Streszczenie

Omawiane w pracy wyniki badań wskazują, że 5-metylocytozyna (5mC) może ulegać hydrok­sylacji do 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), a jej zawartość w genomie ssaków ocenia się na około 0,02-0,7% całkowitej zawartości cytozyny. Tak zmodyfikowana zasada jest związkiem po­średnim w procesie aktywnej demetylacji DNA i obecnie nazywa się ją „szóstą zasadą DNA”.
Chociaż aktywna demetylacja DNA pozostaje nadal zjawiskiem słabo poznanym, to uważa się, że uczestniczą w tym procesie trzy grupy enzymów:
• białka Tet katalizujące przemianę 5mC do 5hmC, która następnie może być utleniana do 5-for­mylocytozyny (5fC) i 5-karboksylocytozyny (5caC);
• AID/APOBEC deaminujące 5mC (lub 5hmC) do tyminy lub 5-hydroksymetylouracylu (5hmU) błędnie parującego z guaniną;
• glikozylaza TDG uczestnicząca w ścieżce naprawy DNA typu BER, która usuwa 5fC, 5caC i 5hmU zastępowane następnie cytozyną, czego efektem jest demetylowany DNA.
Działanie glikozylazy TDG (i/lub innych glikozylaz DNA) prawdopodobnie poprzedzone jest deaminacją 5mC do tyminy, ponieważ substratem dla TDG są błędne pary G: T. Etap deamina­cji zachodzi z udziałem białek rodziny AID/APOBEC. Możliwe jest współdziałanie TDG z wy­mienionymi deaminazami.
Wydaje się, że obecność 8-oksyguaniny (8-oksyGua) w DNA ma nie tylko znaczenie mutagenne. Postulowana jest rola tej oksydacyjnie zmodyfikowanej zasady w regulacji ekspresji genów, po­przez udział w procesie relaksacji chromatyny. Możliwe jest, że 8-oksyGua występująca w spe­cyficznych sekwencjach DNA może uczestniczyć w regulacji transkrypcji, co sugerowałoby epi­genetyczne znaczenie obecności tak zmodyfikowanej zasady w DNA.

Słowa kluczowe:czynniki epigenetyczne • metylacja DNA • aktywna demetylacja DNA • oksydacyjne modyfikacje DNA • 5-hydroksymetylocytozyna • 8-oksyguanina

Summary

Recent discoveries have demonstrated that 5-methylcytosine (5mC) may be hydroxymethyla­ted to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in mammals and that genomic DNA may contain abo­ut 0.02-0.7% of 5hmC. The aforementioned modification is the key intermediate of active DNA demethylation and has been named “the sixth base in DNA”.
Although active DNA demethylation in mammals is still controversial, the most plausible me­chanism/s of active 5mC demethylation include involvement of three families of enzymes; i) Tet, which is involved in hydroxylation of 5mC to form 5hmC, which can be further oxidized to 5-for­mylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC); ii) deamination of 5mC (or 5hmC) by AID/APOBEC to form thymine or 5-hydroxymethyluracil (5hmU) mispaired with guanine; iii) the BER pathway induced by involvement of TDG glycosylase to replace the above described base modification (5fC, 5caC, 5hmU) with cytosine to demethylate DNA.
A plausible scenario for engagement of TDG glycosylase (or some other G-T glycosylase) is thro­ugh prior deamination of 5-mC to thymine, which generates a G: T substrate for the enzyme. Here cytidine deaminase of the AID/APOBEC family was implicated in the deamination step. It is possible that TDG may act in concert with these deaminases.
It seems that mutations are not the only effect of oxidatively modified DNA bases. These, as yet, understudied aspects of the damage suggest a potential for 8-oxoguanine (8-oxoGua) to affect gene expression via chromatin relaxation. It is possible that 8-oxoGua presence in specific DNA sequences may be widely used for transcription regulation, which suggests the epigenetic nature of 8-oxoGua presence in DNA.

Key words:epigenetic modifications • DNA methylation • active DNA demethylation • oxidative DNA modifications • 5-hydroxymethylcytosine • 8-oxoguanine

Wykaz skrótów:

5caC – 5-karboksylocytozyna; 5fC – 5-formylocytozyna; 5hmC – 5-hydroksymetylocytozyna; 5hmU – 5-hydroksymetylouracyl; 5mC – 5-metylocytozyna; 8-oksydG – 8-oksy-2′-deoksyguanozyna; 8-oksyGua – 8-oksyguanina; AID – deaminaza cytydyny indukowana aktywacją limfocytów; BER – naprawa DNA przez wycinanie zasad; DNMT – metylotransferaza DNA; ESC – embrionalne komórki macierzyste; NER – naprawa DNA przez wycinanie nukleotydów; NLS – sygnał lokalizacji jądrowej; PCNA – jądrowy antygen komórek proliferujących; SMUG1, TDG, UNG – glikozylazy DNA.

Wprowadzenie

Postępy w poznaniu sekwencji genomowej różnych organi­zmów, w tym genomu człowieka, nie doprowadziły dotych­czas do pełnego zrozumienia zjawisk związanych z realizacją informacji genetycznej. Ta z kolei wydaje się bezpośrednio zależna od przejścia chromatyny upakowanej w luźniejsze domeny, dostępne dla białek enzymatycznych, a więc prze­miany heterochromatyny w euchromatynę. Powiązane jest to zarówno z potranslacyjną modyfikacją histonów, jak i me­tylacją bądź demetylacją DNA. Modyfikacje takie określane są jako zmiany epigenetyczne, regulujące organizację chro­matyny i ekspresję genów, nie wpływając bezpośrednio na sekwencję nukleotydów w DNA. Interesującym przykładem wpływu metylacji DNA na funkcje komórek i dalsze tego kon­sekwencje dla losów organizmu jest pszczoła miodna (Apis mellifera). W przypadku tego owada wzór metylacji DNA komórkowego decyduje o tym czy dany osobnik przeobra­zi się w robotnicę, czy też pisany mu jest los królowej [50].

Najlepiej scharakteryzowanym markerem epigenetycznym jest grupa metylowa w pozycji 5 cytozyny. Około 3-4% genomowej cytozyny ulega metylacji, a powstająca 5-mety­locytozyna (5mC) stanowi 0,75-1% ogółu zasad DNA typo­wej komórki ssaków [12]. Pomimo powszechnego przeko­nania, że wzór metylacji DNA ustalany jest we wczesnych fazach rozwoju zarodkowego i utrzymywany podczas życia osobniczego przez metylotransferazy DNA (DNMT), wy­niki badań pochodzące z ostatnich dwóch lat sugerują, że w komórkach ssaków możliwa jest także aktywna demety­lacja. W artykule omówiono wyniki prac, które wskazują na możliwość dynamicznej regulacji metylowania DNA, co z kolei sugeruje możliwość reprogramowania, jak się wydawało do niedawna nieodwracalnych, procesów okre­ślających charakter zróżnicowanej komórki. Zwrócono tak­że uwagę na wyniki badań, które sugerują nową, epigene­tyczną funkcję innej obecnej w DNA cząsteczki, jaką jest oksydacyjnie zmodyfikowana guanina, w postaci 8-oksy­guaniny (8-oksyGua).

5-Hydroksymetylocytozyna – „szósta zasada DNA”

Hydroksylowana pochodna 5mC, czyli 5-hydroksyme­tylocytozyna (5hmC), została po raz pierwszy opisana w DNA ssaków, we wczesnych latach 70 ubiegłego wie­ku. Stwierdzono wówczas bardzo wysoki poziom tej zmo­dyfikowanej zasady, sięgający aż 15% zawartości genomo­wej cytozyny (C), w mózgach szczura, myszy i żaby [44]. Ponieważ późniejsze prace nie potwierdziły tej rewelacji, przez następne 30 lat analiza 5hmC, nie cieszyła się spe­cjalnym zainteresowaniem badaczy [29]. W 2009 r. opu­blikowano wyniki dwóch prac, które jak się okazało przy­wróciły zainteresowanie tą modyfikacją DNA [30,53].

Z powodu znaczącej roli jaką odgrywa 5hmC w proce­sach fizjologicznych i stwierdzonego wysokiego poziomu tej zmodyfikowanej zasady w DNA, obecnie nazywa się ją często „szóstą zasadą DNA” [11].

5-Hydroksymetylocytozyna jest oksydacyjną modyfikacją 5mC, co sugeruje, że jej komórkowy poziom może zale­żeć od nasilenia stanu stresu oksydacyjnego. Nie uzyska­no jednak dowodów eksperymentalnych, wskazujących wyraźnie na taką zależność [53].

Mechanizmy odpowiedzialne za aktywną demetylację DNA

Udział białek Tet w przekształceniu 5mC do 5hmC

5-Metylocytozyna jest, jak wynika z wielu badań, ważnym elementem w regulacji ekspresji genów. Metylacja DNA odgrywa bowiem rolę w transkrypcyjnym wyciszaniu ge­nów i służy w komórce m.in. do wyciszania licznych se­kwencji powtórzonych, piętnowania rodzicielskiego, jak również wyłączania drugiego chromosomu X w komór­kach osobników żeńskich [24,40]. Ponadto wzór metylacji DNA to także konsekwencja demetylacji tej biomolekuły. Demetylacja DNA może być procesem pasywnym, zależ­nym od replikacji, kiedy DNMT nie metyluje nowo zsynte­tyzowanego łańcucha DNA. W rezultacie druga runda re­plikacyjna, której nie towarzyszy metylacja zachowawcza, daje całkowicie niezmetylowany DNA. Demetylacja DNA może przebiegać również na drodze enzymatycznej nieza­leżnie od przebiegu cyklu podziałowego komórki [6,56].

Dotychczas zaproponowano kilka możliwych mechanizmów aktywnej demetylacji DNA u kręgowców. Należą do nich:
• bezpośrednie usuwanie grupy metylowej z 5mC, z udzia­łem białka MBD2b,
• wycięcie 5mC przez glikozylazę (TDG lub MBD4) i za­stąpienie cytozyną w wyniku naprawy typu BER,
• przekształcenie 5mC w tyminę poprzez jej deamina­cję z udziałem białek AID/APOBEC, a następnie przy­wrócenie pary G: C w wyniku naprawy BER, w której uczestniczą glikozylazy TDG [6,48,56].

Niedawno opublikowane wyniki badań wskazują, że w ak­tywnej demetylacji promotorów genów ulegających ekspre­sji może również uczestniczyć system naprawy NER [49]. Brak jest jednak potwierdzenia tych obserwacji w później­szych badaniach. Warto również nadmienić, że w wyni­ku naprawy NER usuwane są masywne addukty w DNA (bulky DNA adducts).

Według najnowszych badań istotną rolę w procesie de­metylacji DNA mogą odgrywać białka Tet (Ten-eleven-translocation) katalizujące konwersję 5mC do 5hmC [26,53] (ryc. 1).

Ryc. 1. Mechanizmy demetylacji DNA ssaków (na podstawie [4], zmodyfikowane)

Gen Tet1 wykryto w DNA chorych na ostrą białaczkę szpikową (acute myeloid leukemia – AML) z translokacją t(10;11) (q22;q23) [11]. W wyniku tej translokacji docho­dzi do fuzji N-końcowej części białka MLL (myelo/lym­phoid leukemia, mixed-lineage leukaemia), zawierającej domenę CXXC z C-końcową częścią białka Tet1, która za­wiera domenę katalityczną [31].

W 2009 r. zidentyfikowano u człowieka trzy białka, okre­ślane odpowiednio jako Tet1, Tet2 i Tet3 będące homolo­gami białek JBP1 i JBP2, występujących u Trypanosoma i biorących udział w utlenianiu grupy metylowej tyminy. Wykazano przy tym, że enzym Tet1 człowieka nie mo­dyfikuje tyminy, ale może katalizować reakcję utlenienia 5mC do 5hmC w warunkach in vitro i w hodowlach ko­mórkowych [53]. W kolejnych eksperymentach potwierdzo­no podobną aktywność enzymatyczną pozostałych białek Tet, zarówno w przypadku komórek człowieka, jak i my­szy. Zaobserwowano również, że nadekspresja białek Tet skutkuje obniżeniem poziomu stężenia 5mC i wzrostem 5hmC [26,53]. Ponadto odnotowano obniżenie poziomu 5hmC w mysich komórkach embrionalnych z obniżoną zawartością Tet1 [53]. Wszystkie enzymy należące do ro­dziny białek Tet są dioksygenazami zależnymi od jonów Fe(II) i α-ketoglutaranu, który podczas reakcji ulega de­karboksylacji do bursztynianu [36].

Udział białek Tet w demetylacji DNA oraz regulacji transkrypcji

Obecnie rozważanych jest kilka możliwych sposobów uczestnictwa białek Tet w demetylacji DNA i późniejszej regulacji ekspresji genów. Pierwszy model zakłada, że 5hmC pojawiająca się jako produkt reakcji katalizowanej przez białka Tet, nie jest rozpoznawana przez metylotrans­ferazę DNA. To z kolei może skutkować brakiem metyla­cji nowo zsyntetyzowanego łańcucha DNA podczas repli­kacji, prowadząc do demetylacji pasywnej (ryc. 1). Uważa się też, że 5hmC jest intermediatem, który odgrywa istot­ną rolę w aktywnej demetylacji, z zaangażowaniem me­chanizmu naprawy typu BER (szczegóły w dalszej części artykułu) [4,11]. Pojawienie się 5hmC zamiast 5mC w se­kwencjach promotorowych może skutkować również obni­żeniem powinowactwa białek wiążących metylowane CpG (MBD) do tych sekwencji, co w konsekwencji może pro­wadzić do aktywacji transkrypcji [11].

W komórkach embrionalnych myszy wykazano podwójną rolę białka Tet1 w procesie regulacji transkrypcji i to za­równo aktywacyjną, jak i represyjną. W przypadku genów aktywnych transkrypcyjnie, Tet1 uczestniczy w hipomety­lacji obszarów promotorowych, co z kolei skutkuje wzro­stem poziomu ekspresji tych genów. Wykazano, że Tet1 wiąże się preferencyjnie z regionami charakteryzującymi się dużą zawartością dinukleotydów CpG. Zaobserwowano również, że wyspy CpG niezwiązane z białkiem Tet1 ce­chuje wyższa zawartość 5mC w porównaniu z wyspami CpG promotorów genów, do których przyłącza się Tet1. Przyłączanie Tet1 do promotorów genów jest więc odwrot­nie skorelowane ze stopniem ich zmetylowania. W my­sich komórkach macierzystych o obniżonej ekspresji genu Tet1 odnotowano znacząco wyższy poziom 5mC w pro­motorach genów bogatych w dinukleotydy CpG, zwłasz­cza w miejscach wiązania białek Tet1, w porównaniu do komórek kontrolnych. Obserwacje te mogą sugerować, że białka Tet1 są niezbędne do utrzymania stanu hipomety­lacji promotorów genów aktywnych transkrypcyjnie [55]. Białko Tet1 uczestniczy również w hamowaniu transkryp­cji przez bezpośrednie wiązanie korepresora Sin3a, two­rzącego kompleks z deacetylazami histonów (HDAC) [54]. Na rolę Tet1 w represji transkrypcji wskazują obserwacje wspólnego wiązania się Tet1 i kompleksu białek Polycomb 2 (polycomb represor complex – PRC2) do tych samych genów. Kompleks PRC2 jest odpowiedzialny za metylację lizyny w pozycji 27 histonu H3 (H3K27me3), rozpozna­waną następnie przez swoiste białka efektorowe, co w efek­cie prowadzi do hamowania procesu transkrypcji [4,8].

Sugeruje się, że białka Tet1 i Tet2 odgrywają rolę w utrzy­maniu pluripotencji komórek macierzystych, natomiast obecność Tet3 związana jest z procesem różnicowania komórkowego [36]. Niedobór Tet1 w embrionalnych ko­mórkach macierzystych myszy (embrionic stem cells – ESC) skutkuje nasileniem metylacji w obrębie promoto­ra NANOG i zahamowaniem ekspresji, a to z kolei może prowadzić do utraty pluripotencji komórek [26]. Białko NANOG uznawane jest za główny czynnik utrzymują­cy w stanie pluripotencji embrionalne komórki macierzy­ste. Nadekspresja tego białka w komórkach ESC zwięk­sza ich aktywność proliferacyjną, powodując jednocześnie utrzymanie pluripotencjalnego charakteru komórek [41]. Supresja genu NANOG promuje natomiast różnicowanie komórek macierzystych.

Gen Tet3 wykazuje wysoką ekspresję w oocytach oraz powstających po zapłodnieniu zygotach. Ostatnie badania wskazują, że tuż po zapłodnieniu komórki jajowej, 5mC jest hydroksylowana do 5hmC tylko w męskim przedją­drzu. Może to sugerować, że obserwowana globalna deme­tylacja genomu ojcowskiego przed fuzją przedjądrzy jest faktycznie globalną hydroksylacją 5mC z udziałem Tet3 [20,25,36]. Po zmianie wzoru metylacji genomu ojcowskie­go poziom Tet3 ulega znacznemu obniżeniu. Aktywność Tet3 wzrasta ponownie kiedy komórki zaczynają różnico­wanie. Trwającemu różnicowaniu towarzyszy jednocze­śnie obniżenie zawartości Tet1 i Tet2 w komórkach [36].

Genomowa zawartość 5hmC

O ile poziom 5mC jest dosyć stały w wielu typach tkanek i można go określić na około 4,5% całkowitej zawartości C, o tyle zawartość 5hmC waha się w szerokich granicach, w za­leżności od typu komórek, czy tkanek [11]. W wątrobie i ją­drach poziom 5hmC jest niski, podobnie jak w kulturach tkan­kowych [52]. W mięśniu sercowym i nerkach poziom 5hmC jest średni, a najwyższy stwierdzono w embrionalnych komór­kach macierzystych i ośrodkowym układzie nerwowym [19]. Szczegółowa analiza wykazała, że w siatkówce i móżdżku myszy poziom 5hmC wynosi około 0,3% zawartości cytozy­ny, natomiast w obszarach mózgu związanych z funkcją po­znawczą, korze mózgowej i hipokampie, w granicach 0,7% [35]. Ponieważ ostatnie badania wskazują, że procesy mety­lacji i demetylacji DNA związane są z kształtowaniem pa­mięci uważa się, że wzajemne przejście 5mC-5hmC może odgrywać rolę w kształtowaniu pamięci i rozwoju mózgu. Potwierdzają to obserwacje wskazujące, że poziom 5hmC w hipokampie 90-dniowej myszy wzrasta dwukrotnie, w po­równaniu do zwierząt w pierwszym dniu życia [35].

Bardzo małą zawartość 5hmC stwierdzono w komórkach nowotworowych [32]. W tkance nowotworowej jelita gru­bego poziom tej modyfikacji wynosił 0,02-0,06%, pod­czas gdy w „zdrowej” tkance obrzeża nowotworu, mie­ścił się w granicach 0,46-0,57%, całkowitej zawartości nukleotydów.

Początkowo dominowało twierdzenie, że formowanie 5hmC jest prostym sposobem na reaktywację genów wy­ciszonych poprzez metylację cytozyny, ale ostatnie bada­nia wykluczają raczej taką możliwość, ponieważ wysoki poziom 5hmC nie zawsze koreluje ze wzmożoną aktywa­cją transkrypcji [14,42,54,55,57].

W genomie embrionalnych komórek macierzystych naj­wyższą zawartość 5hmC stwierdzono w miejscach star­tu transkrypcji i wzdłuż sekwencji obszarów kodujących genu, z wyraźną przewagą występowania tej zmodyfiko­wanej zasady w eksonach, w porównaniu z sekwencjami intronowymi [14,54,55,57]. W mózgu dorosłego człowie­ka zdecydowanie wyższy poziom 5hmC stwierdzono w re­gionach promotorowych niż w sekwencjach obszarów ko­dujących genów. Stwierdzono także różnice w dystrybucji 5hmC w genach myszy między komórkami zróżnicowany­mi, takimi jak neurony i embrionalnymi komórkami ma­cierzystymi, co wskazuje, że taka modyfikacja zasad może odgrywać odmienną rolę w regulacji transkrypcji w obu wspomnianych typach komórek [8].

Większość uzyskanych wyników badań dotyczących em­brionalnych komórek macierzystych zgodnie wskazuje, że 5hmC jest umiejscowiona zarówno wzdłuż aktywnych, jak i nieaktywnych genów, których promotory zawierają śred­nią zawartość sekwencji CpG [8].

Wiązanie białka Tet1, zarówno z metylowanymi sekwen­cjami CpG, jak i zawierającymi 5hmC, potwierdza rolę tego enzymu w konwersji 5mC do 5hmC [59] i być może dalszej konwersji do 5fC i 5caC.

Potwierdzeniem wyników badań dotyczących dystrybucji 5hmC w embrionalnych komórkach macierzystych my­szy są rezultaty prac dotyczących preferencyjnego wią­zania białka Tet do DNA. Takie wiązanie zlokalizowano w miejscach startu transkrypcji. Interesujące są wyniki ba­dań, które wykazują, że brak Tet1 powoduje wzrost zawar­tości 5mC w miejscach startu transkrypcji [8].

Charakterystyka genów i białek Tet

Poznane u ssaków enzymy Tet1, Tet2 i Tet3 kodowane są przez trzy odrębne geny. Gen Tet1 zlokalizowany na chromosomie 10q21, zawiera 12 eksonów obejmujących 134 kpz i koduje białko składające się z 2136 aminokwa­sów. Tet2 umiejscowiony na chromosomie 4q24 zawiera 11 eksonów i obejmuje obszar 96 kpz. W wyniku alterna­tywnego splicingu powstają trzy izoformy białka Tet2, zbu­dowane odpowiednio z 2002, 1164 i 1194 aminokwasów. Gen Tet3 znajduje się na chromosomie 2p13, ma długość 61,8 kpz i zawiera 9 eksonów. Zidentyfikowano 3 izofor­my białka Tet3 składające się odpowiednio z 1660, 1440 i 728 aminokwasów [34]. Wszystkie białka Tet zawierają po trzy miejsca wiązania jonów Fe(II), oraz jedno miejsce wiązania α-ketoglutaranu. Dodatkowo białko Tet1 zawiera 3 motywy NLS (sygnał lokalizacji jądrowej, nuclear loca­lization signal) oraz domenę CXXC wiążącą cynk, która jest obecna we wszystkich metylotransferazach DNA i biał­kach MBD wiążących metylowane DNA [34]. W przypad­ku Tet1 region bogaty w reszty cysteinowe (cysteine-rich domain – CD) oraz motyw DBSH (double-stranded b-he­lix) tworzą domenę katalityczną enzymu.

Białka Tet a nowotwory

Pierwsze przesłanki sugerujące, że białka Tet mogą być za­angażowane w proces kancerogenezy i powstawania nie­których postaci białaczek pojawiły się wraz z identyfika­cją Tet1 u pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML), będących nosicielami translokacji t(10;11) (q22;q23). Kolejne badania wykazały jednak, że w licznych przy­padkach białaczek mutacje najczęściej występują w ge­nie Tet2 [11,34]. Somatyczne mutacje Tet2 obserwowano w ostrych białaczkach szpikowych (AML), przewlekłych rozrostach mieloproliferacyjnych (MPN – chronic myelo­proliferative neoplasms), zespołach mielodysplastycznych (MDS), przewlekłych białaczkach mielomonocytowych (CMML – chronic myelomonocytic leukemia). Mutacje punktowe dotyczą głównie domeny katalitycznej biał­ka Tet2, skutkując zakłóceniem przekształcania 5mC do 5hmC. Potwierdzają to badania, w których komórki szpi­ku kostnego pacjentów z ostrą białaczką szpikową, z mu­tacją Tet2, wykazywały znacząco niższy poziom 5hmC w porównaniu do osób zdrowych [11,28].

Udział białek Tet w przekształcaniu 5hmC do 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylocytozyny (5caC)

Jak już wspomniano 5hmC powstaje z 5mC, jako produkt reakcji katalizowanej przez rodzinę enzymów Tet. Okazało się jednak, że 5hmC nie jest końcowym produktem reak­cji enzymatycznej katalizowanej przez Tet. W warunkach in vitro oczyszczone białko enzymatyczne przekształca 5hmC do 5fC i dalej do postaci 5caC (ryc. 1). W macie­rzystych komórkach embrionalnych myszy wykrywa się niewielkie ilości obu pochodnych powstających z prze­mian 5hmC. Są to wartości 10-100 razy niższe, niż poziom 5hmC [11,23,46]. Wskazuje to, że dynamiczne możliwo­ści przekształcania genomu były dotąd przez badaczy nie w pełni doceniane. Zarówno 5fC jak i 5caC są substrata­mi dla glikozylazy TDG [23].

się, że 5caC może być bezpośrednio prze­kształcana w C z udziałem niezidentyfikowanej do tej pory dekarboksylazy [26]. Jednak bardziej prawdopodob­na w tych przemianach wydaje się ścieżka metaboliczna, która wymaga udziału mechanizmu naprawy typu BER, a dokładniej glikozylazy TDG, w usuwaniu 5caC/5fC i za­stąpieniu tych pochodnych cytozyną [9,10,23]. Usunięcie genu TDG u myszy (nokaut genetyczny) jest w skutkach letalne już w fazie rozwoju embrionalnego i związane z za­kłóceniami wzoru metylacji DNA [10]. Niezbędność biał­ka TDG w przebiegu rozwoju embrionalnego pozwoliła na wysunięcie wniosku, że demetylacja jest związana z wcze­śniejszą deaminacją 5mC i przekształceniem w tyminę z udziałem AID (ryc. 1), ponieważ kanonikalnym substra­tem dla TDG są błędne pary G: T. Letalność embrionalna myszy z brakiem białka TDG prawdopodobnie wynika nie tylko z faktu zaburzenia demetylacji DNA, ale także być może z braku bezpośredniej aktywacji transkrypcji wielu genów. Białko TDG oddziałuje bowiem z wieloma czyn­nikami transkrypcyjnymi, w tym z receptorami retinoido­wym, estrogenowym, tyroidowym [10].

Substratem dla TDG są także błędne pary zasad 5fC: G i 5caC: G. Co ciekawe, w lizatach embrionalnych komó­rek macierzystych wykazano aktywność glikozylazy wy­cinającej 5caC z oligonukleotydów, natomiast w komór­kach pozbawionych TDG, takiej aktywności nie wykazano [23]. Wiadomo także, że nadekspresja TDG prowadzi do obniżenia poziomu 5caC, natomiast obniżenie aktywno­ści enzymu związane jest z akumulacją tak zmodyfikowa­nej zasady [23].

Deaminacja 5mC do tyminy katalizowana przez AID/APOBEC i aktywna demetylacja z udziałem glikozylazy TDG

Ponad dekadę temu odkryto w DNA limfocytów B gen, którego produkt pełni funkcję deaminazy cytozyny, prze­kształcającej cytozynę w uracyl (activation – induced cy­tidine deaminase – AID, deaminaza cytydyny indukowana aktywacją limfocytów B) [38]. Obecność uracylu w genach kodujących immunoglobuliny (Ig) jest jednym z czynni­ków prowadzących do powstania różnorodności przeciw­ciał i pełni ważną rolę zarówno w procesie somatycznych hipermutacji, jak i somatycznej rekombinacji prowadzą­cej do przełączania izotypów przeciwciał [39].

W ostatnich latach wykazano, że AID zaangażowana jest także w proces aktywnej demetylacji DNA [3,10].

Pierwsze eksperymentalne dowody wskazujące na udział AID w procesie aktywnej demetylacji 5mC opierają się na wynikach pracy opublikowanej w 2008 roku [48]. W ba­daniach prowadzonych na zarodkach danio pręgowanego (zebrafish) udowodniono, że aktywne usuwanie grupy me­tylowej z 5mC wymaga obecności białek AID i MBD4. W wyniku deaminacji 5mC powstaje tymina (w parze z gu­aniną), która następnie jest usuwana i zastąpiona przez cy­tozynę po rozpoznaniu uszkodzenia przez MBD4. Wyniki Rai i wsp. [48] sugerują również, że do aktywnej demetyla­cji wymagane jest także nieenzymatyczne białko Gadd45, niezbędne do promowania interakcji między AID i MBD4. Wyniki pracy Popp i wsp. [47] sugerują podobną rolę biał­ka AID w globalnej demetylacji DNA, jaka zachodzi pod­czas późnych stadiów embriogenezy u myszy. Potwierdziły to badania dotyczące myszy pozbawionych AID (AID-/-), których pierwotne komórki zarodkowe wykazywały wzrost hipometylacji w obrębie całego genomu [37]. Obecnie su­gerowany jest także udział innej niż AID deaminazy cy­tozyny z rodziny APOBEC, w procesie aktywnej deme­tylacji podczas rozwoju embrionalnego myszy ponieważ zwierzęta pozbawione AID nie wykazują znaczących de­fektów w rozwoju osobniczym [47].

Badania dotyczące reprogramowania jądrowego (nuclear reprogramming) dostarczyły pierwszych znaczących do­wodów na udział AID w aktywnej demetylacji DNA ko­mórek ssaków [3]. W niedzielących się heterokarionach, powstałych w wyniku fuzji embrionalnych komórek ma­cierzystych myszy z ludzkimi fibroblastami, obserwowa­no szybką demetylację regionów promotorowych genów OCT4 i NANOG, które są odpowiedzialne za utrzymanie pluripotencji komórkowej. Opisane wyżej zjawiska były zależne od białka AID ponieważ spadek poziomu tego en­zymu związany był z zablokowaniem demetylacji promo­torów genów i ograniczeniem ich ekspresji.

Zaangażowanie białka AID w proces deaminacji 5mC i związane z tym utworzenie błędnych par zasad G: T su­geruje udział ścieżki naprawy BER w procesie aktywnej demetylacji. Obniżenie poziomu 5hmC i 5mC możliwe jest w sposób pasywny jako wynik replikacji i podziału komórki. Nie ulega jednak wątpliwości, że spadek pozio­mu metylacji możliwy jest także w wyniku aktywnej de­metylacji w komórkach niereplikujących. U roślin proces zależny od ścieżki naprawczej BER jest znany od dawna i został dobrze scharakteryzowany [4]. Wymaga on zaan­gażowania swoistej glikozylazy bezpośrednio usuwającej 5mC [16]. W komórkach ssaków nie znaleziono enzymu/ów o podobnej aktywności. Wyniki badań przeprowadzonych w ostatnich latach sugerują inny mechanizm aktywnej de­metylacji w komórkach ssaków, który jednak wymaga za­angażowania enzymów biorących udział w naprawie typu BER [10,21]. Dwie glikozylazy, które występują w komór­kach ssaków mogą brać udział w procesie aktywnej deme­tylacji. Są to białka TDG i/lub SMUG [10,21]. Obie gliko­zylazy mogą być zaangażowane w proces wycinania T i/lub produktów oksydacji 5-hydroksymetylouracylu (5hmU) par zasad z G, co sugeruje, że działają one w kompleksie z białkami Tet i AID/APOBEC [10,21]. Myszy pozbawio­ne TDG (TDG^-/-) giną w 9-10 dniu rozwoju embrionalne­go, co wskazuje, że obecność tej glikozylazy jest niezbęd­na w procesie demetylacji i w prawidłowej ontogenezie. W badaniach immunocytochemicznych wykazano bezpo­średnią interakcję pomiędzy białkami TDG i AID [10].

Aktywna demetylacja w komórkach ssaków jako odpowiedź na bodziec zewnętrzny

Zdecydowana większość prac opisujących aktywną deme­tylację dotyczyła macierzystych komórek embrionalnych. Demetylacja DNA jest procesem zachodzącym w trakcie regulacji aktywności genomu komórek „dojrzałych”, w od­powiedzi na bodziec zewnętrzny bądź czynnik sygnaliza­cyjny. Obserwowana jest we wczesnych etapach rozwoju osobniczego (komórki zarodkowe) i w wysoce wyspecja­lizowanych komórkach postmitotycznych (neurony) [4].

Jednym z najbardziej interesujących zjawisk jest proces aktywnej demetylacji regionów promotorowych genu mó­zgowego czynnika neurotropowego (brain – derived neu­rothropic factor – BDNF) i czynnika wzrostu fibroblastów (fibroblast growth factor 1 – FGF1) w neuronach postmi­totycznych [4].

Z pracy Guo i wsp. [21] wynika, że za demetylację DNA komórek HEK 293 odpowiedzialne jest wzajemne oddzia­ływanie między białkami Tet, AID/APOBEC i glikozylaza­mi uczestniczącymi w ścieżce naprawy typu BER. Proces rozpoczyna konwersja 5mC do 5hmC, po której następuje indukowana enzymatycznie (AID/APOBEC) deaminacja 5hmC do 5hmU, który jest wycinany i następnie zamie­niany na cytozynę w procesie BER. Wykazano, że rzeczy­wiście glikozylazy TDG i SMUG są zaangażowane w ten typ naprawy [10,21,23].

Inne przykłady aktywnej demetylacji w odpowiedzi na do­cierający do komórki sygnał obserwowano w trakcie sty­mulacji limfocytów T przez interleukinę 2, podczas odpo­wiedzi immunologicznej oraz stymulowanej estrogenami odpowiedzi transformowanych komórek raka piersi [4].

Czy 8-oksyGua jest czynnikiem epigenetycznym?

Najlepiej poznaną i wszechstronnie badaną, oksydacyjną modyfikacją DNA o właściwościach mutagennych, jest 8-oksy-2’deoksyguanozyna (8-oksydG), opisywana też jako postać tautomeryczna 8-hydroksy-2’deoksyguano­zyna (8-OHdG) [58].

Oksydowana guanina jest jednym z najczęściej powstają­cych produktów modyfikacji zasad DNA przez reaktyw­ne formy tlenu. Tak zmodyfikowana guanina może two­rzyć stabilne pary zasad, zarówno z cytozyną jak i adeniną. W tym ostatnim przypadku może to prowadzić do trans­wersji GC–>TA. W badaniach in vivo wykazano, że obec­ność 8-oksyGua w DNA jest odpowiedzialna za zamianę guaniny w tyminę, podczas procesu replikacji (z często­ścią 0,7%) [7]. Biorąc pod uwagę funkcjonujące w komór­kach mechanizmy naprawy, które efektywnie usuwają taką zmodyfikowaną zasadę można założyć, że 8-oksyGua ma słabe właściwości mutagenne [58].

Wydaje się, że indukowane zmiany mutacyjne nie są je­dynym skutkiem obecności zmodyfikowanej guaniny w DNA. Rozważany jest też możliwy wpływ 8-oksyGua na ekspresję genów, poprzez udział w relaksacji konkret­nych domen chromatyny

Dane, które sugerują możliwość regulacji transkrypcji z udziałem 8-oksyGua pochodzą z prac dotyczących genów, których aktywność regulowana jest przez estrogeny [45], genów regulowanych stanem hipoksji [18,43] i pozostają­cych pod wpływem czynnika transkrypcyjnego Myc [2].

W 2008 roku wykazano, że ekspozycja komórek na estro­gen związana jest z wyraźnym wzrostem poziomu 8-oksy­Gua w regionach promotorowych dla 17β estradiolu [45]. Jednym z mechanizmów odpowiedzialnych za remodelo­wanie chromatyny, poprzez jej relaksację, może być wy­cinanie 8-oksyGua z udziałem glikozylazy OGG1 w re­gionach promotorowych niektórych genów. Ekspozycja komórek na estrogen związana jest ze wzrostem poziomu 8-oksyGua w DNA i rekrutacją OGG1 oraz topoizomera­zy IIβ (TopoIIβ) w miejscu występowania elementów od­powiedzi na estrogen (ERE), regionów promotorowych genów odpowiedzi na 17β estradiol (E2). Umiejscowienie kompleksu receptora E2 w określonych obszarach chroma­tyny jest powiązane z demetylacją lizyny 4 w histonie H3 (H3K4). Taka demetylacja, za którą odpowiedzialna jest swoista demetylaza LSD1, powoduje wzmożone generowa­nie H₂O₂, co z kolei indukuje formowanie 8-oksyGua w ści­śle określonych miejscach genomu. Reakcja jest wydajnie hamowana przez N-acetylo-L-cysteinę, która jest zmiata­czem wolnych rodników tlenowych [45]. Dokładna analiza miejsc promotorowych wykazała, że zarówno OGG1, jak i TopoIIβ są kumulowane preferencyjnie w regionach ERE. Model jaki zaproponowali Perillo i wsp. [45] zakłada, że miejsca pęknięć nici DNA utworzone przez OGG1 funk­cjonują jako punkty przyłączania TopoIIβ. Przerwa w nici DNA umożliwia topoizomerazie relaksację chromatyny i tworzenie kompleksu inicjującego proces transkrypcji.

Podobny mechanizm regulacji transkrypcji zaobserwowa­no w przypadku genów aktywowanych czynnikiem trans­krypcyjnym Myc [1,2] (ryc. 2). Sekwencja odcinka DNA, do którego wiąże się białko Myc została zdefiniowana jako CACGTG (E-box, kaseta-E). Po przyłączeniu się czynni­ka Myc do określonych regionów chromatyny demetylaza LSD1 zaczyna przejściową demetylację lizyny 4 histonu H3. Wykazano, że przyłączenie Myc jest powiązane z re­krutacją LSD1 do promotorowych regionów zawierających sekwencje CACGTG. Podobnie jak w przypadku regionów promotorowych dla genów odpowiedzi na 17β estradiol, także i w tym przypadku LSD1 generuje H₂O₂ i induku­je formowanie 8-oksyGua w obrębie opisanych sekwen­cji. Do miejsc zawierających 8-oksyGua rekrutowana jest glikozylaza OGG1 i endonukleaza Ape1 (ryc. 2).

Ryc. 2. Schemat zakładanego mechanizmu regulacji transkrypcji z udziałem 8-oksydG (na podstawie [2], zmodyfikowane)

Inhibicja procesów oksydacyjnych w obecności N-acetylo-L-cysteiny lub redukcja poziomu LSD1, OGG1 i endonu­kleazy Ape1 skutkuje drastycznym obniżeniem poziomu transkrypcji genów aktywowanych czynnikiem transkryp­cyjnym Myc. Warto podkreślić, że około 15% genów w ge­nomie człowieka może zawierać w regionach promotoro­wych sekwencje wiążące czynnik transkrypcyjny Myc [1,2]. Obecnie przyjmuje się, że sekwencje/regiony regulatorowe genów wchodzą we wzajemną interakcję za pomocą wcze­śniej formowanych pętli [2]. Wyniki badań opisanych wyżej pozwoliły na zaproponowanie modelu zakładającego po­stępującą relaksację DNA, w wyniku przyłączenia białka Myc i formowanie pętli, które umożliwiają bezpośrednią interakcję polimerazy RNA II i czynnika transkrypcyjne­go. Demetylacja histonu H3, późniejsze reakcje oksyda­cyjne i indukowana naprawa 8-oksyGua są niezbędne do efektywnego formowania kompleksu inicjującego proces transkrypcji. Wyniki przeprowadzonych ostatnio badań wykazały, że obecność czynnika Myc jest także niezbęd­na w procesie elongacji transkrypcji ponieważ przeciw­działa przerywaniu transkrypcji i zatrzymaniu komplek­su transkrypcyjnego [2].

Zakłada się, że podstawowy poziom 8-oksyGua w jądro­wym DNA komórek ssaków jest zbliżony do poziomu jednej cząsteczki na 106 zasad azotowych [15]. W bada­niach zespołu kierowanego przez Gillespie [18], dotyczą­cych genów indukowanych hipoksją wykazano, że stan ten jest odpowiedzialny za wyraźny wzrost poziomu 8-oksy­Gua (do wartości dwóch zmodyfikowanych cząsteczek na 103 zasad), ale jest on obserwowany wyłącznie w elemen­tach odpowiedzi na hipoksję (HRE). Co więcej, obecność 8-oksyGua wykryto wyłącznie we frakcji chromatyny wrażliwej na nukleazę mikrokokalną, a więc wzbogaconą w sekwencje aktywne transkrypcyjnie [43]. Ta sama gru­pa badaczy stwierdziła, że obecność w sekwencjach HRE miejsc AP (po usunięciu zasad), które są intermediatem w procesie usuwania 8-oksyGua, jest odpowiedzialne za wiązanie czynnika transkrypcyjnego indukowanego hipok­sją (HIF) i za wydajną ekspresję genu reporterowego [61]. Bazując na wynikach tych doświadczeń autorzy wysunęli hipotezę, że intencjonalne wprowadzanie 8-oksyGua i jej późniejsza naprawa wpływa na relaksację DNA, co z ko­lei jest odpowiedzialne za rekrutację czynników transkryp­cyjnych i aktywację procesu transkrypcji.

Na bezpośredni udział 8-oksyGua w regulacji transkrypcji wskazują wyniki badań, w których do sekwencji docelo­wych wiążących czynnik transkrypcyjny NF-κB wprowa­dzano 8-oksyGua. Oksydacja w sekwencji konsensusowej jednej z czterech cząsteczek guaniny powodowała kilka­krotny wzrost powinowactwa podjednostki p50 czynnika NF-κB [22]. Ponieważ wiele sekwencji promotorowych jest wzbogaconych w guaninę, autorzy wskazują możliwość, że oksydacyjna modyfikacja tej zasady może być jednym z czynników regulacyjnych procesu transkrypcji. W tym kontekście ciekawe wydają się rezultaty innych prac, z któ­rych wynika, że istnieje możliwość przemieszczenia po­tencjału oksydacyjnego i jego preferencyjna akumulacja w sekwencji bogatej w guaninę [17].

Wyniki uzyskane przez zespół Katedry Biochemii Klinicznej CM UMK wskazują, że frakcje chromatyny jądrowej aktywne transkrypcyjnie (euchromatyna, frakcja związana z matriks jądrową) charakteryzują się pięciokrot­nie wyższym poziomem 8-oksydG w DNA od frakcji trans­krypcyjnie nieaktywnej (heterochromatyna). Teoretycznie można założyć, że ta wysoce znamienna statystycznie róż­nica mogłaby być wynikiem większej dostępności DNA dla RFT w euchromatynie, który jest w mniejszym stopniu chroniony w tej frakcji przez białka histonowe, niż DNA heterochromatyny. Taka teoria nie tłumaczy jednak podob­nie wysokiego, jak w euchromatynowym DNA, poziomu 8-oksydG w DNA frakcji związanej z macierzą jądrową, ponieważ ta frakcja stanowi ściśle upakowaną strukturę.

Aby ostatecznie zweryfikować możliwość preferencyjnej indukcji 8-oksydG, w naszych badaniach, podjęliśmy się analizy poziomu 8,5′-cyklo-2′-deoksyadenozyny (cdA), w wymienionych frakcjach chromatyny. CdA jest podob­nie jak 8-oksydG produktem oddziaływania rodnika ^•OH z DNA. W przeciwieństwie jednak do 8-oksydG, obec­ność cdA w DNA powoduje zaburzenia w strukturze he­lisy [27] i jest silnym inhibitorem procesu transkrypcji. Nie stwierdzono różnic w poziomie cdA między eu- i he­terochromatyną oraz frakcją związaną z macierzą jądro­wą, co wyklucza prawdziwość argumentu „dostępności”. Przedstawione wyżej wyniki pozwoliły nam na sformuło­wanie hipotezy zakładającej uniwersalne (nie ograniczone tylko do grupy genów przedstawianych wyżej) znaczenie obecności 8-oksydG w DNA, jako czynnika związanego z regulacją transkrypcji (dane nieopublikowane).

Podsumowanie

Jednym z podstawowych warunków przeżycia komór­ki jest utrzymanie integralności i stabilności genomu. Skumulowanie zmian sekwencji DNA wywołanych przez uszkodzenia zasad azotowych, może prowadzić do muta­cji, a tym samym efektów patologicznych, czy przyspie­szonego starzenia, a nawet wprost do śmierci komórki.

Komórki zawierają enzymy naprawcze, minimalizujące częstość pojawiania się mutacji, a tym samym następstwa uszkodzeń DNA. Jeżeli jednak ilość zmian w DNA przekra­cza możliwości naprawy ostateczną linią obrony komórki może być jej śmierć w procesie apoptozy, dla dobra całe­go organizmu wielokomórkowego. W ten sposób komór­ka, z dużą liczbą zmian w strukturze DNA jest eliminowa­na zanim stanie się zagrożeniem dla przeżycia organizmu.

Taka naturalna „logika”, zakładająca obronę integralno­ści materiału genetycznego za wszelką cenę, wydaje się mieć głęboki sens biologiczny zapewniający trwanie ży­cia w przeciagu miliardów lat ewolucji.

W świetle wyników badań uzyskanych w przeciągu ostat­nich kilku lat, wydaje się, że ta oczywista reguła ma swo­je wyjątki. Modyfikacje zasad azotowych, o znaczeniu mutagennym mogą bowiem pełnić istotną rolę w przeka­zywaniu sygnałów niezbędnych do prawidłowego funk­cjonowania komórki, realizowanego w przebiegu me­tabolizmu komórkowego. O ile rola takich modyfikacji w aktywnej demetylacji DNA jest dobrze eksperymen­talnie udokumentowana, o tyle epigenetyczna rola obec­ności 8-oksyGua w DNA nie ma jednoznacznego oparcia doświadczalnego. Należy jednak pamiętać, że do niedaw­na rola RFT i następstwa ich działania w układach bio­logicznych były kojarzone raczej jednoznacznie z działa­niem patogennym. Obecnie wiadomo, że niektóre z tych reaktywnych cząsteczek (NO, H₂O₂, O₂^•-), pełnią ważną rolę w przekazywaniu sygnałów komórkowych, specjali­zacji komórek i w wielu innych procesach biologicznych. Wydaje się, że jeden z najczęściej formowanych produk­tów oddziaływania RFT z DNA, 8-oksyGua może pełnić także funkcje związane z regulacją transkrypcji. Często sekwencje promotorowe genów są bardzo ściśle owinię­te wokół rdzenia histonowego nukleosomu, co utrudnia wiązanie białek regulacyjnych [13]. W procesie aktywa­cji transkrypcji takie sekwencje muszą być udostępnione dla czynników transkrypcyjnych. Zakłada się, że czynniki remodulujące chromatynę mogą jednocześnie pełnić rolę relaksacyjną [13]. Warto zatem postawić pytanie, w jaki sposób czynniki remodelujące mogą się wiązać z DNA i doprowadzić do relaksacji tej molekuły skoro sekwen­cje promotorowe pozostają w ścisłym kompleksie z biał­kami? Dodatkowo, krótkie sekwencje promotorowe mają dosyć sztywną strukturę [51,60].

Pewnym rozwiązaniem omawianych zjawisk może być in­tencjonalne wprowadzenie pęknięcia nici DNA w wyniku wycinania wprowadzonej uprzednio 8-oksyGua, jak zapro­ponowano w badanych modelach eksperymentalnych, opi­sywanych w tym opracowaniu.

Podstawowym nadal wydaje się pytanie, czy wieloko­mórkowy organizm „stać” jest na celowe wprowadzanie w miejsca promotorowe genów uszkodzenia, aby umoż­liwić tym samym regulację fundamentalnych procesów komórkowych. W przypadku procesów regulujących ak­tywną demetylację DNA odpowiedź brzmi tak, jest to nie tylko możliwe, ale i konieczne zważywszy na letalny fe­notyp myszy pozbawionych białka TDG. Jednak i w tym przypadku pozostaje kilka nie do końca zrozumiałych kwestii. Dlaczego białko Tet czasami przekształca 5mC do 5hmC, a innym razem do 5fC lub 5caC? Dlaczego ist­nieją dwa niezależne szlaki demetylacji, opierające się na deaminacji i oksydacji? Czy różny ich przebieg jest przy­pisany odmiennym procesom fizjologicznym np. deamina­cja preferowana jest podczas embriogenezy? Jeśli chodzi o regulatorową rolę 8-oksyGua, to mimo kilku ekspery­mentalnych dowodów, które sugerują udział tej molekuły w regulacji transkrypcji, nadal potrzeba bardziej przeko­nujących dowodów na poparcie tej tezy.

Warto podkreślić, że również innego typu zmiany, uczest­niczące, jak się przypuszcza, w regulacji stopnia upakowa­nia chromatyny, związane z modyfikacją histonów, a do­kładnie z demetylacją reszt lizynowych, są także związane z oksydacją podobną do opisywanej wcześniej, biorącej udział w aktywnej demetylacji DNA [5,33].

Enzymy uczestniczące w tym procesie są, podobnie jak białka Tet, dioksygenazami zależnymi od żelaza i α-keto­glutaranu. Należy także pamiętać, że wspomniane wyżej białko LSD1, które jest bezpośrednio zaangażowane w de­metylację lizyny 4 histonu H3 i generowaniu 8-oksyGua, jest monooksygenazą. Opisane w pracy zjawiska wska­zują, że tlen dla organizmów aerobowych, jest nie tylko niezbędny do efektywnego pozyskiwania energii, ale tak­że może pełnić podstawową rolę w regulacji sygnalizacji epigenetycznej.

Tlen umożliwił rozwój i ekspansję na Ziemi organizmów wielokomórkowych wykorzystujących go w swoim meta­bolizmie. Za wygodę pozyskiwania w ten sposób energii tlenowce płacą jednak wysoką cenę. Są nią wolne rodni­ki, generowane z tlenu w przebiegu przemian metabolicz­nych. Ich nadmiar może być niebezpieczny, bowiem stres oksydacyjny wiązany jest z licznymi patologiami komór­kowymi i uważany za czynnik w procesach starzenia. Jednak w trwającej miliony lat ewolucji biochemicznej komórki aerobowe nauczyły się korzystać z powstających w nich wolnych rodników i włączać je w procesy wręcz warunkujące trwanie życia biologicznego. Do takich fun­damentalych procesów z pewnością należą te, które zwią­zane są z regulacją funkcjonowania materiału genetycz­nego. Być może zatem paradoksalnie te same czynniki, które uczestniczą w przebiegu procesów warunkujących przebieg zjawisk życiowych, są jednocześnie czynnikiem ograniczającym i limitującym czas życia i czynnikiem sprawczym licznych patologii komórkowych. Udział tle­nu i jego metabolitów w funkcjonowaniu genomu wydaje się zatem być jednym z ciekawszych zagadnień współcze­snej biologii i medycyny, a jego zrozumienie to zarówno satysfakcja z odkrycia piękna zjawisk biologicznych, jak i wymiar praktyczny np. związany z zastosowaniami me­dycyny molekularnej.

Podziękowanie

W przygotowaniu rycin autorom pomoc okazał Kamil Jurgowiak.

PIŚMIENNICTWO

[1] Amente S., Bertoni A., Morano A., Lania L., Avvedimento E.V., Majello B.: LSD1-mediated demethylation of histone H3 lysine 4 triggers Myc-induced transcription. Oncogene, 2010; 29: 3691-3702
[PubMed]  

[2] Amente S., Lania L., Avvedimento E.V., Majello B.: DNA oxidation drives Myc mediated transcription. Cell Cycle, 2010; 9: 3002-3004
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[3] Bhutani N., Brady J.J., Damian M., Sacco A., Corbel S.Y., Blau H.M.: Reprogramming towards pluripotency requires AID-dependent DNA demethylation. Nature, 2010; 463: 1042-1047
[PubMed]  

[4] Bhutani N., Burns D.M., Blau H.M.: DNA demethylation dynamics. Cell, 2011; 146: 866-872
[PubMed]  

[5] Bonasio R., Tu S., Reinberg D.: Molecular signals of epigenetic states. Science, 2010; 330: 612-616
[PubMed]  

[6] Chen Z.X., Riggs A.D.: DNA methylation and demethylation in mammals. J. Biol. Chem., 2011; 286: 18347-18353
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[7] Cheng K.C., Cahill D.S., Kasai H., Nishimura S., Loeb L.A.: 8-Hydroxyguanine, an abundant form of oxidative DNA damage, causes G—-T and A—-C substitutions. J. Biol. Chem., 1992; 267: 166-172
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[8] Cimmino L., Abdel-Wahab O., Levine R.L., Aifantis I.: TET family proteins and their role in stem cell differentiation and transformation. Cell Stem Cell, 2011; 9: 193-204
[PubMed]  

[9] Cortázar D., Kunz C., Selfridge J., Lettieri T., Saito Y., MacDougall E., Wirz A., Schuermann D., Jacobs A.L., Siegrist F., Steinacher R., Jiricny J., Bird A., Schär P.: Embryonic lethal phenotype reveals a function of TDG in maintaining epigenetic stability. Nature, 2011; 470: 419-423
[PubMed]  

[10] Cortellino S., Xu J., Sannai M., Moore R., Caretti E., Cigliano A., Le Coz M., Devarajan K., Wessels A., Soprano D., Abramowitz L.K., Bartolomei M.S., Rambow F., Bassi M.R., Bruno T., Fanciulli M., Renner C., Klein-Szanto A.J., Matsumoto Y., Kobi D., Davidson I., Alberti C., Larue L., Bellacosa A.: Thymine DNA glycosylase is essential for active DNA demethylation by linked deamination-base excision repair. Cell, 2011; 146: 67-79
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[11] Dahl C., Gronbaek K., Guldberg P.: Advances in DNA methylation: 5-hydroxymethylcytosine revisited. Clin. Chim. Acta, 2011; 412: 831-836
[PubMed]  

[12] Esteller M.: Relevance of DNA methylation in the management of cancer. Lancet Oncol., 2003; 4: 351-358
[PubMed]  

[13] Felsenfeld G., Groudine M.: Controlling the double helix. Nature, 2003; 421: 448-453
[PubMed]  

[14] Ficz G., Branco M.R., Seisenberger S., Santos F., Krueger F., Hore T.A., Marques C.J., Andrews S., Reik W.: Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature, 2011; 473: 398-402
[PubMed]  

[15] Gedik C.M., Collins A., ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage): Establishing the background level of base oxidation in human lymphocyte DNA: results of an interlaboratory validation study. FASEB J., 2005; 19: 82-84
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[16] Gehring M., Reik W., Henikoff S.: DNA demethylation by DNA repair. Trends Genet., 2009; 25: 82-90
[PubMed]  

[17] Genereux J.C., Boal A.K., Barton J.K.: DNA-mediated charge transport in redox sensing and signaling. J. Am. Chem. Soc., 2010; 132: 891-905
[PubMed]  

[18] Gillespie M.N., Pastukh V., Ruchko M.V.: Oxidative DNA modifications in hypoxic signaling. Ann. N.Y. Acad. Sci., 2009; 1177: 140-150
[PubMed]  

[19] Globisch D., Münzel M., Müller M., Michalakis S., Wagner M., Koch S., Brückl T., Biel M., Carell T.: Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One, 2010; 5: e15367
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[20] Gu T.P., Guo F., Yang H., Wu H.P., Xu G.F., Liu W., Xie Z.G., Shi L., He X., Jin S.G., Iqbal K., Shi Y.G., Deng Z., Szabó P.E., Pfeifer G.P., Li J., Xu G.L.: The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature, 2011; 477: 606-610
[PubMed]  

[21] Guo J.U., Su Y., Zhong C., Ming G.L., Song H.: Hydroxylation of 5-methylcytosine by TET1 promotes active DNA demethylation in the adult brain. Cell, 2011; 145: 423-434
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[22] Hailer-Morrison M.K., Kotler J.M., Martin B.D., Sugden K.D.: Oxidized guanine lesions as modulators of gene transcription. Altered p50 binding affinity and repair shielding by 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine lesions in the NF-κB promoter element. Biochemistry, 2003; 42: 9761-9770
[PubMed]  

[23] He Y.F., Li B.Z., Li Z., Liu P., Wang Y., Tang Q., Ding J., Jia Y., Chen Z., Li L., Sun Y., Li X., Dai Q., Song C.X., Zhang K., He C., Xu G.L.: Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science, 2011; 333: 1303-1307
[PubMed]  

[24] Hermann A., Gowher H., Jeltsch A.: Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases. Cell. Mol. Life Sci., 2004; 61: 2571-2587
[PubMed]  

[25] Iqbal K., Jin S.G., Pfeifer G.P., Szabó P.E.: Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011; 108: 3642-3647
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[26] Ito S., D’Alessio A.C., Taranova O.V., Hong K., Sowers L.C., Zhang Y.: Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature, 2010; 466: 1129-1133
[PubMed]  

[27] Jaruga P., Dizdaroglu M.: 8,5′-Cyclopurine-2′-deoxynucleosides in DNA: mechanisms of formation, measurement, repair and biological effects. DNA Repair, 2008; 7: 1413-1425
[PubMed]  

[28] Ko M., Huang Y., Jankowska A.M., Pape U.J., Tahiliani M., Bandukwala H.S., An J., Lamperti E.D., Koh K.P., Ganetzky R., Liu X.S., Aravind L., Agarwal S., Maciejewski J.P., Rao A.: Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature, 2010; 468: 839-843
[PubMed]  

[29] Kothari R.M., Shankar V.: 5-Methylcytosine content in the vertebrate deoxyribonucleic acids: species specificity. J. Mol. Evol., 1976; 7: 325-329
[PubMed]  

[30] Kriaucionis S., Heintz N.: The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science, 2009; 324: 929-930
[PubMed]  

[31] Langemeijer S.M., Aslanyan M.G., Jansen J.H.: TET proteins in malignant hematopoiesis. Cell Cycle, 2009; 8: 4044-4048
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[32] Li W., Liu M.: Distribution of 5-hydroxymethylcytosine in different human tissues. J. Nucleic Acids, 2011; 870726
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[33] Margueron R., Reinberg D.: Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet., 2010; 11: 285-296
[PubMed]  

[34] Mohr F., Döhner K., Buske C., Rawat V.P.: TET genes: new players in DNA demethylation and important determinants for stemness. Exp. Hematol., 2011; 39: 272-281
[PubMed]  

[35] Münzel M., Globisch D., Brückl T., Wagner M., Welzmiller V., Michalakis S., Müller M., Biel M., Carell T.: Quantification of the sixth DNA base hydroxymethylcytosine in the brain. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2010; 49: 5375-5377
[PubMed]  

[36] Münzel M., Globisch D., Carell T.: 5-Hydroxymethylcytosine, the sixth base of the genome. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2011; 50: 6460-6468
[PubMed]  

[37] Muramatsu M., Kinoshita K., Fagarasan S., Yamada S., Shinkai Y., Honjo T.: Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell, 2000; 102: 553-563
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[38] Muramatsu M., Sankaranand V.S., Anant S., Sugai M., Kinoshita K., Davidson N.O., Honjo T.: Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem., 1999; 274: 18470-18476
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[39] Oliński R., Jurgowiak M.: Uracyl w DNA – przyjaciel czy wróg? Postępy Biochem., 2009; 55: 25-35
[PubMed]  

[40] Paluszczak J., Baer-Dubowska W.: Zjawiska epigenetyczne w patogenezie nowotworów. Nowe możliwości profilaktyki i terapii? Postępy Biochem., 2005; 51: 244-250
[PubMed]  

[41] Pan G., Thomson J.A.: Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency. Cell Res., 2007; 17: 42-49
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[42] Pastor W.A., Pape U.J., Huang Y., Henderson H.R., Lister R., Ko M., McLoughlin E.M., Brudno Y., Mahapatra S., Kapranov P., Tahiliani M., Daley G.Q., Liu X.S., Ecker J.R., Milos P.M., Agarwal S., Rao A.: Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature, 2011; 473: 394-397
[PubMed]  

[43] Pastukh V., Ruchko M., Gorodnya O., Wilson G.L., Gillespie M.N.: Sequence-specific oxidative base modifications in hypoxia-inducible genes. Free Radic. Biol. Med., 2007; 43: 1616-1626
[PubMed]  

[44] Penn N.W., Suwalski R., O’Riley C., Bojanowski K., Yura R.: The presence of 5-hydroxymethylcytosine in animal deoxyribonucleic acid. Biochem. J., 1972; 126: 781-790
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[45] Perillo B., Ombra M.N., Bertoni A., Cuozzo C., Sacchetti S., Sasso A., Chiariotti L., Malorni A., Abbondanza C., Avvedimento E.V.: DNA oxidation as triggered by H3K9me2 demethylation drives estrogen-induced gene expression. Science, 2008; 319: 202-206
[PubMed]  

[46] Pfaffeneder T., Hackner B., Truss M., Münzel M., Müller M., Deiml C.A., Hagemeier C., Carell T.: The discovery of 5-formylcytosine in embryonic stem cell DNA. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2011; 50: 7008-7012
[PubMed]  

[47] Popp C., Dean W., Feng S., Cokus S.J., Andrews S., Pellegrini M., Jacobsen S.E., Reik W.: Genome-wide erasure of DNA methylation in mouse primordial germ cells is affected by AID deficiency. Nature, 2010; 463: 1101-1105
[PubMed]  

[48] Rai K., Huggins I.J., James S.R., Karpf A.R., Jones D.A., Cairns B.R.: DNA demethylation in zebrafish involves the coupling of a deaminase, a glycosylase, and gadd45. Cell, 2008; 135: 1201-1212
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[49] Schmitz K.M., Schmitt N., Hoffmann-Rohrer U., Schäfer A., Grummt I., Mayer C.: TAF12 recruits Gadd45a and the nucleotide excision repair complex to the promoter of rRNA genes leading to active DNA demethylation. Mol. Cell, 2009; 33: 344-353
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[50] Shi Y.Y., Huang Z.Y., Zeng Z.J., Wang Z.L., Wu X.B., Yan W.Y.: Diet and cell size both affect queen-worker differentiation through DNA methylation in honey bees (Apis mellifera, Apidae). PLoS One, 2011; 6, e18808
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[51] Shimada J., Yamakawa H.: DNA-topoisomer analysis on the basis of the helical wormlike chain. Biopolymers, 1984; 23: 853-857
[PubMed]  

[52] Song C.X., Szulwach K.E., Fu Y., Dai Q., Yi C., Li X., Li Y., Chen C.H., Zhang W., Jian X., Wang J., Zhang L., Looney T.J., Zhang B., Godley L.A., Hicks L.M., Lahn B.T., Jin P., He C.: Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol., 2011; 29: 68-72
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[53] Tahiliani M., Koh K.P., Shen Y., Pastor W.A., Bandukwala H., Brudno Y., Agarwal S., Iyer L.M., Liu D.R., Aravind L., Rao A.: Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science, 2009; 324: 930-935
[PubMed]  

[54] Williams K., Christensen J., Pedersen M.T., Johansen J.V., Cloos P.A., Rappsilber J., Helin K.: TET1 and hydroxymethylcytosine in transcription and DNA methylation fidelity. Nature, 2011; 473: 343-348
[PubMed]  

[55] Wu H., D’Alessio A.C., Ito S., Xia K., Wang Z., Cui K., Zhao K., Sun Y.E., Zhang Y.: Dual functions of Tet1 in transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells. Nature, 2011; 473: 389-393
[PubMed]  

[56] Wu S.C., Zhang Y.: Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2010; 11: 607-620
[PubMed]  

[57] Xu Y., Wu F., Tan L., Kong L., Xiong L., Deng J., Barbera A.J., Zheng L., Zhang H., Huang S., Min J., Nicholson T., Chen T., Xu G., Shi Y., Zhang K., Shi Y.G.: Genome-wide regulation of 5hmC, 5mC, and gene expression by Tet1 hydroxylase in mouse embryonic stem cells. Mol. Cell, 2011; 42: 451-464
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[58] Zaremba T., Oliński R.: Oksydacyjne uszkodzenia DNA – ich analiza oraz znaczenie kliniczne. Postępy Biochem., 2010; 56: 124-138
[PubMed]  

[59] Zhang H., Zhang X., Clark E., Mulcahey M., Huang S., Shi Y.G.: TET1 is a DNA-binding protein that modulates DNA methylation and gene transcription via hydroxylation of 5-methylcytosine. Cell Res., 2010; 20: 1390-1393
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[60] Zhang Y., Crothers D.M.: Statistical mechanics of sequence-dependent circular DNA and its application for DNA cyclization. Biophys. J., 2003; 84: 136-153
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[61] Ziel K.A., Grishko V., Campbell C.C., Breit J.F., Wilson G.L., Gillespie M.N.: Oxidants in signal transduction: impact on DNA integrity and gene expression. FASEB J., 2005; 19: 387-394
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Full text