Abstract

The enzyme DOPA decarboxylase (aromatic-L-amino-acid decarboxylase, DDC) plays an important role in the dopaminergic system and participates in the uptake and decarboxylation of amine precursors in the peripheral tissues. Apart from catecholamines, DDC catalyses the biosynthesis of serotonin and trace amines. It has been shown that the DDC amino acid sequence is highly evolutionarily conserved across many species. The activity of holoenzyme is regulated by stimulation/blockade of membrane receptors, phosphorylation of serine residues, and DDC interaction with regulatory proteins. A single gene codes for DDC both in neuronal and non-neuronal tissue, but synthesized isoforms of mRNA differ in the 5′ UTR and in the presence of alternative exons. Tissue-specific expression of the DDC gene is controlled by two spatially distinct promoters – neuronal and non-neuronal. Several consensus sequences recognized by the HNF and POU family proteins have been mapped in the neuronal DDC promoter. Since DDC is located close to the imprinted gene cluster, its expression can be subjected totightly controlled epigenetic regulation. Perturbations in DDC expression result in a range of neurodegenerative and psychiatric disorders and correlate with neoplasia. Apart from the above issues, the role of DDC in prostate cancer, bipolar affective disorder, Parkinson’s disease and DDC deficiency is discussed in our review. Moreover, novel and prospective clinical treatments based on gene therapy and stem cells for the diseases mentioned above are described.

Introduction

DOPA-dekarboksylaza (dekarboksylaza L-aminokwasów aromatycznych, aromatic-L-amino-acid decarboxylase, DOPA-decarboxylase, DDC, AADC) (EC 4.1.1.28) jest drugim enzymem szlaku syntezy amin katecholowych (ryc. 1). Ze względu na rodzaj przeprowadzanej reakcji oraz wykorzystywany koenzym, DDC należy do II podgrupy rodziny α-aminotransferaz [12]. Aktywny enzym w obecności cząsteczki fosforanu pirydoksalu (PLP), dekarboksyluje L-3,4-dihydroksyfenyloalaninę (DOPA) do dopaminy (DA) [128]. Po raz pierwszy obecność DDC stwierdzono w latach 30 ub.w. w ekstraktach białkowych pochodzących z ssaczych nerek [128]. Wyniki otrzymane przez wielu badaczy wykazały, że enzym uczestniczy nie tylko w syntezie DA, ale i serotoniny oraz amin śladowych (tyraminy, 2-fenyloetyloaminy i tryptaminy) (ryc. 2) [128]. Możliwość syntezy różnych produktów przez DDC może wynikać z dywergencyjnej ewolucji obserwowanej w grupie dekarboksylaz i poszerzenia zakresu substratowego tego enzymu [124]. Ze względu na sposób syntezy i tkankowe umiejscowienie wyróżniono neuronalną (nDDC) oraz obwodową (oDDC) DDC. nDDC jak i kodujący ją transkrypt występują głównie w neuronach katecholaminergicznych, serotoninergicznych oraz komórkach chromochłonnych rdzenia nadnerczy. Enzym występuje również w neuronach pozbawionych aktywności hydroksylazy tyrozynowej (TH) i tryptofanowej (TPH) [11] oraz komórkach glejowych [66,75]. Ekspresję oDDC wykazano m.in. w komórkach nerek, wątroby, płuc, serca, przewodu pokarmowego i trzustki, a także w tkance tłuszczowej i keratynocytach [11,26]. W obu przypadkach powstający polipeptyd charakteryzuje się podobnymi właściwościami biochemicznymi, choć jest syntetyzowany na matrycach jednego z dwóch rodzajów mRNA, powstającego po aktywacji promotora – neuronalnego lub obwodowego [4,5]. Fizjologiczne znaczenie oDDC nie zostało jeszcze w pełni opisane poza nielicznymi tkankami/organami. Wykazano, że wytwarzanie dopaminy w nerkach jest związane z istnieniem endokrynnych komórek systemu APUD, biorących udział w wychwycie i dekarboksylacji prekursorów amin, istotnym w regulacji stężenia sodu oraz fosforu w organizmie [7,33,62]. Ponadto, oDDC budzi zainteresowanie badaczy głównie ze względu na rolę w terapii PD prowadzonej za pomocą podawanej egzogennie L-DOPA, której skuteczność jest zależna od zablokowania aktywności DCC metabolizującej lek w tkankach obwodowych [33,45].

Budowa, funkcja i czynniki regulujące aktywność enzymu DDC

Budowa cząsteczki enzymu DCC oraz jej właściwości

Porównanie składu sekwencji aminokwasowych DDC różnych gatunków zwierząt wykazało, że białko to jest zachowywane w toku ewolucji. DDC człowieka jest ponad 88% identyczne z sekwencjami bydła, świni czy szczura. Najniższy (59%) poziom identyczności stwierdzono między ludzką DDC a sekwencjami pochodzącymi z filogenetycznie odległej grupy organizmów, jakimi są owady [79]. Duże podobieństwo sekwencji aminokwasowej, struktury oraz kinetyki prowadzonej reakcji występuje również między DDC zwierząt a ich roślinnymi odpowiednikami – dekarboksylazą L-tryptofanu i L-tyrozyny [38]. Funkcjonalna DDC jest homodimerem o masie około 100 kDa [29,77,78,89,108]. W monomerze DDC człowieka wyróżniono trzy występujące po sobie domeny N, L i C, których granice wyznaczają 85 i 360 aa łańcucha [42] (ryc. 3). Domena N ma budowę charakterystyczną dla II grupy dekarboksylaz – stwierdzono w niej obecność trzech helis α odpowiedzialnych za wytworzenie miejsca styku między dwoma monomerami DDC i nadanie enzymowi struktury czwartorzędowej [42]. Poszczególne motywy domeny N, a także przyległej do niej dużej domeny L, łączą pętle o niskim poziomie strukturalnego uporządkowania [23,42]. Wiele reszt aminokwasowych trzech pierwszych pętli tworzy wiązania z substratem DDC [23] (ryc. 3). Centralną częścią domeny L jest motyw strukturalny, w skład którego wchodzi siedmioniciowa harmonijka β typu mieszanego, oskrzydlona przez osiem helis α o typowym układzie α/β [23]. W obszarze tym znajduje się centrum aktywne enzymu, którego krytycznym elementem jest reszta lizyny 303 odpowiedzialna za wiązanie PLP (ryc. 3) – aktywnej postaci witaminy B6 [13]. Niedobór bądź nieprawidłowości w przemianach związków z grupy witaminy B6 powodują spadek aktywności DDC. Dziedziczne zaburzenia metabolizmu tych związków mogą być mylone z niedoborem DDC, ponieważ obraz kliniczny oraz charakterystyka biochemiczna obu schorzeń jest podobna [7,114]. Mała domena C, podobnie jak domena L, wykazuje budowę typową dla rodziny aminotransferaz asparaginowych, zawiera czteroniciową przeciwrównoległą harmonijkę β oraz trzy helisy α [23]. Region ten uczestniczy w stabilizacji konformacji enzymu przez utworzenie krótkiej, dwuniciowej struktury harmonijki β z kilkoma aa domeny N [23,42].

Badania kinetyczne i krystalograficzne wykazały, że czwartorzędowa struktura DCC pozostaje w ścisłym związku z liczbą cząsteczek kofaktora przyłączanych przez enzym [42]. Otwarta konformacja apoenzymu umożliwia stopniowe wysycenie miejsc dla PLP z przewagą wiązania przez jedną z dwóch asymetrycznie ułożonych podjednostek. Proces ten wywołuje aktywację i wyższy stopień strukturalnego uporządkowania monomerów, zwłaszcza w obrębie niesfałdowanych pętli. Dochodzi do zbliżenia obu domen L i przyjęcia przez holoenzym zamkniętej struktury [23,42]. Przejście konformacyjne wiąże się z obniżeniem tempa degradacji enzymu w wyniku stabilizacji jego konformacji [13]. Potwierdzeniem tej hipotezy są doświadczenia Matsuda i wsp., które wykazały 20-krotnie wyższy poziom degradacji apoezymu w porównaniu z holoenzymem w komórkach szczurzej linii PC12 [80]. Wiązanie kofaktora przez apoenzym zależy od stężenia PLP i jest uważane za jeden z mechanizmów regulujących liczbę cząsteczek DDC w komórce [80]. Zaobserwowano, że wśród 23 mutacji punktowych genu DDC występujących u chorych z zaburzeniami syntezy neuroprzekaźników 16 to mutacje strukturalne, przekładające się na zmiany konformacji białka [42] oraz zaburzenia w strukturze miejsca wiązania kofaktora [12].

Wyniki doświadczeń opartych na frakcjonowaniu, immunoblotingu oraz pomiarach aktywności enzymatycznej, prowadzone na nieneuronalnych i neuronalnych ssaczych liniach komórkowych lub izolowanych tkankach, wykazały obecność aktywnej postaci DDC we frakcji błonowej oraz frakcji białek rozpuszczalnych [25,70,71,98]. Towarzyszący procesowi dysocjacji z frakcji błonowej wzrost aktywności enzymatycznej DDC może stanowić mechanizm kontrolujący właściwości katalityczne tego białka [25]. Badania lizatów szczurzego prążkowia dokumentują koprecypitację DDC z występującym w błonie pęcherzykowym transporterem monoamin (VMAT2), zaangażowanym w transport neuroprzekaźników do wnętrza pęcherzyków synaptycznych [24]. Jak wykazano, DDC nie jest jedynym białkowym partnerem VMAT2. Jednoczesne interakcje transportera z pierwszym w kolejności enzymem szlaku syntezy katecholamin, którym jest TH oraz DDC przypuszczalnie umożliwiają skoordynowanie procesu syntezy dopaminy i jej magazynowania w pęcherzykach synaptycznych [24]. Ponadto wykazano, że czynnikami decydującymi o rozpuszczalności enzymu jest pH środowiska oraz stężenie jonów metali dwuwartościowych [25].

Regulacja aktywności DCC

Zróżnicowany, zależny od bodźca, sposób regulacji DDC leży u podstaw poprawnego działania całego układu dopaminergicznego. Stymulacja neuronów DDC+ doprowadza do powstania odpowiedzi komórki na stres, pozostającej w ścisłym związku z czasem i rodzajem czynnika zaburzającego homeostazę [45]. W czasie odpowiedzi krótkotrwałej wykorzystana zostaje pula zsyntetyzowanej DDC, podczas gdy stężenia mRNA DDC oraz białka pozostają bez zmian [11,63]. Do aktywacji enzymu dochodzi w wyniku jego interakcji z białkami regulatorowymi, do których należy DJ1 i/lub procesu fosforylacji DDC przez swoiste kinazy białkowe [11,45,63]. Wydłużenie czasu pobudzania powoduje wejście neuronów DDC+ w drugą fazę odpowiedzi – długotrwałą. Prócz opisanej mobilizacji dostępnej puli enzymu, dochodzi wówczas do aktywacji transkrypcyjnej genu oraz uruchomienia mechanizmów potranskrypcyjnej i potranslacyjnej regulacji DDC [22,27,28,47].

Regulacja DDC przez receptory błonowe

Złożona, plastyczna odpowiedź komórki dopaminergicznej po stymulacji/hamowaniu adrenergicznych, cholinergicznych, dopaminergicznych, GABA-ergicznych, glutaminergicznych i serotoninergicznych receptorów błonowych obejmuje etap regulacji aktywności DDC [45]. Sposób i poziom aktywacji enzymu pozostaje w ścisłym związku z profilem farmakologicznym oraz typem docelowego receptora [27,28,130]. Uważa się, że podanie antagonistów receptorów zwiększa aktywność DDC, natomiast ich stymulacja wiąże się ze spadkiem aktywności enzymu [27,28,45,47,129]. Pogląd ten potwierdzają doświadczenia, w których hamowanie receptorów dopaminergicznych, serotoninergicznych czy glutaminergicznych wywoływało aktywację DDC w neuronach prążkowia gryzoni [27,46,47,87]. Wzrost aktywności DDC obserwowano także po podaniu niektórych rodzajów agonistów [27,28,46,47]. Omawiany skutek aktywacji może wystąpić zarówno w mechanizmie krótko- jak i długoterminowej odpowiedzi na bodziec [45]. Ponadto, aktywność DDC może być zdeterminowana genetycznie. U osób będących nosicielami allelu A1 genu receptora D2, u których funkcja tego receptora jest zaburzona, występuje wrodzona podwyższona aktywność enzymu w prążkowiu [73]. Stymulacja neuronów DDC+ może doprowadzić do uruchomienia odmiennych mechanizmów komórkowych w czasie odpowiedzi długoterminowej. Rodzaj wywoływanego efektu oraz jego natężenie jest zależne od umiejscowienia neuroanatomicznego neuronu dopaminergicznego [45]. Długotrwałe podawanie myszom antagonistów receptorów D1 (SCH23390) i D2 (haloperydolu) powoduje wzrost aktywności oraz nagromadzenie białka DDC w prążkowiu, a także zwiększa stężenie transkryptu DDC w śródmózgowiu [28]. Również pojedyncza iniekcja klozapiny – mało selektywnego antagonisty receptorów dopaminergicznych oraz serotoninergicznych, powoduje akumulację DDC w prążkowiu oraz zróżnicowany wzrost stężenia mRNA DDC w neuronach brzusznego pola nakrywki, istoty czarnej, miejsca sinawego oraz jąder szwu u myszy [87]. Nie odnotowano natomiast wpływu długotrwałego podawania agonisty receptorów D1 (SKF38393) na aktywność enzymatyczną DDC, ani na stężenie kodującego ją transkryptu [28].

Regulacja aktywności DDC w procesie fosforylacji

Obserwowany in vivo wzrost aktywności DDC w prążkowiu i śródmózgowiu myszy po dokomorowym podaniu aktywatorów białkowej kinazy A zależnej od cAMP (PKA) pozwolił na postawienie hipotezy o jej udziale w regulacji aktywności dekarboksylazy [125,126]. Badania in vitro z użyciem natywnej DDC izolowanej z obu wymienionych obszarów mózgu oraz rekombinowanej bydlęcej DDC dowodzą bezpośredniej fosforylacji przez PKA [34]. Osiągnięcie in vivo większej aktywności przez rekombinowaną DDC autorzy tłumaczą częściową fosforylacją natywnego enzymu [34]. Inną kinazą zdolną do modyfikacji sekwencji DDC jest umiejscowiony w neuronach dopaminergicznych oraz serotoninergicznych typ Iα białkowej kinazy zależnej od cGMP (PKG). Inkubacja zarówno natywnej DDC uzyskanej z prążkowia myszy, jak i zrekombinowanej postaci enzymu z PKG, powoduje istotny wzrost aktywności dekarboksylazy [35]. Proces aktywacji z udziałem PKG został potwierdzony w obecności swoistego inhibitora, po dodaniu którego nie obserwowano zmian kinetyki DDC [35]. Ponadto wykazano, że sekwencja DDC jest modyfikowana przez kinazę białkową II zależną od wapnia/kalmoduliny (CaMKII), biorącą udział w kontroli aktywności takich enzymów neuronalnych jak TH i TPH [44]. Mimo że sekwencja aminokwasowa DDC jest rozpoznawana przez wiele kinaz, jak dotąd nie zmapowano doświadczalnie aa bezpośrednio włączonych w ten proces. Analiza wyłonionej na podstawie cDNA sekwencji aminokwasowej DDC myszy wskazuje, że mogą nimi być Ser220, Ser336, Ser359, Thr320 i Ser429 [34,44]. Fosforylacja rożnych aa przez kinazy aktywowane odmiennymi szlakami sygnałowymi może być jednym z mechanizmów kontrolujących aktywność DDC w czasie krótko- lub długoterminowej odpowiedzi na bodziec docierający do komórki.

Fizjologiczne znaczenie procesu fosforylacji DDC, zwłaszcza w przypadku oDDC, jest wciąż niewyjaśnione. Doświadczenia Waymire’a i Haycocka [111] z użyciem homogenatów komórek chromochłonnych nadnerczy nie wykazały zmian w poziomie ufosforylowania oraz aktywności DDC po zadziałaniu aktywatorami (forskolina, dwumaślan forbolu) lub inhibitorami (kwas okadaikowy) kinaz, a także związkami zwiększającymi aktywność wydzielniczą komórek (jony potasu, acetylocholina) [122]. Dlatego też, otrzymane w warunkach in vitro wyniki wymagają uzupełnienia i wykorzystania modeli badawczych umożliwiających zdefiniowanie znaczenia tego procesu in vivo.

Wpływ białek regulatorowych na kinetykę DDC

Białko α-synukleina

Α-synukleina (ASN) jest białkiem opiekuńczym odpowiedzialnym m.in. za utrzymaniem homeostazy DA w układzie dopaminergicznym. ASN może pełnić tę funkcję bezpośrednio przez interakcje z docelowymi białkami, w tym polipeptydami włączonymi w syntezę DA [68]. Pośrednia regulacja obejmuje aktywację białek o charakterze regulatorowym i/lub wpływ na ekspresję genów kodujących ich mRNA [9]. Wśród białek odpowiadających za proces syntezy DA regulowanych przez ASN znajduje się: kinaza białkowa regulowana sygnałami zewnątrzkomórkowymi (ERK), białkowa kinaza C (PKC), fosfataza białkowa 2A (PP2A) oraz enzym TH [64,91,93,94]. Ponadto wykazano, że mutacja sekwencji kodującej ASN A53T skutkująca powstaniem nieprawidłowego białka, uniemożliwia ich regulację i jest uważana za jedną z przyczyn dziedzicznej postaci choroby Parkinsona (PD) [96].

Jednym z przejawów wpływu ASN na funkcjonowanie układu dopaminergicznego są interakcje tego białka z TH. Mogą być podstawą do zrozumienia przypuszczalnego mechanizmu regulacji DDC przez ASN. Wiązanie TH przez ASN pozostaje w ścisłej zależności ze stopniem fosforylacji enzymu. Nieaktywna, a tym samym nieufosforylowna postać TH, pozostaje skompleksowana z ASN. Zmiana poziomu fosforylacji enzymu TH powoduje wymianę dotychczasowego partnera białkowego na białko 14-3-3. Wiąże się to jednocześnie z utrzymaniem wysokiego stopnia fosforylacji przez TH, stabilizacją i wydłużeniem czasu półtrwania cząsteczki enzymu. Zdarzenia te mają bezpośredni wpływ na poziom syntezy DOPA [93,94]. Tak jak w przypadku enzymu TH, doświadczenia immunoprecypitacji z użyciem homogenatów białkowych i przeciwciał skierowanych przeciwko ASN, wykazały bezpośrednie interakcje białka ASN oraz DDC izolowanej z prążkowia szczura. Wykazano, że nadekspresja ASN lub postaci A53T tego białka hamuje aktywność DDC nie wywołując jednoczesnego spadku jego stężenia w komórkach linii PC12 i MN9D. Obserwowany skutek jest przypuszczalnie wywołany niskim stopniem ufosforylowania dekarboksylazy, w którym pośredniczy ASN. Brak jak dotąd bezpośrednich dowodów, że ASN analogicznie jak w mechanizmie regulacji aktywności TH, hamuje aktywność DDC przez aktywację fosfatazy PP2A [115]. Poza negatywnym wpływem na poziom syntezy DA, nadekspresja dzikiej oraz zmutowanej A53T ASN doprowadza także do zahamowania syntezy serotoniny, drugiego produktu DDC [115].

Białko DJ-1

DJ-1 jest homodimerycznym białkiem należącym do rodziny peptydaz. Występuje w cytosolu, jądrze komórkowym oraz mitochondriach. Umiejscowienie mitochondrialne tego białka jest związane z odpowiedzią komórki na stres oksydacyjny. DJ-1 jest polipeptydem wielofunkcyjnym, wykazującym aktywność białka opiekuńczego zależną od stanu redoks środowiska. Białko to jako koaktywator wpływa na poziom ekspresji wielu genów, w tym sekwencji, których produkty są włączone w biosyntezę DA [8,63,106,127]. Dysfunkcje układu dopaminergicznego obserwowane w postaci sporadycznej lub rodzinnej PD wiążą się z występowaniem niefunkcjonalnych białek DJ-1, w tym postaci L166P [8,16]. Badania zespołu Ishikawa [63] wykazały, że knock-out genu DJ-1 w ludzkich komórkach dopaminergicznych SH-SY5Y znacznie redukuje aktywność enzymatyczną DDC, bez zmian w poziomie jej ekspresji [63]. Immunoprecypitacja z użyciem ekstraktów białkowych komórek SH-SY5Y w obecności przeciwciał skierowanych przeciwko DJ-1 oraz doświadczenia typu pull-down z etykietowaną postacią DJ-1, dokumentują bezpośrednie interakcje DDC-DJ-1. Obserwacje te potwierdzają wyniki badań immunocytochemicznych, w których wykazano współwystępowanie obu białek w komórkach linii SH-SY5Y [63]. Powstanie kompleksu DJ-1-DDC podnosi aktywność dekarboksylazy w obecności dzikiej, a nie zmutowanej L166P postaci DJ-1. Ekspresja L166P DJ-1 doprowadza do dramatycznego obniżenia poziomu ekspresji TH oraz spadku aktywności tego enzymu. Kompleks DJ-1-DDC jest także formowany w komórce w warunkach stresu tlenowego, lecz wraz z postępującą oksydacją reszt cysteinowych DJ-1 zanika stymulujący wpływ tego białka na DDC [63]. DJ-1 uczestniczy również w regulacji białka ASN [127] i może pośrednio wpływać na aktywność DDC.

Molekularna charakterystyka genu DDC oraz mechanizmy regulujące biosyntezę DDC

Budowa ludzkiego genu DDC

Ustalenie przez Ichinose i wsp. [60] składu nukleotydowego sekwencji kodującej DOPA-dekarboksylazy stało się punktem wyjścia w procesie identyfikacji ludzkiego genu DDC [60]. Przeszukanie biblioteki genomowej człowieka sondami cDNA DDC różnej długości pozwoliło na wyłonienie komplementarnych klonów i określenie budowy molekularnej poszukiwanej jednostki transkrypcyjnej [110]. W wyniku intensywnych prac badawczych udało się także sklonować sekwencje DDC Drosophila, bydła domowego, szczura, kawi domowej, myszy oraz świni [4,15,21,53,67,112,113].

Gen DDC człowieka zajmuje obszar ponad 107 kpz na krótkim ramieniu chromosomu 7 w prążku 12.2 [86]. Sekwencja nukleotydowa DDC jest zachowywana ewolucyjnie, a podobieństwo genu DDC myszy, szczura i szympansa do sekwencji genu człowieka wynosi 84-99% [41]. Ponadto, analiza porównawcza obszaru oskrzydlającego locus DDC (sekwencja zawarta między genami Ikzf1 a Grb10) u myszy, szczura i człowieka wykazała jego synteniczny charakter [86,119]. W skład ludzkiego genu DDC wchodzi 17 eksonów, w tym dwa niekodujące, swoiste tkankowo eksony 1 (postać obwodowa – L1, neuronalna – N1), alternatywny ekson 10 oraz odpowiadająca im liczba intronów (ryc. 4). Długość eksonów waha się od 19 (ekson 11) do 407 pz (ekson 15), podczas gdy wielkość najkrótszego i najdłuższego zsekwencjonowanego intronu wynosi odpowiednio 0,6 i 24 kpz [61,86,110,116]. Sekwencję DDC człowieka regulują dwa swoiste tkankowo promotory. Pierwszy, obwodowy zmapowano 5’ powyżej miejsca +1 eksonu L1 (ryc. 4). Drugi promotor, odpowiadający za aktywację transkrypcyjną DDC w tkankach pochodzenia neuronalnego, znajduje się w intronie oskrzydlonym sekwencjami eksonów L1 i N1 (ryc. 4) [61]. W obu obszarach regulatorowych wykazano obecność sekwencji TATA o niekanonicznej budowie. Analiza promotora obwodowego wykazała obecność dwóch sekwencji cis dla czynników AP-1 (Activated Protein 1) i SP-1 (Specificity Protein 1), podczas gdy w promotorze neuronalnym wytypowano zarówno potencjalne i funkcjonalne elementy regulatorowe. Należy do nich sekwencja CAAT oraz miejsca wiązania takich czynników białkowych jak NF-Y (Nuclear Transcription Factor Y), Oct1-2 (Octamer Transcription factor), MRE (Metal Response Element Binding Transcription Factor), NF-κB (Nuclear Factor Kappa-Light-Chain-Enhancer of Activated B Cells), AP-1, AP-3 (Activated Protein 3), HSE (Heat Shock Factor), E4TF1, Pit1/GHF1 (Pituitary-Specific Transcription Factor/Growth Hormone Factor 1), ERE (Estrogen Response Element), IL6-RE-BP (Interleukin 6 Response Element Binding Factor), HNF-3 (Hepatocyte Nuclear Factor 3), Brn2/N-Oct-3, C2/FOXC2 (Forkhead Box Protein C2), H-APF-1 i AP2 (Activated Protein 2) [5,61,74,102,110]. Mechanizm swoistej tkankowo ekspresji genu DDC wydaje się oparty na wzajemnie wykluczającej się aktywności sekwencji jednego z dwóch promotorów. Aguanno i wsp. [3] sformułowali hipotezę, w której aktywacja promotora obwodowego w tkankach obwodowych decyduje o blokowaniu położonego poniżej promotora neuronalnego [3]. Niezgodne z prezentowanym przez Aguanno i wsp. poglądem pozostają wyniki badań wykonanych przez Blechingberga i wsp. [15], które dokumentują obecność zarówno neuronalnej jak i obwodowej postaci transkryptu w zdefiniowanych rejonach mózgu (pień mózgu oraz jądra podstawne) podczas ontogenezy świni [15]. Z tego powodu mechanizm aktywacji/ inaktywacji promotorów DDC wymaga dalszych badań i ustalenia, czy jest to mechanizm uniwersalny czy też swoisty gatunkowo.

Schemat budowy genu DDC człowieka oraz przedstawicieli innych grup kręgowców wyższych wykazuje znaczne podobieństwo [15,21,48,86]. Organizmy o niższym stopniu rozwoju ewolucyjnego charakteryzuje odmienny typ organizacji zarówno obszaru kodującego jak i promotorowego DDC [55]. Badania genu DDC u Drosophila wykazały, że 200 pz 5’ powyżej miejsca +1 eksonu N1 jest w pełni wystarczające do jego ekspresji w hipodermie, podczas gdy do powstawania neuronalnej postaci enzymu jest wymagana aktywacja dodatkowych elementów regulatorowych położonych w rejonie – 1623/-760 [65]. Ponadto, sekwencja ludzkiego genu DDC jest matrycą syntezy cząsteczki antysensownego, niekodującego RNA o niezdefiniowanej dotąd roli [86,107].

Sekwencja promotora genu DDC

Doświadczenia z użyciem wektorów plazmidowych niosących różnej długości obszary promotorowe DDC wraz z 5’ regionem niepodlegającym translacji (UTR), a także zastosowanie metody EMSA, pozwoliło na analizę 9000 pz neuronalnego promotora genu DDC człowieka. Wykazano w nim obecność 5 regionów bogatych w elementy cis, które są włączone w regulację transkrypcyjną dekarboksylazy [74,102]. Wyniki eksperymentów transfekcji nieneuronalnych i neuronalnych linii komórkowych wyżej wymienionymi konstruktami pozwoliły na wskazanie obszarów, w których znajdowały się sekwencje wzmacniające transkrypcję oraz elementy regulatorowe, wykazujące zróżnicowany potencjał wyciszania aktywności DDC [74,102]. Końcowym wynikiem badań było ustalenie minimalnego obszaru promotora niezbędnego do osiągnięcia swoistej komórkowo ekspresji genu. Wykazano, że 560 pz 5’ powyżej miejsca startu transkrypcji znajdującego się w eksonie N1 jest wystarczające do osiągnięcia aktywności genu DDC w liniach komórek nerwowych [74].

Obwodowy promotor DDC człowieka wciąż wymaga badań, które doprowadzą do pełnej charakterystyki funkcjonalnej. Jak dotąd, jedyne dane dla tego obszaru pozyskano w sposób pośredni. Podobieństwo proksymalnej części obwodowego promotora człowieka i szczura pozwala na wyciągniecie wniosku, że wyniki doświadczeń otrzymane z użyciem sekwencji regulatorowej gryzoni mogą być uniwersalne i odnosić się do analogicznego obszaru ludzkiego genu DDC. W pierwszych 80 pz 5’ powyżej miejsca +1 w eksonie L1 potwierdzono obecność istotnych elementów regulatorowych, w tym miejsc decydujących o aktywności szczurzego DDC w tkankach obwodowych. Mapowanie z wykorzystaniem metod footprint, EMSA oraz transfekcji linii komórek LCC-PK1 konstruktami niosącymi delecje dystalnych fragmentów obwodowego promotora lub jego zmutowane postaci wykazało, że w regionie – 49/- 25 pz znajduje się element bogaty w pary A/T (5’AATTAATGTTTAAC3’), wiązany przez swoisty dla hepatocytów czynnik HNF-1 [2].

Promotor neuronalny

Sekwencja – 72/-36

Zastosowanie metody EMSA umożliwiło identyfikację czynników trans i docelowych miejsc cis w proksymalnej części promotora genu DDC człowieka. W obszarze – 72/- 36 pz zaobserwowano formowanie sześciu kompleksów białkowych o odmiennej ruchliwości elektroforetycznej. W skład dwóch o największej i najmniejszej masie cząsteczkowej wchodziły odpowiednio polipeptydy powszechnie występujące w komórkach człowieka oraz charakterystyczne dla komórek pochodzenia neuronalnego [102]. Skracanie sekwencji sond molekularnych użytych w teście EMSA doprowadziło do zawężenia badanego obszaru i zmapowania miejsca bezpośrednich interakcji białko-DNA. Pierwszą sekwencję, położoną między – 53 a – 36 pz powyżej miejsca startu transkrypcji, wiązał czynnik Sp1. Drugą, znajdującą się w pozycji – 72/-53 pz, rozpoznawało białko NF-Y (ryc. 5) [102]. Analiza skutku mutacji punktowych lub delecji kasety NF-Y w konstruktach promotorowych wykazała, że wprowadzane zmiany powodowały znaczny spadek stężenia mRNA genu reporterowego. Obserwacja wskazuje na rolę miejsca NF-Y jako pozytywnego regulatora podczas neuronalnej aktywacji DDC [36,37]. Mimo bezpośredniego sąsiedztwa motywów NF-Y i Sp1 nie stwierdzono tworzenia wspólnego kompleksu białkowego przez polipeptydy rozpoznające oba miejsca regulatorowe [102].

Obszar – 102/-72

Inny obszar interakcji czynników trans znajduje się między – 102 a – 72 pz neuronalnej sekwencji promotorowej. W jego obrębie stwierdzono powstawanie pięciu kompleksów białkowych o zróżnicowanej swoistości komórkowej. Obserwowane w czasie doświadczeń EMSA super przesunięcie po użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko polipeptydowi Oct-1 z rodziny białek POU wykazało, że buduje on kompleks o największej masie cząsteczkowej [102]. Oct-1 wiąże sekwencję promotora genu DDC człowieka w postaci monomeru [14]. W dalszych etapach molekularnej charakterystyki rezydentów poszczególnych kompleksów posłużono się techniką EMSA oraz preparatami białkowymi izolowanymi z nieneuronalnych oraz neuronalnych linii komórkowych, w tym linii poddanych transfekcji sekwencjami czynników Oct (izoforma 2 i 3) i HNF-3β. Obecność polipeptydów N-Oct-2 i N-Oct-3 z ewolucyjnie zachowywanej rodziny białek POU potwierdzono w dwóch swoistych komórkowo kompleksach białkowych o pośrednim tempie migracji [95,102]. Białka rozpoznawały motyw 5’AAATAATGC3’ znajdujący się w pozycji -86/-78 pz badanego obszaru promotora DDC człowieka (ryc. 5) [14,82,102]. Analiza skutku wywieranego przez N-Oct-3 wskazuje, że pełni rolę swoistego komórkowo aktywatora DDC [36,37]. W oparciu o metodę spektroskopii masowej oraz modelowania in silico ustalono, że N-Oct-3 rozpoznaje docelowy element cis w promotorze DDC w formie monomerycznej, jako homodimer lub heterodimer z NF-Y [36,37]. Badania funkcji kasety wiązanej przez N-Oct-3 wykazały, że jest odpowiedzialna za podstawowy jak i indukowany swoistym czynnikiem trans poziom transkrypcji [37]. Białko N-Oct-3 może aktywować gen DDC również pośrednio, bez interakcji z docelowym elementem regulatorowym. Powstaje wówczas kompleks NF-Y/N-Oct-3 stabilizowany związaniem sekwencji promotora DDC w miejscu rozpoznawanym przez NF-Y (ryc. 5) [36].

Wyniki badań, w których posłużono się zsyntetyzowanymi in vitro polipeptydami HNF-3α i β wykazały, że białka te są rezydentami dwóch najbardziej ruchliwych kompleksów [102]. Białka HNF należą do rodziny czynników z konserwowanym motywem winged helix/ forkhead. Są odpowiedzialne za remodelowanie chromatyny, wczesne etapy rozwoju układu nerwowego (HNF-3β) oraz funkcjonowanie gruczołu wątrobowego człowieka [39]. Wiązana przez nie sekwencja znajduje się między -94 a -73 nt obszaru promotorowego DDC (ryc. 5). Nakładanie się elementów cis rozpoznawanych przez opisywane wyżej polipeptydy oraz te z rodziny Oct/NOct powoduje formowanie dwóch typów kompleksów białkowych. Pierwszy typ zawiera wyłącznie polipeptydy HNF charakterystyczne dla komórek budujących tkanki obwodowe, drugi jest heteromerycznym kompleksem tworzonym przez białko HNF-3β oraz N-Oct-3 [14,102]. Wykazano ponadto, że polipeptyd HNF-3β wiąże sekwencje promotorową z niewielkim powinowactwem i może być wypierany przez czynnik Oct-1 z miejsca swego wiązania (ryc. 5) [14].

Element regulatorowy położony między – 900 a – 872 nt promotora DDC

Analiza dalszych odcinków neuronalnego promotora genu DDC pozwoliła na identyfikację dodatkowego miejsca wiązania dla Oct-3 – elementu MORE (More Palindromie Oct Factor Recognition Element), położonego między – 900 a – 872 pz powyżej miejsca startu transkrypcji [37]. Białko N-Oct-3 rozpoznawało docelowy element cis w formie monomeru lub homodimeru. Stwierdzono, że do osiągnięcia pełnej aktywności DDC jest niezbędna obecność wszystkich kaset rozpoznawanych przez monomeryczną N-Oct-3, homodimer, a także heterodimery tworzone z innymi czynnikami białkowymi. Prócz sekwencji MORE krytycznym dla tego procesu obszarem jest pierwszych 100 pz neuronalnego promotora genu DDC człowieka [37].

Regulacja przez inne czynniki białkowe

Transkrypcja genu DDC jest regulowana czynnikami białkowymi kontrolującymi ekspresję pozostałych genów kodujących enzymy szlaku syntezy amin katecholowych. Ustalenia wymaga, czy czynniki te wiążą sekwencję promotorową DDC bezpośrednio czy też wpływają na jego aktywność w sposób pośredni. Białko Nurr1 (Nuclear Receptor Related 1) należy do rodziny sierocych receptorów jądrowych i jest uważane za główny czynnik decydujący o powstawaniu i rozwoju neuronów dopaminergicznych w mózgu. Uczestniczy w regulacji aktywności wielu genów neuronalnych w tym TH, transportera dopaminy (DAT), VMAT2 oraz DDC [32]. Mimo że nie udało się zidentyfikować miejsca rozpoznawanego przez Nurr1 w obrębie promotora mysiego genu DDC, doświadczenia na mysiej neuronalnej linii komórkowej MN9D wykazały wzrost poziomu transkryptu DDC po transfekcji wektorem niosącym cDNA Nurr1 [52]. W przypadku linii nieneuronalnej transfekcja tego typu wektorem nie indukowała ekspresji wymienionych genów neuronalnych. Badania mysich zarodków pozbawionych jednego lub obu alleli genu Nurr1 wykazały natomiast, że jest to czynnik niezbędny do ekspresji zarówno DDC, jak i VMAT2 już we wczesnych stadiach rozwoju embrionalnego [52].

Regulacja potranskrypcyjna DDC

Sekwencja kodująca DDC człowieka jest konserwowana ewolucyjnie i niesie pojedynczy ORF oskrzydlony na końcach 5’ oraz 3’ obszarami UTR o różnej długości [60,61,72] (ryc. 4). Obecność wielu postaci mRNA DDC, z których część wykazuje specyfikę tkankową, wiąże się z procesem alternatywnego splicingu zachodzącym w sekwencji obu UTRów i/lub części kodującej składanych cząsteczek [26,61,90,116]. Polimorfizm długości obwodowej oraz neuronalnej postaci mRNA DDC człowieka, będących dwoma głównymi typami transkryptu, wynika z obecności w sekwencji 5’ UTR jednego z dwóch swoistych tkankowo eksonów – L1 lub N1 [61]. Sekwencja eksonu L1 człowieka wykazuje niski poziom homologii do analogicznego obszaru znajdującego się w 5’ UTR mRNA DDC innych gatunków [15]. W najdłuższych wariantach obu transkryptów miejsce startu translacji, kodon stop oraz sygnał poliadenylacji zmapowano odpowiednio w proksymalnej części eksonu 2, eksonie 14 oraz 15 [110]. Podobne położenie opisanych elementów stwierdzono również w cząsteczkach transkryptów DDC gryzoni [15]. Obecność w eksonie L1 czterech sekwencji ATG niepowiązanych z procesem startu translacji ma przypuszczalny związek z ich udziałem w tworzeniu drugorzędowych struktur w tym obszarze [61]. Powstawanie kolejnych izoform mRNA DDC warunkuje alternatywny splicing eksonu 3 lub wycinanie sekwencji eksonów 10-15 [26,90,116] (ryc. 4). Skrócenie sekwencji transkryptu o sześć eksonów położonych dystalnie łączy powosię z obecnością alternatywnego eksonu 10 niosącego kodon stop [116] (ryc. 4).

Badanie rozkładu mRNA DDC w ośrodkowym układzie nerwowym oraz organach obwodowych człowieka ujawniło istnienie różnic w proporcjach poszczególnych transkryptów [26,90,116]. Obserwowane w danym typie tkanki stężenie mRNA DDC może być cechą uniwersalną w świecie zwierząt lub być w pełni swoiste gatunkowo [4,5,15,26,90,116]. Wykazano jednocześnie, że enzym DDC człowieka kodowany na matrycy mRNA pozbawionego eksonu 3 nie wykazuje właściwości enzymatycznych, co ma przypuszczalnie związek z delecją reszt aminokwasowych odpowiedzialnych za rozpoznanie substratu lub nadawanie trzeciorzędowej struktury temu białku [90].

W innych grupach ssaków również wykazano obecność dwóch typów mRNA DDC kodujących neuronalną i obwodową postać enzymu. Ostatni z wymienionych rodzajów transkryptów charakteryzuje swoista gatunkowo budowa 5’ UTR [4,5,15,48,72,113]. Polimorfizm 5’sekwencji mRNA DDC wiązał się z wykorzystywaniem w procesie dojrzewania różnych miejsc akceptorowych położonych w proksymalnym regionie eksonu II (szczur) lub obecnością dodatkowego eksonu (świnia), występującego między odpowiednikami eksonów L1 i N1 człowieka [4,5,15,48,72]. U zwierząt, podobnie jak u człowieka, występowanie wielu postaci mRNA DDC jest spowodowane alternatywnym składaniem zachodzącym wewnątrz cząsteczki transkryptu. Proces dotyczy wycinania wyłącznie sekwencji eksonu 5 lub w złożeniu z eksonem 6 u świni [15].

Regulacja epigenetyczna – piętnowanie rodzicielskie genu DDC

W czasie badań dotyczących korelacji między mutacjami w obrębie sekwencji genu DDC a podatnością na zachorowanie na chorobę afektywną dwubiegunową (BPAD) stwierdzono, że jeden z typów mutacji jest dziedziczony ojcowsko [19]. Podobny związek między typem allelu i sposobem jego przekazywania obserwowano w przypadku innego zaburzenia psychicznego – zespołu nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi (ADHD) [51]. Ekspresja zmutowanej postaci allelu jest skutkiem mechanizmu piętnowania rodzicielskiego – inaktywacji poprawnego allelu pochodzącego od matki. Tak jak i wiele innych piętnowanych sekwencji, DDC znajduje się w bliskim sąsiedztwie innego piętnowanego genu – Grb10, kodującego białko adapterowe receptora czynnika wzrostu [19]. Jednak wyniki badań Hitchinsa i wsp. [54], w których posłużono się tkankami ludzkimi oraz pochodzącymi z mysich płodów, nie potwierdziły hipotezy o przynależności DDC do grupy genów piętnowanych [54]. Odmiennych wniosków dostarczyły doświadczenia Menheniott i wsp. [81], w których wskazano przejściową, ojcowską ekspresję neuronalnej DDC w kardiomiocytach mysich płodów i noworodków [81]. Jak dotąd nie udało się jednoznacznie wyjaśnić przyczyn tego zjawiska oraz jego znaczenia w procesie ontogenezy [99].

Rola DDC w zaburzeniach psychicznych

Jedną z przyczyn zaburzeń o podłożu psychotycznym (np. schizofrenia) oraz afektywnym (np. BPAD) jest niepoprawna regulacja mezolimbicznego układu dopaminergicznego [33,85]. Stanom tym towarzyszy nadaktywność neuronów dopaminergicznych powodująca nadmierne wytwarzanie DA i hiperstymulację receptorów D1 [33]. Już w 1994 r. badania Reitha i wsp. wykazały istnienie związku między zwiększonym metabolizmem DA a wzrostem aktywności DDC w prążkowiu osób cierpiących na psychozy, w tym na schizofrenię [103]. Børglum i wsp. przeanalizowali polimorfizm sekwencji kodującej oraz promotora neuronalnego DDC z predyspozycją zachorowania na schizofrenię lub BPAD [17,18,19]. Analiza haplotypów wykazała obecność dwóch delecji:

• 1 pz zlokalizowanej w regionie promotorowym, w potencjalnym miejscu wiązania neuronalnych czynników transkrypcyjnych z rodziny NGFI-A oraz

• 4 p z zmapowanej w proksymalnej części powtórzenia (GA)5 w obrębie sekwencji UTR genu DDC.

Ponieważ ostatni z wymienionych elementów jest przypuszczalnie miejscem wiązania białek rozpoznających powtórzenia GA (GAF), opisana 4 pz mutacja może spowodować zanik interakcji swoistych czynników trans z docelową sekwencją cis [17]. Wykazano istnienie korelacji w przypadku punktowej delecji a zachorowaniem na BPAD [17]. Badania dotyczące segregacji opisanych wariantów haplotypów z przypadkami schizofrenii dokumentują modulujący wpływ mutacji sekwencji promotorowej DDC na przebieg oraz wystąpienie pierwszych objawów choroby [18]. Stwierdzono, że obecność przynajmniej jednego allelu z 1 pz delecją powoduje późniejsze wystąpienie objawów schizofrenii u mężczyzn [18]. Wciąż jednak brak dowodów potwierdzających istotną rolę DDC w etiologii zaburzeń psychotycznych. W dalszych badaniach również nie udało się jednoznacznie skorelować wykrytych delecji z wystąpieniem BPAD [19].

Rola DDC w chorobach o podłożu neurologicznym

Choroba Parkinsona

Choroba Parkinsona (PD) jest przewleką, postępującą chorobą neurodegeneracyjną o mało poznanej etiologii. Podczas jej trwania dochodzi do wybiórczego zaniku neuronów o fenotypie dopaminergicznym prowadzącego do powstawania zaburzeń motorycznych, autonomicznych oraz neurobehawioralnych u człowieka. Standardowa terapia PD polega na podawaniu L-DOPA, która po przeniknięciu bariery krew-mózg zostaje przekształcona do DA w neuronach DDC+ [100]. Skuteczność terapii opartej na prekursorze DA pozostaje w ścisłym związku z osiągnięciem odpowiedniego stężenia preparatu w neuronach z zaburzoną ekspresją DDC i/lub TH. Dlatego tak ważnym zagadnieniem w czasie terapii jest hamowanie przez swoiste blokery aktywności DDC metabolizującej lek w tkankach obwodowych [33,45]. Podczas leczenia pacjentom podaje się L-DOPA z inhibitorami DDC – karbidopą lub benserazydem, co pozwala na dostarczenie większej dawki prekursora do ludzkiego mózgu [45,100]. Długotrwałe stosowanie L-DOPA wiąże się z obniżeniem jej skuteczności i pojawianiem się komplikacji motorycznych, spowodowanych efektem wyczerpywania – chory wymaga coraz większych i częściej podawanych dawek leku w celu utrzymania działania terapeutycznego [45,100].

Projektowane lub stosowane blokery muszą spełniać wiele warunków, z których brak toksyczności, stabilność oraz wybiórczość działania wobec oDDC są podstawowymi kryteriami ich wyboru. Doświadczalny przegląd potencjalnych inhibitorów enzymu pozwolił na wyłonienie cząsteczki Amb2470350, będącej swoistym inhibitorem kompetycyjnym DDC. Działanie Amb2470350 jest odwracalne, a sama cząsteczka nie przenika przez barierę krew-mózg, blokując tym samym tylko obwodową postać DDC [12,31]. Do niezwykle obiecujących cząsteczek terapeutycznych należą endogenne blokery hamujące oDDC u ssaków:

• składniki surowicy u małp [101], • białka globularne o masie 25,5-32,5 kDa występujące w gruczołach podżuchwowych szczurów [50], • hydrofobowe białko z ludzkiej surowicy o masie 25 kDa [118], • 35 kDa białko błonowe oczyszczone z ludzkiego łożyska, zidentyfikowane jako aneksyna V – inhibitor kaskady krzepnięcia krwi [117] oraz • analogi strukturalne DA wyizolowane z ekstraktów silnie trującej trzmieliny gładkiej (Euonymus glabra Roxb), występującej na terenie Chin [104].

Niedobór DDC

Niedobór DDC jest neurometaboliczną, wrodzoną chorobą genetyczną, dziedziczoną autosomalnie recesywnie. W 1990 r. Hyland i Clayton opisali pierwszy przypadek tej choroby u bliźniąt jednojajowych [58]. Objawy, do których należą opóźnienie rozwoju, dystoniczne odchylanie gałek ocznych, hipotonia, zaburzenia snu i funkcji motorycznych, a także dysfunkcje układu autonomicznego, pojawiają się w okresie wczesnego dzieciństwa [114]. Opisane zaburzenia wynikają ze znacznego obniżenia stężenia amin biogennych oraz ich metabolitów spowodowanego niskim stężeniem i poziomem aktywności DDC [114]. Zmiany kinetyki enzymu nie dotyczą w tym samym stopniu wszystkich tkanek DDC+ – obserwowanemu spadkowi poziomu metabolitów DA w płynie mózgowo-rdzeniowym i osoczu nie towarzyszyły zmiany stężenia DA w moczu osób chorych, co sugeruje właściwą ekspresję i aktywność dekarboksylazy w nerkach [1,59]. Do 2013 r. opisano prawie 100 przypadków niedoboru DDC na świecie. Większość mutacji pojawia się de novo, jednak częstsze zachorowania w południowych Chinach są najprawdopodobniej spowodowane efektem założyciela i przekazywaną mutacją miejsca splicingowego intronu 6 (IVS6+4A>T) [114]. Analiza genotypu 49 pacjentów wykazała istnienie 24 mutacji punktowych dotyczących miejsca splicingowego lub skutkujących zamianą aminokwasu w sekwencji polipeptydu [20]. Porównanie właściwości biochemicznych niezmutowanej postaci DDC z 4 wariantami niosącymi mutacje konserwowanych reszt aa G102S, F309, S147R i A275T, zaangażowanych w wiązanie PLP, wykazało spadek aktywności katalitycznej lub zmniejszenie powinowactwa enzymu do kofaktora czy substratu [83].

Ze względu na duże zróżnicowanie wykrywanych mutacji oraz stosunkowo małą grupę pacjentów nie opracowano dotychczas skutecznej metody leczenia niedoboru DDC. Chorym podaje się witaminę B6, agonistów receptorów dopaminergicznych oraz inhibitory monoaminooksydazy, hamujące rozkład dopaminy [7,97]. Dalsze szczegółowe badania nad molekularnym podłożem niedoboru DDC mogą pozwolić na tworzenie skutecznej terapii dopasowanej do mutacji występującej u chorego. Obecnie trwają doświadczenia mające umożliwić dostarczenie do komórek pacjenta prawidłowej kopii genu DDC i wywołanie stabilnej ekspresji funkcjonalnego enzymu. Podobne prace z wykorzystaniem wektorów wirusowych dotyczą leczenia choroby Parkinsona. Wykazano, że ekspresja ludzkiej DDC miała korzystny wpływ na stan zdrowia zwierząt poddanych terapii [7].

Perspektywiczne metody leczenia

Terapia genowa z wykorzystaniem sekwencji genu DDC

Ze względu na skuteczność chirurgiczne lub farmakologiczne zwalczanie objawów PD oraz niedoboru DDC jest postrzegane jako niewystarczająca postać terapii. Dlatego też istotnym zagadnieniem stało się znalezienie nowych sposobów leczenia, w tym metod opartych na terapii genowej. W założeniu technika ta polega na wprowadzaniu genów o charakterze terapeutycznym do komórek wykazujących zaburzenia ekspresji danej jednostki transkrypcyjnej lub zdolnych przejąć funkcje komórek ulegających degeneracji. W tym celu stosuje się wektory molekularne wykazujące ograniczony tropizm komórkowy (także wobec komórek postmitotycznych), przenoszące długie sekwencje transgenów, charakteryzujące się niskim poziomem immunogenności oraz niezdolne do replikacji w organizmie pacjenta [121]. Do najczęściej wykorzystywanych typów nośników stosowanych w terapii chorób neurodegeneracyjnych należą lentiwektory lub wektory oparte na wirusach zależnych od adenowirusów (AAV). Pierwsze z wymienionych charakteryzuje naturalna zdolność do czystego wbudowywania się do genomu komórki. Drugi typ wektorów o dużym tropizmie neuronalnym pozostaje w postaci episomów wykazując stabilną ekspresję transgenu [121]. Modyfikacje genomu komórek z użyciem egzogennych sekwencji przeprowadza się in vivo lub pozaustrojowo [121]. Ostatni z wymienionych sposobów wymusza ponowne wprowadzenie komórek z transgenem do organizmu pacjenta.

Obecnie testowanych jest kilka sposobów leczenia PD. Polegają na dostarczaniu nowych, prawidłowych kopii genów kodujących mRNA enzymów niezbędnych do:

• konwersji egzogennej L-DOPA w dopaminę, • ektopowej syntezy dopaminy, • ektopowej syntezy L-DOPA oraz genów, których produkty zastąpią nieprawidłowe białka w dziedzicznych postaciach PD [30].

W pierwszym przypadku wektor AAV dostarcza sekwencję genu DDC do degenerujących neuronów prążkowia. Synteza dopaminy jest możliwa po podaniu pacjentowi egzogennego prekursora [100]. Doświadczenia z iniekcją takiego konstruktu przeszły już etap badań przedklinicznych. Wyniki I fazy badań klinicznych wydają się obiecujące ze względu na zwiększoną aktywność DDC w badaniach neuroobrazowych, brak poważnych działań niepożądanych i umiarkowaną poprawę stanu pacjentów [30,84]. Druga strategia wykorzystuje lentiwektor niosący sekwencję trzech genów – DDC, skróconej postaci TH oraz genu cyklohydrolazy-GTP (GCH1) biorącej udział w syntezie kofaktora enzymu TH, jakim jest tetrahydrobiopteryna. Opracowany przez OxfordBioMedica preparat, znany jako ProSavin, przeszedł pomyślnie fazę badań przedklinicznych, a obecnie publikowane są prace opisujące pierwsze skutki podawania leku osobom chorym na PD w I/II fazie klinicznej [30,92]. W ciągu roku od podania leku odnotowano poprawę funkcji motorycznych przy obniżonych dawkach podawanej L-DOPA i stosunkowo łagodnych działaniach niepożądanych (dyskinezy i efekt on-off). Ze względu na poziom działania terapeutycznego oraz nieliczną grupę pacjentów poddanych zabiegowi badania te wymagają kontynuacji [92]. Trzeci rodzaj terapii opiera się na aktywności endogennej DDC w średnich neuronach kolczastych (Medium Spiny Neurons, MSN), do których wprowadza się konstrukty z egzogennymi kopiami genów TH i GCH1 [30]. Jak dotąd, badania nie weszły w fazę kliniczną. Ostatni sposób terapii genowej PD dotyczy wprowadzania do neuronów sekwencji genów innych niż DDC, np. GDNF, SNCA czy parkiny [30]. Niestety, wciąż poważnym problemem jest ustalenie skutecznej dawki preparatu, szeroki zakres komórek infekowanych przez wektory wirusowe oraz brak precyzyjnej kontroli poziomu ekspresji transgenów. Ostatnie z wymienionych zagadnień jest niezwykle istotnym ze względu na hamowanie zwrotne enzymu TH przez dopaminę czy toksyczny wpływ nadmiaru cząsteczek DA na wytwarzające ją neurony.

Mimo znaczących postępów w poznaniu biologii genu DDC wciąż nie udaje się rozwiązać wszystkich problemów związanych z dysfunkcją tej jednostki transkrypcyjnej w chorobie związanej z niedoborem DDC. Wynika to m.in. z powodu:

• braku dogodnych modeli zwierzęcych tej choroby z powodu letalności mutacji typu knock-out genu DDC, • nie w pełni scharakteryzowanego tropizmu wektorów wirusowych dostarczających prawidłową kopię genu DDC, • obszaru działania preparatu terapeutycznego ograniczonego do miejsca jego podania oraz • nieprzewidywalnej reakcji organizmu na nagłe przywrócenie funkcjonalnego stężenia monoamin [7].

Podobnie jak w PD, terapia genowa osób cierpiących na niedobór DDC polega na dostarczeniu do ich komórek prawidłowej kopii genu DDC i wywołaniu stabilnej ekspresji funkcjonalnego enzymu. Wyniki Hwu i wsp. [57] z I fazy badań klinicznych u czworga pacjentów wskazują, że iniekcja wektora AAV zawierającego ludzką sekwencję DDC do skorupy, mimo przejściowych dyskinezji występujących miesiąc po podaniu leku, znacznie poprawia funkcje ruchowe [57]. Jest to pierwsze tak zaawansowane badanie z wykorzystaniem terapii genowej w leczeniu niedoboru DDC. Potwierdza też bezpieczeństwo śródmózgowych iniekcji wektorów wirusowych, co budzi nadzieje związane z procesem efektywnego leczenia tej i innych chorób za pomocą opisanej techniki.

Terapia z wykorzystaniem komórek macierzystych

Terapia z użyciem komórek macierzystych może się stać sposobem leczenia chorych z dysfunkcją DDC. Wykorzystanie w medycynie regeneracyjnej komórek zdolnych do różnicowania w wiele różnych typów, pozwoliłoby na odbudowanie populacji neuronów ulegających neurodegeneracji lub wprowadzenie ich do tkanek wykazujących nieprawidłowy wzorzec ekspresji [7,49,76,88,105,109]. W związku z tym niezwykle ważna jest możliwość pozyskania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) o cechach pierwotnych komórek zarodkowych za pomocą związków drobnocząsteczkowych [69]. iPS wyprowadzone ze zdrowych komórek tkanki pacjenta pozwalają na ominięcie problemów związanych z niezgodnością tkankową oraz stosowaniem wektorów wirusowych jako nośników prawidłowych kopii genów [111]. Jak dotąd, skuteczność tego typu terapii udokumentowano na przykładzie zwierzęcych modeli, w tym szczurzego modelu PD [6,49,76,105,123].

Podsumowanie

Omówiony przegląd doniesień dotyczących regulacji aktywności genu DDC oraz jego produktu wskazuje na istnienie wielu mechanizmów determinujących ten proces. Wykazano, że za odpowiedni wzorzec transkrypcji odpowiadają sekwencje promotora obwodowego lub neuronalnego aktywowanego w komórkach o fenotypie DA. Mimo znacznych wysiłków wielu grup badawczych, ujawnienia wymagają kolejne czynniki trans oraz wiązane przez nie elementy cis odpowiadające za swoistą rozwojowo/tkankowo/komórkowo ekspresję DDC. Ważnym zagadnieniem jest epigenetyczna regulacja DDC i powiązanie niektórych procesów chorobowych z mechanizmem piętnowania rodzicielskiego. Uzupełnienie wiedzy w tym zakresie może pozwolić na usprawnienie procesu projektowania wektorów o znaczeniu terapeutycznym, co umożliwi opracowanie leków aktywujących odpowiednie szlaki przesyłania sygnałów wpływających na transkrypcję DDC. Proces poznawczy nie pozostanie bez wpływu na dalszy rozwój terapii, w tym wykorzystujących właściwości komórek iPS.

Analiza oddziaływań DDC z innymi polipeptydami wskazuje na zdolność tego enzymu do tworzenia wieloskładnikowego kompleksu białkowego. Jak wykazano, białko to pozostając w interakcjach z TH i VMAT2, w zależności od stanu fizjologicznego neuronów DDC+, kotwiczy polipeptydy o charakterze regulatorowym – ASN oraz DJ-1. Na tej podstawie można spekulować, że rekrutacja ASN do kompleksu może wpływać hamująco na aktywność enzymatyczną TH i/lub DDC. Zmiana partnera białkowego z ASN na DJ-1 spowodowałaby zapewne zwiększenie stężenia produktów syntetyzowanych przez wymienione enzymy. Jednocześnie ilość DOPA zsyntetyzowanej przez TH determinowałby stężenie substratu dostępnego dla DDC. Wiadomo natomiast, że produkt DDC jakim jest dopamina, hamuje enzym TH tworząc pętlę sprzężenia zwrotnego ujemnego. W funkcjonalnym kompleksie zachodziłaby więc ścisła kontrola poszczególnych etapów procesu syntezy neuroprzekaźników oraz ich skoordynowany transport do wnętrza pęcherzyków synaptycznych. Zdolność DJ-1 do regulowania właściwości ASN oraz pośredni wpływ na poziom ekspresji genów włączonych w syntezę amin katecholowych, tworzy dodatkowy poziom kontroli aktywności całego kompleksu. Przedstawiony pogląd wymaga jednak dalszych badań.

Pełne zrozumienie biologii DDC wymaga wciąż znalezienia odpowiedzi na wiele pytań. Ważnym zagadnieniem jest potencjalna obecność w kompleksie innych niż wymienione białek o charakterze regulatorowym, np. 14-3-3 i PP2A. Czy wiążą one wybiórczo poszczególnych partnerów białkowych, czy też są zdolne do regulacji obu enzymów jednocześnie? Jaki wpływ na poziom aktywności DDC ma mechanizm fosforylacji tego białka? Czy dysfunkcja jednego z białek regulatorowych wpływa na interakcje poszczególnych rezydentów kompleksu? Czy obserwowany mechanizm regulacji jest uniwersalny dla wszystkich kręgowców? W jaki sposób projektować terapię poszczególnych chorób neurodegeneracyjnych, w których dochodzi do dysfunkcji TH jak i DDC, mając do czynienia z wieloskładnikowym kompleksem o właściwościach enzymatycznych? Jaką rolę pełnią poszczególne izoformy DDC, w tym te niewykazujące aktywności enzymatycznej?

References

• 1. Abeling N.G., Bräutigam C., Hoffmann G.F., Barth P.G., Wevers R.A.,Jaeken J., Fiumara A., Knust A., van Gennip A.H.: Pathobiochemicalimplications of hyperdopaminuria in patients with aromatic L-aminoacid decarboxylase deficiency. J. Inherit. Metab. Dis., 2000; 23: 325-328
  Google Scholar
• 2. Aguanno A., Afar R., Albert V.R.: Tissue-specific expression of thenonneuronal promoter of the aromatic L-amino acid decarboxylasegene is regulated by hepatocyte nuclear factor 1. J. Biol. Chem.,1996; 271: 4528-4538
  Google Scholar
• 3. Aguanno A., Lee M.R., Marden C.M., Rattray M., Gault A., AlbertV.R.: Analysis of the neuronal promoter of the rat aromatic L-aminoacid decarboxylase gene. J. Neurochem., 1995; 65: 1944-1954
  Google Scholar
• 4. Albert V.R., Allen J.M., Joh T.H.: A single gene codes for aromaticL-amino acid decarboxylase in both neuronal and non-neuronaltissues. J. Biol. Chem., 1987; 262: 9404-9411
  Google Scholar
• 5. Albert V.R., Lee M.R., Bolden A.H., Wurzburger R.J., Aguanno A.:Distinct promoters direct neuronal and nonneuronal expression ofrat aromatic L-amino acid decarboxylase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1992; 89: 12053-12057
  Google Scholar
• 6. Ali F., Stott S.R., Barker R.A.: Stem cells and the treatment of Parkinson’sdisease. Exp. Neurol., 2014; 260: 3-11
  Google Scholar
• 7. Allen G.F., Neergheen V., Oppenheim M., Fitzgerald J.C., Footitt E.,Hyland K., Clayton P.T., Land J.M., Heales S.J.: Pyridoxal 5’-phosphatedeficiency causes a loss of aromatic L-amino acid decarboxylase inpatients and human neuroblastoma cells, implications for aromaticL-amino acid decarboxylase and vitamin B6 deficiency states. J.Neurochem., 2010; 114: 87-96
  Google Scholar
• 8. Ariga H., Takahashi-Niki K., Kato I., Maita H., Niki T., Iguchi-ArigaS.M.: Neuroprotective function of DJ-1 in Parkinson’s disease. Oxid.Med. Cell. Longev., 2013; 2013: 683920
  Google Scholar
• 9. Baptista M.J., O’Farrell C., Daya S., Ahmad R., Miller D.W., Hardy J.,Farrer M.J., Cookson M.R.: Co-ordinate transcriptional regulation ofdopamine synthesis genes by α-synuclein in human neuroblastomacell lines. J. Neurochem., 2003; 85: 957-968
  Google Scholar
• 10. Baylin S. B., Mendelsohn G.: Medullary thyroid carcinoma –a model for the study of human tumor progression and cell heterogeneity.New York, Acad. Press, 1984; 4: 9-27
  Google Scholar
• 11. Berry M.D., Juorio A.V., Li X.M., Boulton A.A.: Aromatic L-aminoacid decarboxylase: a neglected and misunderstood enzyme. Neurochem.Res., 1996; 21: 1075-1087
  Google Scholar
• 12. Bertoldi M.: Mammalian Dopa decarboxylase: structure, catalyticactivity and inhibition. Arch. Biochem. Biophys., 2014; 546: 1-7
  Google Scholar
• 13. Bertoldi M., Voltattorni C.B.: Multiple roles of the active sitelysine of Dopa decarboxylase. Arch. Biochem. Biophys., 2009; 488:130-139
  Google Scholar
• 14. Blaud M., Vossen C., Joseph G., Alazard R., Erard M., Nieto L.:Characteristic patterns of N Oct-3 binding to a set of neuronal promoters.J. Mol. Biol., 2004; 339: 1049-1058
  Google Scholar
• 15. Blechingberg J., Holm I.E., Johansen M.G., Børglum A.D., NielsenA.L.: Aromatic l-amino acid decarboxylase expression profilingand isoform detection in the developing porcine brain. Brain Res.,2010; 1308: 1-13
  Google Scholar
• 16. Bonifati V., Rizzu P., van Baren M.J., Schaap O., Breedveld G.J.,Krieger E., Dekker M.C., Squitieri F., Ibanez P., Joosse M., van DongenJ.W., Vanacore N., van Swieten J.C., Brice A., Meco G. i wsp.: Mutationsin the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onsetparkinsonism. Science, 2003; 299: 256-259
  Google Scholar
• 17. Børglum A.D., Bruun T.G., Kjeldsen T.E., Ewald H., Mors O., KirovG., Russ C., Freeman B., Collier D.A., Kruse T.A.: Two novel variantsin the DOPA decarboxylase gene: association with bipolar affectivedisorder. Mol. Psychiatry, 1999; 4: 545-551
  Google Scholar
• 18. Børglum A.D., Hampson M., Kjeldsen T.E., Muir W., Murray V.,Ewald H., Mors O., Blackwood D., Kruse T.A.: Dopa decarboxylasegenotypes may influence age at onset of schizophrenia. Mol. Psychiatry,2001; 6: 712-717
  Google Scholar
• 19. Børglum A.D., Kirov G., Craddock N., Mors O., Muir W., MurrayV., McKee I., Collier D.A., Ewald H., Owen M.J., Blackwood D., KruseT.A.: Possible parent-of-origin effect of Dopa decarboxylase in susceptibilityto bipolar affective disorder. Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr.Genet., 2003; 117B: 18-22
  Google Scholar
• 20. Brun L., Ngu L.H., Keng W.T., Ch’ng G.S., Choy Y.S., Hwu W.L., LeeW.T., Willemsen M.A., Verbeek M.M., Wassenberg T., Régal L., OrcesiS., Tonduti D., Accorsi P., Testard H. i wsp.: Clinical and biochemicalfeatures of aromatic L-amino acid decarboxylase deficiency. Neurology,2010; 75: 64-71
  Google Scholar
• 21. Bruneau G., Thibault J., Gros F., Mattei M.G.: Mapping of thedopa decarboxylase gene to the 11A band of the murine genome.Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992; 186: 926-930
  Google Scholar
• 22. Buckland P.R., O’Donovan M.C., McGuffin P.: Changes in dopadecarboxylase mRNA but not tyrosine hydroxylase mRNA levels inrat brain following antipsychotic treatment. Psychopharmacology,1992; 108: 98-102
  Google Scholar
• 23. Burkhard P., Dominici P., Borri-Voltattorni C., Jansonius J.N.,Malashkevich V.N.: Structural insight into Parkinson’s disease treatmentfrom drug-inhibited DOPA decarboxylase. Nat. Struct. Biol.,2001; 8: 963-967
  Google Scholar
• 24. Cartier E.A., Parra L.A., Baust T.B., Quiroz M., Salazar G., FaundezV., Egaña L., Torres G.E.: A biochemical and functional proteincomplex involving dopamine synthesis and transport into synapticvesicles. J. Biol. Chem., 2010; 285: 1957-1966
  Google Scholar
• 25. Chalatsa I., Fragoulis E.G., Vassilacopoulou D.: Release of membrane-associated L-dopa decarboxylase from human cells. Neurochem.Res., 2011; 36: 1426-1434
  Google Scholar
• 26. Chang Y.T., Mues G., Hyland K.: Alternative splicing in the codingregion of human aromatic L-amino acid decarboxylase mRNA.Neurosci. Lett., 1996; 202: 157-160
  Google Scholar
• 27. Cho S., Neff N.H., Hadjiconstantinou M.: Regulation of tyrosinehydroxylase and aromatic L-amino acid decarboxylase by dopaminergicdrugs. Eur. J. Pharmacol., 1997; 323: 149-157
  Google Scholar
• 28. Cho S., Duchemin A.M., Neff N.H., Hadjiconstantinou M.: Tyrosinehydroxylase, aromatic L-amino acid decarboxylase and dopaminemetabolism after chronic treatment with dopaminergic drugs. BrainRes., 1999; 830: 237-245
  Google Scholar
• 29. Christenson J.G., Dairman W., Udenfriend S.: Preparation andproperties of a homogeneous aromatic L-amino acid decarboxylasefrom hog kidney. Arch. Biochem. Biophys., 1970; 141: 356-367
  Google Scholar
• 30. Coune P.G., Schneider B.L., Aebischer P.: Parkinson’s disease:gene therapies. Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2012; 2: a009431
  Google Scholar
• 31. Daidone F., Montioli R., Paiardini A., Cellini B., Macchiarulo A.,Giardina G., Bossa F., Borri Voltattorni C.: Identification by virtualscreening and in vitro testing of human DOPA decarboxylase inhibitors.PLoS One, 2012; 7: e31610
  Google Scholar
• 32. Doucet-Beaupré H., Lévesque M.: The role of developmentaltranscription factors in adult midbrain dopaminergic neurons. OA.Neurosci., 2013; 1: 3
  Google Scholar
• 33. Drożak J., Bryła J.: Dopamine: not just a neurotransmitter. PostępyHig. Med. Dośw., 2005; 59: 405-420
  Google Scholar
• 34. Duchemin A.M., Berry M.D., Neff N.H., Hadjiconstantinou M.:Phosphorylation and activation of brain aromatic L-amino acid decarboxylaseby cyclic AMP-dependent protein kinase. J. Neurochem.,2000; 75: 725-731
  Google Scholar
• 35. Duchemin A.M., Neff N.H., Hadjiconstantinou M.: Aromatic L–amino acid decarboxylase phosphorylation and activation by PKGIαin vitro. J. Neurochem., 2010; 114: 542-552
  Google Scholar
• 36. Dugast C., Weber M.J.: NF-Y binding is required for transactivationof neuronal aromatic L-amino acid decarboxylase gene promoterby the POU-domain protein Brn-2. Brain Res. Mol. Brain Res.,2001; 89: 58-70
  Google Scholar
• 37. Dugast-Darzacq C., Egloff S., Weber M.J.: Cooperative dimerizationof the POU domain protein Brn-2 on a new motif activates theneuronal promoter of the human aromatic L-amino acid decarboxylasegene. Brain Res. Mol. Brain Res., 2004; 120: 151-163
  Google Scholar
• 38. Facchini P.J., Huber-Allanach K.L., Tari L.W.: Plant aromatic L–amino acid decarboxylases: evolution, biochemistry, regulation,and metabolic engineering applications. Phytochemistry, 2000; 54:121-138
  Google Scholar
• 39. Friedman J.R., Kaestner K.H.: The Foxa family of transcriptionfactors in development and metabolism. Cell. Mol. Life Sci., 2006;63: 2317-2328
  Google Scholar
• 40. Gazdar A.F., Helman L.J., Israel M.A., Russell E.K., Linnoila R.I.,Mulshine J.L., Schuller H.M., Park J.G.: Expression of neuroendocrinecell markers L-dopa decarboxylase, chromogranin A, and dense coregranules in human tumors of endocrine and nonendocrine origin.Cancer Res., 1988; 48: 4078-4082
  Google Scholar
• 41. GeneCards. Human Gene Database. DDC Gene (Protein coding)http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=DDC&ortholog=all#orthologs (16.07.2015)
  Google Scholar
• 42. Giardina G., Montioli R., Gianni S., Cellini B., Paiardini A., VoltattorniC.B., Cutruzzolà F.: Open conformation of human DOPAdecarboxylase reveals the mechanism of PLP addition to Group IIdecarboxylases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011; 108: 20514-20519
  Google Scholar
• 43. Gilbert J.A., Bates L.A., Ames M.M.: Elevated aromatic-L-aminoacid decarboxylase in human carcinoid tumors. Biochem. Pharmacol.,1995; 50: 845-850
  Google Scholar
• 44. Hadjiconstantinou M., Duchemin A.M, Azad A., Neff N.H.: AromaticL-amino acid decarboxylase. W: Biogenic Amines. Pharmacological,neurochemical and molecular aspects in the CNS. Red.: T. Farooqui,A.A. Farooqui. Nova Biomedica Books, New York, 2010, 25-45
  Google Scholar
• 45. Hadjiconstantinou M., Neff N.H.: Enhancing aromatic L-aminoacid decarboxylase activity: implications for L-DOPA treatment inParkinson’s disease. CNS Neurosci. Ther., 2008; 14: 340-351
  Google Scholar
• 46. Hadjiconstantinou M., Rossetti Z.L., Wemlinger T.A., Neff N.H.: Dizocilpineenhances striatal tyrosine hydroxylase and aromatic L-aminoacid decarboxylase activity. Eur. J. Pharmacol., 1995; 289: 97-101
  Google Scholar
• 47. Hadjiconstantinou M., Wemlinger T.A., Sylvia C.P., Hubble J.P.,Neff N.H.: Aromatic L-amino acid decarboxylase activity of mousestriatum is modulated via dopamine receptors. J. Neurochem., 1993;60: 2175-2180
  Google Scholar
• 48. Hahn S.L., Hahn M., Joh T.H.: Genomic organization of the rataromatic L-amino acid decarboxylase (AADC) locus: partial analysisreveals divergence from the Drosophila dopa decarboxylase (DDC)gene structure. Mamm. Genome, 1991; 1: 145-151
  Google Scholar
• 49. Han F., Wang W., Chen B., Chen C., Li S., Lu X., Duan J., ZhangY., Zhang Y.A., Guo W., Li G.: Human induced pluripotent stem cell–derived neurons improve motor asymmetry in a 6-hydroxydopamine-induced rat model of Parkinson’s disease. Cytotherapy, 2015;17: 665-679
  Google Scholar
• 50. Hashimoto S., Ikeno T., Hasegawa J., Nagatsu T., Kuzuya H.: Endogenousinhibitors of DOPA decarboxylase in rat submandibulargland. Arch. Oral Biol., 1980; 25: 195-199
  Google Scholar
• 51. Hawi Z., Foley D., Kirley A., McCarron M., Fitzgerald M., Gill M.:Dopa decarboxylase gene polymorphisms and attention deficit hyperactivitydisorder (ADHD): no evidence for association in the Irishpopulation. Mol. Psychiatry, 2001; 6: 420-424
  Google Scholar
• 52. Hermanson E., Joseph B., Castro D., Lindqvist E., Aarnisalo P.,Wallén A., Benoit G., Hengerer B., Olson L., Perlmann T.: Nurr1 regulatesdopamine synthesis and storage in MN9D dopamine cells.Exp. Cell Res., 2003; 288: 324-334
  Google Scholar
• 53. Hirsh J., Davidson N.: Isolation and characterization of the dopadecarboxylase gene of Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol., 1981;1: 475-485
  Google Scholar
• 54. Hitchins M.P., Bentley L., Monk D., Beechey C., Peters J., KelseyG., Ishino F., Preece M.A., Stanier P., Moore G.E.: DDC and COBL, flankingthe imprinted GRB10 gene on 7p12, are biallelically expressed.Mamm. Genome, 2002; 13: 686-691
  Google Scholar
• 55. Hodgetts R.B., O’Keefe S.L.: Dopa decarboxylase: a model gene–enzyme system for studying development, behavior, and systematics.Annu. Rev. Entomol., 2006; 51: 259-284
  Google Scholar
• 56. Hu Y., Ippolito J.E., Garabedian E.M., Humphrey P.A., GordonJ.I.: Molecular characterization of a metastatic neuroendocrine cellcancer arising in the prostates of transgenic mice. J. Biol. Chem.,2002; 277: 44462-44474
  Google Scholar
• 57. Hwu W.L., Muramatsu S., Tseng S.H., Tzen K.Y., Lee N.C., ChienY.H., Snyder R.O., Byrne B.J., Tai C.H., Wu R.M.: Gene therapy foraromatic L-amino acid decarboxylase deficiency. Sci. Transl. Med.,2012; 4: 134ra61
  Google Scholar
• 58. Hyland K., Clayton P.T.: Aromatic amino acid decarboxylase deficiencyin twins. J. Inherit. Metab. Dis., 1990; 13: 301-304
  Google Scholar
• 59. Hyland K., Clayton P.T.: Aromatic L-amino acid decarboxylasedeficiency: diagnostic methodology. Clin. Chem., 1992; 38: 2405-2410
  Google Scholar
• 60. Ichinose H., Kurosawa Y., Titani K., Fujita K., Nagatsu T.: Isolationand characterization of a cDNA clone encoding human aromaticL-amino acid decarboxylase. Biochem. Biophys. Res. Commun.,1989; 164: 1024-1030
  Google Scholar
• 61. Ichinose H., Sumi-Ichinose C., Ohye T., Hagino Y., Fujita K., NagatsuT.: Tissue-specific alternative splicing of the first exon generatestwo types of mRNAs in human aromatic L-amino acid decarboxylase.Biochemistry, 1992; 31: 11546-11550
  Google Scholar
• 62. Isaac J., Berndt T.J., Chinnow S.L. Tyce G.M., Dousa T.P., KnoxF.G.: Dopamine enhances the phosphaturic response to parathyroidhormone in phosphate-deprived rats. J. Am. Soc. Nephrol., 1992;2: 1423-1429
  Google Scholar
• 63. Ishikawa S., Taira T., Niki T., Takahashi-Niki K., Maita C., MaitaH., Ariga H., Iguchi-Ariga S.M.: Oxidative status of DJ-1-dependentactivation of dopamine synthesis through interaction of tyrosinehydroxylase and 4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) decarboxylasewith DJ-1. J. Biol. Chem., 2009; 284: 28832-28844
  Google Scholar
• 64. Iwata A., Miura S., Kanazawa I., Sawada M., Nukina N.:α-Synuclein forms a complex with transcription factor Elk-1. J. Neurochem.,2001; 77: 239-252
  Google Scholar
• 65. Johnson W.A., McCormick C.A., Bray S.J., Hirsh J.: A neuron–specific enhancer of the Drosophila dopa decarboxylase gene. GenesDev., 1989; 3: 676-686
  Google Scholar
• 66. Juorio A. V., Li X.M., Walz W., Paterson I.A.: Decarboxylation ofL-dopa by cultured mouse astrocytes. Brain Res., 1993; 626: 306-309
  Google Scholar
• 67. Kang U.J., Joh T.H.: Deduced amino acid sequence of bovinearomatic L-amino acid decarboxylase: homology to other decarboxylases.Brain Res. Mol. Brain Res., 1990; 8: 83-87
  Google Scholar
• 68. Kaźmierczak A., Adamczyk A., Strosznajder J.B.: Udziałα-synukleiny w funkcji układu dopaminergicznego. Postępy Biol.Kom., 2007; 34: 377-390
  Google Scholar
• 69. Kim D., Kim C.H., Moon J.I., Chung Y.G., Chang M.Y., Han B.S.,Ko S., Yang E., Cha K.Y., Lanza R., Kim K.S.: Generation of human inducedpluripotent stem cells by direct delivery of reprogrammingproteins. Cell Stem Cell, 2009; 4: 472-476
  Google Scholar
• 70. Kokkinou I., Fragoulis E.G., Vassilacopoulou D.: The U937 macrophage cell line expresses enzymatically active L-Dopa decarboxylase.J. Neuroimmunol., 2009; 216: 51-58
  Google Scholar
• 71. Kokkinou I., Nikolouzou E., Hatzimanolis A., Fragoulis E.G., VassilacopoulouD.: Expression of enzymatically active L-DOPA decarboxylasein human peripheral leukocytes. Blood Cells Mol. Dis., 2009;42: 92-98
  Google Scholar
• 72. Krieger M., Coge F., Gros F., Thibault J.: Different mRNAs code fordopa decarboxylase in tissues of neuronal and nonneuronal origin.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991; 88: 2161-2165
  Google Scholar
• 73. Laakso A., Pohjalainen T., Bergman J., Kajander J., HaaparantaM., Solin O., Syvälahti E., Hietala J.: The A1 allele of the human D2dopamine receptor gene is associated with increased activity ofstriatal L-amino acid decarboxylase in healthy subjects. Pharmacogenet.Genomics, 2005; 15: 387-391
  Google Scholar
• 74. Le Van Thai A., Coste E., Allen J.M., Palmiter R.D., Weber M.J.:Identification of a neuron-specific promoter of human aromatic L–amino acid decarboxylase gene. Brain Res. Mol. Brain Res., 1993;17: 227-238
  Google Scholar
• 75. Li X.M., Juorio A.V., Paterson I.A., Walz W., Zhu M.Y., BoultonA.A.: Gene expression of aromatic L-amino acid decarboxylase incultured rat glial cells. J. Neurochem., 1992; 59: 1172-1175
  Google Scholar
• 76. Lim M.S., Chang M.Y., Kim S.M., Yi S.H., Suh-Kim H., Jung S.J.,Kim M.J., Kim J.H., Lee Y.S., Lee S.Y., Kim D.W., Lee S.H., Park C.H.:Generation of dopamine neurons from rodent fibroblasts throughthe expandable neural precursor cell stage. J. Biol. Chem., 2015;290: 17401-17414
  Google Scholar
• 77. Maneckjee R., Baylin S.B.: Use of radiolabeled monofluoromethyl-Dopa to define the subunit structure of human L-Dopa decarboxylase.Biochemistry, 1983; 22: 6058-6063
  Google Scholar
• 78. Mappouras D.G., Stiakakis J., Fragoulis E.G.: Purification andcharacterization of L-dopa decarboxylase from human kidney. Mol.Cell. Biochem., 1990; 94: 147-156
  Google Scholar
• 79. Maras B., Dominici P., Barra D., Bossa F., Voltattorni C.B.: Pigkidney 3,4-dihydroxyphenylalanine (dopa) decarboxylase. Primarystructure and relationships to other amino acid decarboxylases. Eur.J. Biochem., 1991; 201: 385-391
  Google Scholar
• 80. Matsuda N., Hayashi H., Miyatake S., Kuroiwa T., KagamiyamaH.: Instability of the apo form of aromatic L-amino acid decarboxylasein vivo and in vitro: implications for the involvement of theflexible loop that covers the active site. J. Biochem., 2004; 135: 33-42
  Google Scholar
• 81. Menheniott T.R., Woodfine K., Schulz R., Wood A.J., Monk D., GiraudA.S., Baldwin H.S., Moore G.E., Oakey R.J.: Genomic imprintingof Dopa decarboxylase in heart and reciprocal allelic expression withneighboring Grb10. Mol. Cell. Biol., 2008; 28: 386-396
  Google Scholar
• 82. Millevoi S., Thion L., Joseph G., Vossen C., Ghisolfi-Nieto L.,Erard M.: Atypical binding of the neuronal POU protein N-Oct3 tononcanonical DNA targets. Implications for heterodimerization withHNF-3β. Eur. J. Biochem., 2001; 268: 781-791
  Google Scholar
• 83. Montioli R., Cellini B., Borri Voltattorni C.: Molecular insightsinto the pathogenicity of variants associated with the aromatic aminoacid decarboxylase deficiency. J. Inherit. Metab. Dis., 2011; 34:1213-1224
  Google Scholar
• 84. Muramatsu S., Fujimoto K., Kato S., Mizukami H., Asari S., IkeguchiK., Kawakami T., Urabe M., Kume A., Sato T., Watanabe E., OzawaK., Nakano I.: A phase I study of aromatic L-amino acid decarboxylasegene therapy for Parkinson’s disease. Mol. Ther., 2010; 18: 1731-1735
  Google Scholar
• 85. Murawiec S.: Some questions about the essence of delusions inthe light of recent neurobiological findings. Psychiatr. Pol., 2009;43: 403-410
  Google Scholar
• 86. NCBI. DDC dopa decarboxylase [Homo sapiens (human)]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1644 (16.07.2015)
  Google Scholar
• 87. Neff N.H., Wemlinger T.A., Duchemin A.M., HadjiconstantinouM.: Clozapine modulates aromatic L-amino acid decarboxylase activity in mouse striatum. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2006; 317: 480-487
  Google Scholar
• 88. Newman M.B., Bakay R.A.: Therapeutic potentials of humanembryonic stem cells in Parkinson’s disease. Neurotherapeutics,2008; 5: 237-251
  Google Scholar
• 89. Nishigaki I., Ichinose H., Tamai K., Nagatsu T.: Purification ofaromatic L-amino acid decarboxylase from bovine brain with a monoclonalantibody. Biochem. J., 1988; 252: 331-335
  Google Scholar
• 90. O’Malley K.L., Harmon S., Moffat M., Uhland-Smith A., WongS.: The human aromatic L-amino acid decarboxylase gene can bealternatively spliced to generate unique protein isoforms. J. Neurochem.,1995; 65: 2409-2416
  Google Scholar
• 91. Osterova-Golts N., Petrucelli L., Hardy J., Lee J.M., Farer M., WolozinB.: The A53T α-synuclein mutation increases iron-dependentaggregation and toxicity. J. Neurosci., 2000; 20: 6048-6054
  Google Scholar
• 92. Palfi S., Gurruchaga J.M., Ralph G.S., Lepetit H., Lavisse S., ButteryP.C., Watts C., Miskin J., Kelleher M., Deeley S., Iwamuro H., LefaucheurJ.P., Thiriez C., Fenelon G., Lucas C. i wsp.: Long-term safetyand tolerability of ProSavin, a lentiviral vector-based gene therapyfor Parkinson’s disease: a dose escalation, open-label, phase 1/2 trial.Lancet, 2014; 383: 1138-1146
  Google Scholar
• 93. Peng X., Tehranian R., Dietrich P., Stefanis L., Perez R.G.: Alpha–synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosinehydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells. J. Cell Sci.,2005; 118: 3523-3530
  Google Scholar
• 94. Perez R.G., Waymire J.C., Lin E., Liu J.J., Guo F., Zigmond M.J.:A role for α-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis.J. Neurosci., 2002; 22: 3090-3099
  Google Scholar
• 95. Phillips K., Luisi B.: The virtuoso of versatility: POU proteinsthat flex to fit. J. Mol. Biol., 2000; 302: 1023-1039
  Google Scholar
• 96. Polymeropoulos M.H., Lavedan C., Leroy E., Ide S.E., Dehejia A.,Dutra A., Pike B., Root H., Rubenstein J., Boyer R., Stenroos E.S., ChandrasekharappaS., Athanassiadou A., Papapetropoulos T., JohnsonW.G. i wsp.: Mutation in the α-synuclein gene identified in familieswith Parkinson›s disease. Science, 1997; 276: 2045-2047
  Google Scholar
• 97. Pons R., Ford B., Chiriboga C.A., Clayton P.T., Hinton V., HylandK., Sharma R., De Vivo D.C.: Aromatic L-amino acid decarboxylasedeficiency: clinical features, treatment, and prognosis. Neurology,2004; 62: 1058-1065
  Google Scholar
• 98. Poulikakos P., Vassilacopoulou D., Fragoulis E.G.: L-DOPA decarboxylaseassociation with membranes in mouse brain. Neurochem.Res., 2001; 26: 479-485
  Google Scholar
• 99. Prickett A.R., Oakey R.J.: A survey of tissue-specific genomicimprinting in mammals. Mol. Genet. Genomics, 2012; 287: 621-630
  Google Scholar
• 100. Pytka K., Zygmunt M., Filipek B.: Pharmacotherapy of Parkinson’sdisease: progress or regress? Postępy Hig. Med. Dośw., 2013;67: 700-708
  Google Scholar
• 101. Rahman M.K., Togari A., Kojima K., Takahashi K., Nagatsu T.:Presence of endogenous inhibitor of aromatic L-amino acid decarboxylasein monkey serum. Mol. Cell. Biochem., 1984; 63: 53-58
  Google Scholar
• 102. Raynal J.F., Dugast C., Le Van Thaï A., Weber M.J.: Winged helixhepatocyte nuclear factor 3 and POU-domain protein brn-2/Noct- 3 bind overlapping sites on the neuronal promoter of humanaromatic L-amino acid decarboxylase gene. Brain Res. Mol. BrainRes., 1998; 56: 227-237
  Google Scholar
• 103. Reith J., Benkelfat C., Sherwin A., Yasuhara Y., Kuwabara H.,Andermann F., Bachneff S., Cumming P., Diksic M., Dyve S.E., EtienneP., Evans A.C., Lal S., Shevell M., Savard G., Wong D.F., ChouinardG., Gjedde A.: Elevated dopa decarboxylase activity in living brainof patients with psychosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994; 91:11651-11654
  Google Scholar
• 104. Ren J., Zhang Y., Jin H., Yu J., Zhou Y., Wu F., Zhang W.: Novelinhibitors of human DOPA decarboxylase extracted from Euonymusglabra Roxb. ACS Chem. Biol., 2014; 9: 897-903
  Google Scholar
• 105. Rhee Y.H., Ko J.Y., Chang M.Y., Yi S.H., Kim D., Kim C.H., ShimJ.W., Jo A.Y., Kim B.W., Lee H., Lee S.H., Suh W., Park C.H., Koh H.C.,Lee Y.S., Lanza R., Kim K.S., Lee S.H.: Protein-based human iPS cellsefficiently generate functional dopamine neurons and can treata rat model of Parkinson disease. J. Clin. Invest., 2011; 121: 2326-2335
  Google Scholar
• 106. Saracchi E., Fermi S., Brighina L.: Emerging candidate biomarkersfor Parkinson’s disease: a review. Aging Dis., 2013; 5: 27-34
  Google Scholar
• 107. Shin S.Y., Fauman E.B., Petersen A.K., Krumsiek J., Santos R.,Huang J., Arnold M., Erte I., Forgetta V., Yang T.P., Walter K., MenniC., Chen L., Vasquez L., Valdes A.M. i wsp.: An atlas of genetic influenceson human blood metabolites. Nat. Genet., 2014; 46: 543-550
  Google Scholar
• 108. Shirota K., Fujisawa H.: Purification and characterization of aromaticL-amino acid decarboxylase from rat kidney and monoclonalantibody to the enzyme. J. Neurochem., 1988; 51: 426-434
  Google Scholar
• 109. Soldner F., Hockemeyer D., Beard C., Gao Q., Bell G.W., Cook E.G.,Hargus G., Blak A., Cooper O., Mitalipova M., Isacson O., Jaenisch R.:Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cellsfree of viral reprogramming factors. Cell, 2009; 136: 964-977
  Google Scholar
• 110. Sumi-Ichinose C., Ichinose H., Takahashi E., Hori T., Nagatsu T.:Molecular cloning of genomic DNA and chromosomal assignmentof the gene for human aromatic L-amino acid decarboxylase, theenzyme for catecholamine and serotonin biosynthesis. Biochemistry,1992; 31: 2229-2238
  Google Scholar
• 111. Takahashi K., Yamanaka S.: Induced pluripotent stem cells inmedicine and biology. Development, 2013; 140: 2457-2461
  Google Scholar
• 112. Taketoshi M., Horio Y., Imamura I., Tanaka T., Fukui H., WadaH.: Molecular cloning of guinea-pig aromatic-L-amino acid decarboxylasecDNA. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990; 170: 1229-1235
  Google Scholar
• 113. Tanaka T., Horio Y., Taketoshi M., Imamura I., Ando-YamamotoM., Kangawa K., Matsuo H., Kuroda M., Wada H.: Molecular cloningand sequencing of a cDNA of rat dopa decarboxylase: partial aminoacid homologies with other enzymes synthesizing catecholamines.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86: 8142-8146
  Google Scholar
• 114. Tay S.K., Wang F.S., Lin J.B.: Aromatic L-amino acid decarboxylasedeficiency: perspectives on diagnosis and management. Pediatr.Health Med. Ther., 2013; 4: 89-99
  Google Scholar
• 115. Tehranian R., Montoya S.E., Van Laar A.D., Hastings T.G., PerezR.G.: Alpha-synuclein inhibits aromatic amino acid decarboxylaseactivity in dopaminergic cells. J. Neurochem., 2006; 99: 1188-1196
  Google Scholar
• 116. Vassilacopoulou D., Sideris D.C., Vassiliou A.G., Fragoulis E.G..:Identification and characterization of a novel form of the humanL-dopa decarboxylase mRNA. Neurochem. Res., 2004; 29: 1817-1823
  Google Scholar
• 117. Vassiliou A.G., Fragoulis E.G., Vassilacopoulou D.: Detection,purification and identification of an endogenous inhibitor of L-Dopadecarboxylase activity from human placenta. Neurochem. Res.,2009; 34: 1089-1100
  Google Scholar
• 118. Vassiliou A.G., Vassilacopoulou D., Fragoulis E.G.: Purificationof an endogenous inhibitor of L-Dopa decarboxylase activity fromhuman serum. Neurochem. Res., 2005; 30: 641-649
  Google Scholar
• 119. Vassort C., Rivière M., Bruneau G., Gros F., Thibault J., Levan G.,Szpirer J., Szpirer C.: Assignment of the rat genes coding for dopadecarboxylase (DDC) and glutamic acid decarboxylases (GAD1 andGAD2). Mamm. Genome, 1993; 4: 202-206
  Google Scholar
• 120. Wafa L.A., Cheng H., Rao M.A., Nelson C.C., Cox M., Hirst M.,Sadowski I., Rennie P.S.: Isolation and identification of L-dopa decarboxylaseas a protein that binds to and enhances transcriptionalactivity of the androgen receptor using the repressed transactivatoryeast two-hybrid system. Biochem. J., 2003; 375: 373-383
  Google Scholar
• 121. Wang D., Gao G.: State-of-the-art human gene therapy: partII. Gene therapy strategies and clinical applications. Discov. Med.,2014; 18: 151-161
  Google Scholar
• 122. Waymire J.C., Haycock J.W.: Lack of regulation of aromatic L–amino acid decarboxylase in intact bovine chromaffin cells. J. Neurochem.,2002; 81: 589-593
  Google Scholar
• 123. Wernig M., Zhao J.P., Pruszak J., Hedlund E., Fu D., Soldner F.,Broccoli V., Constantine-Paton M., Isacson O., Jaenisch R.: Neuronsderived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate intothe fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson’s disease.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008; 105: 5856-5861
  Google Scholar
• 124. Woźniak M., Koziołkiewicz M.: Enzymy zależne od fosforanupirydoksalu – charakterystyka i zastosowanie w biotechnologii. Biotechnologia,2005; 4: 63-81
  Google Scholar
• 125. Young E.A., Duchemin A.M., Neff N.H., Hadjiconstantinou M.:Parallel modulation of striatal dopamine synthetic enzymes by secondmessenger pathways. Eur. J. Pharmacol., 1998; 357: 15-23
  Google Scholar
• 126. Young E.A., Neff N.H., Hadjiconstantinou M.: Evidence for cyclicAMP-mediated increase of aromatic L-amino acid decarboxylaseactivity in the striatum and midbrain. J. Neurochem., 1993; 60:2331-2333
  Google Scholar
• 127. Zhong N., Kim C.Y., Rizzu P., Geula C., Porter D.R., Pothos E.N.,Squitieri F., Heutink P., Xu J.: DJ-1 transcriptionally up-regulatesthe human tyrosine hydroxylase by inhibiting the sumoylation ofpyrimidine tract-binding protein-associated splicing factor. J. Biol.Chem., 2006; 281: 20940-20948
  Google Scholar
• 128. Zhu M.Y., Juorio A.V.: Aromatic L-amino acid decarboxylase:biological characterization and functional role. Gen. Pharmacol.,1995; 26: 681-696
  Google Scholar
• 129. Zhu M.Y., Juorio A.V., Paterson I.A., Boulton A.A.: Regulationof striatal aromatic L-amino acid decarboxylase: effects of blockadeor activation of dopamine receptors. Eur. J. Pharmacol., 1993;238: 157-164
  Google Scholar
• 130. Zhu M.Y., Juorio A.V., Paterson I.A., Boulton A.A.: Regulationof aromatic L-amino acid decarboxylase in rat striatal synaptosomes:effects of dopamine receptor agonists and antagonists. Br. J.Pharmacol., 1994; 112: 23-30
  Google Scholar

Full text