Streszczenie

Pierwotny transkrypt genu eukariotycznego (pre-mRNA) składa się z regionów kodujących – eksonów, poprzedzielanych sekwencjami niekodującymi intronami, które usuwane są w proce­sie składania RNA, co prowadzi do powstania dojrzałego transkryptu. Alternatywne składanie pre-mRNA, do niedawna uważane za szczególny wyraz metabolizmu kwasów nukleinowych, odpowiada za dużą różnorodność komórkowego proteomu i służy efektywnemu wykorzystaniu informacji zawartej w genomie. Pełni istotne role w regulacji tak ważnych procesów w organi­zmie, jak regulacja apoptozy, czy rozwój i plastyczność układu nerwowego. Zadaniem alterna­tywnego składania jest różnicowe, zależne od warunków i typu komórki składanie mRNA, co w rezultacie daje różniące się strukturą transkrypty tego samego genu, a po translacji różniące się między sobą izoformy białka. Ze względu na złożoność tego mechanizmu alternatywne skła­danie jest szczególnie podatne na zaburzenia. Niebezpieczne są zwłaszcza zaburzenia wynika­jące z mutacji w sekwencjach kluczowych dla regulacji alternatywnego składania. Patogeneza wielu schorzeń wynika z zaburzeń w alternatywnym składaniu, a dotyczy to tak różnych stanów chorobowych, jak nowotwory czy choroby neurodegeneracyjne. Z powodu genetycznych korze­ni tych schorzeń, ich terapia jest problematyczna. Obecnie duże nadzieje w terapii tych schorzeń wiąże się z zastosowaniem interferencji RNA. Interferencja RNA jest powszechnym u eukarion­tów mechanizmem wyciszania genów, a zakończone sukcesem próby wyciszania produkcji trans­kryptów kodujących wadliwe izoformy białek dają nadzieję na opracowanie nowych, skutecznych metod korekcji zaburzeń alternatywnego składania.

Słowa kluczowe: składanie RNA • składanie alternatywne • interferencja RNA

Summary

The primary transcript of an eukaryotic gene (pre-mRNA) is composed of coding regions – exons intervened by non-coding introns – which are removed in the RNA splicing process, leading to the formation of mature, intron-free mRNA. Alternative splicing of pre-mRNA is responsible for high complexity of the cellular proteome and expresses effective use of genetic information contained in genomic DNA. Alternative splicing plays important roles in the organism, inclu­ding apoptosis regulation or development and plasticity of the nervous system. The main role of alternative splicing is differential, dependent on conditions and the cell type, splicing of mRNA, generating diverse transcripts from one gene, and, after the translation, different isoforms of a particular protein. Because of the high complexity of this mechanism, alternative splicing is particularly prone to errors. The perturbations resulting from mutations in the key sequences for splicing regulations are especially harmful. The pathogenesis of numerous diseases results from disturbed alternative RNA splicing, and those include cancers and neurodegenerative disorders. The treatment of these conditions is problematic due to their genetic background and currently RNA interference, which is a common mechanism of eukaryotic gene regulation, is being stu­died. Initial successes in the attempts of silencing the expression of faulty protein isoforms sup­port the idea of using RNA interference in targeting disease related to disturbances in alternati­ve splicing of RNA.

Key words:RNA splicing • alternative splicing • RNA interference

Składanie pre-mRNA

Droga od genu do białka jest wieloetapowa. Podczas trans­krypcji genu kodującego białko u organizmów eukario­tycznych powstaje transkrypt pierwotny – pre-mRNA, który zanim będzie gotowy do transportu poza jądro ko­mórki i weźmie udział w wytwarzaniu białka w procesie translacji, poddany musi zostać wielu modyfikacjom [30] (ryc.1). Pierwotny produkt transkrypcji kodujący białko u organi­zmów wyższych składa się z eksonów – sekwencji ko­dujących, poprzedzielanych sekwencjami niekodujący­mi – intronami. Introny ulegają wycinaniu z pre-mRNA w procesie składania mRNA [100]. Poza usunięciem in­tronów pre-mRNA poddawany jest też modyfikacjom na obu swoich końcach. Na końcu 5′ takiego transkryptu za­chodzi proces „czapeczkowania” (capping) – dołączenie guanozyny wiązaniem 5′,5′-trifosforanowym oraz jej me­tylacja w pozycji 7. Czapeczka 5′ (7-mG) zabezpiecza trans­krypt przed enzymatyczną degradacją przez egzonukleazy 5′-3′, a także jest niezbędna dla transportu mRNA do cy­toplazmy i inicjacji procesu translacji [30,100]. Koniec 3′ cząsteczki RNA podlega natomiast cięciu w miejscu po­przedzonym o 10-30 nukleotydów przez sekwencję sygna­łową (AAUAAA u ssaków), a następnie ulega poliadenyla­cji w procesie, w którym polimeraza poliA (PAP) dołącza adenozyny na końcu 3′ cząsteczki, tworząc „ogon poliA” [30,75]. Oba te procesy są konieczne do prawidłowego eksportu mRNA do cytoplazmy oraz efektywnej trans­lacji [103]. W procesie wycinania intronów bierze udział złożona struktura nazywana spliceosomem (spliceosome). Szacuje się, że spliceosom, jako zwarta struktura, zawiera ponad 200 białek i 5 cząsteczek krótkiego (małego) jądro­wego RNA (snRNA – small nuclear RNA) [84,91], bio­rących udział w składaniu mRNA. Jest to zorganizowany, a zarazem dynamiczny zbiór cząsteczek, w którym wy­stępują oddziaływania białko-białko, białko-RNA i RNA-RNA [62]. Wśród składników spliceosomu zasadniczą rolę w procesie wycinania intronów pełni pięć małych jądro­wych rybonukleoprotein snRNP – U1, U2, U4, U5 i U6, składających się z snRNA oraz stowarzyszonych z nimi białek [78,91]. Proces biogenezy cząsteczek UsnRNP jest również procesem złożonym i przebiega wieloetapowo za­równo w jądrze, jak i cytoplazmie, z udziałem domen ją­drowych – ciał Cajala [90,94,113]. Mechanizm wycinania intronów przebiega w kilku etapach, którym towarzyszy wiele rearanżacji w obrębie spliceosomu oraz zmian kon­formacyjnych czynników biorących udział w tym proce­sie. Pierwszym etapem składania jest rozpoznanie końca 5′ intronu i miejsca rozgałęzienia (branch point) w intro­nie, charakteryzującego się zazwyczaj obecnością adeni­ny, przez czynniki U1 i U2 snRNP. Powstaje w ten sposób kompleks A. Kompleks B powstaje przez dołączenie kom­pleksu U4•U6/U5 tri-snRNP. Ostatecznie, w wyniku re­aranżacji uwalniającej czynniki U1 i U4 snRNP powstaje katalitycznie aktywny kompleks C [91]. W pierwszym eta­pie wycinania intronu grupa 2′-OH nukleozydu w miejscu rozgałęzienia przeprowadza nukleofilowy atak na wiąza­nie fosfodiestrowe ostatniego nukleotydu (w eksonie) po stronie 5′ intronu, w wyniku czego powstaje struktura pę­tli. Następnie grupa 3′-OH wolnego końca eksonu ataku­je ostatni nukleotyd intronu po stronie 3′, intron wypętla się tworząc strukturę przypominającą lasso, po czym wol­ne końce eksonów ulegają połączeniu [83,91,102]. Warto odnotować, iż elementami spliceosomu uczestniczącymi bezpośrednio w katalizie wycinania intronu są cząsteczki RNA. Podobnie jak w szczególnym przypadku autokatali­tycznych, samowycinajacych się intronów, tak i w klasycz­nym składaniu transkryptów RNA odpowiada za katali­zę reakcji chemicznej, działając jako rybozym [37,101]. Liczne dane dowodzą ścisłego związku między składa­niem pre-mRNA a transkrypcją. Proces składania zacho­dzi zarówno kotranskrypcyjnie, jak i posttranskrypcyj­nie. Ma to szczególne znaczenie w przypadku syntezy i obróbki bardzo długich transkryptów, np. w przypadku genu dystrofiny (2,4 mln par zasad) [39]. Zaznaczyć na­leży jednak, że składanie kotranskrypcyjne nie jest regu­łą. Nie wyjaśniono dotąd mechanizmu, który decydował­by o tym, które introny są wycinane kotranskrypcyjnie, a które posttranskrypcyjnie, jednak dane na ten temat po­zwalają sądzić, iż nie jest to proces przypadkowy i istnie­je tu swoista regulacja [39]. Ponadto, wiele danych wska­zuje na ścisły funkcjonalny związek między transkrypcją i składaniem pierwotnego transkryptu. Główną rolę może tu odgrywać C-końcowa domena polimerazy II RNA – do­mena CTD (C-terminal domain). Brak funkcjonalnej do­meny CTD skutkuje silnym zaburzeniem procesu składania RNA i obróbki na obu końcach pierwotnego transkryptu (czapeczkowanie końca 5′, trawienie i poliadenylacja koń­ca 3′) [52,56]. Efekt ten zależny jest w znacznej mierze od stanu fosforylacji domeny CTD. Prawidłowy wzorzec fosforylacji domeny CTD jest niezbędny do prawidłowe­go przebiegu zarówno wycinania intronów, jak i obróbki obu końców transkryptu. Natura tej regulacji nie została ostatecznie wyjaśniona, jednak wiadomo, że wiele czyn­ników zaangażowanych w proces dojrzewania transkryptu może bezpośrednio oddziaływać z domeną CTD polime­razy II RNA, co prawdopodobnie jest ściśle kontrolowane przez posttranslacyjne modyfikacje domeny CTD [30,71]. ­

Ryc. 1. Uproszczony schemat kanonicznego składania RNA. Fragment pierwotnego transkryptu (pre-mRNA) zawierający intron jest celem dla kompleksu składającego (spliceosomu). Składniki spliceosomu formują aktywny kompleks na pre-mRNA, następuje wycięcie intronu – powstanie struktury „lassa”, po czym składniki spliceosomu oddysocjowują od mRNA. U1, U2, U4, U5, U6 – rybonukleoproteiny, składniki kompleksu składania RNA

Składanie alternatywne i jego regulacja

Przez długi czas uważano, że złożoność fenotypowa orga­nizmu warunkowana jest liczbą genów w genomie tego or­ganizmu. W trakcie poznawania genomu człowieka oraz genomów innych organizmów wątpliwości budził brak bezpośredniej zależności między złożonością organizmu a liczbą genów w jego genomie [41,95]. Intrygującym było zwłaszcza to, iż szacowana liczba genów u człowieka (około 30 000) jest znacznie niższa od szacowanej liczby białek. [79,95]. Doprowadziło to do odkrycia w 1980 r. mecha­nizmu alternatywnego składania pre-mRNA, kiedy zaob­serwowano, że dwa różne białka – jedno związane z błoną komórkową i drugie wydzielane z komórki, są kodowa­ne przez jeden gen [1]. Było to początkiem trwających do dziś badań nad kolejnym poziomem złożoności genomu. Nieprzerwanie identyfikowane są kolejne izoformy zna­nych białek, a frakcja genów o więcej niż jednym eksonie ulegających alternatywnemu składaniu w ciągu kilku lat wzrosła prawie z 50 do 95-100% [27,64,87].

Alternatywne składanie prowadzi do generowania kilku bia­łek różniących się strukturą (ryc. 2). Jest to proces złożony i jed­nostkowo dzieli się na kilka zasadniczych typów. Wśród nich wyróżnia się pominięcie/wycięcie eksonu (exon skip­ping); ekson zostaje wykluczony z mRNA, zachowanie in­tronu (intron retention) – intron nie zostaje wycięty z pre­-mRNA, alternatywne miejsce 3′ składania i 5′ składania – alternatywne miejsca wycięcia intronu, przez co pozosta­ły odcinek – ekson, może mieć różną długość, eksony wza­jemnie wykluczające się (mutually exclusive exons) eksony takie nigdy nie występują w dojrzałym transkrypcie razem (zachowany zostaje jeden) [64,79,38]. Zidentyfikowano również alternatywne miejsca startu transkrypcji, alterna­tywne miejsca poliadenylacji [49], a także alternatywne re­giony nieulegające translacji (regiony UTR – untranslated region) [32]. W niektórych przypadkach proces alterna­tywnego składania może generować eksony o niepodziel­nej przez 3 liczbie par zasad (eksony niesymetryczne), co powoduje przesunięcie ramki odczytu i w konsekwen­cji zmienia właściwości całej dalszej części transkryptu [77]. W jednym genie może zachodzić jeden wariant al­ternatywnego składania lub też kilka różnych jego typów jednocześnie, dając dużą różnorodność form białka kodo­wanego przez ten gen [79].

Ryc. 2. Wybrane mechanizmy niekanonicznego składania RNA – składania alternatywnego (dokładny opis w tekście)

Zidentyfikowano wiele genów o bardzo dużym bogactwie białkowych izoform. Przykładem takiego genu jest Dscam u muszki owocowej Drosophila melanogaster. W skład dojrzałego transkryptu tego genu wchodzą 24 eksony. Gen Dscam zawiera jednak 115 eksonów, z czego 95 pogrupowa­nych w 4 kasety stanowią warianty alternatywne. Tylko jeden ekson z każdej kasety wchodzi w skład końcowego mRNA [72,85]. Taka złożoność genu daje 38 016 potencjalnie możli­wych izoform białka – dwa razy więcej niż liczba wszystkich genów. Produkty genu Dscam pełnią istotne role w ośrodko­wym układzie nerwowym, m.in. w morfogenezie komórek nerwowych i tworzeniu synaps w mózgu [20,25]. Na obec­nym poziomie wiedzy wydaje się, że układ nerwowy charak­teryzuje się szczególnie wysokim poziomem alternatywne­go składania, co skłaniać może do wniosku, iż po części to ten mechanizm jest odpowiedzialny za wyjątkową złożoność i zarazem plastyczność i dynamiczną naturę mózgu [109].

Ludzki gen KCNMA1, kodujący podjednostkę kanału po­tasowego zależnego od wapnia, jest kolejnym przykładem genu generującego dużą liczbę izoform białkowych. Transkrypt tego genu może podlegać alternatywnemu składaniu na kilka sposobów obejmujących alternatywne miejsca składania 3′ i 5′ i wykluczenie eksonu, generując łącznie ponad 500 izoform białka [61,82]. Nieco innym pro­cesem, znacznie mniej poznanym, ale o potencjalnie dużym znaczeniu jest zjawisko transskładania mRNA (trans-spli­cing). W tym mechanizmie dojrzałe transkrypty są skła­dane z eksonów pochodzących z więcej niż jednego pre­-mRNA [28]. Jak dotąd brak jest precyzyjnych danych na temat częstości tego zjawiska, wiadomo natomiast, że jest to proces powszechny wśród organizmów eukariotycznych, także u człowieka [22,26].

Izoformy białek generowane w wyniku alternatywne­go składania transkryptu różnią się od siebie strukturą w mniejszym lub większym stopniu. Z różnic ich struktu­ry wynika duża różnorodność funkcjonalna, dzięki czemu izoformy takie pełnić mogą wiele funkcji, odpowiadając za dyskretne różnice w metabolizmie komórki w zależno­ści od jej typu, fazy życiowej czy chwilowych warunków. Oszacowano, że prawie 75% przypadków alternatywnego składania pre-mRNA dotyczy różnic w regionie ulegają­cym translacji, ma wiec bezpośredni wpływ na strukturę białka [67]. Zmiana właściwości jednej izoformy białka względem drugiej może przyjmować najróżniejsze posta­ci, zależnie od typu i skali alternatywnego składania, jakie w danym wypadku wystąpiły. W skrajnych przypadkach, przy znacznym skróceniu transkryptu wynikającym z wpro­wadzenia przedwczesnego kodonu stop lub przesunięciu ramki odczytu, transkrypt taki ulega degradacji w procesie NMD (nonsense-mediated decay), a jak wykazano, proces taki zachodzi w komórce w wyniku alternatywnego skła­dania [44] i uważa się ten proces za element mechanizmu regulacji ekspresji genów [2,14]. Zmiana w strukturze izo­formy białka może mieć wpływ na jego zdolność oddzia­ływania z innymi cząsteczkami, w tym z innymi białkami i kwasami nukleinowymi. Dana izoforma może nie zawie­rać domeny odpowiedzialnej za wiązanie innej cząstki (np. przez wykluczenie eksonu), czego przykładem może być receptor kwasu retinowego hRXR beta3. Dochodzi tam do utraty zdolności wiązania liganda – kwasu retinowego [51], co jest regulacją negatywną. Ważna jest rola regula­cji zdolności oddziaływania z DNA czynników transkryp­cyjnych, przez co alternatywne składanie przyczynia się do regulacji ekspresji genów [86]. Zależnie od obecności domeny transbłonowej dana izoforma może być białkiem błonowym lub np. cytoplazmatycznym [1], a brak domen zawierających odpowiednie sygnały lokalizacji w komór­ce może warunkować ich wewnątrzkomórkową lokalizację, jak w przypadku receptora dopaminy D2 (retencja w reti­kulum endoplazmatycznym) [74], czy receptora estroge­nowego (jądro/cytoplazma) [73]. Także aktywność i inne właściwości enzymów, takie jak powinowactwo, swoistość substratowa czy sposób regulacji mogą się znacznie różnić między izoformami [5]. Nieco innym następstwem alter­natywnego składania jest różna stabilność produktu biał­kowego – czas półtrwania białka może się znacznie róż­nić dla poszczególnych izoform, np. przez wprowadzenie miejsc trawienia białka [50,76]. Ostatecznie alternatywne składanie w regionach 3′- i 5′ – UTR może wpływać na stabilność mRNA [96].

Efekt fenotypowy alternatywnego składania może się prze­jawiać na różne sposoby. Mechanizm ten, przez genero­wanie wysokiego zróżnicowania proteomicznego i ści­słą koordynację alternatywnego składania, zarówno co do miejsca jak i czasu, pozwala na niezwykle precyzyjną regulację procesów komórkowych w zależności od wielu czynników. Przede wszystkim alternatywne składanie ma charakter tkankowoswoisty [16,97]. Oznacza to, że różne izoformy białka mogą być wytwarzane w różnych tkan­kach w istotnie różniących sie proporcjach [11]. Na tym tle wyróżnić należałoby komórki ośrodkowego układu ner­wowego charakteryzujące się szczególnie wyspecjalizowa­nym zestawem izoform białkowych [20,25]. Innym czyn­nikiem różnicującym proteom komórki jest zależność od fazy rozwojowej oraz etapu różnicowania komórki [64]. Zidentyfikowano wiele wewnętrznych i zewnętrznych czyn­ników modulujących alternatywne składanie mRNA. Są wśród nich zarówno procesy fizjologiczne, jak aktywacja komórkowego receptora czy zmiany aktywności neuro­nów, a także procesy będące odpowiedzią na zewnętrzny czynnik, np. zmiana pH, promieniowanie UV lub zmiany warunków osmotycznych [62,93].

Regulacja alternatywnego składania na poziomie moleku­larnym wydaje się procesem bardzo złożonym, składającym się z wielu współdziałających mechanizmów w znacznej mierze jeszcze niepoznanych (ryc. 3). Klasyczny, najlepiej poznany mechanizm regulacji alternatywnego składania obejmuje wzajemne oddziaływanie elementów cis, na które składa­ją się swoiste sekwencje w mRNA, z elementami trans – grupą białkowych czynników rozpoznających odpowied­nie sekwencje w transkrypcie [30]. Elementy cis dzieli się na sekwencje wzmacniające, promujące wycinanie (enhan­cers) oraz elementy wyciszające, hamujące wycinanie (si­lencers). Obie te grupy dzieli się z kolei ze względu na lo­kalizację na intronowe i eksonowe – najlepiej poznane są eksonowe wzmacniacze składania (ESEs – exonic splicing enhancers), wiążące elementy trans – białka bogate w sery­nę i argininę SR (serine/arginine-rich) [30]. Eksonowe wy­gaszacze składania (ESSs – exonic splicing silencers) wią­żą białka z rodziny hnRNP – białek wchodzących w skład heterogennych rybonukleoprotein, które przyjmują zazwy­czaj rolę elementów hamujących trans. Prawdopodobnie czynniki te wiążąc się z sekwencją w eksonie działają bez­pośrednio przez współzawodniczenie z czynnikami składa­nia U1 i U2snRNP, aczkolwiek szczegóły tego mechanizmu nie zostały ostatecznie wyjaśnione [30,64]. Rozpatrywane są różne sposoby regulacji, takie jak bezpośrednie bloko­wanie steryczne elementów składania mRNA, rekrutacja pozytywna, polegająca na promowaniu przyłączania czyn­ników składania w danym miejscu mRNA, czy oddziały­wanie z tymi czynnikami i modulowanie ich właściwości [64]. Stwierdzono, że czynniki hnRNP mogą oligomery­zować na nici mRNA i w ten sposób oddziaływać na bar­dziej odległe fragmenty transkryptu. Uważa się też, że mogą działać przez wypętlanie eksonu, przez co jest on niedostępny dla elementów kompleksu składającego [105]. Elementy intronowe – ISS (intronic splicing silencers) oraz ISE (intronic splicing enhancers) są również obecne, ale są o wiele słabiej poznane [33]. Wśród ISE stosunkowo do­brze scharakteryzowano tzw. tryplety G lub trakt G – po­wszechne w intronach bogatych w guaninę, a także spo­tykane w intronach powtórzenia CA, mogące pełnić rolę ISE [105]. Obecność powszechnych elementów cis i re­gulatorów trans nie tłumaczy w pełni złożoności regulacji alternatywnego składania. Odkrywane są nowe, bardziej swoiste mechanizmy regulacji. Sekwencje cis są w pew­nym stopniu zdegenerowane, co przekładać się może na zróżnicowane powinowactwo do elementów trans [33]. Zaproponowano model „ying-yang”, w którym występu­je dynamiczna równowaga między oddziaływaniem ele­mentów promujących i hamujących wycinanie, a niewiel­ka przewaga jednego z nich decyduje o tym, czy dany fragment mRNA pozostanie, czy zostanie wycięty [19]. Zidentyfikowane też zostały regulatory tkankowoswoiste, np. NOVA, nPTB, FOX1/2, ESRP1/2 w układzie nerwo­wym [64,93]. Regulatory takie mogą ulegać modyfikacjom potranslacyjnym, także jako elementy efektorowe dróg sy­gnalizacji wewnątrzkomórkowej (np. Ras/Raf/MEK/ERK, czy Ca²⁺/kalmodulina/CamkIV) [33]. Ważna jest też loka­lizacja danej sekwencji [105], wzajemne położenie jednej sekwencji względem innych i liczba powtórzeń motywu, co stanowi o sile jej oddziaływania [110]. Interesującym, a zarazem znaczącym w kontekście regulacji alternatyw­nego składania wydaje się sprzężenie składania mRNA z transkrypcją, „transcriptional coupling”. Składanie od­bywa się często (zwłaszcza w przypadku dłuższych trans­kryptów) kotranskrypcyjnie [70] i jak sie uważa, tempo transkrypcji ma wpływ na wzorzec składania transkryp­tu [48]. Najnowsze informacje wskazują też na udział do­meny CTD polimerazy II RNA w modulacji alternatyw­nego składania [58].

Ryc. 3. Kontrola alternatywnego składania RNA przez elementy pozytywne i negatywne (na podstawie [105] zmodyfikowano). Wzajemne oddziaływanie elementów trans – białek SR i hnRNP z eksonowymi i intronowymi elementami cis decyduje o wyborze miejsca składania. U1 i U2 – rybonukleoproteiny, składniki kompleksu składania RNA; ESE/ESS – eksonowy wzmacniacz/wygaszacz składania; ISE/ISS – intronowy wzmacniacz/wygaszacz składania

Schorzenia związane z zaburzeniami składania alternatywnego

Bardzo duża złożoność mechanizmu alternatywnego skła­dania pre-mRNA, a zwłaszcza wielopoziomowego syste­mu jego regulacji pozwala przypuszczać, że jest on bardzo wrażliwy na zaburzenia. Co więcej, zaburzenia alternatyw­nego składania mogą wywoływać wiele, często trudnych do przewidzenia konsekwencji i prowadzić do rozwoju sta­nów patologicznych, nierzadko o poważnych następstwach dla całego organizmu. Mnogość nie w pełni jeszcze pozna­nych sekwencji regulatorowych stanowić może przeszkodę w ustalaniu związku między stanem patologicznym a za­burzeniem w alternatywnym składaniu transkryptu. Mimo to, zidentyfikowano wiele schorzeń o dobrze udokumen­towanym związku z procesem alternatywnego składania. Innym stanom chorobowym towarzyszą zmiany wzorca al­ternatywnego składania wielu genów, trudno jednak jed­noznacznie określić, czy jest to następstwem, czy przyczy­ną procesu chorobowego. Przyczyną stanu patologicznego może być mutacja w genie, którego etiologicznie stan ten dotyczy lub w innym miejscu w genomie, przez co wpływ ten może być pośredni [93]. Proces chorobowy może być następstwem zarówno mutacji w sekwencjach sygnało­wych składania, sekwencjach regulatorowych cis, jak też w sekwencjach genów czynników białkowych trans, bio­rących udział w regulacji składania alternatywnego [93]. Najprostszym i najbardziej oczywistym przykładem mogą być mutacje umiejscowione w trzech podstawowych dla składania sekwencjach najwyższej zgodności – miejsc składania 3′ i 5′ oraz miejsca rozgałęzienia. Takie muta­cje w oczywisty sposób zaburzają składanie znosząc od­działywanie pre-mRNA z czynnikami U1 i U2snRNP. Jak oszacowano, około 9-10% schorzeń genetycznych zwią­zanych z mutacjami punktowymi to wynik mutacji w tych trzech sekwencjach [104]. Prawie 15% mutacji punktowych związanych z genetycznymi schorzeniami człowieka doty­czy składania pre-mRNA [33], a 60% z nich związane jest z mutacjami w obszarach końcowych eksonów 3′ i 5′, co może utrudniać ich rozpoznanie [65]. Poza wymienionymi sekwencjami najwyższej zgodności eksony zawierać mogą bardzo różnorodne sekwencje regulatorowe o charakterze wzmacniającym lub wyciszającym składanie. Jak się oce­nia, prawie 25% mutacji synonimicznych w eksonach istot­nie wpływa na proces składania, zaburzając jego prawidło­wy wzorzec [69]. Dla niektórych genów nawet ponad 50% mutacji punktowych w ich eksonach może istotnie zaburzać prawidłowe składanie [46]. Cząsteczki mRNA generowa­ne w wyniku prawidłowego alternatywnego składania ule­gają procesowi translacji dając w pełni funkcjonalne biał­ko. Także część izoform nieprawidłowych, generowanych w wyniku zaburzeń w składaniu pre-mRNA może ulegać translacji do białka o mniej lub bardziej zmienionej funk­cji względem białka prawidłowego. Pozostałe, nieprawi­dłowe transkrypty mające przedwczesny kodon stop, ule­gać mogą procesowi degradacji przez mechanizm NMD (nonsense-mediated decay), inne niezawierające kodonu stop – procesowi NSD (nonstop mRNA decay) lub NGD (no-go decay), jeśli z powodu błędnej budowy powodują zatrzymanie procesu translacji [31,34]. Rodzinna dysauto­nomia, FD (familial dysautonomia) jest przykładem scho­rzenia związanego z wprowadzeniem przez alternatywne składanie przedwczesnego kodonu STOP. Jest to neuropa­tia czuciowa dziedziczona recesywnie spowodowana mu­tacją w genie IKBKAP, którego produkt funkcjonuje jako czynnik transkrypcyjny [106]. Synonimiczna tranzycja T>C w ostatnim nukleotydzie 20 intronu po stronie 5′ miejsca wycinania powoduje pominięcie 20 eksonu, co przesuwa ramkę odczytu za tym miejscem i wprowadza przedwcze­sny kodon STOP. Taki skrócony wariant białka częściowo ulega degradacji w procesie NMD, przez co zostaje ogra­niczona pula tego białka w komórce [106].

Innym, charakterystycznym przykładem zespołu genetycz­nego powiązanego z zaburzeniami w alternatywnym skła­daniu jest dystrofia mięśniowa Duchenne’a – najczęściej występująca postać dystrofii mięśniowej sprzężona z płcią [66]. Jest to schorzenie o zróżnicowanej patogenezie mo­lekularnej i choć większość przypadków choroby wią­że się z delecją w genie dystrofiny, składającego się z 79 eksonów, to również znaczna część przypadków choroby wiąże się z występowaniem punktowych mutacji zarów­no w eksonach jak i intronach, w wyniku czego zaburzo­ne zostaje składanie [66]. Przykładem takiej mutacji jest zmiana T>A w eksonie 31, wprowadzająca przedwczesny kodon STOP, ale jednocześnie wprowadza nowe miejsce ESS wiążące negatywny cis-regulator hnRNPA1, przez co ekson ten jest częściowo pomijany [13]. Takie białko zachowuje częściową funkcjonalność, dając łagodniejszy w przebiegu obraz choroby [13].

Zaburzenie alternatywnego składania może mieć wymiar ilościowy. Różne mutacje w DNA mogą prowadzić do ta­kiego samego lub też podobnego efektu – mogą zmieniać proporcje izoform prawidłowych i nieprawidłowych, lecz w różnym stopniu. Na przykład mutacja G>A pierwszego nukleotydu eksonu 6 w genie ATP7A – białka uczestniczą­cego w metabolizmie miedzi w organizmie człowieka, pro­wadzi do pominięcia tego eksonu, czego następstwem jest ostra postać schorzenia neurodegeneracyjnego związane­go z upośledzoną zdolnością asymilacji miedzi – choro­by Menkesa [7]. Jednocześnie inna mutacja, podstawienie U>A w pozycji +6 eskonu 6 skutkuje częściowym tylko wykluczeniem prawidłowej izoformy produktu ATP7A, a to w konsekwencji prowadzi do schorzenia o łagodniej­szym przebiegu – tzw. zespołu rogu potylicznego (occi­pital horn syndrome), charakteryzującego się głównie ist­nieniem zmian kostnych [57].

Tauopatie, to grupa schorzeń o charakterze neurodegene­racyjnym, związana z defektami w alternatywnym składa­niu białka tau. Rola tego białka ograniczona jest w znacz­nej mierze do komórek układu nerwowego, jest kodowane przez gen MAPT (microtubule associated protein tau) i na skutek alternatywnego składania generowanych jest wiele jego izoform – 8 z 16 jego eksonów ulega alternatywnemu składaniu [98]. Dodatkowo, alternatywne składanie tego białka jest ściśle zależne zarówno od fazy rozwoju osob­niczego, jak też od ściśle zdefiniowanego umiejscowienia komórek w obrębie mózgu. Białko tau wiąże mikrotubule dzięki obecności powtórzeń regionów wiązania tych bia­łek. Zidentyfikowano wiele mutacji wpływających na alter­natywne składanie tego białka i jednocześnie ich związek z występowaniem takich schorzeń, jak choroba Alzheimera czy otępienie skroniowo-czołowe [98]. Mutacje dotyczące otępienia skroniowo-czołowego (zidentyfikowano 42 takie mutacje) dotyczą w głównej mierze eksonu 10. Bardziej szczegółowe badania sugerują, że proces chorobowy może być w tym przypadku wynikiem zmian wzajemnych pro­porcji poszczególnych izoform białka tau w wyniku zabu­rzających alternatywne składanie mutacji, a nie zmiany, czy utraty funkcji przez te izoformy [12,98].

Osobną grupą schorzeń o potwierdzonym związku z zabu­rzeniami w alternatywnym składaniu transkryptu są nowo­twory złośliwe. Mutacje w genach prowadzące do zmian we wzorcu alternatywnego składania mogą być związane z transformacją nowotworową. Jednym z przykładów może być gen LKB1, supresor nowotworowy, kodujący kinazę serynowo-treoninową biorącą udział w kontroli apoptozy i cyklu komórkowego. Mutacja w tym genie związana jest z syndromem Peutza-Jeghersa, objawiającego się polipowa­tością jelita i dużą predyspozycją do nowotworów. W wy­niku mutacji powstaje alternatywne miejsce składania 3′, a w konsekwencji dochodzi do przesunięcia ramki odczy­tu i wprowadzenia przedwczesnego kodonu STOP [24]. Innym przykładem może być gen BRCA1 – dobrze pozna­ny supresor nowotworowy, którego mutacje związane są z dużym ryzykiem raka piersi. Jedna z mutacji w tym genie – mutacja nonsensowa w eksonie 18 – wpływa na zaburze­nie alternatywnego składania przez zniesienie miejsca ESE (dotąd zidentyfikowano 23 sekwencje ESE w tym genie) i powoduje pominięcie eksonu 18 [92]. Ponadto w wielu nowotworach wykryto istotne zmiany we wzorcu alterna­tywnego składania wielu genów, a nie zostały znalezione mutacje w ich sekwencji mogące leżeć u podstaw takich zmian. Poza tym, niektóre izoformy produktów tych genów ulegają kumulacji w rozwoju guza, a potwierdzono też, że sztuczna nadekspresja tych wariantów może powodować transformację nowotworową komórki [88,92]. Pozwala to przypuszczać, że mutacje te mogą dotyczyć genów kodu­jących elementy regulatorowe trans [92]. Za ciekawy przy­kład może tu posłużyć dobrze poznany supresor nowotwo­rowy p53. Białko to może występować pod postacią kilku izoform [68], a ich występowanie jest tkankowoswoiste, a także proporcje ich są zaburzone w nowotworze piersi [9]. Alternatywnemu składaniu ulegają też główne regu­latory białka p53, w tym MDM2. Zidentyfikowano ponad 40 alternatywnych transkryptów tego białka, z czego część uważa się za cząsteczki nieprawidłowe, związane z nowo­tworzeniem [92]. Podkreśla to rolę, jaką w procesie nowo­tworzenia odgrywać może alternatywne składanie trans­kryptów i wskazuje na ważny kierunek badań nad biologią molekularną nowotworów, a jednocześnie otwiera drogę do nowych potencjalnych terapii chorób nowotworowych.

Interferencja RNA w terapii chorób związanych z alternatywnym składaniem

Schorzenia będące wynikiem błędnego alternatywnego składania mają przeważnie ciężki przebieg, co więcej le­czenie tych schorzeń tradycyjnymi metodami jest proble­matyczne, a w wielu przypadkach niemożliwe, co nadaje im status nieuleczalnych i często prowadzą do śmierci cho­rego. Z tego powodu poszukiwanie nowych, skutecznych metod terapii takich schorzeń znajduje się w centrum za­interesowania wielu grup badawczych. Interferencja RNA (RNAi – RNA interference) jest zachowanym ewolucyj­nie mechanizmem regulacji ekspresji genów u eukarion­tów (ryc. 4). Należy do grupy zależnych od RNA mechanizmów wyciszania genów. Umożliwia degradację swoistych czą­steczek mRNA, bądź też zablokowanie translacji, zależ­nie od ich sekwencji [81]. Najlepiej i najwcześniej pozna­nym jest udział w interferencji cząsteczek siRNA (short interferring RNA). Powstają one z dłuższych, dwunicio­wych cząsteczek prekursorowych, ulegających cięciu przez rybonukleazę III, Dicer, do 21-25-nukleotydowych dwu­niciowych cząsteczek, które wchodzą następnie w skład dużych rybonukleoproteinowych kompleksów RISC (RNA-induced silencing complex), gdzie zostają rozwinięte do form jednoniciowych [81]. Jako składnik kompleksu RISC siRNA uczestniczą w rozpoznawaniu i degradacji kom­plementarnych do nich cząsteczek mRNA. Za degrada­cję docelowych mRNA odpowiada obecna w kompleksie RISC endonukleaza Argonaute 2 (Ago-2) z rodziny bia­łek Argonaute [45]. Nieco odmiennym typem cząsteczek RNA biorącym udział w interferencji jest miRNA (mi­croRNA). Wyciszanie genów zależne od miRNA może się odbywać zarówno przez degradację docelowych RNA (podobnie jak siRNA), jak też przez zablokowanie trans­lacji mRNA (częściej) [3]. Podobnie jak siRNA, miRNA powstają z większych prekursorów poprzez działanie ry­bonukleazy Dicer [99]. Biogeneza miRNA jest procesem wieloetapowym. Pierwotne prekursory – pri-miRNA, czę­sto pochodzące z intronów genów transkrybowanych przez polimerazę RNA II, podlegają obróbce przez rybonukle­azę Drosha. Daje to ~70-nukleotydowy produkt pośredni o strukturze szpilki do włosów [42], który jest następnie transportowany do cytoplazmy, gdzie po ostatecznej obrób­ce przez białko Dicer powstaje gotowy produkt – miRNA. Dojrzałe cząsteczki miRNA wchodzą w skład komplek­sów rybonukleoproteinowych miRNP i na tym etapie mogą uczestniczyć w interferencji RNA [6].

Ryc. 4. Mechanizm interferencji RNA z udziałem siRNA. Prekursor siRNA (dsRNA) podlega cięciu przez kompleks DICER, generując dwuniciowe siRNA. SiRNA wchodzi w skład kompleksu RISC, w wyniku rozplatania siRNA do postaci jednoniciowej następuje aktywacja RISC. Aktywny kompleks RISK rozpoznaje docelową cząsteczkę mRNA indukując jej degradację

Mimo iż proces interferencji RNA odkryto stosunkowo niedawno [18], zaproponowano wiele jego potencjalnych zastosowań, a wiele jest obecnie w powszechnym uży­ciu, zarówno jako narzędzie terapeutyczne, jak i badaw­cze. Rutynowo stosuje sie je w badaniach nad funkcją ge­nów, poprzez kontrolowane ich wyciszanie [47]. Koncepcję zastosowania interferencji RNA do korekty zaburzeń al­ternatywnego składania (ryc. 5) można uznać za względnie nowy punkt widzenia, z czego wynika niewielka, jak dotąd liczba spektakularnych sukcesów. Jednak wiele opublikowanych wyników pozwala optymistycznie oceniać rozwój badań w tym kierunku i potwierdza słuszność rozwijania me­tod opierających się na interferencji RNA. Przede wszyst­kim jednak podejście to daje nadzieję na eliminację wie­lu problemów spotykanych przy rozwoju wcześniejszych, standardowych technik molekularno-genetycznych opie­rających się na terapii genowej, takie jak niewielka efek­tywność transferu genu, znaczne ograniczenie w wielko­ści wprowadzanego fragmentu genu, negatywne efekty zależne od miejsca wprowadzenia transgenu, czy reakcja obronna komórki i organizmu związana z procesem trans­fekcji [108]. Podjęto już pierwsze próby zastosowania in­terferencji RNA zarówno w badaniach na komórkach, jak również w leczeniu schorzeń u człowieka. Osiągnięto też pierwsze sukcesy, czego przykładem może być próba za­stosowania interferencji RNA w leczeniu wysiękowej po­staci zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem (AMD – age-related macular degeneration), z zastosowaniem siR­NA w celu wyciszenia genu receptora śródbłonkowego czynnika wzrostu naczyń, (VEGFR1 – vascular endothe­lial growth factor receptor 1) [54], jednego z czynników odpowiedzialnych za patologiczny rozrost choriokapilar w siatkówce w wysiękowej postaci AMD. Inny zespół ra­portował, że w pierwszej fazie badań klinicznych iniekcja do gałki ocznej siRNA komplementarnego do transkryp­tu genu VEGFR1 (Sirna-027) skutkowało zatrzymaniem progresji choroby, a często także poprawą ostrości widze­nia w grupie badanej. Nie obserwowano również działa­nia toksycznego podanej substancji [34].

Ryc. 5. Korekta alternatywnego składania przez interferencję RNA, powstają dwa transkrypty różniące się fragmentem (prawidłowy – zielona wstawka i nieprawidłowy – czerwona wstawka). Wprowadzone do komórki siRNA współtworzy aktywny kompleks RISC, rozpoznaje nieprawidłowy wariant i go degraduje. Prawidłowy wariant nie zostaje rozpoznany i nie ulega degradacji

Projektuje się cząsteczki siRNA swoiste dla określonych, wytwarzanych w komórce transkryptów, wyciszając w ten sposób określone geny, których zaburzona ekspresja jest często charakterystycznym symptomem w stanach choro­bowych [23]. Liczne próby podjęto w terapii nowotworów, ze względu na nie tylko oporność na tradycyjne schema­ty terapeutyczne i dużą śmiertelność, ale i ze względu na swoiste, odmienne od stanu prawidłowego, wzorce ekspre­sji wielu genów w nowotworach, z obniżonym poziomem ekspresji grupy genów przy jednoczesnej nadekspresji in­nych [3]. Dotyczy to zwłaszcza genów związanych z re­gulacją takich procesów jak apoptoza, neowaskularyzacja, czy podziały komórki. Ponadto u podstaw procesu nowo­tworzenia leżą kaskady następujących po sobie mutacji w obrębie głównych genów [3], a przez to genów wydają­cych się właściwym celem terapii z użyciem interferują­cego RNA. Liczne próby zastosowania interferencji RNA w terapii związane były ze swoistą dla odpowiedzi na infek­cje wirusowe reakcją przeciw wprowadzanym do komórki syntetycznym dwuniciowym RNA. W tym celu stosowano transfekcję komórek krótkimi jednoniciowymi cząsteczka­mi RNA zawierającymi dwunukleotydowe jednoniciowe końce 3′, co znosiło negatywne działanie związane z re­akcją obronną komórki [15]. Wkrótce też uzyskano eks­presję cząsteczki zawierającej promotor polimerazy RNA III krótkich cząsteczek RNA o strukturze szpilki do wło­sów – shRNA (short hairspin RNA), naśladujących miR­NA [21]. Takie cząsteczki shRNA ulegają następnie obrób­ce w komórce przez RNAzę III, po czym zostają włączone w skład kompleksu RISC [53].

Wraz z rozwojem technik opartych na interferencji RNA, jak i próbami ich zastosowań klinicznych rozwinął się kie­runek badań w biologii molekularnej, o znacznym poten­cjale i dużej precyzji w kontroli ekspresji genów. O ile jednak zablokowanie funkcji poszczególnych genów nie stanowi obecnie dużego wyzwania, to próby wyciszenia poszczególnych alleli czy izoform jest podejściem o wie­le bardziej problematycznym (ryc. 6). Wyciszenie izoformy wy­różniającej się obecnością lub brakiem pojedynczego eksonu, bądź też zawierającej skrócony/wydłużony ekson w stosunku do izoformy prawidłowej stanowi techniczny problem ze względu na duże podobieństwo w sekwencji izoform i duże ryzyko ich jednoczesnego wyciszenia. Co więcej, o ile względnie łatwym zadaniem jest ukierunko­wanie interferencji RNA na alternatywny ekson, znacznie trudniejszym zadaniem jest zorientowanie interferującego RNA na granicę ekson-intron. Problemem jest tu znacz­ne podobieństwo sekwencji w ściśle określonym miejscu stanowiącym zarazem granicę między eksonem i intro­nem [21]. Niedostateczna precyzja w wyciszaniu izofor­my białka może spowodować całkowite zahamowanie eks­presji genu (wyeliminowanie także innych, poza docelową, prawidłowych izoform białka), a taka ingerencja może za­kończyć się śmiercią komórki [21].

Ryc. 6. Zastosowanie interferencji RNA w wyciszaniu izoformy białka VEGF jako celu terapii nowotworów (na podstawie [108] zmodyfikowano). Izoforma VEGF165 nie ma eksonu 6 i ulega wyciszaniu w procesie interferencji RNA. VEGF189 – prawidłowa cząsteczka mRNA, VEGF165 – mRNA z brakującym eksonem 6; kolorowe prostokąty odpowiadają poszczególnym eksonom mRNA

W terapiach antynowotworowych jednym z głównych i oczywistych potencjalnych celów interferencji RNA wy­dają się geny biorące udział w regulacji procesu apoptozy. W komórkach nowotworowych zachodzi wiele zmian we wzorcu ekspresji genów, w tym genów związanych z regu­lacją apoptozy, wzrostu i różnicowania komórek. Dotyczy to zarówno poziomu ekspresji tych genów, jak i względ­nych poziomów poszczególnych ich izoform. Alternatywne składanie mRNA jest ważnym punktem w regulacji eks­presji tych genów, ich ekspresja wykazuje w wielu przy­padkach silny swoisty tkankowo charakter i jak wiadomo, wiąże się z występowaniem poszczególnych typów no­wotworów [21]. Wśród białek z rodziny Bcl-2, o ważnej funkcji w regulacji apoptozy, produkt genu Bcl-x ulega al­ternatywnemu składaniu, w wyniku czego powstają dwie izoformy o przeciwstawnym działaniu – Bcl-xL o właści­wościach antyapoptotycznych oraz Bcl-xS, którego przewa­ga w komórce promuje apoptozę [8]. Wyciszenie izoformy Bcl-xL uwrażliwia komórki nowotworowe na indukowaną chemioterapeutykami apoptozę [111,112]. Podobnie bło­nowy receptor Fas jest pozytywnym elementem sygnali­zacji w apoptozie, jednakże występująca w mniejszości izoforma tego białka, pochodząca z transkryptu pozba­wionego eksonu 6, będąca cytoplazmatycznym warian­tem receptora Fas nie ma zdolności indukowania apoptozy [107]. Inaktywacja tej izoformy receptora Fas może zatem zwiększać wrażliwość komórki na sygnały proapoptotyczne [21]. Nieco innym przykładem jest supresor nowotworowy – białko KLF6, wykazujący dysfunkcję w nowotworze pro­staty [10]. Związana z tym nowotworem mutacja IVSΔA w genie KLF6 skutkuje nadmiernym wytwarzaniem izo­formy SV1 względem pozostałych izoform – SV2 i SV3. Izoformy SV2 i SV3 działają antyproliferacyjnie, z kolei izoforma SV1 stymuluje podziały komórkowe [59]. SiRNA skierowane przeciwko izoformie SV1 produktu genu KLF6 ograniczało wzrost guza o 50% i dodatkowo powodowa­ło spadek ekspresji innych, związanych ze wzrostem guza i angiogenezą genów [60], okazując się przez to obiecują­cą metodą w terapii nowotworu prostaty.

Prawie 30% przypadków nowotworów piersi i jajnika jest związanych z nadekspresją receptora estrogenowego HER-2, co oznacza gorsze rokowania dla pacjenta [89]. Wyciszanie genu HER-2 za pomocą interferencji RNA w przypadkach HER-2-zależnych nowotworów wyraźnie ogranicza proli­ferację komórek guza i promuje ich apoptozę [17]. Co wię­cej, produkt genu HER-2 ulega alternatywnemu składaniu, a obecność niedawno zidentyfikowanej izoformy DHER-2 może się wiązać z większą aktywnością transformacyjną komórek, a przez to wydaje się potencjalnie wartościowym celem terapii za pomocą interferencji RNA ukierunkowa­nej na konkretną izoformę białka [40].

Trwają także intensywne prace nad zastosowaniem interfe­rencji RNA w schorzeniach neurodegeneracyjnych. Dobrze scharakteryzowana została grupa mutacji w genie tau, leżą­ca u podstaw wielu schorzeń w obrębie układu nerwowego, w tym demencja czołowo-skroniowa i parkinsonizm, czy postępujące porażenie nadjądrowe [29]. Mutacja V337M wewnątrz eksonu 12 związana jest z demencją czołowo­-skroniową. Ponieważ jest to mutacja punktowa, dużym wyzwaniem było skonstruowanie takiej cząsteczki siR­NA, która charakteryzowałaby się selektywnością w sto­sunku do wadliwego wariantu, nie wpływając na ekspre­sję wariantu prawidłowego [55].

Szczególnie istotne z punktu widzenia terapii skierowa­nej na proces alternatywnego składania RNA są zaburze­nia związane z mutacjami w genach czynników uczestni­czących w samym procesie składania mRNA. Klasycznym tego przykładem są mutacje w genach SMN1 i SMN2, któ­re leżą u podstaw rdzeniowej atrofii mięśni (SMA – spinal muscular athrophy) [80]. Produkty tych genów ulegają kon­stytutywnej ekspresji w różnego rodzaju tkankach i pełnią istotne funkcje na etapie montażu kompleksu rybonukle­oproteinowego składania mRNA [4]. W następstwie sub­stytucji C>T w pozycji 6 eksonu 7 genu SMN2 dochodzi do nieprawidłowego alternatywnego składania transkryptu, w wyniku czego w komórce pojawia się przewaga niepra­widłowej izoformy pozbawionej 7 eksonu [43]. Większość typów komórek jest w stanie skompensować lub tolerować ten defekt, jednakże w przypadku motoneuronów dochodzi do ich obumierania [4]. Molekularno-genetyczny mecha­nizm tego zjawiska nie został jeszcze wyjaśniony, a roz­ważane są dwa modele tłumaczące to schorzenie. Pierwszy model zakłada istnienie eksonowego wzmacniacza skła­dania w eksonie 7, a mutacja w jego obrębie znosi skut­ki wzmacniania [36]. W alternatywnym modelu mutacja w eksonie 7 powoduje powstanie eksonowego wygaszacza składania, który przez przyłączenie cząsteczki hnRNP A1 promuje usuwanie tego eksonu [36]. Przeprowadzono próbę korekcji polegającą na wyciszeniu genu czynnika hnRNP A1 (a także pokrewnego mu czynnika hnRNP A2), za po­mocą interferencji RNA. W wyniku takiego działania uda­ło się przywrócić prawidłowy fenotyp, a ekspresja wadli­wej izoformy SMN2 została wygaszona na rzecz pełnego, funkcjonalnego białka, zawierającego domenę kodowaną w eksonie 7 [36].

Przedstawione informacje mają na celu przedstawienie obecnego stanu wiedzy i rozwoju metod terapeutycznych z użyciem procesu interferencji RNA. Dzięki intensywnym próbom nad stosowaniem interferencji RNA w terapii, me­toda ta jest na etapie dynamicznego rozwoju, obejmując coraz liczniejszą grupę schorzeń, jako potencjalnych ce­lów w terapii. Nie jest wykluczone, że udział alternatyw­nego składania w patogenezie okaże się istotnym elemen­tem większej liczby chorób, w których aspekt ten nie został jeszcze zbadany. W tym kontekście wyciszanie wadliwych wariantów białek wydaje się podejściem znacznie bardziej precyzyjnym niż standardowe terapie i jednocześnie dają­cym ogromne możliwości i nadzieję na skuteczne leczenie dużej grupy schorzeń będących wciąż chorobami nieule­czalnymi. Pomijając aspekty techniczne stanowiące pewne ograniczenia w korekcji składania mRNA, jedynym pro­blemem zdaje się pozostawać znajomość molekularnych podstaw w patogenezie schorzeń człowieka, których po­znanie pozwala na wyznaczenie molekularnych celów te­rapii, a w przypadku terapii opartej na interferencji RNA daje nadzieje na opracowanie niezwykle skutecznych i nie­osiągalnych dotychczas schematów leczenia.

PIŚMIENNICTWO

[1] Alt F.W., Bothwell A.L., Knapp M., Siden E., Mather E., Koshland M., Baltimore D.: Synthesis of secreted and membrane-bound immunoglobulin mu heavy chains is directed by mRNAs that differ at their 3’ends. Cell, 1980; 20: 293-301
[PubMed]  

[2] Amor S., Remy S., Dambrine G., Le Vern Y., Rasschaert D., Laurent S.: Alternative splicing and nonsense-mediated decay regulate telomerase reverse transcriptase (TERT) expression during virus-induced lymphomagenesis in vivo. BMC Cancer, 2010; 10: 571
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Angaji S.A., Hedayati S.S., Poor R.H., Madani S., Poor S.S., Panahi S.: Application of RNA interference in treating human diseases. J. Genet., 2010; 89: 527-537
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[4] Bebee T.W., Gladman J.T., Chandler D.S.: Splicing regulation of the survival motor neuron genes and implications for treatment of spinal muscular atrophy. Front. Biosci., 2010; 15: 1191-1204
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[5] Benedict C.L., Gilfillan S., Kearney J.F.: The long isoform of terminal deoxynucleotidyl transferase enters the nucleus and, rather than catalysing nontemplated nucleotide addition, modulates the catalytic activity of the short isoform. J. Exp. Med., 2001; 193: 89-99
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[6] Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M., Hannon G.J.: Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature, 2001; 409: 363-366
[PubMed]  

[7] Bertini I., Rosato A.: Menkes disease. Cell Mol. Life Sci., 2008; 65: 89-91
[PubMed]  

[8] Boise L.H., Gonzalez-Garcia C.E., Postema C.E., Ding L., Lindsten T., Turka L.A., Mao X., Nunez G., Thomson C.B.: Bcl-x, a Bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell, 1993; 74: 597-608
[PubMed]  

[9] Bourdon J.C., Fernandes K., Murray-Zmijewski F., Liu G., Diot A., Xirodimas D.P., Saville M.K., Lane D.P.: p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev., 2005; 19: 2122-2137
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[10] Chen C., Hyytinen E.R., Sun X., Helin H.J., Koivisto P.A., Frierson H.F.Jr, Vessella R.L., Dong J.T.: Deletion, mutation and loss of expression of KLF6 in human prostate cancer. Am. J. Pathol., 2003; 162: 1349-1354
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[11] Chen Z., Gao X., Lei T., Chen X., Zhou L., Yu A., Lei P., Zhang R., Long H., Yang Z.: Molecular characterization, expression and chromosomal localization of porcine PNPLA3 and PNPLA4. Biotechnol. Lett., 2011; 33: 1327-1337
[PubMed]  

[12] Dawson H.N., Cantillana V., Chen L., Vitek M.P.: The tau N279K exon 10 splicing mutation recapitulates frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17 tauopathy in a mouse model. J. Neurosci., 2007; 27: 9155-9168
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[13] Disset A., Bourgeois C.F., Benmalek N., Claustres M., Stevenin J., Tuffery-Giraud S.: An exon skipping-associated nonsense mutation in the dystrophin gene uncovers a complex interplay between multiple antagonistic splicing elements. Hum. Mol. Genet., 2006; 15: 999-1013
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[14] Durand C., Roeth R., Dweep H., Vlatkovic I., Decker E., Schneider K.U., Rappold G.: Alternative splicing and nonsense-mediated RNA decay contribute to the regulation of SHOX expression. PLoS One, 2011; 6: e18115
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[15] Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T.: RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev., 2001; 15: 188-200
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[16] Emig D., Albrecht M.: Tissue-specific proteins and functional implications. J. Proteome Res., 2011; 10: 1893-1903
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[17] Faltus T., Yuan J., Zimmer B., Kramer A., Loibl S., Kaufmann M., Strebhardt K.: Silencing of the HER2/neu gene by siRNA inhibits proliferation and induces apoptosis in HER2/neu-overexression breast cancer cells. Neoplasia, 2004; 6: 786-795
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[18] Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C.: Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998; 391: 806-811
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[19] Fu X.D.: Towards a splicing code. Cell, 2004; 119: 736-738
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[20] Gao F.B.: Molecular and cellular mechanisms of dendritic morphogenesis. Curr. Opin. Neurobiol., 2007; 17: 525-532
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[21] Gaur R.K.: RNA interference: a potential therapeutic tool for silencing splice isoforms linked to human diseases. Biotechniques , 2006; Suppl.: 15-22
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[22] Glanz S., Kuck U.: Trans-splicing of organelle introns – a detour to continuous RNAs. Bioessays, 2009; 31: 921-934
[PubMed]  

[23] Gupta P.K.: RNA interference-gene silencing by double-stranded RNA: The 2006 Nobel prize for physiology or medicie. Curr. Sci., 2006; 91: 1443

[24] Hastings M.L., Resta N., Traum D., Stella A., Guanti G., Krainer A.R.: An LKB1 AT-AC intron mutation causes Peutz-Jeghers syndrome via splicing at noncanonical cryptic sites. Nat. Struct. Mol. Biol., 2005; 12: 54-59
[PubMed]  

[25] Hattori D., Millard S.S., Wojtowicz W.M., Zipursky S.L.: Dscam-mediated cell recognition regulates neural circuit formation. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2008; 24: 597-620
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[26] Herai R.H., Yamagishi M.E.: Detection of human interchromosomal trans-splicing in sequence databanks. Brief Bioinform., 2010; 11: 198-209
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[27] Hertel K.J.: Combinatorial control of exon recognition. J. Biol. Chem., 2008; 283: 1211-1215
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[28] Horiuchi T., Aigaki T.: Alternative trans-splicing: a novel mode of pre-mRNA processing. Biol. Cell, 2006; 98: 135-140
[PubMed]  

[29] Houlden H., Baker M., Morris H.R., MacDonald N., Pickering-Brown S., Adamson J., Lees A.J., Rossor M.N., Quinn N.P., Kertesz A., Khan M.N., Hardy J., Lantos P.L., St George-Hyslop P., Munoz D.G., Mann D., Lang A.E., Bergeron C., Bigio E.H., Litvan I., Bhatia K.P., Dickson D., Wood N.W., Hutton M.: Corticobasal degeneration and progressive supranuclear palsy share a common tau haplotype. Neurology, 2001; 56: 1702-1706
[PubMed]  

[30] House A.E., Lynch K.W.: Regulation of alternative splicing: more than just the ABCs. J. Biol. Chem., 2008; 283: 1217-1221
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[31] Hsu S.N., Hertel K.J.: Spliceosomes walk the line: splicing errors and their impact on cellular function. RNA Biol., 2009; 6: 526-530
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[32] Hughes T.A.: Regulation of gene expression by alternative untranslated regions. Trends Genet., 2006; 22: 119-122
[PubMed]  

[33] Hui J.: Regulation of mammalian pre-mRNA splicing. Sci. China C. Life Sci., 2009; 52: 253-60
[PubMed]  

[34] Isken O., Maquat L.E.: Quality control of eukaryotic mRNA: safeguarding cells from abnormal mRNA function. Genes Dev., 2007; 21: 1833-1856
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[35] Kaiser P.K., Symons R.C., Shah S.M., Quinlan E.J., Tabandeh H., Do D.V., Reisen G., Lockridge J.A., Short B., Guerciolini R., Nguyen Q.D.: Sirna-027 Study Investigators.: RNAi-based treatment for neovascular age-related macular degeneration by Sirna-027. Am. J. Ophthalmol., 2010; 150: 33-39.e2
[PubMed]  

[36] Kashima T., Manley J.L.: A negative element in SMN2 exon 7 inhibits splicing in spinal muscular atrophy. Nat. Genet., 2003; 34: 460-463
[PubMed]  

[37] Keating K.S., Toor N., Perlman P.S., Pyle A.M.: A structural analysis of the group II intron active site and implication for the spliceosome. RNA, 2010; 16: 1-9
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[38] Kim E., Goren A., Ast G.: Alternative splicing: current perspectives. Bioessays, 2008; 30: 38-47
[PubMed]  

[39] Kornblihtt A.R., de la Mata M., Fededa J.P., Munoz M.J., Noques G.: Multiple links between transcription and splicing. RNA, 2004; 10: 1489-1498
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[40] Kwong K.Y., Hung M.C.: A novel splice variant of HER2 with increased transformation activity. Mol. Carcinog., 1998; 23: 62-68
[PubMed]  

[41] Lander E.S., Lander E.S., Linton L.M., Birren B., Nusbaum C., Zody M.C., Baldwin J., Devon K., Dewar K., Doyle M., FitzHugh W., Funke R., Gage D., Harris K., Heaford A., Howland J., Kann L., Lehoczky J., LeVine R., McEwan P., McKernan K., Meldrim J., Mesirov J.P., Miranda C., Morris W., Naylor J., Raymond C., Rosetti M., Santos R., Sheridan A., Sougnez C., Stange-Thomann N., Stojanovic N., Subramanian A., Wyman D., Rogers J., Sulston J., Ainscough R., Beck S., Bentley D., Burton J., Clee C., Carter N., Coulson A., Deadman R., Deloukas P., Dunham A., Dunham I., Durbin R., French L., Grafham D., Gregory S., Hubbard T., Humphray S., Hunt A., Jones M., Lloyd C., McMurray A., Matthews L., Mercer S., Milne S., Mullikin J.C., Mungall A., Plumb R., Ross M., Shownkeen R., Sims S., Waterston R.H., Wilson R.K., Hillier L.W., McPherson J.D., Marra M.A., Mardis E.R., Fulton L.A., Chinwalla A.T., Pepin K.H., Gish W.R., Chissoe S.L., Wendl M.C., Delehaunty K.D., Miner T.L., Delehaunty A., Kramer J.B., Cook L.L., Fulton R.S., Johnson D.L., Minx P.J., Clifton S.W., Hawkins T., Branscomb E., Predki P., Richardson P., Wenning S., Slezak T., Doggett N., Cheng J.F., Olsen A., Lucas S., Elkin C., Uberbacher E., Frazier M., Gibbs R.A., Muzny D.M., Scherer S.E., Bouck J.B., Sodergren E.J., Worley K.C., Rives C.M., Gorrell J.H., Metzker M.L., Naylor S.L., Kucherlapati R.S., Nelson D.L., Weinstock G.M., Sakaki Y., Fujiyama A., Hattori M., Yada T., Toyoda A., Itoh T., Kawagoe C., Watanabe H., Totoki Y., Taylor T., Weissenbach J., Heilig R., Saurin W., Artiguenave F., Brottier P., Bruls T., Pelletier E., Robert C., Wincker P., Smith D.R., Doucette-Stamm L., Rubenfield M., Weinstock K., Lee H.M., Dubois J., Rosenthal A., Platzer M., Nyakatura G., Taudien S., Rump A., Yang H., Yu J., Wang J., Huang G., Gu J., Hood L., Rowen L., Madan A., Qin S., Davis R.W., Federspiel N.A., Abola A.P., Proctor M.J., Myers R.M., Schmutz J., Dickson M., Grimwood J., Cox D.R., Olson M.V., Kaul R., Raymond C., Shimizu N., Kawasaki K., Minoshima S., Evans G.A., Athanasiou M., Schultz R., Roe B.A., Chen F., Pan H., Ramser J., Lehrach H., Reinhardt R., McCombie W.R., de la Bastide M., Dedhia N., Blöcker H., Hornischer K., Nordsiek G., Agarwala R., Aravind L., Bailey J.A., Bateman A., Batzoglou S., Birney E., Bork P., Brown D.G., Burge C.B., Cerutti L., Chen H.C., Church D., Clamp M., Copley R.R., Doerks T., Eddy S.R., Eichler E.E., Furey T.S., Galagan J., Gilbert J.G., Harmon C., Hayashizaki Y., Haussler D., Hermjakob H., Hokamp K., Jang W., Johnson L.S., Jones T.A., Kasif S., Kaspryzk A., Kennedy S., Kent W.J., Kitts P., Koonin E.V., Korf I., Kulp D., Lancet D., Lowe T.M., McLysaght A., Mikkelsen T., Moran J.V., Mulder N., Pollara V.J., Ponting C.P., Schuler G., Schultz J., Slater G., Smit A.F., Stupka E., Szustakowski J., Thierry-Mieg D., Thierry-Mieg J., Wagner L., Wallis J., Wheeler R., Williams A., Wolf Y.I., Wolfe K.H., Yang S.P., Yeh R.F., Collins F., Guyer M.S., Peterson J., Felsenfeld A., Wetterstrand K.A., Patrinos A., Morgan M.J., de Jong P., Catanese J.J., Osoegawa K., Shizuya H., Choi S., Chen Y.J.; International Human Genome Sequencing Consortium: Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2001; 409: 860-921
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[42] Lee Y., Ahn C., Han J., Choi H., Kim J., Yim J., Lee J., Provost P., Radmark O., Kim S., Kim V.N.: The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature, 2003; 425: 415-419
[PubMed]  

[43] Lefebvre S., Burglen L., Reboullet S., Clermont O., Burlet P., Viollet L., Benichou B., Cruaud C., Millasseau P., Zeviani M., Le Paslier D., Frezal J., Cohen D., Weissenbach J., Munnich A., Melki J.: Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell, 1995; 80: 155-165
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[44] Lewis B.P., Green R.E., Brenner S.E.: Evidence for the widespread coupling of alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay in humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: 189-192
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[45] Liu J., Carmell M.A., Rivas F.V., Marsden C.G., Thomson J.M., Song J.J., Hammond S.M., Joshua-Tor L., Hannon G.J.: Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science, 2004; 305: 1437-1441
[PubMed]  

[46] Lopez-Bigas N., Audit B., Ouzounis C., Parra G., Guigo R.: Are splicing mutations the most frequent cause of hereditary disease? FEBS Lett., 2005; 579: 1900-1903
[PubMed]  

[47] Lopez-Fraga M., Martinez T., Jimenez A.: RNA interference technologies and therapeutics: from basic research to products. BioDrugs, 2009; 23: 305-332
[PubMed]  

[48] Luco R.F., Allo M., Schor I.E., Kornblihtt A.R., Misteli T.: Epigenetics in alternative pre-mRNA splicing. Cell, 2011; 144: 16-26
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[49] Lutz C.S.: Alternative polyadenylation: a twist on mRNA 3′ end formation. ACS Chem. Biol., 2008; 3: 609-617
[PubMed]  

[50] Lynch C.J., Shah Z.H., Allison S.J., Ahmed S.U., Ford J., Warnock L.J., Li H., Serrano M., Milner J.: SIRT1 undergoes alternative splicing in a novel auto-regulatory loop with p53. PLoS One, 2010; 5: e13502
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[51] Mahajna J., Shi B., Bruskin A.: A four-amino-acid insertion in the ligand-binding domain inactivates hRXRbeta and renders dominant negative activity. DNA Cell Biol., 1997; 16: 463-476
[PubMed]  

[52] McCracken S., Fong N., Rosonina E., Yankulov K., Brothers G., Siderovski D., Hessel A., Foster S., Shuman S., Bentley D.L.: 5′-capping enzymes are targetted to pre-mRNA by binding to the phosphorylated carboxy-terminal domain of RNA polymerase II. Genes Dev. 1997; 11: 3306-3318
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[53] Meister G., Tuschl T.: Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature, 2004; 431: 343-349
[PubMed]  

[54] Michels S., Schmidt-Erfurth U., Rosenfeld P.J.: Promising new treatments for neovascular age-related macular degeneration. Expert Opin. Investig. Drugs, 2006; 15: 779-793
[PubMed]  

[55] Miller V.M., Gouvion C.M., Davison B.L., Paulson H.L.: Targeting Alzheimer’s disease genes with RNA interference: an efficient strategy for silencing mutant alleles. Nucleic Acids Res., 2004; 32: 661-668
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[56] Misteli T., Spector D.L.: RNA polymerase II targets pre-mRNA splicing factors to transcription sites in vivo. Mol. Cell., 1999; 3: 697-705
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[57] Moller L.B., Tumer Z., Lund C., Petersen C., Cole T., Hanusch R., Seidel J., Jensen L.R., Horn N.: Similar splice-site mutations of the ATP7A gene lead to different phenotypes: classical Menkes disease or occipital horn syndrome. Am. J. Hum. Genet., 2000; 66: 1211-1220
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[58] Munoz M.J., de la Mata M., Kornblihtt A.R.: The carboxy terminal domain of RNA polymerase II and alternative splicing. Trends Biochem. Sci., 2010; 35: 497-504
[PubMed]  

[59] Narla G., Difeo A., Reeves H.L., Schaid D.J., Hirshfeld J., Hod E., Katz A., Isaacs W.B., Hebbring S., Komiya A., McDonnell S.K., Wiley K.E., Jacobsen S.J., Isaacs S.D., Walsh P.C., Zheng S.L., Chang B.L., Friedrichsen D.M., Stanford J.L., Ostrander E.A., Chinnaiyan A.M., Rubin M.A., Xu J., Thibodeau S.N., Friedman S.L., Martignetti J.A.: A germline DNA polymorphism enhances alternative splicing of the KLF6 tumor suppresor gene and is associated with increased prostate cancer risk. Cancer Res., 2005; 65: 1213-1222
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[60] Narla G., DiFeo A., Yao S., Banno A., Hod E., Reeves H.L., Qiao R.F., Camacho-Vanegas O., Levine A., Kirschenbaum A., Chan A.M., Friedman S.L., Martignetti J.A.: Targeted inhibition of the KLF6 splice variant, KLF6 SV1, suppresses prostate cancer cell growth and spread. Cancer Res., 2005; 65: 5761-5768
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[61] Navaratnam D.S., Bell T.J., Tu T.D., Cohen E.L., Oberholtzer J.C.: Differential distribution of Ca²⁺-activated K⁺ channel splice variants among hair cells along the tonopic axis of the chick cochlea. Neuron, 1997; 19: 1077-1085
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[62] Nicholls C.D., Shields M.A., Lee P.W., Robbins S.M., Beattie T.L.: UV-dependent alternative splicing uncoples p53 activity and PIG3 gene function through rapid proteolytic degradation. J. Biol. Chem., 2004; 279: 24171-24178
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[63] Nilsen T.W.: The spliceosome: the most complex macromolecular machine in the cell? Bioessays, 2003; 25: 1147-1149
[PubMed]  

[64] Nilsen T.W., Graveley B.R.: Expansion of the eukariotic proteome by alternative splicing. Nature, 2010; 463: 457-463
[PubMed]  

[65] Nissim-Rafinia M., Kerem B.: Splicing regulation as a potential genetic modifier. Trends. Genet., 2002; 18: 123-127
[PubMed]  

[66] Nowak K.J., Davies K.E.: Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO Rep., 2004; 5: 872-876
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[67] Okazaki Y., Furuno M., Kasukawa T., Adachi J., Bono H., Kondo S., Nikaido I., Osato N., Saito R., Suzuki H., Yamanaka I., Kiyosawa H., Yagi K., Tomaru Y., Hasegawa Y., Nogami A., Schönbach C., Gojobori T., Baldarelli R., Hill D.P., Bult C., Hume D.A., Quackenbush J., Schriml L.M., Kanapin A., Matsuda H., Batalov S., Beisel K.W., Blake J.A., Bradt D., Brusic V., Chothia C., Corbani L.E., Cousins S., Dalla E., Dragani T.A., Fletcher C.F., Forrest A., Frazer K.S., Gaasterland T., Gariboldi M., Gissi C., Godzik A., Gough J., Grimmond S., Gustincich S., Hirokawa N., Jackson I.J., Jarvis E.D., Kanai A., Kawaji H., Kawasawa Y., Kedzierski R.M., King B.L., Konagaya A., Kurochkin I.V., Lee Y., Lenhard B., Lyons P.A., Maglott D.R., Maltais L., Marchionni L., McKenzie L., Miki H., Nagashima T., Numata K., Okido T., Pavan W.J., Pertea G., Pesole G., Petrovsky N., Pillai R., Pontius J.U., Qi D., Ramachandran S., Ravasi T., Reed J.C., Reed D.J., Reid J., Ring B.Z., Ringwald M., Sandelin A., Schneider C., Semple C.A., Setou M., Shimada K., Sultana R., Takenaka Y., Taylor M.S., Teasdale R.D., Tomita M., Verardo R., Wagner L., Wahlestedt C., Wang Y., Watanabe Y., Wells C., Wilming L.G., Wynshaw-Boris A., Yanagisawa M., Yang I., Yang L., Yuan Z., Zavolan M., Zhu Y., Zimmer A., Carninci P., Hayatsu N., Hirozane-Kishikawa T., Konno H., Nakamura M., Sakazume N., Sato K., Shiraki T., Waki K., Kawai J., Aizawa K., Arakawa T., Fukuda S., Hara A., Hashizume W., Imotani K., Ishii Y., Itoh M., Kagawa I., Miyazaki A., Sakai K., Sasaki D., Shibata K., Shinagawa A., Yasunishi A., Yoshino M., Waterston R., Lander E.S., Rogers J., Birney E., Hayashizaki Y., FANTOM Consortium, RIKEN Genome Exploration Research Group Phase I & II Team: Analysis of the mouse transctiptome based on functional annotation of 60,770 full-lenght cDNAs. Nature, 2002; 420: 563-573
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[68] Olivares-Illana V., Fahraeus R.: p53 isoforms gain functions. Oncogene, 2010; 29: 5113-5119
[PubMed]  

[69] Pagani F., Raponi M., Baralle F.E.: Synonymous mutations in CFTR exon 12 affect splicing and are not neutral in evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005; 102: 6368-6372
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[70] Pandaya-Jones A., Black D.L.: Co-transciptional splicing of constitutive and alternative exons. RNA, 2009; 15: 1896-1908
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[71] Pandit S., Wang D., Fu X.D.: Functional integration of transcription and RNA processing machineries. Curr. Opin. Cell Biol., 2008; 20: 260-265
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[72] Park J.W., Graveley B.R.: Complex alternative splicing. Adv. Exp. Med. Biol., 2007; 623: 50-63
[PubMed]  

[73] Pasqualini C., Guivarc’h D., Barnier J.V., Guibert B., Vincent J.D., Vernier P.: Differential subcellular distribution and transcriptional activity of sigmaE3, sigmaE4, and sigmaE3-4 isoforms of the rat estrogen receptor-alpha. Mol. Endocrinol., 2001; 15: 894-908
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[74] Prou D., Gu W.J., Le Crom S., Vincent J.D., Salamero J., Vernier P.: Intracellular retention of the two isoforms of the D(2) dopamine receptor promotes endoplasmic reticulum disruption. J. Cell Sci., 2001; 114: 3517-3527
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[75] Proudfoot N.: New perspectives on connecting messenger RNA 3′ end formation to transcription. Curr. Opin. Cell Biol., 2004; 16: 272-278
[PubMed]  

[76] Raharjo S.B., Emoto N., Ikeda K., Sato R., Yokoyama M., Matsuo M.: Alternative splicing regulates the endoplasmic reticulum localization or secretion of soluble secreted endopeptidase. J. Biol. Chem., 2001; 276: 25612-25620
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[77] Resch A., Xing Y., Alekseyenko A., Modrek B., Lee C.: Evidence for a subpopulation of conserved alternative splicing events under selection pressure for protein reading frame preservation. Nucleic Acids Res., 2004; 32: 1261-1269
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[78] Ritchie D.B., Schellenberg M.J., MacMillan A.M.: Spliceosome structure: piece by piece. Biochim. Biophys. Acta, 2009; 1789: 624-633
[PubMed]  

[79] Roberts G.C., Smith C.W.: Alternative splicing: combinatorial output from the genome. Curr. Opin. Chem. Biol., 2002; 6: 375-383
[PubMed]  

[80] Rodrigues N.R., Owen N., Talbot K., Ignatius J., Dubowitz V., Davies K.E.: Deletions in the survival motor neuron gene on 5q13 in autosomal recessive spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet., 1995; 4: 631-634
[PubMed]  

[81] Rodriguez-Lebron E., Paulson H.L.: Allele-specific RNA interference for neurological disease. Gene Ther., 2006; 13: 576-581
[PubMed]  

[82] Rosenblatt K.P., Sun Z.P., Heller S., Hudspeth A.J.: Distribution of Ca²⁺-activated K⁺ channel isoforms along the tonotopic gradient of the chicken’s cochlea. Neuron, 1997; 19: 1061-1075
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[83] Sanford J.R., Caceres J.F.: Pre-mRNA splicing: life at the centre of the dogma. J. Cell Sci., 2004; 117: 6261-6263
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[84] Schellenberg M.J., Ritchie D.B., MacMillan A.M.: Pre-mRNA splicing: a complex picture in higher definition. Trends Biochem. Sci., 2008; 33: 243-246
[PubMed]  

[85] Schmucker D., Chen B.: Dscam and DSCAM: complex genes in simple animals, complex animals yet simple genes. Genes Dev., 2009; 23: 147-156
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[86] Scholz H., Kirschner K.M.: Oxygen-dependent gene expression in development and cancer: lessons learned from the Wilm’s tumor gene, WT1. Front. Mol. Neurosci., 2011; 4: 4
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[87] Sharp P.A.: The discovery of split genes and RNA splicing. Trends Biochem. Sci., 2005; 30: 279-281
[PubMed]  

[88] Singh A., Karnoub A.E., Palmby T.R., Lengyel E., Sondek J., Der C.J.: Rac1b, a tumor associated, constitutively active Rac1 splice variant, promotes cellular transformation. Oncogene, 2004; 23: 9369-9380
[PubMed]  

[89] Slamon D.J., Godolphin W., Jones L.A., Holt J.A., Wong S.G., Keith D.E., Levin W.J., Stuart S.G., Udove J., Ullrich A., Press M.F.: Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer. Science, 1989; 244: 707-712
[PubMed]  

[90] Smoliński D.J., Wróbel B., Zienkiewicz K., Niedojadlo J.: Organizacja systemu splicingowego w komórkach linii generatywnej. Kosmos, 2003; 52: 481-492

[91] Sperling J., Azubel M., Sperling R.: Structure and function of the pre-mRNA splicing machine. Structure, 2008; 16: 1605-1615
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[92] Srebrow A., Kornblihtt A.R.: The connection between splicing and cancer. J. Cell Sci., 119: 2635-2641
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[93] Stamm S., Ben-Ari S., Rafalska I., Tang Y., Zhang Z., Toiber D., Thanaraj T.A., Soreq H.: Function of alternative splicing. Gene, 2005; 344: 1-20
[PubMed]  

[94] Stanek D., Neugebauer K.M.: The Cajal body: a meeting place for spliceosomal snRNPs in the nuclear maze. Chromosoma, 2006; 115: 343-354
[PubMed]  

[95] Stetefeld J., Ruegg M.A.: Structural and functional diversity generated by alternative mRNA splicing. Trends Biochem. Sci., 2005; 30: 515-521
[PubMed]  

[96] Sureau A., Gattoni R., Dooghe Y., Stevenin J., Soret J.: SC35 autoregulates its expression by promoting splicing events that destabilize its mRNAs. EMBO J., 2001; 20: 1785-1796
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[97] Taliaferro J.M., Alvarez N., Green R.E., Blanchette M., Rio D.C.: Evolution of a tissue-specific splicing network. Genes Dev., 2011; 25: 608-620
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[98] Tazi J., Bakkour N., Stamm S.: Alternative splicing and disease. Biochim. Biophys. Acta, 2009; 1792: 14-26
[PubMed]  

[99] Tijsterman M., Plasterk R.H.: Dicers at RISC; the mechanism of RNAi. Cell, 2004; 117: 1-3
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[100] Toor N., Keating K.S., Pyle A.M.: Structural insights into RNA splicing. Curr. Opin. Struct. Biol., 2009; 19: 260-266
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[101] Valadkhan S.: snRNAs as the catalysts of pre-mRNA splicing. Curr. Opin. Chem. Biol., 2005; 9: 603-608
[PubMed]  

[102] Wachtel C., Manley J.L.: Splicing of mRNA precursors: the role of RNAs and proteins in catalysis. Mol. Biosyst., 2009; 5: 311-316
[PubMed]  

[103] Wakiyama M., Imataka H., Sonenberg N.: Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus oocyte maturation. Curr. Biol., 2000; 10: 1147-1150
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[104] Wang G.S., Cooper T.A.: Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat. Rev. Genet., 2007; 8: 749-761
[PubMed]  

[105] Wang Z., Burge C.B.: Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. RNA, 2008; 14: 802-813
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[106] Ward A.J., Cooper T.A.: The pathobiology of splicing. J. Pathol., 2010; 220: 152-163
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[107] Wood C.M., Goodman P.A., Vassilev A.O., Uckun F.M.: CD95 (APO-1/FAS) deficiency in infant acute lymphoblastic leukemia: detection of novel soluble Fas splice variants. Eur. J. Haematol., 2003; 70: 156-171
[PubMed]  

[108] Wood M., Yin H., McClorey G.: Modulating the expression of disease genes with RNA-based therapy. PLoS Genet., 2007; 3: e109
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[109] Xu Q., Modrek B., Lee C.: Genome-wide detection of tissue-specific alternative splicing in the human transctiptome. Nucleic Acids Res., 2002; 30: 3754-3766
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[110] Zhang X.H., Chasin L.A.: Computational definition of sequence motifs governing constitutive exon splicing. Genes Dev., 2004; 18: 1241-1250
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[111] Zhu H., Guo W., Zhang J.J., Davis J.J., Teraishi F., Wu S., Cao X., Daniel J., Smythe W.R., Fang B.: Bcl-XL small interfering RNA suppresses the proliferation of 5-fluorouracil-resistant human colon cancer cells. Mol. Cancer Ther., 2005; 4: 451-456
[PubMed]  

[112] Zhu H., Guo W., Zhang L., Davis J.J., Wu S., Teraishi F., Cao X., Smythe W.R., Fang B.: Enhancing TRAIL-induced apoptosis by Bcl-X(L) siRNA. Cancer Biol. Ther., 2005; 4: 393-397
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[113] Zienkiewicz K., Niedojadło J.: Natura i funkcje ciał Cajala w świetle nowych badań. Post. Biol. Kom., 2004; 31: 313-327
[Abstract]  

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Full text