Streszczenie

W ostatnich latach systematycznie wzrasta zainteresowanie substancjami o właściwościach prze­ciwutleniających, które obniżają lub zapobiegają szkodliwemu wpływowi wolnych rodników na żywe tkanki, hamując m.in. proces starzenia oraz rozwój niektórych chorób. Celem niniejszej pracy jest dokonanie przeglądu nowych metod pozyskiwania przeciwutleniaczy pochodzenia roślinnego oraz tendencji badawczych w kierunku zwiększania ich ogólnej jakości i opłacalności produkcji na skalę przemysłową. Wśród omawianych zagadnień znalazły się metody z wykorzystaniem na­rzędzi inżynierii genetycznej roślin i mikroorganizmów. W pracy przedstawiono również krótką charakterystykę antyoksydantów oraz naturalne źródła ich występowania.
Ze względu na to, że szlaki biosyntezy flawonoidów i izoflawonoidów są prawdopodobnie najlepiej poznanymi szlakami biosyntezy naturalnych produktów roślinnych, przegląd osiągnięć ostatnich lat w zakresie inżynierii metabolicznej omówiono na przykładzie związków flawonowych. Przed­stawione modyfikacje szlaków biosyntezy flawonoidów dotyczyły zmian w poziomie ekspresji genów strukturalnych lub regulacyjnych, wyciszania genów konkurencyjnych lub też modyfika­cji właściwości katalitycznych enzymów za pomocą technik inżynierii białek. W pracy przedsta­wiono także dokonania inżynierii mikroorganizmów w zastosowaniu procesów fermentacyjnych jako źródła specyficznych związków flawonowych, poprzez konstrukcję szlaku biosyntezy feny­lopropanoidów w komórkach drobnoustrojów, takich jak bakterie E. coli czy drożdże piekarskie S. cerevisiae. Oba podejścia mogą znaleźć zastosowanie w produkcji flawonoidów atrakcyjnych pod względem aplikacyjnym.

Słowa kluczowe:przeciwutleniacze • flawonoidy • inżynieria genetyczna

Summary

In recent years there has been growing interest in substances with antioxidative properties, which reduce or prevent harmful effects of free radicals on living tissues, and inhibit aging processes and the development of certain diseases. The objective of this paper is to review new methods of obtaining antioxidants of plant origin and new trends in research aiming to impro­ve their quality and profitability on an industrial scale. Among the issues discussed, there are the methods that use techniques of plant and microbial genetic engineering. A brief descrip­tion of antioxidants and natural sources of their occurrence is also presented in this paper.
In view of the fact that the biosynthesis of flavonoids and isoflavonoids is probably the best-known metabolic pathway of natural plant products, the review of achievements of recent years in the field of metabolic engineering was shown with the example of flavonoids. The modifications of flavonoid biosynthetic pathways were related to changes in the expression level of structural or regulatory genes, silencing of competitive genes or modifying catalytic properties of enzymes using techniques of protein engineering. The paper also presents the achievements of micro­organism engineering in the field of application of fermentation processes as a source of spe­cific flavonoid compounds, which was possible by designing the phenylpropanoid biosynthetic pathway in cells of microorganisms such as the bacterium E. coli or S. cerevisiae, baker’s yeast. Both approaches can be used in the production of flavonoids attractive in terms of application.

Key words:antioxidants • flavonoids • genetic engineering

Wstęp

Tlen jest niezbędny do życia wszystkim tlenowym organi­zmom żywym, ale od kilku dziesięcioleci wiadomo także, że gdy jego stężenie w organizmie jest zbyt wysokie, może stać się toksyczny dla komórek żywych. Cząsteczka tlenu w sta­nie podstawowym jest stosunkowo nieaktywna chemicz­nie, ale może być źródłem reaktywnych form tlenu (RFT), takich jak: tlen singletowy (¹O₂), anionorodnik ponadtlen­kowy (O₂^–), rodnik hydroksylowy (OH^•), nadtlenek wodoru (H₂O₂) itp. [47].

Reaktywne formy tlenu (RFT) oraz reaktywne formy azo­tu (RFA) spełniają ważne funkcje fizjologiczne w warun­kach homeostazy. Uwalniane w niskich stężeniach pełnią rolę regulatorów i mediatorów wielu reakcji w komórce, np.: regulują odpowiedź komórkową na szkodliwe czyn­niki zewnętrzne, biorą udział w prawidłowym funkcjono­waniu szlaków sygnałowych, indukują działanie czynni­ków mitogennych [72], a także regulują procesy starzenia i apoptozy oraz biorą udział w prawidłowej odpowiedzi immunologicznej [14]. Wymienione funkcje zależą jednak w dużej mierze od prawidłowego stosunku między samy­mi RFT i RFA, a złożonymi systemami antyoksydacyjny­mi. W chwili zachwiania tej równowagi wzrasta poziom czynników utleniających w komórkach, co prowadzi do tzw. stresu oksydacyjnego. Stres oksydacyjny wywoływa­ny jest przez tleno- i azotopochodne rodniki (reaktywne cząsteczki chemiczne zawierające niesparowane elektro­ny) powstające w wyniku metabolizmu komórki, głównie podczas oddychania komórkowego zachodzącego w mito­chondriach. Stan ten może prowadzić do uszkodzeń orga­nelli komórkowych [54], uszkodzenia cząsteczek DNA oraz zaburzeń w funkcjonowaniu szlaków metabolicznych [36].

Rodniki mogą być generowane zarówno poprzez czyn­niki egzogenne, w tym na przykład: promieniowanie jonizujące, ksenobiotyki, toksyny zawarte w powietrzu oraz czynniki endogenne: oddychanie komórkowe, „wy­buchy tlenowe” fagocytów podczas procesu zapalnego i inne [6]. Szczególną uwagę badaczy skupia grupa re­aktywnych form tlenu, których nadmierne wytwarza­nie ma największy udział w powstawaniu stresu oksy­dacyjnego i związanych z nim stanów chorobowych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, choroby nowotworowe, miażdżyca tętnic [47], a także zawał mię­śnia sercowego oraz choroby neurodegeneracyjne [36]. Wspomniane wyżej reaktywne formy tlenu, czyli anio­norodnik ponadtlenkowy, nadtlenek wodoru oraz rod­nik hydroksylowy powstają w procesie redukcji tlenu cząsteczkowego w mitochondriach [6].

W odpowiedzi na wzrastające zagrożenie komórek organizmów żywych ze strony rodników został wy­kształcony antyoksydacyjny mechanizm obronny, któ­ry dzieli się zasadniczo na dwa systemy: enzymatyczny i nieenzymatyczny. Mechanizm enzymatyczny opiera się na enzymach antyoksydacyjnych, takich jak dysmu­taza ponadtlenkowa, peroksydaza glutationowa i kata­laza, natomiast na system nieenzymatyczny składają się niskocząsteczkowe przeciwutleniacze: kwas askor­binowy, α-tokoferol, glutation, karotenoidy, flawono­idy i inne [73].

Rośliny i zwierzęta utrzymują w swoich komórkach środowisko redukujące za pomocą przeciwutleniaczy, które neutralizują rodniki, przekształcając je w mniej aktywne pochodne, opóźniając lub zatrzymując całko­wicie proces utleniania. Przeciwutleniacze pełnią rolę inhibitorów procesu utleniania, stąd bierze się ich zna­cząca rola w walce o przywrócenie i utrzymanie home­ostazy organizmu [47]. Nauki o żywności definiują an­tyoksydant jako substancję, której obecność w niskich stężeniach, w porównaniu do substratu podatnego na utlenianie, znacząco obniża lub zapobiega szkodliwemu wpływowi wolnych rodników na ludzkie tkanki [29].

Klasyfikacja przeciwutleniaczy i charakterystyka ich działania

Termin „przeciwutleniacz” może odnosić się do każdej cząsteczki zdolnej do związania rodnika, zanim dojdzie do uszkodzenia komórki [58]. Możemy wyróżnić prze­ciwutleniacze enzymatyczne (endogenne) i nieenzyma­tyczne (egzogenne). Główną rolę w obronie organizmu przed rodnikami, a przez to w utrzymaniu homeosta­zy, pełnią przeciwutleniacze pochodzenia endogenne­go [67].

Niezależnie od poprzedniego podziału związki o wła­ściwościach przeciwutleniających można sklasyfiko­wać „alfabetycznie” w dziewięciu kategoriach (tab. 1) w zależności od ich struktury, występowania, rozpusz­czalności (w wodzie i tłuszczach) oraz kinetyki reakcji, w których biorą udział [17].

Tabela 1. Klasyfikacja alfabetyczna przeciwutleniaczy [17]

Przeciwutleniacze enzymatyczne

Główną rolę w zwalczaniu wolnych rodników w organi­zmie pełnią przeciwutleniacze endogenne, najczęściej enzymy. Jednym z najwydajniejszych przeciwutleniaczy enzymatycznych jest dysmutaza ponadtlenkowa (SOD, EC 1.15.1.1), która katalizuje reakcję rozkładu aniono­rodników ponadtlenkowych do tlenu cząsteczkowego i nadtlenku wodoru. Występuje ona w kilku izoformach, które różnią się od siebie m.in. budową centrum aktyw­nego czy obecnością różnych kofaktorów [41].

Kolejnym enzymem jest katalaza (EC 1.11.1.6) wystę­pująca w peroksysomach komórek roślin, zwierząt oraz bakterii tlenowych i odpowiadająca za rozkład nadtlen­ku wodoru do tlenu cząsteczkowego i wody. Reakcje z jej udziałem charakteryzują się dużą szybkością – jedna cząsteczka katalazy może przekształcić nawet 6 milio­nów cząsteczek nadtlenku wodoru w ciągu minuty [40].

Następnym ważnym elementem systemu chroniącego komórkę przed atakiem wolnych rodników są reakcje związane z metabolizmem glutationu (GSH), w których uczestniczy peroksydaza glutationowa (GPx), występu­jąca w dwóch izoformach: selenozależnej (EC 1.11.1.19, dye decolorizing peroxidase) i selenoniezależnej (EC 2.5.1.18, glutathione transferase). W obecności glutatio­nu enzym ten katalizuje przeniesienie dwóch elektro­nów na cząsteczkę nadtlenku wodoru, w wyniku czego dochodzi do rozkładu nadtlenku do cząsteczki wody oraz do utlenienia cząsteczek glutationu (GSH) [40].

Zarówno katalaza jak i peroksydaza są enzymami wy­korzystującymi jako substrat nadtlenek wodoru, jednak to peroksydaza glutationowa jest dominującym czynni­kiem w enzymatycznej ochronie przeciwrodnikowej [9].

Przeciwutleniacze nieenzymatyczne

Działanie przeciwutleniaczy enzymatycznych wspoma­ga grupa małocząsteczkowych związków nieenzyma­tycznych, głównie metabolitów wtórnych (drugorzędo­wych), wykazujących właściwości przeciwutleniające. Do tej grupy należą m.in. witamina C, witamina E, glu­tation, kwas α-liponowy, melatonina, karotenoidy oraz flawonoidy. Część przeciwutleniaczy, które szczególnie łatwo ulegają utlenieniu, może wchodzić w rekcję z in­nymi antyoksydantami, przywracając ich pierwotne właściwości np. witamina C wzmacnia działanie wita­miny E, tworząc tzw. „sieć przeciwutleniaczy” [60,67].

Witamina C (kwas askorbinowy, ryc. 1) jest rozpusz­czalnym w wodzie przeciwutleniaczem o dużej efek­tywności działania. W walce z rodnikami współdziała z witaminą E i karotenoidami [58], biorąc udział w re­generacji α-tokoferolu, redukując jego utlenioną postać znajdującą się w błonach komórkowych oraz lipoprote­inach [38]. Ponadto podnosi stężenie wewnątrzkomór­kowego glutationu, który chroni grupy tiolowe białek przed utlenianiem [52]. Dzięki szybkiemu transferowi elektronów witamina C zmiata RFT (reaktywne formy tlenu), zapobiegając utlenianiu lipidów [32].

Ryc. 1. Przeciwutleniacze nieenzymatyczne

Witamina E występuje w ośmiu izoformach, z których najbardziej aktywną, spotykaną u ludzi, jest związany z błoną komórkową α-tokoferol (ryc. 1) [25]. Głównym zadaniem witaminy E jest ochrona komórki przed utle­nianiem lipidów [56]. Mechanizm tej reakcji polega na przenoszeniu atomu wodoru z cząsteczki α-tokoferolu na cząsteczkę tłuszczu. Powstaje wówczas postać utle­niona α-tokoferolu, która może zostać zredukowana przez kwas askorbinowy [38].

Najważniejszym i powszechnie występującym w komór­kach nieenzymatycznym przeciwutleniaczem jest gluta­tion (GSH, ryc. 1). Jest to tripeptyd zbudowany z kwasu glutaminowego, cysteiny i glicyny, występujący w cy­tosolu, jądrze komórkowym i mitochondriach [48]. Ze względu na budowę zalicza się go do przeciwutleniaczy tiolowych, które swoje antyoksydacyjne właściwości zawdzięczają obecności grupy -SH w cząsteczce [34]. Glutation jest kofaktorem enzymów biorących udział w metabolizmie ksenobiotyków, ponadto uczestniczy w transporcie aminokwasów przez błony, zmiata rodni­ki wodorotlenowe oraz redukuje witaminy C i E do ich aktywnych form [48]. Utleniona cząsteczka glutationu (GSSG) jest akumulowana w komórkach, stąd stosunek postaci zredukowanej glutationu (GSH) do utlenionej (GSSG) jest dobrym wyznacznikiem stresu oksydacyj­nego [14].

Kolejnym przeciwutleniaczem tiolowym jest kwas α-liponowy (LA, ryc. 1). Ze względu na rozpuszczal­ność w wodzie oraz w tłuszczach kwas ten występuje w błonach oraz cytosolu komórek prokariotycznych i eukariotycznych. Kwas α-liponowy łatwo wchłania się z pożywieniem i jest szybko przekształcany w po­stać zredukowaną – kwas dihydroliponowy (DHLA) [68]. Obie postaci są silnymi przeciwutleniaczami, które zmiatają rodniki, chelatują jony metali, redukują inne przeciwutleniacze, a także przywracają białkom funk­cjonalność, utraconą na skutek stresu oksydacyjnego [45,51].

Następnym antyutleniaczem nieenzymatycznym, o sze­rokim zakresie działania w organizmie jest neurohor­mon melatonina (ryc. 1), której wytwarzaniem kieruje szyszynka. Jedną z najważniejszych funkcji tego neuro­hormonu jest ochrona organizmu przed uszkodzenia­mi DNA, błon komórkowych i białek [57]. Melatonina w odróżnieniu od pozostałych przeciwutleniaczy nie ulega regeneracji [39], stąd bywa nazywana przeciwu­tleniaczem „samobójcą” lub przeciwutleniaczem koń­cowym [70].

Dużą grupę antyoksydantów stanowią karotenoidy, mo­gące przeciwdziałać lub hamować rozwój niektórych nowotworów, miażdżycy czy chorób degeneracyjnych mięśni [17]. Funkcja przeciwutleniająca tej grupy związ­ków wynika z obecności w ich strukturze sprzężonego układu wiązań podwójnych (β-karoten, ryc. 1). Taka bu­dowa sprzyja delokalizacji niesparowanych elektronów w łańcuchu [49], dzięki czemu karotenoidy są zdolne do „wyłapywania” tlenu singletowego oraz do reago­wania z rodnikami nadtlenkowymi, wodorotlenowymi i ponadtlenkowymi. Ponadto wykazują działanie prze­ciwproliferacyjne [17].

Ostatnią opisywaną grupę przeciwutleniaczy stanowią flawonoidy, których podstawowy szkielet opiera się na strukturze 2- lub 3-fenylochromen-4-onu albo 2-feny­lochromanu (ryc. 2) [4]. Zależnie od modyfikacji struk­turalnych w tej grupie związków rozróżniamy flawony (luteolina), flawanony (hesperetina), izoflawony (geni­steina), flawonole (kwercytyna), flawanole, (katechina) i antocyjanidyny (delfinidyna) [4], przy czym te dwie ostatnie grupy flawonoidów zawierają szkielet bez gru­py ketonowej w pozycji 4.

Ryc. 2. Flawonoidy – ogólna struktura i przykłady

W organizmach roślinnych flawonoidy odpowiadają za pigmentację kwiatów, owoców i łodyg [4], działają prze­ciwbakteryjnie oraz chronią przed insektami, a wystę­wystę­pują najczęściej w postaci glikozydów. Pierwszym eta­pem metabolizmu tych związków, jest deglikozylacja, po której mogą nastąpić hydroksylacja, metylowanie, sulfonowanie lub glukuronowanie [58]. Właściwości przeciwutleniające flawonoidów opierają się na ich zdolności do przerywaniu łańcuchowych reakcji rod­nikowych [59] oraz chelatowaniu jonów metali [63], a wynikają z obecności kilku grup fenolowych w czą­steczce. Związki te uchodzą za idealne „zmiatacze” rodników nadtlenkowych oraz inhibitory peroksydacji lipidów [55].

Roślinne źródła związków o właściwościach przeciwutleniających

Naturalne źródła antyoksydantów

Dieta obfitująca w produkty pochodzenia roślinnego odgry­wa ważną rolę w profilaktyce wielu chorób, takich jak cu­krzyca, miażdżyca tętnic, choroba Alzheimera czy choroba Parkinsona. Prozdrowotne właściwości żywności wynikają m.in. z dużej zawartości związków przeciwutleniających, m.in. polifenoli, witaminy C, E, A, karotenoidów, kwasów organicznych oraz selenu [69]. Jednym z głównych źródeł substancji o silnych właściwościach antyoksydacyjnych są owoce, wśród których na szczególną uwagę zasługują owoce jagodowe obfitujące w antocyjany i taniny (tab. 2).

Największą zawartością antyoksydantów spośród owoco­wych produktów przetworzonych odznaczają się wina. Obecne w nich naturalne przeciwutleniacze, głównie fla­wonoidy, wpływają hamująco na utlenianie tłuszczów (również tych obecnych w LDL) oraz są inhibitorami enzy­mów oksydacyjnych. Badania aktywności przeciwutlenia­jącej związków zawartych w winach wykazały, że jest ona najwyższa w winach czerwonych, mniejsza w winach różo­wych i najniższa w winach białych (odpowiednio 6-krotnie i 17-krotnie w stosunku do win czerwonych) [73].

Warzywa również stanowią bogate źródło związków przeciwutleniających, jednak ich zawartość jest znacznie mniejsza niż w wspomnianych wcześniej owocach (tab. 2). Największą zdolnością neutralizacji rodników nad­tlenkowych odznaczają się substancje zawarte w czosnku, natomiast jarmuż i brukselka najlepiej redukują rodniki hydroksylowe (tab. 3) [28].

Tabela 2. Zawartość przeciwutleniaczy oraz aktywność antyoksydacyjna owoców jagodowych [35]

Tabela 3. Aktywność przeciwutleniaczy zawartych w wybranych gatunkach warzyw [7]

W grupie warzyw istotną rolę jako źródło przeciwutle­niaczy spełnia pomidor ze względu na zawarty w nim likopen. Wykazuje silne działanie antyoksydacyjne wy­nikające z obecności w cząsteczce sprzężonego układu jedenastu wiązań podwójnych. Również przetwory po­midorowe są dobrym źródłem tego barwnika, ponieważ procesy technologiczne nie zmniejszają jego zawartości w tych produktach [27].

Kolejnym roślinnym źródłem charakteryzującym się dużą zawartością przeciwutleniaczy są nasiona roślin strączko­wych, zwłaszcza soi, której nasiona wykazują duże zróżni­cowanie jakościowe i ilościowe izoflawonów [69], są to m.in. glikozydy flawonoli, katechiny, antocyjanidyny, izoflawo­noidy oraz kwasy fenolowe, których największa koncen­tracja występuje w okrywach nasiennych tej rośliny [71].

Produkty zbożowe charakteryzują się na ogół mniejszą zawartością przeciwutleniaczy aniżeli owoce czy warzy­wa. Antyoksydanty powszechnie występujące w tej grupie produktów to: kwasy fenolowe, lignany, witamina E, pier­wiastki śladowe pełniące funkcje kofaktorów przeciwutle­niaczy enzymatycznych (Se, Cu, Zn oraz Mn), glutation, a także melatonina [85].

Istotnym źródłem tokoferoli są nasiona roślin oleistych. Tokoferole znajdują się w różnych stężeniach we wszyst­kich tłuszczach pochodzenia roślinnego. W tej grupie pro­duktów największą zawartością tokoferoli odznacza się olej z zarodków pszennych oraz bardziej popularne oleje – sojowy i kukurydziany [46].

Szczególnie dużą zawartością substancji o właściwo­ściach przeciwutleniających charakteryzuje się herbata ze względu na obecność związków fenolowych, których zawartość w liściach może sięgać 35% suchej masy. Są to w głównej mierze katechiny, teaflawiny oraz tearubiginy [75]. Rodzaj i ilość antyoksydantów zawartych w herbacie zależy od jej typu, w zielonej herbacie głównymi anty­utleniaczami są katechiny, natomiast w czarnej herba­cie i herbacie oolong dominują teaflawiny i tearubiginy, które powstają w procesie fermentacji liści. Aktywność katechin wyizolowanych z zielonej herbaty dorównuje aktywności syntetycznych przeciwutleniaczy, np. buty­lowany hydroksyanizol (BHA) czy butylowany hydrok­sytoluen (BHT) [81]. Związki antyutleniające obecne są również w ziołach i przyprawach [66].

Zastosowanie inżynierii genetycznej i metabolicznej roślin w syntezie flawonoidów

Modyfikacje genetyczne szlaków biosyntezy wtórnych metabolitów roślinnych znajdują się w centrum zainte­resowań biotechnologów roślin. Wynika to z tego, że syn­teza chemiczna niektórych metabolitów, w związku ze stopniem ich złożoności, jest nie tylko trudna, ale rów­nież kosztowna i mało wydajna. Metody inżynierii ge­netycznej i metabolicznej wychodzą naprzeciw potrze­bom zwiększania zawartości różnych metabolitów, w tym flawonoidów, poprzez zmiany poziomu ekspresji genów endogennych lub egzogennych w gatunkach roślin użyt­kowych [20].

Szczególne zainteresowanie flawonoidami wynika z ich szerokiego działania prozdrowotnego. Sukcesywnie przybywa dowodów naukowych potwierdzających ich działanie przeciwutleniające, przeciwnowotworowe, przeciwmiażdżycowe i przeciwzapalne. Niestety spo­żywane rośliny uprawne często nie zawierają flawono­idów lub zawierają tylko niewielkie ich ilości [18], stąd istnieje potrzeba sięgania po narzędzia inżynierii gene­tycznej w celu podwyższania zawartości w komórkach roślinnych.

Szlaki biosyntezy flawonoidów i izoflawonoidów są prawdopodobnie najlepiej poznanymi szlakami biosyn­tezy naturalnych produktów roślinnych, m.in. dlatego związki flawonowe są przedmiotem licznych badań w za­kresie inżynierii metabolicznej. Modyfikacje szlaków biosyntezy flawonoidów mogą dotyczyć zmian w pozio­mie ekspresji genów strukturalnych lub regulacyjnych, wyciszania genów konkurencyjnych lub też modyfikacji właściwości katalitycznych enzymów za pomocą tech­nik inżynierii białek [13]. Inżynieria metaboliczna roślin uprawnych i modelowych skupia się w głównej mierze na zwiększaniu zawartości flawonoidów w surowcach roślinnych, natomiast inżynieria mikroorganizmów rzu­ca nowe światło na procesy fermentacyjne jako źródło specyficznych związków flawonowych wytwarzanych w kontrolowanych warunkach poprzez konstrukcję szla­ku biosyntezy fenylopropanoidów w komórkach drob­noustrojów. Oba podejścia mogą znaleźć zastosowanie w produkcji atrakcyjnych pod względem medycznym flawonoidów [78].

Rozwój inżynierii metabolicznej flawonoidów i innych związków chemicznych opiera się na kilku rozwiązaniach [13,16,77]. Po pierwsze, aby zwiększyć zawartość intere­sujących metabolitów w organizmie gospodarza należy doprowadzić do nadekspresji enzymów limitujących ich wytwarzanie lub doprowadzić do ekspresji w organizmie gospodarza enzymów nieulegających inhibicji. Większość przemysłowo wykorzystywanych mikroorganizmów nie zawiera endogennego szlaku biosyntezy flawonoidów, dlatego niezbędne jest wprowadzenie roślinnych genów kodujących konkretne enzymy [13,16].

Drugi kierunek modyfikacji ma na celu pokonanie barier regulatorowych przez modyfikacje w aparacie trans­krypcyjnym i translacyjnym. W przypadku roślin udało się zmodyfikować kilka szlaków metabolicznych dzięki identyfikacji swoistych czynników transkrypcyjnych i ich nadekspresji. Rozpoznawanie czynników trans­krypcyjnych nadal jest problemem badawczym, które­go rozwiązanie jest niezbędne do zwiększenia ekspresji transgenów [16].

Kierunek przemian w danym szlaku metabolicznym może być przewidywany i wybierany dzięki analizom trans­kryptomicznym i metabolicznym całego genomu bądź jego konkretnej części. W ostatnim czasie takie analizy okazały się potężnym narzędziem w identyfikacji nie­znanych wcześniej konkurujących szlaków. W efekcie nadekspresja wybranych genów bądź inhibicja konku­rencyjnych szlaków prowadzi do zwiększonej produkcji pożądanych produktów [16,18,26].

Ostatnim rozwiązaniem stosowanym przez inżynierię metaboliczną jest kontrola mechanizmów transportu i magazynowania produktów zarówno u roślin jak i mi­kroorganizmów [78]. Ważną rolę w tym podejściu pełnią swoiste transportery drugorzędowych metabolitów, które oprócz przenoszenia produktów syntezy między organel­lami oraz między środowiskiem wewnątrzkomórkowym a zewnątrzkomórkowym, pozwalają na magazynowanie produktów w dużych stężeniach bez jednoczesnego efek­tu toksycznego, a także odpowiadają za zachowanie kie­runku biosyntezy, odprowadzając produkty reakcji z miej­sca ich powstawania [84].

Szlak biosyntezy flawonoidów

Flawonoidy są produktami dobrze poznanego szlaku syntezy związków fenylopropanowych (ryc. 3). Sklo­nowano wiele ze strukturalnych genów tego szlaku oraz część genów regulatorowych z kilku roślin mo­delowych, takich jak kukurydza, wyżlin większy, tytoń, petunia czy rzodkiewnik pospolity [26], a ich ekspresji dokonano w zmodyfikowanych genetycznie roślinach modelowych i mikroorganizmach [13,17]. Dzisiejsze standardowe narzędzia biologii molekularnej wystar­czają, by modyfikować genetycznie kilka ważnych ro­ślin uprawnych, tj. kukurydzę, ziemniaka, buraka cu­krowego i pszenicę [65].

Ryc. 3. Szlak biosyntezy flawonoidów [3]. ANS, syntaza antocyjanowa; CHI, izomeraza chalkonowa; CHS, syntaza chalkonowa; DFR, reduktaza dihydroflawonolowa; F3H, flawanon-3-hydroksylaza (EC 1.14.11.9); F3’H, flawanon-3′-hydroksylaza (EC1.14.13.21); F3’5’H, flawanon-3’5′-hydroksylaza (EC 1.14.13.88); FLS, syntaza flawonolowa (EC 1.14.11.23); PAL, liaza fenyloalaninowa; 4CL, ligaza 4-kumaroilo-CoA (EC 6.2.1.12); C4H, 4-hydroksylaza kwasu cynamonowego (EC 1.14.13.11)

Pierwsze trzy etapy szlaku fenylopropanowego są kata­lizowane przez amoniakoliazę fenyloalaninową (PAL, EC 4.3.1.24), 4-hydroksylazę kwasu cynamonowego (C4H) i li­gazę 4-kumaroilo-CoA (4CL, EC 6.2.1.12). PAL odpowiada za deaminację fenyloalaniny do kwasu cynamonowego, C4H katalizuje utlenianie kwasu cynamonowego do kwasu 4-kumarowego, który z kolei jest konwertowany przez 4CL do 4-kumaroilo-CoA. Następnym etapem jest kondensacja czterech cząsteczek 4-kumaroilo-CoA z trzema cząstecz­kami malonylo-CoA, co umożliwia otrzymanie chalkonu naringeniny. Reakcja ta jest katalizowana przez syntazę chalkonową (CHS, EC 2.3.1.74). Zamknięcie pierścienia ka­talizowane izomerazą chalkonową (CHI, EC 5.5.1.6) skut­kuje syntezą naringeniny, która jest prekursorem dużej liczby flawonoidów [78].

We współczesnych badaniach można wyróżnić cztery spo­soby modyfikacji szlaku biosyntezy flawonoidów:
• z udziałem genów regulatorowych,
• modyfikacje genów strukturalnych,
• blokowanie specyficznych etapów szlaku za pomocą RNAi (interferencyjnego RNA o dwuniciowej strukturze),
• wytwarzanie flawonoidów przez wprowadzanie nowych ścieżek szlaku.

Modyfikacje ekspresji genów regulatorowych

O ostatecznej zawartości drugorzędowych metabolitów w komórkach roślinnych decyduje poziom transkryp­cji właściwych genów strukturalnych. Swoiste czynni­ki transkrypcyjne, które reagują z regionem promoto­rowym danego genu, zmieniają poziom jego ekspresji, a zatem odgrywają istotną rolę w biosyntezie metaboli­tów [59]. Czynniki transkrypcyjne regulujące ekspresję wybranych genów szlaku fenylopropanowego zidentyfi­kowano u wielu roślin [26]. Kontrola genów regulatoro­wych tego szlaku wydaje się bardzo zależna od rodzaju tkanki, sygnałów wewnętrznych (np. hormonalnych) i sygnałów zewnętrznych (np. promieniowania ultra­fioletowego) [76]. Za regulację genów strukturalnych szlaku biosyntezy flawonoidów odpowiadają w znacz­nym stopniu czynniki transkrypcyjne z rodziny C1 lub rodziny R. Mogą one kontrolować nawet kilka genów strukturalnych szlaku flawonoidowego [24,37].

Do najlepiej scharakteryzowanych genów regulatoro­wych należą gen C1 (colorless) z kukurydzy i gen Lc (leaf color) należący do rodziny genów kodujących czynniki transkrypcyjne typu R. Nadekspresja obu genów w kul­turach komórkowych kukurydzy spowodowała indukcję całego szlaku biosyntezy flawonoidów [23]. Geny podda­wano ektopowej ekspresji u takich roślin jak np. tytoń, rzodkiewnik pospolity [44], petunia [5] i pomidor [22]. Nadekspresja genów Lc i C1 kukurydzy u pomidora, któ­ry wytwarza i akumuluje jedynie niewielkie ilości kem­ferolu i kwercetyny, skutkowała zwiększonym wytwa­rzaniem kemferolu zarówno w skórce, jak i w miąższu (nawet o 60%) [18]. Ekspresja genów Lc i C1 u ziemniaka również doprowadziła do zwiększonej akumulacji kem­ferolu w jego bulwach [18]. Wprowadzenie do tytoniu i ryżu genu Lc zaowocowało zwiększoną akumulacją an­tocyjanów [21,44]. W przypadku tytoniu i rzodkiewnika pospolitego ekspresja jedynie genu R skutkowała zwięk­szeniem zawartości antocyjanów w tkankach pierwot­nie go wytwarzających, natomiast ekspresja genu C1 nie miała żadnego wpływu na cechy fenotypowe roślin transgenicznych. Co ciekawe w przypadku ekspresji obu wspomnianych genów zaobserwowano u rzodkiewni­ka pospolitego akumulację antocyjanów w tkankach, w których one nie występują [44]. U transgenicznego pomidora nadekspresja genów Lc i C1 zaowocowała nie­mal 20-krotnie wyższą zawartością flawonoli w owocu w porównaniu do owoców odmiany dzikiej. Ektopowa ekspresja genów Lc i C1 może prowadzić nie tylko do zwiększonego wytwarzania antocyjanów, ale także in­nych klas flawonoidów (ryc. 4) [3].

Ryc. 4. Wpływ genów regulatorowych Lc i C1 pomidora na szlak biosyntezy flawonoidów [3]. Pogrubione strzałki reprezentują natywny szlak biosyntezy flawonoidów w skórce pomidora. Po ekspresji czynników transkrypcyjnych Lc (leaf color) i C1 (colorless) zaobserwowano zwiększoną biosyntezę flawonoidów w miąższu

Ekspresja cDNA genu Lc w petunii, znajdującego się pod kontrolą promotora wirusa mozaiki kalafiora, skutkowała nadmiernym wytwarzaniem antocyjanów głównie w li­ściach. Obecność tego genu zwiększyła wydajność szlaku biosyntezy flawonoidów w tej roślinie na skutek nade­kspresji genów strukturalnych opisywanego szlaku [5,12].

Powyższe przykłady pokazują, że kontrola akumulacji produktów szlaków metabolicznych u roślin na poziomie molekularnym może odbywać się na etapie transkrypcji, a podejście to daje obiecujące rezultaty u kilku różnych gatunków organizmów roślinnych [74].

Modyfikacje związane z genami strukturalnymi

Badania związane z nadekspresją i wyciszaniem genów głównych enzymów związanych ze szlakiem biosyntezy flawonoidów roślin wykazały, że są to skuteczne metody zwiększania zawartości flawonoidów w materiale roślin­nym [16]. W przypadku pomidora głównym związkiem flawonowym jest chalkon naringeniny, produkt reakcji katalizowanej przez syntazę chalkonową (CHS), groma­dzący się w skórce w czasie dojrzewania w odpowiedzi na wzrost ekspresji genu kodującego CHS. W skórce pomi­dora oprócz chalkonu naringeniny gromadzona jest rów­nież rutyna. Izomeraza chalkonowa (CHI) bierze udział w transformacji chalkonu naringeniny do naringeniny, a reakcja ta stanowi etap ograniczający syntezę rutyny u pomidora. Ektopowa ekspresja genu kodującego CHI z petunii skutkowała zniesieniem tej blokady prowadząc do 70-krotnego wzrostu zawartości flawonoidów w skórce owocu pomidora [50].

W literaturze znane są także inne przykłady modyfikacji ekspresji genów strukturalnych szlaku syntezy flawono­idów. W celu zwiększenia stężenia flawonoidów w miąż­szu owocu pomidora, do jego komórek wprowadzono konstrukt składający się z czterech genów petunii. Jed­noczesna ekspresja genów kodujących enzymy CHS (syn­tazę chalkonową EC 2.3.1.74), CHI (izomerazą chalkonową, EC 5.5.1.6), F3H (flawanon-3-hydroksylazę, EC 1.14.11.9) i FLS (syntazę flawonolową, EC 1.14.11.23) przyczyniła się do zwiększenia akumulacji flawonoli zarówno w skórce, jak i miąższu pomidora [11].

Z kolei ekspresja u rzodkiewnika pospolitego genu kodu­jącego amoniakoliazę tyrozynową (TAL), enzymu który u niektórych roślin i bakterii katalizuje reakcję przemia­ny tyrozyny bezpośrednio do kwasu 4-kumarowego [77], doprowadziła do zwiększonej akumulacji antocyjanów oraz flawonoidów, a także innych fenylopropanoidów w tkankach [53].

Ważną klasą flawonoidów są izoflawony, które mogą dzia­łać jak fitoestrogeny. Izoflawony (ryc. 5) wzbudziły zain­teresowanie środowisk medycznych w związku z ich po­tencjalnym wykorzystaniem w leczeniu i zapobieganiu chorobom endokrynologicznym [64]. Występowanie tej grupy metabolitów ogranicza się główne do roślin strącz­kowych, u których pierwszym etapem ich biosyntezy jest reakcja katalizowana przez syntazę izoflawonową (IFS, EC 1.14.13.136). Sklonowanie genu kodującego IFS umożli­wiło wytwarzanie izoflawonów przez rośliny uprawne, u których związki te naturalnie nie występują [18].

Ryc. 5. Przykłady utleniaczy z grupy izoflawonów, deoksychalkonów i stilbenów

Blokowanie specyficznych etapów szlaków metabolicznych za pomocą RNAi

Przykładem wykorzystania techniki wyciszania genów za pomocą RNAi (interferencyjnego RNA o dwuniciowej strukturze) może być zmniejszenie zawartości lignin na rzecz flawonoidów rzodkiewnika pospolitego. Ligniny są głównymi składnikami ścian komórkowych ważnymi dla przemysłu biopaliwowego. Wyciszenie u rzodkiewnika pospolitego genu kodującego glukozylotransferazę hy­droksycynamonową (HCT, EC 2.4.1.177, enzymu szlaku syntezy ligniny), za pomocą powtarzalnych sekwencji nukleotydowych genu HCT, powodowało zahamowanie syntezy ligniny i zwiększenie wydajności szlaku syntezy flawonoidów przez wzrost aktywności syntazy chalko­nowej (CHS), enzymu konkurującego z HCT o wspólny substrat [1].

Wykorzystując zjawisko interferencji RNA można rów­nież zmieniać stężenie flawonoidów przez blokowanie specyficznych etapów szlaku ich syntezy. Za pomocą konstruktu RNAi genu kodującego syntazę flawonolową (FLS, EC 1.14.11.23), wprowadzonego do wegetatywnych tkanek pomidora, osiągnięto wysokie stężenie antocy­janów w tkankach, obniżając tym samym zawartość fla­wonoli [4].

Wprowadzenie nowych ścieżek w szlakach biosyntezy flawonoidów w komórkach roślinnych

Głównym źródłem przeciwutleniaczy z grupy flawono­idów jest seler i pietruszka. Podjęte próby wytwarzania flawonów w komórkach pomidora opierały się na wpro­wadzeniu do jego tkanek genu kodującego syntazę fla­wonową (FNS, EC 1.14.11.22) z gerbery. Metoda ta jednak okazała się efektywna jedynie przy równoczesnym zwięk­szeniu wydajności endogennego szlaku biosyntezy flawo­noidów [62], co zaowocowało dużą akumulacją flawonów, głównie luteoliny i 7-glikozydu luteoliny (odpowiednio do 340 mg/kg i do 150 mg/kg świeżej masy). Oprócz zwięk­szonej zawartości flawonów w komórkach skórki trans­genicznego pomidora odnotowano również 16-krotny wzrost flawonoli (kwercetyny do 67 mg/kg świeżej masy oraz rutyny do 900 mg/kg świeżej masy) w porównaniu z odmianą dziką [4].

Innym przykładem omawianego podejścia inżynierii me­tabolicznej jest wytwarzanie deoksychalkonów (ryc. 5), występujących głównie u roślin motylkowych, gdzie za ich wytwarzanie odpowiadają dwa enzymy: reduktaza chal­konowa (CHR, EC 2.3.1.170) i syntaza chalkonowa (CHS) [11]. Nadekspresja obu genów kodujących wspomniane enzymy w pomidorze zaowocowała akumulacją tych fla­wonoidów (do 265 mg/kg świeżej masy) [62]. Podobny poziom akumulacji deoksychalkonów został opisany dla transgenicznej petunii [11].

Stilbeny są grupą związków rzadko spotykanych w kró­lestwie roślin, ale niezwykle ciekawych z punktu widze­nia ich prozdrowotnych właściwości. Dokonano kilku prób syntezy tych związków w powszechnie występu­jących roślinach jadalnych, takich jak pomidor. Wpro­wadzenie do pomidora cDNA syntazy stilbenowej (EC 2.3.1.95) skutkowało akumulacją stilbenów w owocach (głównie resweratrolu, ryc. 6) [62]. Interesujące jest to, że w transgenicznych pomidorach stężenie stilbenów było znacznie większe niż w różnego rodzaju czerwo­nych winach, uważanych obecnie za najbogatsze źródło resweratrolu [8].

Ryc. 6. Szlak syntezy flawonoidów u pomidora z uwzględnieniem nowych gałęzi wprowadzonych metodami inżynierii genetycznej (zmodyfikowano na podstawie [4]) (wprowadzone odgałęzienia szlaku oznaczono pogrubionymi strzałkami); CHS – syntaza chalkonowa (CHS, EC 2.3.1.74); STS – syntaza stilbenowa (EC 2.3.1.95), CHR – reduktaza chalkonowa (EC 2.3.1.170), CHI – izomeraza chalkonowa (EC 5.5.1.6); FNS – syntaza flawonowa (EC 1.14.11.22); F3’H – flawanon-3′-hydroksylaza (EC1.14.13.21); FLS – syntaza flawonolowa (EC 1.14.11.23); DFR – reduktaza dihydroflawonolowa (EC 1.1.1.219); ANS – syntaza antocyjanowa

Poszerzenie wiedzy w zakresie kontroli szlaku biosyntezy flawonoidów otwiera nowe możliwości zwiększania ilości związków flawonowych o właściwościach antyutlenia­jących w roślinach jadalnych. Przedstawione przykłady roślin transgenicznych potwierdzają możliwość efektyw­nej produkcji przeciwutleniaczy, syntezowanych w nie­wielkich stężeniach lub naturalnie nieprodukowanych. Dzięki metodom inżynierii genetycznej możliwa była akumulacja stilbenów, deoksychalkonów i flawonów na poziomie porównywalnym lub wyższym niż w źródłach naturalnych [4].

Genetycznie modyfikowane mikroorganizmy jako źródło przeciwutleniaczy

Biosynteza związków chemicznych i biomateriałów za pomocą rekombinowanych mikroorganizmów stała się ciekawą alternatywą dla metod ekstrakcyjnych oraz metod syntezy chemicznej. Niekwestionowaną zaletą hodowli mikroorganizmów jest możliwość przenosze­nia skali z poziomu laboratoryjnego do rozmiarów bio­fermentorów przemysłowych. Fermentacja mikrobio­logiczna na dużą skalę rozwiązuje problemy związane z ekstrakcją metabolitów ze źródeł roślinnych. Rekombi­nowane mikroorganizmy są zazwyczaj pozbawione kon­kurujących szlaków metabolicznych, dzięki czemu mogą wytwarzać swoiste produkty, np. konkretny enancjomer danego związku, co z kolei skraca proces jego oczyszcza­nia oczyszcza­nia. Kolejnymi zaletami takiej hodowli jest szybki wzrost inokulum bakteryjnego lub drożdżowego pozwalający na znaczne skrócenie czasu wytwarzania flawonoidów w stosunku do organizmów roślinnych oraz to, że wzrost drobnoustrojów może być ściśle kontrolowany i odby­wać się w pożywkach zawierających tanie, odnawialne źródła węgla [10].

Powszechnie stosowanymi organizmami modelowymi w produkcji flawonoidów są Escherichia coli oraz droż­dże piekarskie Saccharomyces cerevisiae. Synteza flawono­idów przez komórki mikroorganizmów zazwyczaj wyma­ga wprowadzenia do komórek gospodarza wielogenowego konstruktu, a wytwarzanie tych metabolitów jest limito­wane dostępem do prekursorów i kofaktorów dla enzy­mów szlaku w organizmie gospodarza [16].

Escherichia coli jako narzędzie do produkcji flawonoidów

Komórki Escherichia coli są często wykorzystywane jako „fabryki komórkowe” do syntezy wielu ważnych pro­duktów roślinnych, w tym także flawonoidów [19,42,61]. Barierą w wytwarzaniu związków flawonowych w ko­mórkach bakteryjnych są trudności w ekspresji C4H (4-hy­droksylazy kwasu cynamonowego) wynikające z braku odpowiedniej reduktazy związanej z cytochromem P450 bakterii. Wykazano, że ektopowa ekspresja genu kodują­cego 4CL (ligazę 4-kumarylo-Co A) z bakterii Streptomy­ces coelicolor (ScCCL) umożliwia efektywną syntezę białka enzymatycznego 4CL, które bierze udział w transformacji kwasu cynamonowego bezpośrednio do cynamoilo-CoA [33]. Bazując na tym doniesieniu stworzono konstrukt składający się z genów kodujących: 4CL (ze S. coelicolor), PAL (o aktywności TAL z drożdży), CHS (z lukrecji) i CHI (z opornika łatkowatego), uzyskując roślinne flawanoidy: pinocembryny w ilości 751 µg/dm³ i naringeniny w ilości równej 452,6 µg/dm³ (ryc. 7) [16,30,33].

Ryc. 7. Szlak heterologicznej biosyntezy flawonoidów w komórkach E. coli [15]; ScCCL ligaza 4-kumaroilo/cynamoilo-Co A przyłącza cząsteczkę CoA do kwasu 4-kumarowego lub kwasu cynamonowego z taką samą wydajnością; PAL, amoniakoliaza fenyloalaninowa; TAL, amoniakoliaza tyrozynowa; CHS, syntaza chalkonowa; CHI, izomeraza chalkonowa

Zwiększenie wydajności syntezy różnych flawonoidów w komórkach E. coli w ostatnich latach było możliwe dzięki podniesieniu wewnątrzkomórkowej puli kofaktorów nie­zbędnych w szlaku ich biosyntezy. Przykładem takiego rozwiązania może być synteza antocyjanów m.in. przez eliminację szlaku syntezy cukrów złożonych w szlaku biosyntezy UDP-glukozy, biorącej udział w wytwarzaniu antocyjanów [43,83]. Podobnie udało się zwiększyć wy­twarzanie flawanonów (do 710 mg/dm³) przez podnie­sienie stężenia wewnątrzkomórkowego malonylo-CoA, indukując m.in. nadekspresję genu karboksylazy acety­lo-CoA (ACC) [42].

Santos i wsp. zaproponowali metodę mikrobiologiczne­go wytwarzania naringeniny z wykorzystaniem glukozy w podłożu hodowlanym, bez dodatku aminokwasów jako prekursorów syntezy flawonoidy [61]. Konstrukt złożo­ny z czterech genów kodujących kolejno CHS, TAL, 4CL i CHI wprowadzono do dwóch linii E. coli, które następ­nie zmodyfikowano genetycznie w kierunku zwiększo­nego wytwarzania L-tyrozyny. Komórki te były zdolne do syntezy 29 mg/dm³ naringeniny z glukozy, a przy do­datkowym zahamowaniu aktywności enzymów syntety­zujących kwasy tłuszczowe – nawet do 84 mg/dm³ tego flawonoidu. Natomiast w wyniku koekspresji genu TAL z Rhodobacter sphaeroides, 4CL i CHS w E. coli uzyskano naringeniny 20,8 mg/dm³ [79].

Jednym z pierwszych doniesień dotyczących wytwarzania związków flawonowych jako substancji mogących znaleźć zastosowanie w medycynie była praca opisująca linie E. coli zmodyfikowane w kierunku wytwarzania reswera­trolu przez ekspresję roślinnych genów kodujących 4CL i STS [33,43]. Ponadto bakterie E. coli okazały się także zdolne do wytwarzania resweratrolu w podłożu z dodat­kiem kwasu p-kumarowego lub kwasu kawowego. Synteza resweratrolu przez tak zmodyfikowane komórki osiągnęła poziom powyżej 100 mg/dm³ płynu pohodowlanego [80].

Metody otrzymywania flawonoidów w komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae

Drożdże Saccharomyces cerevisiae jako organizmy eukario­tyczne są bardziej odpowiednimi od bakterii gospodarza­mi do ekspresji genów roślinnego szlaku biosyntezy fla­wonoidów, gdyż m.in. zawierają kompartmenty podobne do tych występujących u roślin, dzięki czemu mogą po­translacyjnie modyfikować białka [2,78].

Wprowadzenie do komórek drożdży genów kodujących PAL (o aktywności TAL, z Rhodosporidium toriloides), 4CL (z rzodkiewnika) i CHS (z dziurawca) wraz z promotorem GAL10 (promotor genu epimerazy UDP-galaktozy, jednego z genów odpowiedzialnych za wykorzystanie galaktozy przez komórki S. cerevisiae) zaowocowało syntezą około 7 mg/dm3 naringeniny i 0,8 mg/dm³ pinocembryny, w po­żywce z dodatkiem odpowiednio tyrozyny i fenyloalaniny [31]. Z kolei sklonowanie genów C4H (z rzodkiewnika), 4CL (z pietruszki), CHS i CHI (z petunii) z podobnym promo­torem GAL1 (promotor genu galaktokinazy) skutkowa­ło około 4-krotnym wzrostem wytwarzania naringeniny (28,3 mg/dm³) i ponad 20-krotnym pinocembryny (16,3 mg/dm³) [82] w porównaniu z przytoczonymi wyżej wy­nikami Jiang i wsp. [31].

Ważnym czynnikiem wpływającym na wytwarzanie fla­wonoidów jest rodzaj zastosowanej pożywki w hodowli transgenicznych drożdży. Komórki drożdży zawierające ektopowe enzymy C4H, 4CL i CHS wytwarzają małą ilość naringeniny (0,2 mg/dm³), gdy prekursorem ich synte­zy jest kwas cynamonowy, natomiast w przypadku, gdy miejsce kwasu cynamonowego zajmie kwas 4-kumaro­wy akumulacja naringeniny w kulturze wzrasta do 28,3 mg/dm³ [82].

Dowiedziono również, że wprowadzenie transportera bakteryjnego araE do komórek drożdży zwiększa aku­mulację resweratrolu. Komórki drożdży zawierające gen kodujący wspomniany transporter produkowały do 2,5 razy więcej resweratrolu w porównaniu do komórek nie­modyfikowanych [78].

Podsumowanie

Prozdrowotny wpływ przeciwutleniaczy na organizmy żywe jest niekwestionowany. W odpowiedzi na wzrasta­jące tempo rozwoju cywilizacyjnego, coraz wyższe wy­magania stawiane przez społeczeństwo i związany z tym stres, powoduje wzrost zapotrzebowania na „strażników homeostazy procesów redoks”, czyli szeroko rozumianą grupę przeciwutleniaczy.

Znane są metody zwiększania zawartości antyoksydantów w tkankach roślinnych przez genetyczną modyfikację na­turalnie występujących szlaków biochemicznych. Jednym z najlepiej poznanych szlaków metabolicznych jest szlak syntezy flawonoidów, którego produkty stanowią ważną grupę związków przeciwdziałających stresowi oksyda­cyjnemu. Wspomniane modyfikacje mogą dotyczyć za­równo genów strukturalnych jak i regulacyjnych szlaku, występujących natywnie, jak i genów ektopowych, a także blokowania specyficznych jego etapów czy wprowadzania nowych ścieżek do szlaku. Alternatywnym rozwiązaniem jest wprowadzanie roślinnych szlaków metabolicznych do komórek mikroorganizmów, np. bakterii Escherichia coli czy drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Pula funkcjonalnych związków o właściwościach an­tyoksydacyjnych jest ogromna. Problemem nie jest ich identyfikacja ani ekstrakcja z materiałów roślin­nych czy hodowla mikroorganizmów, ale pozyskiwa­nie w stężeniach umożliwiających efektywne terapie antyrodnikowe oraz zwiększenie ich dostępności i róż­norodności w diecie. Celem badaczy powinno być rów­nież opracowanie metod otrzymywania bezpiecznych przeciwutleniaczy syntetycznych, niewykazujących działania toksycznego in vivo. Rozwój metod produk­cji antyutleniaczy na skalę przemysłową i jednoczesne badania nad interakcją między rodnikami, przeciw­utleniaczami i żywymi tkankami pozwolą być może, na skuteczne zwalczanie chorób spowodowanych nad­miernym utlenianiem komórkowym.

PIŚMIENNICTWO

[1] Besseau S., Hoffmann L., Geoffroy P., Lapierre C., Pollet B., Legrand M.: Flavonoid accumulation in Arabidopsis repressed in lignin synthesis affects auxin transport and plant growth. Plant Cell, 2007; 19: 148-162
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[2] Białecka-Florjańczyk E., Kapturowska A.U.: Genetically modified baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae in chemical synthesis and biotransformations, Chem. Biol., Deniz Ekinci (Ed.), ISBN: 978-953-51-0049-2, InTech, DOI: 10.5772/33079. 2012 (30.09.2013)
http://www.intechopen.com/books/chemical-biology/genetically-modified-baker-s-yeast-saccharomyces-cerevisiae-in-chemical-synthesis-and-biotransformat

[3] Bovy A., de Vos R., Kemper M., Schijlen E., Pertejo M.A., Muir S., Collins G., Robinson S., Verhoeyen M., Hughes S., Santos-Buelga C., van Tunen A.: High-flavonol tomatoes resulting from the heterologous expression of the maize transcription factor genes LC and C1. Plant Cell, 2002; 14: 2509-2526
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[4] Bovy A., Schijlen E., Hall R.D.: Metabolic engineering of flavonoids in tomato (Solanum lycopersicum): the potential for metabolomics. Metabolomics, 2007; 3: 399-412

[5] Bradley J.M., Davies K.M., Deroles S.C., Bloor S.J., Lewis D.H.: The maize Lc regulatory gene up-regulates the flavonoid biosynthetic pathway of Petunia. Plant J., 1998; 13: 381-392

[6] Cadet J.L., Brannock C.: Free radicals and the pathobiology of brain dopamine systems. Neurochemistry Int., 1998; 32: 117-131
[PubMed]  

[7] Cao G., Sofic E., Prior R.L.: Antioxidant capacity of tea and common vegetables. J. Agricultural Food Chem., 1996; 44: 3426-3431

[8] Celotti E., Ferrarini R., Zironi R., Conte L.S.: Resveratrol content of some wines obtained from dried Valpolicella grapes: Recioto and Amarone. J. Chromatography, 1996; 730: 47-52
[PubMed]  

[9] Chaudiere J., Ferrari-Iliou R.: Intracellular antioxidants: from chemical to biochemical mechanisms. Food Chem. Toxicol., 1999; 37: 949-962
[PubMed]  

[10] Chemler J.A., Koffas M.A.: Metabolic engineering for plant natural product biosynthesis in microbes. Curr. Op. Biotechnol., 2008; 19: 597-605
[PubMed]  

[11] Colliver S., Bovy A., Collins G., Muir S., Robinson S., de Vos C.H., Verhoeyen M.E.: Improving the nutritional content of tomatoes through reprogramming their flavonoid biosynthetic pathway. Phytochemistry Rev., 2002; 1: 113-123

[12] Davies K.M., Bloor S.J., Spiller G.B., Delores S.C.: Production of yellow colour in flowers: redirection of flavonoid biosynthesis in Petunia. Plant J., 1998; 13: 259-266

[13] Dixon R.A., Steele C.L.: Flavonoids and isoflavonoids – a gold mine for metabolic engineering. Trends Plant Sci., 1999; 4: 394-400
[PubMed]  

[14] Dröge W.: Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological Rev., 2002; 82: 47-95
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[15] Du F., Zhang F., Chen F., Wang A., Wang Q., Yin X., Wang S.: Advances in microbial heterologous production of flavonoids. Afr. J. Microbiol., 2011; 5: 2566-2574

[16] Du H., Huang Y., Tang Y.: Genetic and metabolic engineering of isoflavonoid biosynthesis. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010; 86: 1293-1312
[PubMed]  

[17] Flora S.J.: Structural, chemical and biological aspects of antioxidants for strategies against metal and metalloid exposure. Oxid. Med. Cell. Longev., 2009; 2: 191-206
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[18] Forkmann G., Martens S.: Metabolic engineering and applications of flavonoids. Curr. Op. Biotechnol., 2001; 12: 155-160
[PubMed]  

[19] Fowler Z.L., Gikandi W.W., Koffas M.A.: Increased malonyl coenzyme a biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Appl. Environ. Microbiol., 2009; 75: 5831-5839
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[20] Galili G., Höfgen R.: Metabolic engineering of amino acids and storage proteins in plants. Metabolic Engineering, 2002; 4: 3-11
[PubMed]  

[21] Gandikota M., de Kochko A., Chen L., Ithal N., Fauquet C., Reddy A.R.: Development of transgenic rice plants expressing maize anthocyanin genes and increased blast resistance. Mol. Breeding, 2001; 7: 73-83

[22] Goldsbrough A.P., Tong Y., Yoder J.I.: Lc as a non-destructive visual reporter and transposition excision marker gone for tomato. Plant J., 1996; 9: 927-933

[23] Grotewold E., Chamberlin M., Snook M., Siame B., Butler L., Swenson J., Maddock S., St Clair G., Bowen B.: Engineering secondary metabolism in maize cells by ectopic expression of transcription factors. Plant Cell, 1998; 10: 721-740
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[24] Grotewold E., Koes R.: How genes paint flowers and seeds. Trends Plant Sci., 1998; 3: 212-217

[25] Hensley K., Benaksas E. J., Bolli R., Comp P., Grammas P., Homdheydari L., Mou S., Pye Q.N., Stoddard M.F., Wallis G., Williamson K.S., West M., Wechter W.J., Floyd R.A.: New perspectives on vitamin E: γ-tocopherol and carboxyelthylhydroxychroman metabolites in biology and medicine. Free Radical Biol. Med., 2004; 36: 1-15
[PubMed]  

[26] Holton T.A., Cornish E.C.: Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis. Plant Cell, 1995; 7: 1071-1083
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[27] Horbowicz M., Saniewski M.: Biosynteza, występowanie i właściwości biologiczne likopenu. Postępy Nauk Rolniczych, 2000; 1: 29-46

[28] Horubała A.: Pojemność przeciwutleniająca i jej zmiany w procesach przetwarzania owoców i warzyw. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 1999; 3: 30-32

[29] Huang D., Ou B., Prior R.L.: The chemistry behind antioxidant capacity assays. J. Agricultural Food Chem., 2005; 53: 1841-1856
[PubMed]  

[30] Hwang E., Kaneko M., Ohnishi Y., Horinouchi S.: Production of plant-specific flavanones by Escherichia coli containing an artificial gene cluster. Appl. Environ. Microbiol., 2003; 69: 2699-2706
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[31] Jiang H., Wood K.V., Morgan J.A.: Metabolic engineering of the phenylpropanoid pathway in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol., 2005; 71: 2962-2969
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[32] Jones D.P., Kagan V.E., Aust S.D., Reed D.J., Omaye S.T.: Impact of nutrients on cellular lipid peroxidation and antioxidant defense system. Fundam. Appl. Toxicol., 1995; 26: 1-7
[PubMed]  

[33] Kaneko M., Hwang E., Ohnishi Y., Horinouchi S.: Heterologous production of flavanones in Escherichia coli: potential for combinatorial biosynthesis of flavonoids in bacteria. J. Industrial Microbiol. Biotechnol., 2003; 30: 456-461
[PubMed]  

[34] Karoui H., Hogg N., Frejaville C., Tordo P., Kalyanaraman B.: Characterization of sulfur-centered radical intermediates formed during the oxidation of thiols and sulfite by peroxynitrite. J. Biol. Chem., 1996; 11: 6000-6009
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[35] Katsube N., Iwashita K., Tsushida T., Yamaki K., Kobori M.: Induction of apoptosis in cancer cells by bilberry (Vaccinium myrtillus) and the anthocyanins. J. Agricultural Food Chem., 2003; 51: 68-75
[PubMed]  

[36] Kerr M.E., Bender C.M., Monti E.J.: An introduction to oxygen free radicals. Heart Lung: J. Critical Care, 1996; 25: 200-209
[PubMed]  

[37] Koes R.E., Quatrocchio F., Mol J.N.: The flavonoid biosynthetic pathway in plants: function and evolution. BioEssays, 1994; 16: 123-132

[38] Kojo S.: Vitamin C: basic metabolism and its function as an index of oxidative stress. Curr. Med. Chem., 2004; 11: 1041-1064
[PubMed]  

[39] Korkmaz A., Reiter R.J., Topal T., Manchester L.C., Oter S., Tan D.X.: Melatonin: an established antioxidant worthy of use in clinical trials. Mol. Med., 2009; 15: 43-50
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[40] Krishnamurthy P., Wadhwani A.: Antioxidant enzymes and human health, antioxidant enzyme, El-Missiry M.A. (red.), InTech, DOI: 10.5772/48109, 2012 (30.09.2013)
http://www.intechopen.com/books/antioxidant-enzyme/antioxidant-enzymes-and-human-health

[41] Landis G.N., Tower J.: Superoxide dismutase evolution and life span regulation. Mech. Ageing Dev., 2005; 126: 365-379
[PubMed]  

[42] Leonard E., Lim K., Saw P., Koffas M.A.: Engineering central metabolic pathways for high-level flavonoid production in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 2007; 73: 3877-3886
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[43] Leonard E., Yan Y., Fowler Z.L., Li Z., Lim C.G., Lim K.H., Koffas M.A.: Strain improvement of recombinant Escherichia coli for efficient production of plant flavonoids. Mol. Pharmaceutics, 2008; 5: 257-265
[PubMed]  

[44] Lloyd A.M., Walbot V., Davis R.W.: Arabidopsis and Nicotiana anthocyanin production activated by maize regulators R and C1. Science, 1992; 258: 1773-1775
[PubMed]  

[45] Malińska D., Winiarska K.: Kwas liponowy – charakterystyka i zastosowanie w terapii. Postępy Hig. Med. Dośw., 2005; 59: 535-543
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[46] Małecka M.: Składniki frakcji nieglicerydowej olejów roślinnych jako przeciwutleniacze. Tłuszcze Jadalne, 1995; 30: 123-130

[47] Mandal S.S., Yadav S. Yadav, Nema R.K.: Antioxidants: a review. J. Chem. Pharm. Res., 2009; 1: 102-104

[48] Masella R., Di Benedetto R., Vari R., Filesi C., Giovannini C.: Novel mechanisms of natural antioxidant compounds in biological systems: involvement of glutathione and glutathione-related enzymes. J. Nutr. Biochem., 2005; 16: 577-586
[PubMed]  

[49] Mortensen A., Skibsted L.H., Truscott T.G.: The interaction of dietary carotenoids with radical species. Arch. Biochem. Biophys., 2001; 385: 13-19
[PubMed]  

[50] Muir S.R., Collins G.J., Robinson S., Hughes S., Bovy A., Ric De Vos C.H., van Tunen A.J., Verhoeyen M.E.: Overexpression of petunia chalcone isomerase in tomato results in fruit containing increased levels of flavonols. Nature Biotechnol., 2001; 19: 470-474
[PubMed]  

[51] Navari-Izzo F., Quartacci M.F., Sgherri C.: Lipoic acid: a unique antioxidant in the detoxification of activated oxygen species. Plant Physiol. Biochem., 2002; 6: 463-470

[52] Naziroglu M., Butterworth P.J.: Protective effects of moderate exercise with dietary vitamin C and E on blood antioxidative defense mechanism in rats with streptozotocin-induced diabetes. Can. J. Appl. Physiol., 2005; 2: 172-185
[PubMed]  

[53] Nishiyama Y., Yun C.S., Matsuda F., Sasaki T., Saito K., Tozawa Y.: Expression of bacterial tyrosine ammonia-lyase creates a novel p-coumaric acid pathway in the biosynthesis of phenylpropanoids in Arabidopsis. Planta, 2010; 232: 209-218
[PubMed]  

[54] Packer L., Cadenas E., Davies K.L.: Free radicals and exercise: an introduction. Free Radic Biol. Med., 2008; 44: 123-125
[PubMed]  

[55] Polovka M., Brezová V., Stasko A.: Antioxidant properties of tea investigated by EPR spectroscopy. Biophys. Chem., 2003; 106: 39-56
[PubMed]  

[56] Pryor W.A.: Vitamin E and heart disease: basic science to clinical intervention trials. Free Rad. Biol. Med., 2000; 28: 141-164
[PubMed]  

[57] Rahimi R., Nikfar S., Larijani B., Abdollahi M.: A review on the role of antioxidants in the management of diabetes and its complications. Biomed. Pharmacother., 2005; 59: 365-373
[PubMed]  

[58] Rahman K.: Studies on free radicals, antioxidants and co-factors. Clin. Interv. Aging, 2007; 2: 219-236
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[59] Ranish J.A,, Hahn S.: Transcription: basal factors and activation. Curr. Op. Genet. Dev., 1996; 6: 151-158
[PubMed]  

[60] Rice-Evans C.: Flavonoid antioxidants. Curr. Med. Chem., 2001; 8: 797-807
[PubMed]  

[61] Santos C.N., Koffas M., Stephanopoulos G.: Optimization of a heterologous pathway for the production of flavonoids from glucose. Metab. Eng., 2011; 13: 392-400
[PubMed]  

[62] Schijlen E, Ric de Vos C.H., Jonker H., van den Broeck H., Molthoff J., van Tunen A., Martens S., Bovy A.: Pathway engineering for healthy phytochemicals leading to the production of novel flavonoids in tomato fruit. Plant Biotechnol. J., 2006; 4: 433-444
[PubMed]  

[63] Schroeter H., Boyd C., Spencer J.P., Williams R.J., Cadenas E., Rice-Evans C.: MAPK signaling in neurodegeneration: influences of flavonoids and of nitric oxide. Neurobiol. Aging, 2002; 23: 861-880
[PubMed]  

[64] Setchell K.D., Cassidy A.: Dietary isoflavones: biological effects and relevance to human health. J. Nutr., 1999; 129: 758S-767S
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[65] Sévenier R., van der Meer I.M., Bino R., Koops A.J.: Increased production of nutriments by genetically engineered crops. J. Am. Coll. Nutr., 2002; 21: 199-204
[PubMed]  

[66] Shan B., Cai Y.Z., Sun M., Corke H.: Antioxidant capacity of 26 spice extracts and characterization of their phenolic constituents. J. Agric. Food Chem., 2005; 53: 7749-7759
[PubMed]  

[67] Sies H., Stahl W., Sevanian A.: Nutritional, dietary and post-prandial oxidative stress. J. Nutr., 2005; 135: 969-972
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[68] Smith A.R., Shenvi S.V., Widlansky M., Suh J.H., Hagen T.M.: Lipoic acid as a potential therapy for chronic diseases associated with oxidative stress. Curr. Med. Chem., 2004; 11: 1135-1146
[PubMed]  

[69] Szajdek A., Borowska J.: Właściwości przeciwutleniające żywności pochodzenia roślinnego. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2004; 4 Suppl.: 5-28
[Full Text PDF]  

[70] Tan D.X., Reiter R.J., Manchester L.C., Yan M.T., El-Sawi M., Sainz R.M., Mayo J.C., Kohen R., Allegra M., Hardeland R.: Chemical and physical properties and potential mechanisms: melatonin as a broad spectrum antioxidant and free radical scavenger. Curr. Top. Med. Chem., 2002; 2: 181-197
[PubMed]  

[71] Troszyńska A., Bednarska A., Łatosz A., Kozłowska H.: Polyphenolic compounds in the seed coat of legume seeds. Pol. J. Food Nutr. Sci., 1997; 6: 37-45

[72] Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Cronin M.T., Mazur M., Telser J.: Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2007; 39: 44-84
[PubMed]  

[73] Verhagen J.V., Haenen G.R., Bast A.: Nitric oxide radical scavenging by wines. J. Agricultural Food Chem., 1996; 44: 3733-3734

[74] Verpoorte R., Memelink J.: Engineering secondary metabolite production in plants. Curr. Opin. Biotechnol., 2002; 13: 181-187
[PubMed]  

[75] Vinson J.A., Dabbagh Y.A.: Tea phenols: antioxidant effectiveness of teas, tea components, tea fractions and their binding with lipoproteins. Nutr. Res., 1998; 18: 1067-1075

[76] Vom Endt D., Kijne J.W., Memelink J.: Transcription factors controlling plant secondary metabolism: what regulates the regulators? Phytochemistry, 2002; 61: 107-114
[PubMed]  

[77] Wang Y., Chen S., Yu O.: Metabolic engineering of flavonoids in plants and microorganisms. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011; 91: 949-956
[PubMed]  

[78] Wang Y., Halls C., Zhang J., Matsuno M., Zhang Y., Yu O.: Stepwise increase of resveratrol biosynthesis in yeast Saccharomyces cerevisiae by metabolic engineering. Metab. Engineer., 2011; 13: 455-463
[PubMed]  

[79] Watts K.T., Lee P.C., Schmidt-Dannert C.: Exploring recombinant flavonoid biosynthesis in metabolically engineered Escherichia coli. Chembiochem, 2004; 5: 500-507
[PubMed]  

[80] Watts K.T., Lee P.C., Schmidt-Dannert C.: Biosynthesis of plant-specific stilbene polyketides in metabolically engineered Escherichia coli. BCM Biotechnol.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1435877/, 2006; 6: 22
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[81] Wilska-Jeszka J.: Struktura i właściwości antyoksydacyjne polifenoli. Materiały II Konferencji Naukowej “Żywność a Zdrowie”, Łódź 1999; 27-36

[82] Yan Y., Kohli A., Koffas M.A.: Biosynthesis of natural flavanones in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol., 2005; 71: 5610-5613
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[83] Yan Y., Li Z., Koffas M.A.: High-yield anthocyanin biosynthesis in engineered Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng., 2008; 100: 126-140
[PubMed]  

[84] Yazaki K.: Transporters of secondary metabolites. Curr. Op. Plant Biol., 2005; 8: 301-307
[PubMed]  

[85] Zieliński H.: Low molecular weight antioxidants in the cereal grains – a review. Pol. J. Food Nutr. Sci., 2002; 1: 3-9

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Full text