodatnich, jest rodzina ABC. Białka należące do tej rodziny zbudowane są z czterech domen: dwóch domen NBD (nucleotide binding domain) i dwóch TMD (transmembrane domain) [31]. TMD w swej struk­turze zawierają sześć transbłonowych α-helis i tworzą homo- lub heterodimery. Dwie domeny NBD wiążą ATP po stronie cytoplazmatycznej i współdziałają z domenami transbłonowymi [23].

Cechą odróżniającą transportery ABC od pozostałych ro­dzin jest źródło energii do aktywnego usuwania leków, energia bowiem pochodzi z hydrolizy ATP. Związanie i hy­droliza ATP wywołuje zmiany konformacyjne w struktu­rze transportera, co jest niezbędne do eksportu substratów. Zakres substratowy transporterów ABC obejmuje tetracykli­ny, fluorochinolony, chloramfenikol, rifampicynę, makroli­dy, linkozamidy, aminoglikozydy [55]. Białka należące do rodziny ABC rzadko występują u bakterii. Pierwszym po­znanym bakteryjnym systemem usuwania leków jest LmrA występujący u L. lactis. Transporter ten funkcjonuje jako homodimer i ma przynajmniej dwa miejsca wiążące lek [4]. Determinuje oporność na chloramfenikol oraz antybiotyki MLS. Homologi tego białka występują także u B. subtilis i S. aureus [33]. Badania wykazały, że indukowana opor­ność na erytromycynę i streptograminy typu B związana jest z przypuszczalnym mechanizmem usuwania leków ko­dowanym przez plazmidowy gen msrA. Białko MsrA nale­ży do rodziny ABC jednak nie ma domeny transmembra­nowej. Gronkowce mające MsrA wykazywały zmniejszoną akumulację erytromycyny w komórce. Jest więc możliwe, że MsrA współpracuje z innym białkiem, dostarczającym niezbędną domenę transbłonową. Znalezione na mobilnych elementach plazmidowych geny vgaA i vgaB determinu­ją oporność na mieszaninę streptogramin typu A i typu B u S. aureus [33]. U innej bakterii, Enterococcus faecalis, powszechnie występuje chromosomowy gen msrC kodu­jący determinantę oporności na makrolidy i streptogra­miny B. E. faecalis wykazuje również charakterystyczną dla siebie, wrodzoną oporność na linkozamidy i strepto­graminy A. Zapewnia ją chromosomowy gen lsa, kodują­cy transporter ABC, który nie ma domeny transbłonowej. Białko podobne do Lsa opisano u Streptococcus sciuri. Jest to transporter LsaB kodowany przez DNA plazmido­we i warunkujący oporność tego gatunku na półsyntetycz­ny antybiotyk z grupy linkozamidów – klindamycynę [33].

4. Systemy usuwania leków z komórek bakterii Gram-ujemnych

W związku z różnicami w budowie między osłonami ko­mórek bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, różne są również systemy usuwania leków występujące u tej gru­py bakterii. Mimo że u bakterii Gram-ujemnych występują systemy usuwania leków należące do wszystkich wspomnia­nych wcześniej rodzin, najbardziej znaczące i charaktery­styczne dla tej grupy są transportery należące do rodziny RND (resistance-nodulation-cell division).

4.1. Rodzina RND transporterów błonowych

Transportery RND (resistance-nodulation-cell division) są szeroko rozprzestrzenione wśród bakterii Gram-ujemnych. Są to pompy wielolekowe, kodowane zwykle przez geny chromosomowe [23]. Transportery RND współpracują z białkami występującymi w peryplazmie i w błonie ze­wnętrznej w taki sposób, że cały system wyrzutu leków składa się z trójczęściowego kompleksu. Pierwszą składo­wą tego systemu jest białko transporterowe znajdujące się w błonie cytoplazmatycznej. Ma ono 12 transmembrano­wych segmentów lub α-helis, które mają dwie duże dome­ny cytoplazmatyczne między segmentem pierwszym i dru­gim oraz między segmentem siódmym i ósmym. Domeny te zawierają reszty aminokwasowe, które są odpowie­dzialne za rozpoznawanie substratu. Działanie transpor­terów polega na antyporcie substrat-proton. Kolejną czę­ścią systemu RND jest peryplazmatyczne białko łączące błony. Białko to tworzy strukturę podobną do pierścienia i ma dwie domeny hydrofobowe przy C-końcu i N-końcu, które prawdopodobnie oddziałują z komponentami błony zewnętrznej i cytoplazmatycznej. Jego działanie opisują dwa możliwe modele. Pierwszy zakłada oligomeryzację peryplazmatycznego białka łączącego błony z białkiem bło­ny zewnętrznej, przez co formowany jest kanał, który sta­nowi drogę substratu przez peryplazmę. Funkcjonowanie białka łączącego błony według drugiego modelu odbywa się przez pośrednictwo w zestawieniu błony zewnętrznej i cytoplazmatycznej i utworzeniu szlaku transportu sub­stratu. Białka te są prawdopodobnie niezbędne w montażu i funkcjonowaniu pomp RND [43]. Ostatnią składową jest białkowy kanał błony zewnętrznej. Jest to trimer składają­cy się z połączonych beczułkowatych struktur. Jeden koniec tworzy por o szerokim otworze i jest osadzony w błonie ze­wnętrznej kotwicząc długi tunel zbudowany z 12 a-helis, siegający w peryplazmę. Jest on otwarty w stronę części beczułkowatej, a zamknięty w kierunku błony cytopla­zmatycznej. Zamknięty koniec tunelu może zostać otwar­ty poprzez ruch α-helis. Tak funkcjonujący system wyrzu­tu może usuwać antybiotyki przez błonę cytoplazmatyczną i słabo przepuszczalną błonę zewnętrzną. U Escherichia coli występuje siedem znanych transporterów RND, z cze­go pięć jest dobrze scharakteryzowanych. Charakterystykę tych białek przedstawia tabela 3.

Tabela 3. Systemy usuwania leków z rodziny RND występujące u E. coli

Najlepiej poznany jest system AcrAB-TolC, gdzie AcrB to białko transporterowe znajdujące się w błonie cytoplazma­tycznej, AcrA jest białkiem peryplazmatycznym, a TolC białkiem błony zewnętrznej [32]. Trimer AcrB składa się z domeny peryplazmatycznej i domeny transmembranowej. Wyższa część domeny peryplazmatycznej wchodzi w in­terakcje z TolC. Domena peryplazmatyczna odgrywa de­cydującą rolę w determinowaniu swoistości substratowej. Transportowany lek jest wiązany do kieszeni znajdującej się w centrum trimeru AcrB, jednak każdy z rozpoznawa­nych leków oddziałuje z innymi resztami aminokwasów.

TolC to białko wielofunkcyjne, które dzięki krótkotrwałym interakcjom z transporterem lekowym indukowanym obec­nością substratu, może się chwilowo otwierać i przenosić leki o niewielkiej masie oraz duże polipeptydowe toksy­ny. TolC ma strukturę trimeryczną – trzy cząsteczki TolC formują cylindryczny kanał. Koniec od strony błony ze­wnętrznej jest otwarty, a koniec peryplazmatyczny zwęża się. Zamykanie kanału TolC zależy m.in. od pH [4]. Geny acrA i acrB leżą w jednym operonie i ekspresjonowane razem odpowiadają za oporność na barwniki, detergenty i antybiotyki. Substratami tego systemu są takie leki jak: chloramfenikol, β-laktamy, makrolidy i fluorochinolony. Składanie AcrA, AcrB i TolC w funkcjonalną pompę na­stępuje w zależności od obecności substratu. Innym sys­temem usuwania leków u E. coli jest AcrD, który ekspor­tuje nowobiocynę i aminoglikozydy, jednak do sprawnego funkcjonowania wymaga obecności AcrA i TolC. System AcrEF nie występuje u organizmów dzikich, tylko u mu­tantów opornych na fluorochinolony, które nie mają sys­temu AcrAB. Białko AcrF współdziała z AcrA i TolC. Zwiększona ekspresja genów systemu YhiUV powoduje oporność tego gatunku na doksorubicynę i erytromycynę. YhiUV jest homologiem AcrAB. Kolejnym kompleksem promującym eksport leków u E. coli jest MdtABC. Jest to system, zawierający dwa różne transportery: MdtB i MdtC i obecność ich obu jest konieczna do sprawnego działania. Substratami dla tych transporterów jest np. nowobiocyna [23]. Wszystkie wyżej wymienione systemy współdziała­ją z białkiem TolC.

Kolejnym organizmem, u którego występuje wiele róż­nych transporterów RND jest Pseudomonas aueruginosa. Ma on około dwanaście pomp, z czego siedem zostało do­tychczas scharakteryzowanych (tabela 4). Pierwszą z nich jest system MexAB-OprM, gdzie MexA to białko perypla­zmatyczne łączące błony, MexB jest transporterem RND, a OprM białkiem błony zewnętrznej. Jest to system, które­go transportery mają najszerszy zakres substratowy u tego gatunku. Substratami dla tej pompy mogą być b-laktamy, chinolony, makrolidy, tetracyklina, chloramfenikol, no­wobiocyny, sulfonamidy, trimetoprim, tiolaktomycyna. System MexCD-OprJ występuje u szczepów P. aeruginosa mających mutację nfxB. Mutanty nfxB dzielą się na dwie grupy: A i B. Mutanty typu A oporne są na ofloksacynę, erytromycynę i niektóre nowe cefalosporyny (np. cefsulo­dyna), a mutanty typu B dodatkowo jeszcze na tetracyklinę i chloramfenikol. Kolejnym mechanizmem eksportu leków u tego gatunku jest MexEF-OprN. System ten występuje tylko u szczepów mających mutację nfxC. Zapewnia im to oporność na fluorochinolony, tetracyklinę, chloramfenikol i trimetoprim. W przeciwieństwie do MexAB-OprM, syste­my MexCd-OprJ oraz MexEF-OprN nie są odpowiedzialne za oporność na β-laktamy. Działanie tego systemu wspo­magane jest zmniejszoną ekspresją oprD – genu kodują­cego białko porynowe błony zewnętrznej, które jest głów­nym kanałem imipenemu. Mutanty, u których brak tego białka są niewrażliwe na ten antybiotyk. Operon mexXY, w przeciwieństwie do wyżej wymienionych systemów, nie ma otwartej ramki odczytu dla genu kodującego biał­ko błony zewnętrznej. Zamiast tego wykorzystuje OprM jako komponent błony zewnętrznej. Delecja genów mexXY skutkuje zwiększoną przepuszczalnością dla aminogliko­zydów, tetracykliny i erytromycyny. Ekspresja tych genów u E. coli powoduje oporność na fluorochinolony, mimo że u P. aeruginosa nie przyczynia się do wrodzonej oporności na te leki. MexJK jest systemem, dla którego substratami jest triklosan, erytromycyna i tetracyklina. Do transportu erytromycyny i tetracykliny MexJK wymaga obecności biał­ka błony zewnętrznej OprM, a do eksportu triklosanu wy­korzystuje białko OpmH. Kolejnym mechanizmem ekspor­tu leków u P. aeruginosa jest MexGHI-OpmD. Składa się on z peryplazmatycznego białka łączącego błony (MexH), transportera RND (MexI) i kanału białkowego błony ze­wnętrznej (OpmD). W systemie tym występuje dodatkowo małe białko integralne błony – MexG, którego rola nie zo­stała jeszcze poznana. Mechanizm ten zapewnia oporność na norfloksacynę. MexVW współpracuje z OprM i jest od­powiedzialny za eksport fluorochinolonów, tetracykliny, chloramfenikolu i erytromycyny. U Neisseria gonorrhoeae występuje system MtrCDE, gdzie MtrC jest białkiem pe­ryplazmatycznym, MtrD jest transporterem RND, a MtrE białkiem błony zewnętrznej. Obecność MtrC i MtrE jest konieczna do transportu erytromycyny, penicyliny i kwa­sów tłuszczowych. Ich inaktywacja powodowała wzrost wrażliwości na te związki [23]. Burkholderia cepacia, która jest patogenem roślin i oportunistycznym patogenem ludzkim ma system CeoAB-OpcM. Jest on homologiem MexAB-OprM i promuje aktywne usuwanie chloramfe­nikolu, fluorochinolonów i trimetoprimu. Inny przedsta­wiciel tego rodzaju, Burkholderia pseudomallei, ma dwa systemy wyrzutu: AmrAB-OprA oraz BpeAB-OprB. Oba nadają oporność tej bakterii na aminoglikozydy i w mniej­szym stopniu na makrolidy. Dwa mechanizmy eksportu leków występują również u innej bakterii Gram-ujemnej, Stenotrophomonas maltophila. Pierwszy z nich to SmeABC, jednak tylko SmeC warunkuje oporność na β-laktamy, aminoglikozydy i fluorochinolony. Sugeruje to, że SmeC może być częścią innej, niezidentyfikowanej jeszcze pom­py. Drugim mechanizmem jest SmeDEF, dla którego sub­stratami są makrolidy, fluorochinolony, chloramfenikol, te­tracyklina i erytromycyna [23]. Serratia marcescens ma trzy mechanizmy RND, zapewniające wieloantybiotykową oporność. SdeAB odpowiada za usuwanie fluorochinolo­nów, chloramfenikolu, barwników i detergentów, natomiast SdeCDE i SdeXY eksportują norfloksacynę i tetracykli­nę [4]. U Haemophilus influenzae występuje trójgenowa grupa kodująca HIO893, HIO894 i HIO895. Dysrupcja (zniszczenie) genów HIO894 i HIO895 powoduje wzrost wrażliwości na erytromycynę, rifampicynę, nowobiocyny, SDS i barwniki kationowe. Acinetobacter baumannii ma dwa systemy usuwania leków: AdeABC, których obecność warunkuje oporność na aminoglikozydy, fluorochinolony, chloramfenikol, tetracyklinę, erytromycynę i trimetoprim, natomiast ekspresja AdeDE powoduje spadek wrażliwo­ści na amikacynę, ceftazidim, chloramfenikol, ciproflok­sacynę, erytromycynę, meropenem, rifampin i tetracyklinę [23]. Salmonella enterica serotyp Typhimurium oporność na fluorochinolony, tetracykliny, chloramfenikol, karbeni­cylinę i cefoksytynę zawdzięcza obecności systemu AcrAB [42]. Mechanizm AcrAB-TolC występuje też u Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae i Klebsiella oxytoca i warunkuje oporność na fluorochinolony, chloramfeni­kol i tetracyklinę. U Campylobacter jejuni obecne są dwa mechanizmy usuwania leków: CmeABC, odpowiedzial­ny za oporność na fluorochinolony, sole kwasów żółcio­wych, bromek etydyny i metale ciężkie oraz CmeDEF [23].

Tabela 4. Systemy usuwania leków z rodziny RND u P. aeruginosa

4.2. Rodziny MF, MATE, SMR i ABC transporterów błonowych

U bakterii Gram-ujemnych występują białka transportujące leki należące do każdej z głównych rodzin. Transportery te­tracykliny są w większości białkami rodziny MF. Systemy usuwania leków są przeważającym mechanizmem warun­kującym oporność na te związki. Występują u kilkunastu organizmów m.in.: Shigella spp., Salmonella spp., E. coli, Chlamydia, Helicobacter pylori, ale brak ich na przykład u Campylobacter czy Neisseria spp. Białka Tet zapew­niają oporność na tetracyklinę, oksytetracyklinę i chlor­tetracyklinę [43]. Badania wykazały obecność u E. coli dwóch otwartych ramek odczytu: emrA i emrB. Pierwsza z nich koduje białko transporterowe należące do rodzi­ny MF, a druga białko peryplazmatyczne łączące błony. Transporter ten współdziała z białkiem błony zewnętrz­nej TolC. System EmrAB zapewnia oporność na anty­biotyki hydrofobowe. Znaczącą homologię z systemem EmrAB wykazuje VceAB występujący u Vibrio cholerae. Obecność tego transportera warunkuje oporność na róż­ne toksyczne związki np. deoksycholany oraz antybioty­ki: kwas nalidyksowy i chloramfenikol [44]. MdfA wystę­pujący u E. coli również należy do rodziny MF i promuje wyrzut chloramfenikolu z komórki. MdfA jest przykładem transportera, który nadaje oporność na jedną grupę związ­ków, ale zwiększa wrażliwość na drugą. Homologi MdfA obecne są u wielu bakterii Gram-ujemnych, np. CmlA występujący u P. aeruginosa. Jego obecność warunku­je oporność na chloramfenikol i florfenikol. Z opornością na oba te związki związane jest również białko kodowa­ne plazmidowo przez gen pp-flo występujące u patogenu ryb Pasteurella piscicida. Prawie identyczny gen flo^_St jest obecny u Salmonella enterica serowar Typhimurium i rów­nież warunkuje eksport chloramfenikolu i florfenikolu [30]. Do rodziny SMR należy m.in. transporter EmrE występu­jący u E. coli. Jest to homooligomer, złożony prawdopo­dobnie z trzech monomerów [7]. Warunkuje oporność na tetracyklinę i bromek etydyny. Jego działanie polega na tym, że po związaniu leku dwie z trzech reszt Glu oddają proton. Wtedy transporter ulega zmianom konformacyj­nym. Miejsce wiązania zamyka się i otwiera po drugiej stronie błony. Uwolnienie leku katalizowane jest przez dwa protony. U bakterii Gram-ujemnych występują także transportery należące do rodziny MATE. Usuwanie leku jest w tym przypadku połączone z napływem Na⁺ do ko­mórki. Przedstawicielem tej klasy białek jest NorM wy­stępujący u Vibrio parahaemolyticus. Determinuje opor­ność na barwniki, fluorochinolony i aminoglikozydy [4]. Jego homolog YdhE promuje eksport tych samych związ­ków i występuje u E. coli. Innymi transporterami tej ro­dziny są HmrM u Haemophilus influenzae oraz PmpM u P. aeruginosa. Ich obecność warunkuje oporność na flu­orochinolony, detergenty i barwniki [43]. Do rodziny ABC należy m.in. MacAB-TolC. Jest to jedyny znany system usuwania leków z tej rodziny, kodowany przez geny chro­mosomowe u bakterii Gram-ujemnych, który działa razem z peryplazmatycznym białkiem łączącym błony i białkiem błony zewnętrznej. Występuje u E. coli i jest swoisty dla eksportu makrolidów [44]. Transporterem należącym do rodziny ABC jest EC-MsbA występujący u E. coli, który eksportuje lipidy. Funkcjonuje jako homodimer o kształ­cie stożka, gdzie domeny wiążące nukleotyd znajdują się przy podstawie. Każdy monomer składa się z sześciu a-helis, które zapewniają wejście i wyjście kanału po stro­nie wewnętrznej i zewnętrznej błony [4].

5. Regulacja ekspresji systemów wyrzutu leków

Ekspresja transporterów błonowych promujących eks­port leków z komórek musi podlegać ścisłej kontroli. Mechanizmy prowadzące do nadekspresji systemów usu­wania leków działają na różnej zasadzie. Większość syste­mów RND znajduje się pod kontrolą lokalnego represora [44]. AcrR, podobnie jak wiele innych represorów, nale­ży do rodziny represorów TetR. Wszystkie białka repre­sorowe podobne do TetR działają na podobnej zasadzie. Represor wiąże się do operatora, co zapobiega ekspresji transportera. Powoduje to podatność komórki bakteryjnej na toksyczne substancje. Jednak gdy związek pasujący do profilu substratowego znajdzie się w komórce, wiąże się do represora, co umożliwia ekspresję i wytwarzanie bia­łek transporterowych. Kontrola ekspresji systemów wyrzu­tu leków może się również odbywać na zasadzie regulacji pozytywnej dzięki aktywatorom transkrypcji. Przykładem jest regulacja operonu mexEF-oprN przez lokalny aktywa­tor MexT. Gen mexT znajduje się powyżej genów systemu usuwania leków MexEF-OprN i ulega transkrypcji w tym samym kierunku co mexEF-oprN. Nadekspresja MexT in­dukuje ekspresję białek transporterowych [43]. Ekspresja operonu MexEF-OprN regulowana jest również przez produkt genu mexS, który jest represorem tego operonu. Mutacje w genie mexS powodują wzrost ekspresji genów operonu mexEF-oprN [25]. Lokalnym induktorem jest również białko BmrR, występujące u B. subtilis i aktywu­jące transkrypcję transportera Bmr [30]. Innym mechani­zmem kontroli ekspresji białek transporterowych są muta­cje w genach kodujących globalne regulatory. Przykładem mogą być geny soxR i marR występujące m.in. u E. coli i S. enterica. Mutacje w tych genach prowadzą do ich nadekspresji, co powoduje aktywację transkrypcji acrAB [42]. Pozytywnej regulacji przez globalne regulatory podlegają również m.in.: systemy Mex u P. aeruginosa oraz Bmr i Blt u B. subtilis [30]. Innym mechanizmem kontroli ekspresji genów kodujących transportery lekowe są mutacje w re­gionie promotora tych genów. Badania wykazały, że mu­tacje w +5 nukleotydzie mRNA kodującego system norA u S. auerus prowadziły do nadekspresji tego systemu [42]. W wielu przypadkach ekspresja genów kodujących białka transporterowe zwiększa się, gdy w środowisku znajduje się substrat danego białka. Wielolekooporne szczepy kli­niczne często są otrzymywane podczas stosowania terapii antybakteryjnych. Niektóre z leków są szczególnie istot­ne w powstawaniu i selekcji mutantów opornych na anty­biotyki i chemioterapeutyki. Najlepiej zbadaną grupą środ­ków antybakteryjnych w związku z selekcją lekoopornych mutantów są fluorochinolony. Badania wykazały, że opor­ność indukowana działaniem fluorochinolonów powstaje dzięki mutacjom w domenie QRDR (quinolone-resistan­ce-determining region). Fluorochinolony to substancje syn­tetyczne, a docelowym miejscem ich działania jest gyraza DNA, co stwarzało ogromną szansę skutecznego leczenia infekcji bakteryjnych. Jednak okazało się, że działanie tymi chemioterapeutykami na komórki bakteryjne powodowa­ło zwiększone wytwarzanie transporterów lekowych, po­nieważ jest to jedyny mechanizm zapewniający bakteriom oporność na fluorochinolony. Możliwe również, że związ­ki te niszczą bakteryjne DNA i inicjują włączenie systemu naprawy DNA, co pomaga w selekcjonowaniu mutantów opornych na fluorochinolony. Przykładem bakterii, która wystawiona na działanie fluorochinolonów zwiększała wy­twarzanie transporterów jest P. aeruginosa. W zależności od użytego leku powstały różne fenotypy. Na przykład po zadziałaniu kwasem nalidiksowym wyselekcjonowane zo­stały mutanty typu nal, natomiast norfloksacyna powodo­wała generację mutantów typu nfx. Badania nad selekcją lekoopornych mutantów P. aeruginosa in vitro wykazały, że często dochodziło do generowania mutantów poprzez działanie na dzikie szczepy, takimi środkami antybakteryj­nymi jak β-laktamy (zwłaszcza karbenicylina), tetracykli­na, chloramfenikol czy aminoglikozydy. Induktorami po­wstawania wielolekoopornych mutantów mogą być również środki antyseptyczne, takie jak triklosan [30].

6. Naturalne funkcje transporterów lekowych

Mimo ogromnej roli w warunkowaniu oporności na anty­biotyki i chemioterapeutyki, fizjologiczne funkcje trans­porterów błonowych są prawdopodobnie o wiele bardziej złożone. Bardzo ważną rolę spełniają one w transporcie sub­stancji szkodliwych, co zapewnia przetrwanie w niesprzy­jającym środowisku. W przypadku bakterii jelitowych, ich naturalne środowisko bytowania bogate jest w żółć i sole kwasów żółciowych. Są to naturalne substancje o dzia­łaniu antymikrobiologicznym, występujące w układzie pokarmowym ptaków i ssaków, dlatego też naturalna mi­kroflora jelitowa musi mieć mechanizmy ochrony przed tymi substancjami. Ochronę taką zapewniają białka eks­porterowe, które z jednej strony zapobiegają akumulacji soli kwasów żółciowych, a z drugiej promują wydzielanie metabolitów z komórki bakteryjnej. Rolę w zwiększaniu tolerancji na żółć i sole kwasów żółciowych wykazano ba­dając mutanty E. coli, S. enterica serowar Typhimurium oraz Campylobacter jejuni. Delecje komponentów syste­mu AcrAB-TolC lub CmeABC skutkowały w zwiększonej przepuszczalności osłon komórkowych dla soli kwasów żół­ciowych. Natomiast mutanty wykazujące nadekspresję bia­łek wyrzutu były oporne na duże stężenia żółci. U E. coli ekspozycja na sole kwasów żółciowych, takie jak cheno­deoksycholan i taurocholan indukowała aktywację syste­mów AcrAB i EmrAB, natomiast w przypadku S. enteri­ca serowar Typhimurium, wystawienie na działanie żółci uaktywniało mechanizm AcrAB [42]. Wiele różnych funk­cji mają systemy należące do rodziny RND. Są one bardzo ważne dla patogenności bakterii i przetrwania w ich niszy ekologicznej. U P. aeruginosa mechanizm MexAB-OprM odpowiada za eksport kilkunastu czynników wirulencji na zewnątrz komórki. Szczepy wykazujące nadekspresję tego mechanizmu charakteryzowały się mniejszą zdolnością wi­rulencji, spowodowaną zwiększonym eksportem czynników wirulencji. Funkcjonowanie systemu MtrCDE u Neisseria gonorrhoeae zapewnia przetrwanie w obecności hydrofo­bowych substancji śluzówkowych w drogach rodnych [42]. Systemy IefABC u Agrobacterium tumefaciens oraz AcrAB u Erwinia amylovora pełnią istotną rolę w wirulencji i ko­lonizacji roślin. Pompy te eksportują izoflawonoidy i za­pewniają oporność na fitoaleksyny. Podczas badań hodowli tkankowych wykazano, że składniki pomp RND są bardzo istotne w inwazji, adhezji i kolonizacji komórek gospo­darza przez bakterie. Mutanty P. aeruginosa z nieaktyw­nym genem mexB nie miały zdolności kolonizacji komó­rek. Szczepy S. enterica serowar Typhimurium z delecją genu tolC wykazywały słabszą adhezję do ludzkich komó­rek jelita cienkiego, mysich monocytów oraz nie były zdol­ne do inwazji makrofagów [43]. Systemy usuwania leków prawdopodobnie odgrywają też rolę w quorum-sensing. Obecność transporterów promuje eksport cząsteczek sy­gnalnych do kontaktu komórka-komórka. Na wydzielanie sygnalnego chinolonu PQS przez P. aeruginosa wpływa nadekspresja systemu MexEF-OprN. Białko SdiA, będące regulatorem quorum-sensing u E. coli, jest pozytywnym regulatorem systemu AcrAB-TolC. Badania wykazały, że istnieje związek między obecnością systemu AcrAB-TolC u E. coli a transportem wapnia [23].

7. Inhibitory transporterów wielolekowych

W związku z dużym wpływem systemów usuwania leków w warunkowaniu wielolekooporności, konieczne jest za­stosowanie środków hamujących działanie transporterów lekowych. W przeciągu ostatnich lat zidentyfikowano wie­le związków będących inhibitorami transporterów wielole­kowych występujących u bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Wiele z nich zostało wyizolowanych z roślin lub mikroorganizmów.

Badania dotyczące inhibicji pomp wielolekowych wystę­pujących u bakterii Gram-dodatnich prowadzono głów­nie na wielolekoopornych szczepach S. aureus. Związki działające hamująco na transportery lekowe pochodzą głównie ze źródeł naturalnych. Przykładem jest rezerpi­na, alkaloid roślinny po raz pierwszy wyizolowany z ko­rzeni Rauwolfia vomitoria [50]. Działa ona hamująco na białko Bmr, będące transporterem lekowym u B. subtilis. Badania wykazały, że rezerpina oddziałuje bezpośrednio z białkiem Bmr, wiążąc się do kieszeni utworzonej przez fenyloalaninę 143, walinę 286 i fenyloalaninę 306 [42]. Alkaloid ten wzmacnia również działanie tetracykliny, cze­go dowodem był 4-krotny spadek MIC w izolatach klinicz­nych S. aureus mających białka TetK promujące eksport tetracykliny [50]. Rezerpina hamuje również transporter NorA, obecny u S. aureus, przez wzmocnienie działania norfloksacyny [42]. Kolejnym inhibitorem jest flawono­lignan 5′-MHC-D (5′-metoksyhydrokarpin-D). W połą­czeniu z berberyną, która naturalnie wykazuje niewiel­kie właściwości antybakteryjne, obserwowano 16-krotny wzrost działania antybakteryjnego berberyny przeciwko S. aureus. Również zastosowanie niektórych metabolitów fenolowych wzmacniało działanie zarówno berberyny jak i tetracykliny i erytromycyny. Przykładem może być chal­kon, który redukował MIC do tego stopnia, że był on po­równywalny z wartością MIC dla mutantów S. aureus nie­mających białka NorA. Innymi fenolowymi metabolitami są estry kwasu galusowego. EGCG (galusan epigallokate­chiny) wzmaga działanie tetracykliny u szczepów S. aureus mających białka TetK. Badania meksykańskich gatunków „Morning Glory” doprowadziły do izolacji trzech oligo­sacharydów (orizabin XIX, XV i IX), które wzmacniają aktywność norfloksacyny względem szczepów S. aureus charakteryzujących się zwiększoną ekspresją transporte­rów NorA. Kolejnym inhibitorem transporterów lekowych jest piperyna, alkaloid roślinny wyizolowany m.in. z pie­przu czarnego. Badania wykazały, że związek ten zwięk­sza akumulację ciprofloksacyny i powoduje 2-krotny spa­dek MIC dla tego chemioterapeutyku. Aktywność białek transportujących leki hamuje również baikaleina. Jest to flawonoid wyizolowany z liści Thymus vulgaris. Wykazuje silne działanie zwiększające koncentrację tetracykliny oraz niektórych β-laktamów (ampicyliny i oksacyliny) w ko­mórce szczepów S. aureus opornych na metycylinę [50].

Badania dotyczące mechanizmów usuwania leków występu­jących u bakterii Gram-ujemnych doprowadziły do odkrycia i produkcji środków wpływających hamująco na transpor­tery lekowe. Dużą rodzinę inhibitorów białek eksportują­cych leki stanowią peptydomimetyki. Pierwszym zidenty­fikowanym środkiem hamującym transportery lekowe był PAβN (fenyloalanylo-arginylo-naftyloamid), inaczej zwany MC-207,110. Związek ten zwiększa przepuszczalność le­wofloksacyny u różnych szczepów P. aeruginosa, ale rów­nież może wzmagać działanie innych antybiotyków, takich jak chloramfenikol czy makrolidy. PAβN pasuje do profilu substratowego systemów wyrzutu leków i współzawodni­czy z antybiotykiem o miejsce wiązania leku. Dużym pro­blemem w przypadku użycia tego inhibitora w terapii an­tybakteryjnej jest jego znaczna toksyczność. Jest jednak używany w laboratoriach do badań nad inhibicją transpor­terów lekowych. Kolejną klasą związków hamujących sys­temy usuwania leków są pochodne chinolonów. Badania wykazały, że związki te wzmagają działanie antybiotyków należących do różnych rodzin, poprzez zwiększenie ich akumulacji w komórce. Pochodne chinolonów są aktyw­ne względem transporterów wielolekowych obecnych u E. aerogenes i K. pneumoniae. Oba gatunki, po zastosowaniu tych inhibitorów, stawały się wrażliwe na chloramfenikol, tetracyklinę i norfloksacynę, nie wykazano jednak działa­nia przeciwko systemowi MexAB-OprM występującego u P. aeruginosa. Mimo dokładnie zbadanej aktywności po­chodnych chinolonów przeciwko transporterom wieloleko­wym, wciąż trwają badania związane z toksycznością tych środków. Innym inhibitorem transporterów wielolekowych jest arylopiperydyna, która wspomaga akumulację linezo­lidu w komórce E. coli. Z kolei inhibitory należące do ro­dziny arylopiperazyn hamują działanie transporterów RND. Przykładem jest NMP (N-metylopirolidon), który zwięk­sza wewnątrzkomórkową koncentrację różnych związków antybakteryjnych, m.in.: fluorochinolonów, chloramfeniko­lu i linezolidu. Jest on aktywny wobec transporterów leko­wych występujących u Acinetobacter baumannii, rodziny Enterobacteriaceae (z wyjątkiem rodzaju Serratia spp.), jednak nie obserwowano aktywności wobec transporterów P. aeruginosa. Związki należące do rodziny arylopipery­dyn i arylopiperazyn są jednak zbyt toksyczne, aby stoso­wać je w leczeniu ludzi i zwierząt [33].

Mimo istnienia tak wielu związków działających hamu­jąco na systemy wyrzutu leków, żaden z nich nie został wprowadzony do użycia w medycynie i weterynarii. Ze względu na potencjalne lub realne zagrożenie tych środ­ków dla zdrowia konieczne jest przeprowadzenie jeszcze wielu badań dotyczących toksyczności inhibitorów bakte­ryjnych transporterów lekowych.

8. Transportery wielolekowe u grzybów

Oporność wielolekowa drobnoustrojów stanowi poważny problem kliniczny. Zarówno bakterie, jak i grzyby wyko­rzystują różne mechanizmy obrony przed antybiotykami i fungicydami. U grzybów głównym mechanizmem opor­ności jest aktywny eksport leków z komórki za pomocą bia­łek transportujących znajdujących się w błonie komórko­wej. Badania przeprowadzone na drożdżach Saccharomyces cerevisiae wykazały, że za wyrzut leków z komórek grzy­bów odpowiadają głównie białka należące do rodziny ABC.

8.1. Transportery ABC występujące u drożdży Saccharomyces cerevisiae

Całkowita sekwencja genomu S. cerevisiae została opubli­kowana w 1996 roku [13]. Drożdże piekarnicze były pierw­szym organizmem eukariotycznym, dla którego wykona­no analizę sekwencji genomu w celu wyszukania genów wszystkich potencjalnych transporterów ABC. Wykazano istnienie 30 potencjalnych genów transporterów ABC. Wśród wyszukanych białek znalazły sie 22 transportery ABC mające domeny NBD i MSD i 8 białek mających tylko sekwencje NBD. Wśród drożdżowych transporterów wy­różniono 5 podrodzin: PDR, MDR, ALDP, MRP/CFTR, YEF3 i RLI [3,9,34]. Białka ABC u drożdży są zlokali­zowane w błonach komórkowej, wakuoli, mitochondriów, peroksysomów i cytoplazmie.

Białka odpowiedzialne za wielolekooporność należą do podrodziny PDR (pleiotropic drug resistance). Wszystkie białka tej podrodziny to klasyczne pełne transportery zbu­dowane z dwóch domen NBD i TMD, umiejscowione w błonie komórkowej. Odpowiedzialne są za katalizowanie zależnego od ATP transportu związków z cytoplazmy na zewnątrz komórki. Zaliczane do niej transportery Pdr5p i Snq2p należą do najlepiej poznanych spośród białek ABC. Pdr5p i Snq2p to białka lokalizujące się w błonie komór­kowej drożdży, mające szeroki zakres substratowy, obej­mujący antybiotyki, fungicydy, detergenty, jonofory i leki przeciwnowotworowe [45]. Gen PDR5 nie jest niezbędny do życia komórki, jego delecja powoduje jednak hiperwrażliwość komórek na wiele inhibitorów. Wyniki badań wskazują, że Pdr5p jest głównym mediatorem oporności komórek drożdży na azole, powszechnie stosowane środki grzybobójcze. Wśród substratów Pdr5p znalazły sie rów­nież leki przeciwnowotworowe i ludzkie hormony stero­idowe. Szczepy z usuniętym genem PDR5 są więc wyko­rzystywane w projektach dotyczących badań toksycznego działania związków na komórki drożdży [10,22]. Bliskim homologiem PDR5 jest należący do tej samej podrodziny gen SNQ2 (sensitivity to 4nitroquinoline oxide). Początkowo błonowe białko Snq2p zostało scharakteryzowane jako na­dające komórkom oporność na N-tlenek 4-nitrochinoliny (4NQO) w późniejszych badaniach wykazano, że usunię­cie genu SNQ2 powoduje hiperwrażliwość komórek droż­dży na kilkadziesiąt różnych inhibitorów [11,21].

Z wielolekową opornością komórek związane jest również białko Pdr12p. Transporter Pdr12p zidentyfikowano jako nadający komórkom oporność na słabe kwasy organiczne. Pdr12p jest umiejscowiony w błonie komórkowej i katali­zuje zależny od ATP transport anionów karboksylowych na zewnątrz komórki. Wykazano, że substratami pompy Pdr12p są związki stosowane jako konserwanty żywności (np. kwas benzoesowy, kwas sorbowy, kwas propionowy), jak i C1-C7 słabe kwasy organiczne powstające w czasie metabolizmu komórki [18,41]. Najbliższym homologiem głównego mediatora wielorakiej oporności komórki biał­ka Pdr5p jest białko Pdr15p. Transporter Pdr15p nadaje komórkom oporność na chloramfenikol i eter laurylowy polioksyetylenu, które są również substratami Pdr5p [54]. Do podrodziny MDR należy m.in. umiejscowione w błonie komórki białko: Ste6p, odpowiedzialne za eksport czynni­ka a feromonu płciowego. Był to pierwszy odkryty trans­porter błonowy u drożdży S. cerevisiae. Komórki pozba­wione genu STE6 stają sie sterylne [29]. Pozostałe białka należące do podrodziny MDR to zlokalizowane w błonie mitochondrialnej Atm1p, Mdl1p i Mdl2p powiązane z usu­waniem z mitochondriów źle sfałdowanych białek [17,19].

W podrodzinie MRP/CFTR zgrupowane są białka, takie jak: Ycf1p, Bat1p i Bpt1p, Vmr1p, Nft1p i Yor1p. Białka tej rodziny są zlokalizowane w błonie wakuoli, jedynym wyjątkiem jest Yor1p zlokalizowany w błonie komórkowej i są odpowiedzialne za detoksyfikację cytoplazmy poprzez aktywny transport inhibitorów do wakuoli. Ycf1p został scharakteryzowany jako wakuolarny czynnik oporności na metale np. kadm, rtęć, ołów, arsen [27,28]. Białko Bpt1 bierze również udział w detoksyfikacji bilirubiny i kad­mu [39,48]. Vmr1p jest zdolny do transportu wielu róż­nych inhibitorów w tym np. rodaminy6G, kadmu i rtęci. Wykazano, że substraty białek Ycf1p, Bpt1p i Vmr1p są transportowane głównie w postaci koniugatów glutationu rzadziej w postaci nieskoniugowanej [53]. Białko Bat1p bierze udział w transporcie kwasów żółciowych [37]. Yor1p został scharakteryzowany jako transporter wielolekowy. Mutacje inaktywujące gen YOR1 powodowały wrażliwość m.in. na oligomycynę i leki anionowe. Najnowsze dane wskazują również na udział Yor1p w detoksyfikacji kad­mu [8,35]. Nie poznano jeszcze funkcji wszystkich trans­porterów. Pdr11 i Aus1 związane są z pobieraniem stero­li, a także mają wpływ na wzrost komórek w warunkach beztlenowych.

Tak różnorodny charakter transportowanych przez biał­ka ABC związków sugeruje różne możliwe mechanizmy transportu. Nie udało się jeszcze dokładnie scharaktery­zować w jaki sposób białka ABC przenoszą związki przez błony. Zaproponowano trzy modele transportu: klasycz­nej pompy, flipazy i wakuolarnego odkurzacza [2,15,49]. Zgodnie z modelem klasycznej pompy związki przenoszone są z cytoplazmy bezpośrednio przez kanał centralny two­rzony w błonie przez białko (np. Pdr12p). Większość sub­stratów przenoszonych przez transportery ABC ma jednak charakter hydrofobowy, wydaje się więc prawdopodobne, że są one wyłapywane bezpośrednio w błonie i usuwane na zewnątrz w systemie molekularnego odkurzacza lub po­przez aktywność flipazową ABC (np. Pdr5p) w ruchu flip-flop. W każdym z tych modeli wykorzystywana jest ener­gia uzyskana z rozkładu dwóch cząsteczek ATP. Uważa sie, że przyłączenie substratu do domen TMD zwiększa powinowactwo białek do ATP, natomiast związanie ATP wymusza zmianę konformacji białka umożliwiającą prze­pchnięcie substratu na drugą stronę błony [2].

Pompy ABC zidentyfikowano również u innych grzybów, w tym u patogennych Candida albicans. Wykazano, że substratami białka Cdr1p, najlepiej scharakteryzowanego transportera ABC u C. albicans, są m.in. cykloheksymid, flukonazol, ketokonazol, itrakonazol i oligomycyna, hor­mony steroidowe, chloramfenikol. Białko Cdr1p z powo­dzeniem ekspresjonowano w S. cerevisiae [52].

8.2. Transportery MF występujące u S. cerevisiae

Wielolekooporność nie jest związana jedynie z działaniem transporterów ABC. Badania wykazały, że u drożdży wy­stępują również białka należące do rodziny pomp protono­wych MF. Transportery te potrzebną do transportu energię czerpią z gradientu protonów po obu stronach błony. Białka te nie mają domen NBD. Ze względu na liczbę transbło­nowych domen TMD dzielimy je na 12- i 14-transbłono­we. Białka MF transportują chemioterapeutyki, ale rów­nież katalizują transport substancji endogennych, takich jak intermediaty cyklu Krebsa czy oligosacharydy [38,46,47].

Najlepiej poznane MF transportery to: Atr1p – nadają­cy komórce oporność na aminotriazol, Sge1p – związany z opornością na kationowe barwniki, Hxt9p – transporter heksoz oraz białko Tpo1p będące wakuolarnym transpor­terem poliaminowym [12,36].

W przypadku Candida albicans najlepiej poznanym trans­porterem MF jest Ca MDR1(BEN) odpowiedzialny za nadawanie komórkom oporności na benomyl, metotreksat i azole. Nadekspresja FLU1 przyczynia się do oporności komórek C. albicans na flukonazol i kwas mukofenolowy [6,16]. Podobnie jak w bakteryjnych systemach usuwania leków, transportery drożdżowe również mają swoją fizjo­logiczną rolę niezwiązaną z eksportem leków. Ich natu­ralne funkcje polegają na dwukierunkowym transporcie hydrofobowych substratów egzogennych, takich jak jony metali, peptydy, lipidy, cholesterol czy witaminy oraz en­dogennych steroidów, cytokin czy bilirubiny [45].

8.3. Regulacja ekspresji białek PDR u drożdży

Systemy usuwania leków typu PDR (pleiotropic drug resi­stance) tworzą sieć genów obejmującą geny kodujące białka transporterów błonowych oraz geny PDR1 i PDR3. Geny PDR1 i PDR3 kodują czynniki transkrypcyjne regulujące ekspresję transporterów PDR. Dominujące mutacje spon­taniczne, które aktywują transkrypcję genów PDR1 lub PDR3 powodują powstawanie fenotypu wielolekooporno­ści poprzez aktywny transport leków z komórki lub mo­dyfikacje biernej dyfuzji leków do komórki przez zmianę składu lipidów błony komórkowej [20]. Pdr1p i Pdr3p na­leżą do rodziny czynników transkrypcji GAL4. Cechą cha­rakterystyczną tej rodziny jest motyw Zn2Cys6 wiążący DNA. Pdr1p i Pdr3p przyłączają się do sekwencji PDRE (Pdr1p/Pdr3p response element) obecną w promotorach ge­nów docelowych. Aktywuje to transkrypcję genów kodu­jących transportery PDR. Mimo wielu podobieństw w bu­dowie i ogólnej funkcji, białka Pdr1p i Pdr3p rozpoznają i aktywują różne geny. Struktura obu czynników trans­krypcji jest podobna. Oba mają domenę z palcem cynko­wym wiążącą DNA, znajdującą się na N-końcu. W centrum obu białek znajduje się osiem motywów hydrofobowych (MI-MVIII). Białko Pdr1p ma dwa regiony aktywujące (AR). ARI znajduje się przy N-końcu, natomiast bardziej znaczący ARII jest umiejscowiony przy C-końcu. Pdr3p ma jeden region aktywujący [20]. Czynniki Pdr1p i Pdr3p regulują transkrypcję wielu genów związanych z oporno­ścią na inhibitory. Są to m.in. geny kodujące białka bło­nowe ABC (Pdr5p, Pdr10p, Pdr15p, Snq2p, Yor1p), geny kodujące transportery należące do rodziny MF (Hxt9p, Hxt11p), gen IPT1/D4405, którego produkt wpływa na bio­syntezę sfingolipidów, gen PDR16 kodujący białko mające wpływ na skład fosfolipidów i steroli w błonie komórkowej, TPO1 kodujący wakuolarny transporter poliamidy, perme­azy HXT2, RTA1, YOR049c oraz geny kodujące białka za­angażowane w metabolizm lipidów i ściany komórkowej. Białka Pdr1p i Pdr3p wpływają również na zahamowanie ekspresji niektórych białek, np. Pdr12p będącego transpor­terem typu ABC, odpowiedzialnym za oporność na sorbi­nian, benzoesan i octan [20]. Transportery PDR są rów­nież regulowane przez wiele innych czynników. Badania wykazały, że w kontrolę transkrypcji genów kodujących białka transporterowe zaangażowany jest czynnik yAP-1. Białka podlegające kontroli czynnika yAP-1 zapewniają drożdżom oporność m.in. na kadm, cykloheksymid oraz wiele innych toksycznych związków [1].

9. Podsumowanie

Oporność wielolekowa coraz częściej pojawiająca się wśród bakterii i grzybów stała się poważnym problemem w lecze­niu zakażeń. Jednym z szeroko rozpowszechnionych mecha­nizmów oporności są systemy aktywnego usuwania leków z komórek. Białka te pozwalają bakteriom i grzybom prze­żyć w środowisku zawierającym toksyczne dla nich sub­stancje, natomiast występowanie wielu czynników regulu­jących ich ekspresję zapewnia prawidłowe funkcjonowanie transporterów lekowych. Znane są substancje hamujące działanie systemów wyrzutu leków jednak wciąż wymaga­ją zbadania pod kątem toksyczności. Poznanie dokładne­go działania transporterów oraz ewentualnych możliwości inhibicji ich działania stanowi krok w kierunku pokonania infekcji wywoływanych przez wielolekooporne szczepy.

PIŚMIENNICTWO

[1] Alarco A., Balan I., Talibi D., Mainville N., Raymond M.: AP1-mediated multidrug resistance in Saccharomyces cerevisiae requires FLR1 encoding a transporter of the major facilitator superfamily. J. Biol. Chem., 1997; 272: 19304-19313
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[2] Ambudkar S.V., Kim I.W., Sauna Z.E.: The power of the pump: mechanism of action of P-glycoprotein (ABCB1). Eur. J. Pharm. Sci., 2006; 27: 392-400
[PubMed]  

[3] Bauer B.E., Wolfger H., Kuchler K.: Inventory and function of yeast ABC proteins: about sex, stress, pleiotropic drug and heavy metal resistance. Biochim. Biophys. Acta., 1999; 1461: 217-236
[PubMed]  

[4] Borges-Walmsley M.I., McKeegan K.S., Walmsley A.R.: Structure and function of efflux pumps that confer resistance to drugs. Biochem. J., 2003; 376: 313-338
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[5] Borges-Walmsley M.I., Walmsley A.R.: The structure and function of drug pumps. Trends Microbiol., 2001; 9: 71-79
[PubMed]  

[6] Calabrese D., Bille J., Sanglard D.: A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology, 2000; 146: 2743-2745
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[7] Chen Y.J., Pornillos O., Lieu S., Ma C., Chen A.P., Chang G.: X-ray structure of EmrE supports dual topology model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007; 104: 18999-19004
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[8] Cui Z., Hirata E., Tauchiya H., Osada H., Miyakawa T.: The multidrug resistance associated protein (MRP) subfamily (YRS1/Yor1) of S. cerevisiae is important for the tolerance to a broad range of organic anions. J. Biol. Chem., 1996; 271: 14712-14716
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[9] Decottignies A., Goffeau A.: Complete inventory of the yeast ABC proteins. Nat. Gen., 1997; 15: 137-145
[PubMed]  

[10] Decottignies A., Kolaczkowski M., Balzi E., Goffeau A.: Solubilization and characterization of the overexpressed PDR5 multidrug resistance nucleotide triphosphatase of yeast. J. Biol. Chem., 1994; 296: 12797-12803
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[11] Decottignies A., Lambert L., Catty P., Degand H., Epping E.A., Moye-Rowley W.S., Balzi E., Goffeau A.: Identification and characterization of SNQ2, a new multidrug ATP-binding cassette transporter of the yeast plasma membrane. J. Biol. Chem., 1995; 270: 18150-18157
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[12] Ehrenhofer-Murray A.E., Seitz K., Sengstag C.: The Sge1 protein of Saccharomyces cerevisiae is a membrane associated multidrug transporter. Yeast, 1998; 14: 49-65
[PubMed]  

[13] Goffeau A., Barrell B.G., Bussey H., Davis R.W., Dujon B., Feldmann H., Galibert F., Hoheisel J.D., Jacq C., Johnston M., Louis E.J., Mewes H.W., Murakami Y., Philippsen P., Tettelin H., Oliver S.G.: Life with 6000 genes. Science, 1996; 247: 546-567
[PubMed]  

[14] Hieter P., Bassett D.E. Jr, Valle D.: The yeast genome: the common currency. Nat. Genet., 1996; 13: 253-255
[PubMed]  

[15] Higgins C.F., Gottesman M.M.: Is the multidrug transporter a flippase? Trends Biochem. Sci., 1992; 17: 18-21
[PubMed]  

[16] Hiller D., Sanglard D., Morschhauser J.: Overexpression of MDR1 gene is sufficient to confer increased resistance to toxic compounds in Candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother., 2006; 50: 1365-1371
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[17] Hofacker M., Gompf S., Zutz A., Presenti C., Haase W., van der Does C., Model K., Tampe R.: Structural and functional fingerprint of the mitochondrial ATP-binding cassette transporter Mdl1 from Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 2007; 282: 3951-3961
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[18] Holyoak C.D., Bracey D., Piper P.W., Kuchler K., Coote P.J.: The Saccharomyces cerevisiae weak-acid-inducible ABC transporter Pdr12 transports fluorescein and preservative anions from the cytosol by an energy-dependent mechanism. J. Bacteriol., 1999; 181: 4644-4652
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[19] Kispal G, Csere P., Guiard B., Lill R.: The ABC transporter Atm1p is required for mitochondrial iron homeostasis. FEBS Lett., 1997; 418: 346-350
[PubMed]  

[20] Kołaczkowska A., Goffeau A.: Regulation of pleiotropic drug resistance in yeast. Drug Resist. Updat., 1999; 2: 403-414
[PubMed]  

[21] Kolaczkowska A., Kolaczkowski M., Goffeau A., Moye-Rowley S.: Compensatory activation of the multidrug transporter Pdr5p, Snq2p, and Yor1p, by Pdr1p in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett., 2008; 582: 977-983
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[22] Kolaczkowski M., Van der Rest M., Cybularz Kolaczkowska A., Soumillion J.P., Konings W.N., Goffeau A.: Anticancer drugs. Ionophoreric peptides and steroids as substrates of the yeast multidrug transporter Pdr5p. J. Biol. Chem., 1996; 271: 31543-31548
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[23] Kumar A., Schweizer H.P.: Bacterial resistance to antibiotics: active efflux and reduced uptake. Adv. Drug Deliv. Rev., 2005; 57: 1486-1513
[PubMed]  

[24] Laundy A.E.: Systemy MDR – istotny mechanizm oporności pałeczek gram-ujemnych na antybiotyki i chemioterapeutyki. Postępy Mikrobiol., 2008; 47: 415-422

[25] Levy S.B.: Active efflux mechanisms for antimicrobial resistance. Antimicrob. Agents Chemother., 1992; 36: 695-703
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[26] Li X.Z., Nikaido H.: Efflux-mediated drug resistance in bacteria. Drugs, 2004; 64: 159-204
[PubMed]  

[27] Li Z.S., Lu Y.P., Zhen R.G., Szczypka M., Thiele D.J., Rea P.A.: A new pathway fore vacuolar cadmium sequestration in Saccharomyces cerevisiae: YCF1-catalyzed transport of bis(glutathionato)cadmium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997; 94: 42-47
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[28] Li Z.S., Szczypka M., Lu Y.P., Thiele D.J., Rea P.A.: The yeast cadmium factor protein (YCF1) is a vacuolar glutathione S-conjugate pump. J. Biol. Chem., 1996; 271: 6509-6517
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[29] Loayza D., Tam A., Schmidt W.K., Michaelis S.: Ste6p mutants defective in exit from the endoplasmic reticulum (ER) reveal aspects of an ER quality control pathway in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell, 1998; 9: 2767-2784
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[30] Lomovskaya O., Zgurskaya H.I., Totrov M., Watkins W.J.: Waltzing transporters and ‘the dance macabre’ between humans and bacteria. Nat. Rev. Drug Discov., 2007; 6: 56-65
[PubMed]  

[31] Lubelski J., Konings W.N., Driessen A.J.: Distribution and physiology of ABC-type transporters contributing to multidrug resistance in bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2007; 71: 463-476
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[32] Mahamoud A., Chevalier J., Alibert-Franco S., Kern W.V., Pagés J.M.: Antibiotic efflux pumps in gram-negative bacteria: the inhibitor response strategy. J. Antimicrob. Chemother., 2007; 59: 1223-1229
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[33] Markham P.N., Neyfakh A.A.: Efflux-mediated drug resistance in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol., 2001; 4: 509-514
[PubMed]  

[34] Michaelis S., Berkower C.: Sequence comparison of yeast ATP-binding cassette proteins. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1995; 60: 291-307
[PubMed]  

[35] Nagy Z., Montigny C., Leverrier P., Yeh S., Goffeau A., Garrigos M., Falson P.: Role of the yeast ABC transporter Yor1p in cadmium detoxification. Biochimie, 2006; 88: 1665-1671
[PubMed]  

[36] Nourani A., Wesolowski-Louvel M., Delaveau T., Jacq C., Delahodde A.: Multiple-drug-resistance phenomenon in the yeast Saccharomyces cerevisiae: involvement of two hexose transporters. Mol. Cell. Biol., 1997; 17: 5453-5460
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[37] Ortiz D.F., St-Pierre M.V., Abdulmessih A., Arias I.M.: A yeast ATP-binding cassette-type protein mediating ATP-dependent bile acid transport. J. Biol. Chem., 1997; 272: 15358-15365
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[38] Paulsen I.T., Brown M.H., Skurray R.A.: Proton-dependent multidrug efflux systems. Microbiol. Rev., 1996; 60: 575-608
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[39] Petrovic S., Pascolo L., Cupelli F., Ostrow J.D., Goffeau A., Tiribelli C., Bruschi C.V.: The product of Ycf1 and YLL015w (BPT1) cooperate for the ATP-dependent vacuolar transport of unconjugated bilirubin in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 2000; 16: 561-571
[PubMed]  

[40] Piddock L.J.: Clinically relevant chromosomally encoded multidrug resistance efflux pumps in bacteria. Clin. Microbiol. Rev., 2006; 19: 382-402
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[41] Piper P., Mahe Y., Thompson S., Pandjaitan R., Holyoak C., Egner R., Muhlbauer M., Coote P., Kuchler K.: The pdr12 ABC transporter is required for the development of weak organic acid resistance in yeast. EMBO J., 1998; 17: 4257-4265
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[42] Poole K.: Efflux-mediated antimicrobial resistance. J. Antimicrob. Chemother., 2005; 56: 20-51
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[43] Poole K.: Efflux-mediated multiresistance in Gram-negative bacteria. Clin. Microbiol. Infect., 2004; 10: 12-26
[PubMed]  

[44] Putman M., van Veen H.W., Konings W.N.: Molecular properties of bacterial multidrug transporters. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2000; 64: 672-693
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[45] Rogers B., Decottignies A., Kołaczkowski M., Carvajal E., Balzi E., Goffeau A.: The pleitropic drug ABC transporters from Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2001; 3: 207-214
[PubMed]  

[46] Sá-Correia I., dos Santos S.C., Teixeira M.C., Cabrito T.R., Mira N.P.: Drug H+ antiporters in chemical stress response in yeast. Trends Microbiol., 2009; 17: 22-31
[PubMed]  

[47] Sa-Correia I., Tenreiro S.: The multidrug resistance transporters of the major facilitator superfamily, 6 years after disclosure of Saccharomyces cerevisiae genome sequence. J. Biotechnol., 2002; 98: 215-226
[PubMed]  

[48] Sharma K.G., Mason D.L., Liu G., Rea P.A., Bachhawat A.K., Michaelis S.: Localization, regulation, and substrate transport properties of Bpt1p, a Saccharomyces cerevisiae MRP-type ABC transporter. Eucaryot. Cell., 2002; 1: 391-400
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[49] Sharom F.J., Lugo M.R., Eckford P.D.: New insight into the drug binding, transport and lipid flippase activities of the p-glycoprotein multidrug transporter. J. Bioenerg. Biomembr., 2005; 37: 481-487
[PubMed]  

[50] Stavri M., Piddock L.J., Gibbons S.: Bacterial efflux pump inhibitors from natural sources. J. Antimicrob. Chemother., 2007; 59: 1247-1260
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[51] Van Bambeke F., Balzi E., Tulkens P.M.: Antibiotic efflux pumps. Biochem. Pharmacol., 2000; 60: 457-470
[PubMed]  

[52] Wakiec R., Prasad R., Morschauser J., Barchiesi F., Borowski E., Milewski S.: Voriconazole and multidrug resistance in Candida albicans. Mycoses, 2006; 50: 109-115
[PubMed]  

[53] Wawrzycka D., Sobczak I., Bartosz G., Bocer T., Ułaszewski S., Goffeau A.: Vmr1p is a novel vacuolar multidrug resistance ABC transporter in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res., 2010; 10: 828-838
[PubMed]  

[54] Wolfger H., Mamnun Y.M., Kuchler K.: The yeast Pdr15p ATP-binding cassette (ABC) protein is a general stress response factor implicated in cellular detoxification. J. Biol. Chem., 2004; 279: 11593-11599
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[55] Zgurskaya H.I., Nikaido H.: Multidrug resistance mechanisms: drug efflux across two membranes. Mol. Microbiol., 2000; 37: 219-225
[PubMed]  

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Full text