Streszczenie

Wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (vesicular stomatitis virus – VSV), należący do rodziny Rhabdoviridae, jest obiecującym wektorem wirusowym wykorzystywanym podczas opracowywania szczepionek przeciwwirusowych o potencjalnym zastosowaniu u ludzi. W przy­rodzie VSV jest patogenem ssaków kopytnych, w tym zwierząt hodowlanych. Najważniejszymi cechami VSV czyniącymi z niego doskonałą platformę do rozwoju różnych terapii przeciwwiru­sowych są jego immunogenność i efektywne namnażanie do wysokich mian w liniach komórko­wych stosowanych w produkcji szczepionek. Zakażenia człowieka VSV są stosunkowo rzadkie i cechują się łagodnymi, grypopodobnymi objawami. Co więcej, ze względu na powinowactwo glikoproteiny osłonkowej VSV do powszechnie występującego receptora LDL (lipoproteiny niskiej gęstości), wirus ten skutecznie kieruje się do różnych tkanek in vivo. Wiele wyników badań potwierdza możliwości opracowania szczepionek wektorowych z zastosowaniem VSV przeciw wirusom brodawczaka ludzkiego (HPV), ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV), wirusowi zapalenia wątroby typu B (HBV) i filowirusom (MARV, ZEBOV i SEBOV), a także potencjalne zastosowanie opracowanej szczepionki przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV). VSV wykazuje neurotropizm, co w następstwie zakażenia może powodować wirusowe zapalenie mózgu u zwierząt doświadczalnych. Z tego względu trwają intensywne prace nad osiągnięciem wystarczającej ekspresji antygenów wirusowych z jednoczesnym zachowaniem bezpieczeństwa skonstruowanego wektora.

Słowa kluczowe:wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej • vesicular stomatitis virus • VSV • wektor szczepionkowy

Summary

Vesicular stomatitis virus (VSV), a member of the Rhabdoviridae family, is a promising candi­date for potential use in construction of antiviral vaccines. In the natural environment VSV is a pathogen of wild ungulates and livestock. Some of the features that make VSV an excellent platform for the development of a range of viral therapeutics includes its immunogenicity and ability to grow to high titers in cell lines approved for vaccine use. Infection in humans is rare and usually asymptomatic, with mild flu-like symptoms. Moreover, due to affinity of VSV envelope glycoprotein to the LDL (low-density lipoprotein) receptor, VSV is effective at targeting a variety of tissues in vivo. A series of research results confirm the possibility of de­veloping VSV-based vaccines against human papilloma viruses (HPV), human immunodefi­ciency virus (HIV), hepatitis B virus (HBV) and filoviruses (MARV, ZEBOV and SEBOV), as well as the potential use of a successfully developed vaccine against hepatitis C virus (HCV). VSV is neurotropic and infection can cause a viral encephalitis in experimental animals. Therefore, intensive studies are being undertaken to achieve satisfactory expression of the viral antigens while maintaining the safety of the constructed vectors.

Key words:vesicular stomatitis virus • VSV • vaccine vector

Wstęp

Wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (vesicular stomatitis virus – VSV) należy do rodziny Rhabdoviridae rzędu Mononegavirales. W przyrodzie VSV jest patogenem ssaków kopytnych, w tym zwierząt hodowlanych, takich jak konie, bydło i świnie. Zakażenie człowieka jest sto­sunkowo rzadkie i cechuje się łagodnymi, grypopodob­nymi objawami [62]. VSV zawiera silnie upakowany ge­nom w postaci pojedynczej nici RNA o ujemnej polarności (ssRNA(-)) złożonej z pięciu nienakładających się na siebie genów kodujących białka wirusowe (ryc. 1). Wirusowy ma­teriał genetyczny jest związany z białkiem nukleokapsydu (N), tworząc spiralny rdzeń rybonukleoproteinowy (RNP). W kapsydzie znajdują się również wirusowa RNA-zależna polimeraza RNA (L) oraz jej kofaktor – fosfoproteina (P). Spiralnie upakowany rdzeń RNP jest stabilizowany biał­kiem macierzy (M) i otoczony podwójną warstwą lipidową, w której znajduje się glikoproteina (G) odpowiedzialna za wiązanie wirusa do komórki gospodarza i fuzję z jej błoną [34,42]. VSV może zakażać większość komórek kręgow­ców i wiele spośród komórek bezkręgowców. Powszech­ność występowania receptora dla VSV na komórkach oraz łatwość i szybkość hodowli wirusa sprawiły, że czę­sto wykorzystuje się go w badaniach dotyczących wnika­nia wirusów do komórki, replikacji wirusowego materiału genetycznego i tworzenia cząstek wirusowych w komórce [23,78]. Ze względu na brak potwierdzonych infekcji VSV u ludzi, w Europie wirus ten często używany jest w bada­niach nieswoistych interakcji wirusów z układem odpor­nościowym odpor­nościowym człowieka, np. Błach-Olszewska i wsp. użyli go do opracowania testu na badanie poziomu nieswoistej od­powiedzi immunologicznej u ludzi [54,77,109]. W połowie lat 90 ub.w. naukowcy wykorzystując standardowe tech­niki klonowania odtworzyli pełny genom VSV w postaci komplementarnego DNA (complementary DNA – cDNA), dzięki wklonowaniu pojedynczych genów VSV oraz ich se­kwencji łączących do plazmidu pGEM-3 z promotorem T7. Otrzymane plazmidy pVSV1(+) oraz pVSV1(-), różniące się polarnością, są nadal wykorzystywane do opracowywania szczepionek na bazie VSV [106]. Konstrukcja wektorów opartych na VSV, które nie tylko kodują białka innych patogennych wirusów, lecz także białka terapeutyczne jest coraz częściej wykorzystywaną strategią. Trzeba mieć jednak na względzie zagrożenia związane z potencjalną neurotoksycznością wirusa – VSV może być przyczyną śmiertelnego zapalenia mózgu nie tylko u gryzoni, ale też u małp wąskonosych [75].

Ryc. 1. Mapa genomu VSV. Litery oznaczają geny kodujące: N – białko nukleokapsydu, P – fosfoproteinę, M – białko macierzy, G – glikoproteinę powierzchniową, L – RNA-zależną polimerazę RNA

Projektowanie wektorów szczepionkowych

Wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej może być wykorzystany jako wektor szczepionek, po wbudowa­niu do jego genomu genów kodujących antygeny innego patogennego wirusa. Wektory wirusowe oparte na VSV można podzielić na:
• replikacyjnie kompetentne, gdy zawierają zestaw prawi­dłowych genów wirusa, niezbędnych do przejścia całego cyklu infekcji wirusowej;
• replikacyjnie defektywne, gdy usunięcie lub zmiana w którymkolwiek z genów wektora skutkuje zabloko­waniem jego cyklu replikacji na jednym z etapów nastę­pujących po wniknięciu wirusa do komórki.

Wektory replikacyjnie kompetentne po podaniu do orga­nizmu wyzwalają silną i długotrwałą odpowiedź immu­nologiczną, jednak ze względu na bezpieczeństwo stoso­wania nie powinny być podawane osobnikom z obniżoną odpornością. Wektory defektywne są potencjalnie bez­pieczniejsze, ale ich zastosowanie wiąże się z koniecz­nością podania większej liczby dawek w celu wywołania optymalnej odpowiedzi immunologicznej. Przykładem wektora replikacyjnie defektywnego może być wektor pozbawiony genu kodującego glikoproteinę G lub eks­presjonujący ją w skróconej postaci [107].

Wektory szczepionek przeciwwirusowych na bazie VSV najczęściej tworzy się poprzez insercję lub substytucję określonego genu wirusowego do genomu VSV. Badania prowadzone najpierw na małych ssakach, a następnie na świniach udowodniły, że największe znaczenie w pato­genności VSV ma położenie genu N. W szczepie dzikim gen N znajduje się na końcu 3′ i jest pierwszym, a co za tym idzie najsilniej transkrybowanym genem VSV [4,51]. Zmiana jego położenia w wyniku rekombinacji prowadzi do atenuacji wirusa, w stopniu zależnym od oddalenia od promotora [31]. Zaobserwowano, że przeniesienie genu glikoproteiny G w stronę 3′, czyli bliżej promotora, skut­kowało zwiększoną odpowiedzią humoralną u myszy [30]. Brak potwierdzonych przypadków rekombinacji homolo­gicznej u któregokolwiek z przedstawicieli rzędu Monone­gavirales wskazuje, że rearanżacja genowa stosowana pod­czas tworzenia rekombinantów VSV jest nieodwracalna, co zwiększa bezpieczeństwo konstruktu VSV jako wektora szczepionek [105]. Tego rodzaju atenuacja pozwala na osłabienie neuropatogenności wektorów rVSV z jedno­czesnym zachowaniem ich wysokiej immunogenności. Na przykład w badaniach nad szczepionką przeciw HIV testo­wano strategie atenuacji rVSV, które obejmowały kombi­nacje translokacji genu N, mutacji genu M oraz skracania genu G. Ostatnia z wymienionych procedur prowadzi do delecji części domeny cytoplazmatycznej glikoproteiny rVSV. Konstrukty tak przygotowanych wektorów zawie­rały gen gag z HIV w pozycji pierwszej genomu rVSV, tuż za sekwencją liderową, co doprowadziło do dalszej atenu­acji wektora wirusowego z jednoczesnym zwiększeniem udziału odpowiedzi humoralnej przeciw białku Gag [17].

Vsv jako wektor szczepionkowy

Szczepionki profilaktyczne i terapeutyczne przeciw HPV

Wirus brodawczaka ludzkiego (human papillomavirus – HPV) jest uważany za czynnik etiologiczny prawie w 90% przypadków raka szyjki macicy. Istnieje ponad 80 różnych typów HPV, niektóre z nich mogą być przenoszone drogą płciową i zakażać nabłonek organów płciowych powo­dując powstawanie tzw. kłykcin kończystych. Przyczyną większości z nich jest HPV typu 6 i 11, natomiast typy 16 i 18 najczęściej są związane z powstawaniem zmian nowo­tworowych w obrębie narządów rozrodczych [7,9,25,46]. W Polsce istnieje możliwość zaszczepienia się przeciw wy­mienionym typom HPV szczepionką dwuwalentną (skie­rowaną przeciw HPV typu 16 i 18) lub czterowalentną (chroni przed infekcją HPV typu 6, 11, 16 i 18). Ogranicze­nia stosowania tych szczepionek wynikają z ich wysokiej ceny, czynników społecznych (błędne przeświadczenie o szkodliwości szczepień) oraz zakresu działania – w two­rzenie się zmian nowotworowych w obrębie narządów rozrodczych mogą być zaangażowane inne typy wirusa, przed którymi nie chroni szczepionka [101].

Do opracowania alternatywnej szczepionki przeciw HPV często wykorzystywany jest króliczy model oparty na wirusie brodawczaka królików (cottontail rabbit papil­lomavirus – CRPV). Genomy wirusów brodawczaka HPV i CRPV charakteryzują się znaczną homologią sekwencji, w której geny sobie odpowiadające kodują białka o po­dobnych funkcjach. Ponadto zakażenie CRPV przebiega w charakterystyczny sposób, a zmiany skórne pojawia­ją się w miejscu skaryfikacji wirusem. W badaniach nad opracowaniem nowej szczepionki przeciw HPV stosowa­no białko kapsydu L1 wirusa brodawczaka króliczego, jednak takie szczepienie wymaga bardzo dużych ilości niezdenaturowanego białka z adiuwantem, a następnie kilku szczepień przypominających [65]. Grupa pod kie­runkiem J. D. Reutera skonstruowała w 2002 r. rekombino­wany VSV (rVSV) przez insercję genu kodującego białko kapsydu L1 CRPV między geny kodujące białka G i L VSV. Wektorem VSV-L1 szczepiono króliki różnymi sposoba­mi: donosowo, domięśniowo i śródskórnie. Króliki były całkowicie zabezpieczone przed chorobą wywołaną przez CRPV, a odpowiedź humoralną w stosunku do białka L1 zaobserwowano już po pojedynczym śródskórnym lub domięśniowym podaniu szczepionki VSV-L1 lub poda­niu donosowym z dawką przypominającą [89]. Dwa lata później zespół A. Robertsa skonstruował drugi wektor – VSVL1-2 – w którym gen kodujący białko L1 pochodzący z CRPV wbudowano między geny N i P VSV. Przesunię­cie pozycji insertu bliżej końca 3′ RNA wirusa zwiększało ekspresję białka L1, dzięki czemu osiągnięto całkowitą ochronę przed CRPV (obserwacje prowadzono przez 10 tygodni od skaryfikacji CRPV) już po domięśniowym po­daniu pojedynczej dawki szczepionki [91].

Szczepionki na bazie wektora VSV mogą być także wy­korzystywane w immunoterapii, leczeniu istniejącego zakażenia i zmian nowotworowych. Takie badania prze­prowadzono na modelu króliczego brodawczaka, w któ­rym wykorzystano cztery wczesne geny CRPV: E1, E2, E6 i E7. Dwa pierwsze kodują białka niezbędne do replikacji, natomiast produkty genów E6 i E7 biorą udział w trans­formacji nowotworowej oraz są konstytutywnie eks­presjonowane we wszystkich nowotworach związanych z wirusem brodawczaka. Brandsma i wsp. skonstruowali rekombinanty VSV wykazujące ekspresję pojedynczych wczesnych genów CRPV przez ich insercję do genomu VSV między geny G i L. Króliki zainfekowano CRPV przez skaryfikację. Po tygodniu podzielono je na grupy i podano szczepionki zawierające jeden lub dwa rodzaje wektorów rVSV. Wszystkie szczepionki znacząco redukowały obję­tość brodawczaków wywołanych przez CRPV w porów­naniu z grupą kontrolną, która otrzymała tylko wektor (rVSV). Najlepszy terapeutyczny wynik uzyskano po za­stosowaniu wektora VSV-E7, mimo stwierdzenia braku odpowiedzi humoralnej przeciw E7, co sugeruje udział odpowiedzi komórkowej w redukcji zmian nowotworo­wych [10]. W kolejnych eksperymentach Brandsma i wsp. podnieśli efektywność szczepienia wektorem VSV kodują­cym białko E6 przez doszczepienie zwierząt szczepionką DNA UbE6 powstałą na bazie plazmidu pcDNA3 z wbudo­wanym genem E6. Zaobserwowano zmniejszenie się trwa­łych zmian przednowotworowych o 67% w porównaniu do grupy kontrolnej [11].

Obiecujące wyniki związane z użyciem wektora VSV-E7 u królików skłoniły badaczy do podjęcia dalszych prób udoskonalenia szczepionek wektorowych do zastosowania w immunoterapii. Liao i wsp. testowali wpływ szczepienia wektorem VSV-E7 na wzrost guza nowotworowego u my­szy. Wektor skonstruowano przez insercję genu kodujące­go białko E7 z HPV typu 16 do genomu VSV tuż za genem kodującym białko N, zapewniając tym samym zwiększoną ekspresję białka E7. Wektorem VSV1-16E7 szczepiono my­szy C57BL/6, tydzień po iniekcji komórek rakowych linii TC-1 (syngenicznych mysich komórek rakowych ekspre­sjonujących białko E7 z HPV16 oraz onkogen ras). Dwa tygodnie po podaniu pojedynczej dawki szczepionki ob­jętość guzów nowotworowych była 10-krotnie mniejsza w grupie szczepionej VSV1-16E7 w porównaniu do grupy szczepionej wektorem kontrolnym. Ponadto zauważono silniejszą odpowiedź komórkową (swoiste CD8⁺ wytwa­rzające IFN-γ) po szczepieniu VSV1-16E7 w grupie myszy z rozwiniętym nowotworem niż w grupie bez nowotworu. Przytoczone wyniki badań wskazują, że komórki nowo­tworowe wywołują w organizmie odpowiedź przeciwno­wotworową, która może być następnie wzmacniana przez szczepienia z użyciem rVSV [64].

Szczepionki przeciw wirusom zapalenia wątroby typu C i B

Wirus zapalenia wątroby typu C (hepatitis C virus – HCV) jest głównym czynnikiem etiologicznym ciężkich chorób wątroby. Szacuje się, że ponad 170 mln ludzi na świecie może być nosicielami HCV [47]. Leczenie farmakologicz­ne za pomocą rybawiryny i pegylowanego interferonu α, oraz inhibitorów proteaz prowadzi do uzyskania trwałej odpowiedzi wirusologicznej i eradykacji wirusa u 60% pa­cjentów, jednak sukces leczenia zależy też w dużym stop­niu od genotypu HCV [49,80,81]. Istotnym powikłaniem u osób przewlekle zakażonych jest zapalenie, marskość lub pierwotny rak wątroby, dlatego wciąż istnieje zapo­trzebowanie na opracowanie szczepionki zapobiegającej nowym zakażeniom [76,98]. Genom HCV to jednoniciowy RNA o polarności dodatniej i wielkości 9500 nukleotydów. Koduje prekursorową poliproteinę o długości 3000 amino­kwasów, która jest następnie przetwarzana na 10 różnych białek: strukturalnych (C, E1, E2) i niestrukturalnych (P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B) [5].

Podczas diagnozowania serologicznego w kierunku rozpo­znania infekcji HCV najczęściej wykrywa się przeciwcia­ła przeciwko białku rdzenia (core – C) oraz białkom NS3, NS4A/4B oraz NS5A. Mimo to kluczem do wyzwolenia od­powiedzi immunologicznej zależnej od przeciwciał, która mogłaby zneutralizować wirusa są glikoproteiny osłonki (E1 i E2). Białka E1 i E2 są bezpośrednio odpowiedzialne za wiązanie wirusa z nieodkrytym dotychczas receptorem na powierzchni komórki [6,48]. Szczepienie szympansów rekombinowanymi glikoproteinami E1/E2 spowodowało nie tylko powstanie przeciwciał neutralizujących, chro­niących przed zakażeniem niskimi dawkami HCV [50], ale także skrócenie czasu trwania wiremii w wyniku rein­fekcji [84]. Przydatność konstruktu VSV z delecją genu G (VSVDG) została potwierdzona w badaniach Majid i wsp., w których w miejsce genu kodującego glikoproteinę G zostały wstawione geny białek strukturalnych HCV-C, E1 i E2. Wektor (VSVΔG) pozbawiony genu G, niezbędnego do namnażania się wirusa w komórkach, jest bezpieczny dla organizmu szczepionego i jednocześnie silnie immuno­genny. Wykorzystując model mysi BALB/c uzyskano obie­cujące rezultaty. Myszy szczepiono wektorami: dzikim VSV-C/E1/E2 lub VSV z delecją G (VSVΔG-C/E1/E2). Po upływie 6 tygodni zakażano je rekombinowanym wirusem krowianki (vaccinia virus – VV) ekspresjonującym te same białka HCV, co wcześniej użyte wektory (recombinant vac­cinia virus expressing the HCV structural proteins – vv­-HCV.S). Wyniki badań wykazały, że defektywny wektor VSVΔG-C/E1/E2 stymulował humoralną i komórkową od­powiedź immunologiczną u myszy, porównywalną z wek­torem dzikim VSV-C/E1/E2. Ponadto miano vv-HCV.S w jajnikach myszy szczepionych wektorem VSVΔG-C/E1/ E2 było o dwa logarytmy niższe w porównaniu do miana u myszy, które otrzymały kontrolny wektor VSVΔG. W ba­daniach oceniono również wpływ szczepienia wektorem VSVΔG-C/E1/E2 na wzrost guza nowotworowego eks­presjonującego białko E2. U myszy w grupie szczepionej defektywnym wektorem nie rozwijały się lub rozwijały znacznie mniejsze guzy niż u tych, którym podawano wektor kontrolny. Zmierzono stężenie IFN-γ wytwarzane­go przez komórki śledziony wyizolowane ze szczepionych myszy, które następnie stymulowano komórkami guza. Zauważono też, że stężenie tej cytokiny jest prawie dwu­krotnie wyższe w hodowli komórek pobranych od myszy szczepionych VSVΔG-C/E1/E2 w porównaniu do grupy szczepionej wektorem kontrolnym. Przedstawione wyniki badań świadczą o potencjale aplikacyjnym szczepionek wektorowych na bazie VSVΔG, których bezpieczeństwo jest niewątpliwie ogromną zaletą [68].

Według bieżących szacunków około 30% światowej po­pulacji, czyli prawie 2 mld, jest zakażonych wirusem za­palenia wątroby typu B (hepatitis B virus – HBV) [108]. Przewlekłe wirusowe zapalenie wątroby (wzw) typu B może być przyczyną marskości wątroby oraz pierwotne­go raka wątroby [19,66]. Antygenem obecnie dostępnych szczepionek przeciw wzw typu B jest powierzchniowa glikoproteina produkowana m.in. w drożdżach. Mimo że szczepionki te są bardzo skuteczne i bezpieczne oraz zostały włączone do narodowych programów szczepień w ponad 150 krajach, to 5-10% zdrowych osób z prawi­dłową odpornością nie wytwarza przeciwciał (anty-HBs), tj. przeciwciał skierowanych przeciwko białku antygenu powierzchniowego wirusa [110]. Minusem jest też to, że obecna procedura szczepienia zaleca stosowanie 2-3 da­wek w celu wywołania trwałej odporności [72]. Badania Cobleigha i wsp. w kierunku otrzymania bardziej efek­tywnej szczepionki, zdolnej do wywołania silniejszej od­powiedzi immunologicznej, polegają na konstrukcji wek­torów VSV-MS na bazie VSV ekspresjonującego część powierzchniowej glikoproteiny HBV (middle envelope surface protein – MS). Gen kodujący białko MS został wbu­dowany do genomu VSV między geny G i L. Eksperymenty z wykorzystaniem gradientu gęstości sacharozy wykazały, że białko MS nie jest włączane do wirionów i jest niezależ­nie wydzielane przez komórki zakażone VSV-MS. U my­szy CB6F1 szczepionych VSV-MS stwierdzono nie tylko lepszą odpowiedź humoralną, ale także bardziej swoistą odpowiedź komórkową, niż po szczepieniu białkiem MS z adiuwantem, czy komercyjnie dostępną szczepionką Engerix-B. Ponadto myszy szczepione tylko jedną dawką VSV-MS wykazywały odporność na infekcję HBV uzyski­waną po podaniu zwierzętom plazmidu pT-HBV1.3. Auto­rzy sugerują, że ze względu na zdolność wektora VSV-MS do wywoływania silnej, swoistej odpowiedzi komórkowej, szczepionki te mogą być szczególnie skuteczne jako szcze­pionki terapeutyczne, pomagające kontrolować istniejące zakażenie [15,16].

Eksperymentalne szczepionki przeciw HIV

Ludzki wirus niedoboru odporności (human immunode­ficiency virus – HIV), wywołujący zespół nabytego niedo­boru odporności (Acquired Immunodeficiency Syndrome – AIDS), do 2011 r. wywołał zakażenie 60 mln osób i był przyczyną 25 mln zgonów. Szacuje się, że ponad 35 mln osób jest nosicielami HIV-1 (dane z 2012 r.) i liczba ta może każdego roku wzrastać o kolejne 2 mln. Jak dotąd jedyna dostępna terapia polega na zastosowaniu leków antyretrowirusowych [24,73,100].

Genom HIV koduje białka osłonki (Env), strukturalne biał­ka Gag, wirusowe enzymy (Pol), dwa białka regulatorowe – Tat i Rev – i kilka pomocniczych (Vpu, Vif, Nef i Vpr). Na białka osłonki HIV składają się trimery zewnętrznej glikoproteiny gp120 niekowalentnie związane z trans­membranową glikoproteiną gp41 [52,94].

W rozwoju odporności przeciwko HIV rolę odgrywa za­równo odpowiedź komórkowa, jak i humoralna, podobnie jest w infekcji VSV, co skłoniło badaczy do użycia tego wi­rusa jako wektora przy testowaniu potencjalnych szcze­pionek przeciw AIDS [63]. W eksperymentach z 1997 r. zespół J. K. Rose’a wbudował gen kodujący białko osłonki gp140 ze szczepu HIV89,6 wyizolowanego od pacjenta, do genomu VSV między geny G i L [58]. W doświadczeniach wykorzystano trzy wektory VSV różniące się rodzajem ekspresjonowanego białka G na powierzchni, a miano­wicie: białko G ze szczepu Indiana (I), New Jersey (NJ) lub z wirusa Chandipura (Ch), również należącego do rodzaju Vesiculovirus. Przeciwciała skierowane przeciw białkom G różnych szczepów VSV nie reagują krzyżowo, dzięki czemu podczas sekwencyjnego szczepienia hete­rologicznymi wektorami w mniejszym stopniu wyzwa­lana jest odpowiedź przeciwko samym wektorom. Mia­na przeciwciał skierowanych przeciw glikoproteinie G u myszy w przypadku podawania kolejnych szczepionek heterologicznych zmniejszały się odpowiednio 8- (przy pierwszym wzmocnieniu szczepienia) i 80-krotnie (po podaniu drugiej szczepionki wzmacniającej odpowiedź), w porównaniu do grupy kontrolnej, której podawano szczepionki homologiczne. Wyniki badań potwierdza­ją, że sekwencyjne szczepienie (w miesięcznych odstę­pach) daje lepsze wyniki, jeśli wykorzystuje się wekto­ry różniące się ekspresjonowanym białkiem G. Dzięki takiemu systemowi szczepień uzyskano czterokrotnie wyższe miana przeciwciał przeciw gp140 niż w przy­padku stosowania wektorów homologicznych [93]. Po eksperymentach na modelu mysim potencjał opraco­wanych szczepionek potwierdzono na modelu rezusa. Uzyskany wynik był zadowalający – otrzymano wysokie miano przeciwciał przeciwko białkom osłonki HIV oraz wyraźnie większe zaangażowanie limfocytów T CD4⁺ oraz cytotoksycznych swoistych wobec białek Gag i Env. Za­skakująco dobre rezultaty tłumaczy się także dłuższym okresem między szczepieniami wynoszącym dwa miesią­ce zamiast jednego [92]. Sekwencyjne szczepienie wek­torami heterologicznymi dawało jeszcze lepsze efekty, jeśli kolejne wektory konstruowane były z wirusów od­rębnych gatunkowo. Podczas badań na modelu mysim zauważono, że szczepienie osobników wektorem VSV Gag i wzmocnienie odpowiedzi wektorem wirusa krowianki ekspresjonującego białko Gag, powodowało pięciokrotny wzrost zaangażowania limfocytów T CD8⁺ w odpowiedź immunologiczną w porównaniu do wzmocnienia odpo­wiedzi z użyciem VSV Gag i heterologicznym białkiem G [45]. Podobny trend obserwowano w przypadku za­stosowania modelu rezusa i oporności na infekcję silnie patogennym szczepem hybrydowym SHIV 89,6P (simian­-human immunodeficiency virus), po szczepieniu wek­torami heterologicznymi. SHIV jest konstruktem chime­rycznym na bazie małpiego wirusa niedoboru odporności (simian immunodeficiency virus – SIV) z osłonką HIV. Pierwsza badana grupa małp została zaszczepiona w sys­temie VSV-VSV, oznacza to, że wektory obu szczepio­nek (pierwszej – pierwotnej i drugiej – przypominającej, wzmacniającej odpowiedź) skonstruowano na bazie VSV ekspresjonującego białka Gag, Pol i Env pochodzące od hybrydy SHIV. Różnice między wektorami VSV dotyczyły ich białek G – pierwotny wektor miał białko G ze szczepu Indiana, natomiast wektor wtórny był mieszaniną dwóch wektorów z białkami G na powierzchni, odpowiednio wi­rusa Chandipura i VSV szczepu New Jersey. Drugą grupę małp szczepiono systemem VSV-MVA, w którym wektor pierwotny był taki sam jak w systemie poprzednim, ale wektor szczepionki przypominającej bazował na zmody­fikowanym wirusie krowianki szczepu Ankara (modified vaccinia Ankara – MVA) ekspresjonującym białka Gag, Pol i Env wirusa SHIV. Wszystkie zaszczepione, a następnie eksperymentalnie zakażone zwierzęta pozostały zdro­we, jednak system VSV-MVA wykazał silniejszą ochronę przed rozwojem infekcji SHIV niż system VSV-VSV, co wiązało się z niższym mianem wirusa na wcześniejszych etapach infekcji. Ponadto zaobserwowano większy pro­cent limfocytów T CD4⁺ we krwi małp grupy VSV-MVA po infekcji SHIV [87].

Doskonalenie heterologicznych systemów szczepień do­prowadziło do wykorzystywania bardzo rzadkich wiru­sów w roli wektorów. Shell i wsp. skonstruowali wekto­ry bazujące na replikonie wirusa gorączki lasu Semliki (Semliki Forest virus – SFV), ekspresjonującym białka SIV: Gag lub Env. Dodatkowo genom SFV zamknięto w infek­cyjnych cząsteczkach zawierających glikoproteinę VSV na powierzchni (SFVG) [95]. Oprócz tego wykorzystano wektor VSV z wklonowanym między geny G i L genem kodującym białko EnvG. Białko EnvG stanowiło cząstecz­kę hybrydową – białko powierzchniowe E660 pochodzące od SIV, którego domenę cytoplazmatyczną zamieniono na odpowiadającą jej sekwencję białka G z VSV, powodu­jąc bardziej wydajne wbudowywanie się EnvG w błonę cząsteczek VSV [57]. W ciągu 112 dni rezusom podano trzy szczepionki: dwie zawierały wektor VSV (New Jersey lub Indiana), natomiast trzecia – SFVG. Wszystkie wek­tory ekspresjonowały te same białka SIV (EnvG i Gag). Po 21 tygodniach od podania pierwotnej szczepionki, małpy zainfekowano doodbytniczo patogennym szcze­pem SIVsmE660. Zaobserwowano silne działanie ochron­ne użytych szczepionek. Tylko u dwóch spośród sześciu osobników szczepionych rozwinęła się infekcja (w grupie kontrolnej rozwinęła się u wszystkich sześciu osobników). Ponadto w grupie szczepionej po zakażeniu SIV zauważo­no zwiększoną liczbę limfocytów T CD4⁺, zarówno w jeli­tach, jak i we krwi. Surowiczy poziom przeciwciał skiero­wanych przeciw białkom osłonki SIV w grupie szczepionej wzrastał po podaniu każdej spośród trzech szczepionek i utrzymywał się na wysokim poziomie nawet 100 dni po zakażeniu małp SIV [95].

Pomimo postępów w opracowywaniu systemu zmniej­szenia ryzyka transmisji wirusów przez łożysko w czasie ciąży, karmienie piersią w dalszym ciągu pozostaje poważ­nym czynnikiem zagrożenia przeniesienia HIV z matki na dziecko w okresie poporodowym. Karmienie piersią sta­nowi duży dylemat kobiet zamieszkałych w szczególności w krajach ubogich, ponieważ jest najlepszym sposobem odżywiania noworodków oraz zapewnienia im ochrony przed innymi chorobami zakaźnymi, ale jednocześnie może się przyczynić do przenoszenia HIV [60]. W sytuacji idealnej szczepionka przeciw HIV powinna zostać poda­na dziecku krótko po jego narodzinach i wywołać szybką i silną odpowiedź przeciwwirusową w błonie śluzowej jamy ustnej. Van Rompay i wsp. szczepili nowo narodzone rezusy dwoma rodzajami szczepionek. Pierwszy obejmo­wał dwie dawki – dożylną i doustną – zawierające jedynie atenuowany szczep SIV (SIVmac1A11). Drugi składał się ze szczepionek heterologicznych:
• pierwotnej szczepionki zawierającej cztery konstrukty VSV-SIV, różniące się kodowanymi białkami SIV (Gag, Pol, EnvG lub Rev-Tat-Nef-Vif); podawanej doustnie za­raz po urodzeniu [102],
• wtórnej szczepionki zawierającej dwa konstrukty oparte na wirusie krowianki szczepu Ankara: MVA-SIV (kodują­ce białka SIV Gag i Pol lub Env), podawanej domięśniowo, dwa tygodnie po urodzeniu [26,103].

Wyniki badań po raz kolejny potwierdziły, że podanie wtórnej, heterologicznej szczepionki wywołuje silniej­szą odpowiedź przeciwwirusową niż po podaniu jedynie szczepionki pierwotnej. Oba systemy indukowały wytwo­rzenie odpowiedzi humoralnej swoistej dla SIV, ale różnej pod względem swoistości wobec zawartych antygenów. Szczepionki z SIVmac1A11 skutkowały powstaniem więk­szej ilości przeciwciał skierowanych przeciw białkom Gag i Pol SIV, natomiast drugi system szczepionek powodował wytwarzanie większej ilości przeciwciał wiążących się do białek osłonki SIV. Nie uzyskano odpowiedzi na pytanie, które przeciwciała są bardziej pożądane in vivo. W ślinie osobników szczepionych wykryto IgG swoiste dla SIV, nie­zależnie od tego, którym systemem były szczepione. Mogą one odgrywać ważną rolę ochronną przed transmisją wi­rusa z matki na dziecko podczas karmienia piersią [102].

W kolejnych badaniach ocenie poddano użyteczność sys­temu szczepionek heterologicznych w indukcji ochrony przed zakażeniem wirusem SIVmac251. Noworodki re­zusów szczepiono układem heterologicznym (pierwotna szczepionka zawierająca konstrukty VSV-SIV ekspresjo­nujące białka SIV: Gag, Pol i EnvG; wtórna szczepionka zawierająca konstrukty MVA-SIV ekspresjonujące białka Gag, Pol i Env). Dwa tygodnie po podaniu szczepionki wtórnej rezusy zakażano doustnie SIV, imitując sytuację, jaka występuje podczas karmienia noworodków piersią, a następnie obserwowano przez okres 3 miesięcy. Zasto­sowany system szczepienia w żadnym z badanych przy­padków nie zapobiegł rozwojowi infekcji. Zaobserwowano jednak pewne efekty, które mogą posłużyć za wskazówki przy opracowywaniu kolejnych szczepionek przeciw HIV:
• w osoczu osobników szczepionych potwierdzono obec­ność wykrywalnego poziomu przeciwciał klasy IgA swo­istych dla SIV. Poziom ten był odwrotnie proporcjonalny do rozwoju wiremii podczas całego jej przebiegu;
• szczepione osobniki o potwierdzonych w migdałkach wyż­szych mianach limfocytów T pamięci oraz CD8⁺ swoistych dla SIV, wytwarzających TNF-α lub IFN-γ, charakteryzo­wały się niższym poziomem replikacji wirusa. Nie wiado­mo jednak czy zidentyfikowane limfocyty znajdowały się w migdałkach rezusów jeszcze przed infekcją SIVmac251. Sugeruje się, że dalsze strategie dotyczące szczepionek przeciw HIV przeznaczonych dla noworodków powinny koncentrować się na zwiększeniu lokalnej odpowiedzi immunologicznej w obrębie błon śluzowych jamy ustnej i gardła po podaniu antygenów szczepionkowych [71].

Podczas opracowywania szczepionek przeciw HIV wyko­rzystuje się również inne wektory wirusowe zawierające glikoproteinę osłonkową VSV. Takie konstrukty mogą po­łączyć pożądane cechy cyklu replikacyjnego wybranego wirusa i jednocześnie zmniejszyć odpowiedź wobec sa­mego wektora w przypadku użycia szczepionki wtórnej. Jednym z przykładów wykorzystania takiego konstruktu na modelu rezusa było testowanie użyteczności wektora na bazie atenuowanego wirusa wścieklizny (rabies virus – RV), który ekspresjonował białka Env lub Gag SHIV oraz glikoproteinę G VSV (VSV-G), zastępującą RV-G (wektory SPBN-IG-SIV Gag i SPBN-IG-89.6P Env). Atenuacja wirusa wścieklizny polegała na wprowadzeniu mutacji w geno­mie RV, która w dużym stopniu ograniczała namnaża­nie się wirusa wyłącznie w komórkach neuronalnych. Wszystkie cztery zaszczepione małpy wykazywały silną odpowiedź komórkową skierowaną przeciw białkom Gag SIV i Env SHIV89.6P oraz wytwarzały przeciwciała neutra­lizujące SHIV89.6P. Ponadto trzy z nich charakteryzowały się wysokim odsetkiem limfocytów T CD4⁺, co skutkowa­ło brakiem wykrywalnej wiremii w surowicy nawet w 12 tygodni po zakażeniu [74].

Inna strategia opracowywania szczepionek przeciwko HIV skupia się na potencjale szczepionek wykorzystujących DNA. Przy zastosowaniu plazmidu z wbudowanym genem kodującym glikoproteinę G z VSV możliwe jest wzmocnie­nie odpowiedzi limfocytów T CD8⁺ swoistych wobec wybra­nego antygenu, podanego jednocześnie z tym plazmidem [69]. Plazmid DNA, po domięśniowym wstrzyknięciu jest pobierany przez miocyty oraz komórki im towarzyszące, w których dochodzi do ekspresji antygenu kodowanego przez ten plazmid i jego transportu do komórek prezen­tujących antygen (APC) pochodzących ze szpiku kostnego [18]. Tam antygen podlega obróbce i prezentacji z udzia­łem cząsteczek MHC klasy I lub II [13]. W celu zwiększenia udziału CTL swoistych dla HIV (Gag) w odpowiedzi komór­kowej, Marsaci i wsp. szczepili myszy jednocześnie dwo­ma plazmidami: pierwszym – kodującym wszystkie białka HIV-1 poza Env (HIV-1 Gag); i drugim – kodującym VSV-G, co miało skutkować powstaniem in vivo HIV-1 z osłonką VSV (VSV-G-coated HIV-1 Gag) [70]. Glikoproteina VSV umożliwiała tak skonstruowanemu wirusowi wejście do komórki za pośrednictwem endocytozy zależnej od pH [2]. W wyniku przeprowadzonego doświadczenia zaobserwo­wano, że immunizacja myszy zastosowanymi plazmida­mi prowadziła do zwiększonej odpowiedzi limfocytów T CD8⁺ swoistych dla Gag. Podejrzewa się, że dzięki obecno­ści białka G w osłonce wirusa HIV-1 zwiększył się wychwyt i przetwarzanie antygenu Gag przez APC biorące udział w immunologicznej odpowiedzi poszczepiennej. Poza tym dowiedziono, że wirus HIV-1 z osłonką VSV jest przetwa­rzany nie tylko z udziałem MHC klasy II ale też MHC kla­sy I. Pozytywne wyniki zastosowanej koinfekcji wydają się wynikać z działania dwóch mechanizmów: wzmocnienia odpowiedzi CTL z powodu fuzogennej aktywności gliko­proteiny VSV oraz swoistych immunogennych właściwości VSV-G, polegających m.in. na aktywacji limfocytów T wy­twarzających IFN-γ [70].

Chimeryczne wirusy SIV ekspresjonujące glikoproteinę G zastosowano także do wzmocnienia odpowiedzi im­munologicznej podczas szczepienia z użyciem cząstek wirusowych typu „single-cycle” (sc), np. scSIV. Wirus w takiej postaci może przejść tylko jeden cykl infekcyj­ny, podczas którego niemożliwe jest odtworzenie replika­cyjnie kompetentnego wirusa w wyniku rekombinacji in vivo, jednak odpowiedź immunologiczna jest słabsza niż w przypadku atenuowanego HIV czy SHIV. Przypuszcza się, że VSV-G warunkuje większą infekcyjność scSIV, która może również skutkować zakażaniem bezpośrednio APC i w efekcie intensywną prezentacją antygenów SIV. Aby zapobiec zmniejszeniu odpowiedzi na szczepienie wtórne w wyniku aktywności przeciwciał skierowanych przeciw VSV-G, kolejne sekwencje szczepionek zawierały różne serotypy VSV-G (zastosowana taktyka jest podobna jak w przypadku użycia heterologicznych szczepionek przez N. F. Rose i wsp. [92,93]). Makaki immunizowane tym sys­temem, a następnie zakażone szczepem SIV_mac239, miały niższe miana wirusa w czasie chronicznej fazy infekcji, przez ponad rok od zakażenia, w porównaniu do małp nieszczepionych [55].

Szczepionki przeciw filowirusom wywołującym gorączki krwotoczne

Wirusy Marburg (Marburg virus – MARV) i Ebola (Ebola virus – EBOV), należące do rodziny Filoviridae, są czynni­kami etiologicznymi gorączek krwotocznych noszących nazwy tych wirusów. Rodzaj Marburgvirus zawiera tyl­ko jeden gatunek Lake Victoria marburgvirus (MARV), podczas gdy rodzaj Ebolavirus reprezentowany jest przez czterech przedstawicieli: wirusa Ebola-Sudan (Sudan ebo­lavirus – SEBOV), Ebola-Zaire (Zaire ebolavirus – ZEBOV), Ebola-Ivory Coast (Cote d’Ivoire ebolavirus – CIEBOV) i Ebola-Reston (Reston ebolavirus – REBOV) [44,53,86]. Piąty, domniemany gatunek – wirus Ebola-Bundibugyo (Bundibugyo ebolavirus – BEBOV), związany jest z wybu­chem epidemii w Ugandzie w 2007 r. [99]. Wymienione wyżej wirusy (z wyjątkiem REBOV) są chorobotwórcze dla ludzi i większość z nich wywołuje epidemie charakteryzu­jące się śmiertelnością 25-90% [28]. Ponadto do tej pory nie zarejestrowano oficjalnie żadnej szczepionki chronią­cej przed infekcją MARV i EBOV, nie jest znane również żadne leczenie przyczynowe. Biorąc powyższe fakty pod uwagę, wymienione filowirusy potencjalnie mogą zostać wykorzystane jako broń biologiczna [8].

Genomy MARV i EBOV kodują siedem białek: nukleopro­teinę (NP), białko wirionu (virion protein – VP) 24, VP30, glikoproteinę (GP), VP35, VP40 i polimerazę (L) [43,61]. Poza tym EBOV ekspresjonuje rozpuszczalną glikopro­teinę (soluble GP – sGP), kodowaną przez gen GP [104]. Wyniki dostępnych badań wskazują, że GP, ze zmiennym udziałem NP, może stanowić klucz do opracowania im­munogennej szczepionki [35].

Zespół badawczy T. W. Geisberta wykorzystał do badań nad szczepionkami przeciw filowirusom wektory bazu­jące na VSV (a skonstruowane przez zespół U. Ströhera [33]), w których glikoproteina rabdowirusa została za­stąpiona GP z wirusa Ebola-Zaire (VSVΔG/ZEBOVGP) lub glikoproteiną wirusa Marburg ze szczepu Musoke (VSVΔG/MARVGP-Musoke) [21,41]. Wirusy takie, mimo braku proteiny G ulegają replikacji, ale nie są patogen­ne [97]. Potencjał ochronny szczepionki zawierającej VSVΔG/MARVGP-Musoke podanej domięśniowo oce­niano u makaków jawajskich. Grupę kontrolną stanowiły dwa osobniki, którym podano tylko VSVDG/ZEBOVGP. Po 28 dniach szczepione małpy zakażano wysokimi, le­talnymi dawkami różnymi szczepów MARV: Musoke, An­gola (który jest bardziej zjadliwym szczepem) oraz słabo spokrewnionym z nimi szczepem Ravn. Podobnie jak w przypadku wcześniejszych badań tej grupy, w których małpy zaszczepione VSVΔG/MARVGP-Musoke przeżyły zakażenie homologicznym szczepem MARV [59], w ko­lejnej serii eksperymentów wszystkie małpy szczepione VSVΔG/MARVGP-Musoke przeżyły też podanie hete­rologicznych szczepów Angola i Ravn bez widocznych zmian klinicznych. Natomiast u małp w grupie kontro­lnej już w 8 dniu po zarażeniu wirusem rozwinęły się typowe objawy gorączki krwotocznej Marburg. W celu wyjaśnienia mechanizmu działania ochronnego zastoso­wanej szczepionki zbadano poziom przeciwciał IgG, ich właściwości neutralizujące oraz wytwarzanie cytokin prozapalnych przez limfocyty T CD4⁺ i CD8⁺. W surowi­cach wszystkich zwierząt potwierdzono wysokie mia­no przeciwciał anty-MarvIgG, zarówno przed zakaże­niem, jak i po podaniu wirusa MARV oraz niski poziom przeciwciał neutralizujących. U żadnego ze zwierząt nie stwierdzono wytwarzania IFN-γ i TNF-α przez popula­cje limfocytów CD4⁺ lub CD8⁺. Autorzy pracy sugerują, że ochronne działanie szczepionki może wynikać z wy­sokiego poziomu przeciwciał nieneutralizujących, jaki zauważono u szczepionych małp [21].

Badania nad działaniem ochronnym szczepionek za­wierających VSVΔG/ZEBOVGP i VSVDG/MARVGP-Mu­soke do 2008 r. wykorzystywały podanie wirusa w po­staci iniekcji. Te same wektory szczepionkowe zostały też wykorzystane podczas eksperymentalnej infekcji wirusowej drogą kropelkową. Wiadomo, że w Związku Radzieckim eksperymentowano z MARV w aerozolu [3]. Dlatego też uważa się, że w przypadku wykorzystania filowirusów jako broni biologicznej, rozpylenie wirio­nów w powietrzu przez terrorystów jest bardzo praw­dopodobne. Zwłaszcza, że filowirusy są silnie patogenne w tej postaci. W eksperymentach Geisberta i wsp. za­równo model badawczy, jak i wektory oraz miano po­danego wirusa były takie same jak w przypadku badań Daddario-DiCaprio i wsp. z 2006 r., w których wirusa aplikowano w postaci iniekcji. Różnica polegała jedynie na sposobie podania wirusa oraz użycia tylko jednego, homologicznego szczepu MARV (Musoke). U zaszcze­pionych osobników nie stwierdzono żadnych objawów gorączki krwotocznej. Natomiast małpy z grupy kon­trolnej rozwinęły pełnoobjawowy obraz choroby oraz wysoką wiremię. Zastosowane szczepionki wzbudziły umiarkowaną odpowiedź humoralną (przeciwciała IgG swoiste dla odpowiednio ZEBOV i MARV) po podaniu od­powiedniego filowirusa. Nie udało się natomiast wykryć udziału odpowiedzi komórkowej w wykazanym ochron­nym działaniu szczepionki [36].

W 2009 r. zespół X. Qiu połączył różne podejścia w odniesieniu do szczepionek przeciw ZEBOV, porównując działanie ochronne wektora VSVΔG/ZEBOVGP w zależności od spo­sobu podania. Testowano zarówno iniekcję domięśniową, jak i podania doustne oraz donosowe. Zwierzęta kontrolne szczepiono VSVΔG/MARVGP, który nie działa ochronnie wobec infekcji ZEBOV. Po 28 dniach od podania szczepionki, makaki jawajskie zakażano patogennym wirusem. Zgodnie z przewidywaniami małpy z grupy kontrolnej zapadły na gorączkę krwotoczną i zostały poddane eutanazji w 6. dniu od zakażenia filowirusem. W odróżnieniu od nich makaki szczepione VSVΔG/ZEBOVGP przeżyły podanie wirusa Ebo­la, niewykazując zauważalnych zmian chorobowych. Wyko­nana przez autorów pracy analiza hematologiczna badanych małp nie wykazała żadnych nieprawidłowości, oprócz lek­ko podwyższonego trombokrytu w grupie małp, w której szczepionkę podano doustnie i donosowo. Przeprowadzono również dogłębną charakterystykę humoralnej odpowiedzi immunologicznej, indukowanej szczepionką. Między drugim a trzecim tygodniem od podania szczepionki, w surowicach wszystkich małp immunizowanych VSVΔG/ZEBOVGP wy­stępowały wysokie miana przeciwciał klasy IgA, IgM oraz IgG swoistych dla ZEBOVGP. Po iniekcji filowirusa miano przeciwciał IgM nie uległo podwyższeniu, natomiast wzro­sły poziomy dwóch pozostałych klas przeciwciał. Najwyższy poziom przeciwciał IgA i IgG zaobserwowano w przypadku donosowego podania szczepionki. Natomiast w przypadku przeciwciał IgM najwyższe wartości dotyczyły zwierząt im­munizowanych donosowo lub doustnie. Przeciwciała neu­tralizujące ZEBOV wykryto u każdej małpy immunizowanej VSVΔG/ZEBOVGP, lecz w grupie z domięśniowym podaniem szczepionki ich poziom był ledwie wykrywalny. Niezależnie od sposobu podania szczepionki dochodziło do indukcji sil­nej odpowiedzi interferonowej swoistej dla ZEBOV. Począt­kowo najwyższy poziom limfocytów wydzielających IFN-γ charakteryzował grupę z domięśniowym podaniem szcze­pionki, lecz w późniejszych etapach rozwoju odporności do­minowały grupy, w których szczepionkę podano donosowo lub doustnie. Podobną zależność odnotowano w przypadku liczby limfocytów wydzielających IL-2. Podanie szczepionki donosowo wywołało u zwierząt najsilniejszą, w porównaniu do innych grup, odpowiedź komórkową. Charakteryzowała się ona zwiększonym odsetkiem zarówno limfocytów cyto­toksycznych, jak i pomocniczych [85].

Badania grupy pod kierunkiem Geisberta, których wy­niki opublikowano w 2006 r., miały na celu sprawdzenie terapeutycznego działania szczepionki VSVΔG/MARVGP­-Musoke podanej po ekspozycji na wirusa. Szczepion­kę podawano rezusom w 20-30 min po podaniu letalnej dawki homologicznego MARV. Wszystkie osobniki (pięć) szczepione VSVΔG/MARVGP-Musoke przeżyły 80 dni bez wykazania objawów klinicznych typowych dla gorączki krwotocznej Marburg. Zgodnie z założeniem, trzy kontro­lne zwierzęta rozwinęły pełnoobjawową chorobę (po 12 dniach od iniekcji wirusa). Wyniki uzyskane przez zespół badawczy Geisberta dają nadzieję na opracowanie nie tylko skutecznej szczepionki zapobiegającej zakażeniu, lecz również użytecznego środka w leczeniu osobników uprzednio zakażonych MARV [22].

Terapeutyczne działanie szczepienia było słabsze, gdy okres między ekspozycją na patogennego wirusa, a poda­niem szczepionki wydłużono do 24 i 48 godzin. W pierw­szym przypadku zakażenie wirusem przeżyło pięć spośród sześciu badanych małp, natomiast w drugim już tylko 33% szczepionych zwierząt. Autorzy pracy podkreślają jednak, że w obliczu braku skutecznego leku na gorączkę krwo­toczną wywoływaną przez MARV, uzyskane przez nich wyniki są godne uwagi [40].

Ten sam zespół badawczy ocenił działanie ochronne szczepionek opartych na wektorach VSV, podawanych po ekspozycji na SEBOV. Jest to drugi, zaraz po ZEBOV, naj­bardziej patogenny gatunek wirusa Ebola. Do szczepień zastosowano wektor na bazie VSV z genem kodującym gli­koproteinę SEBOV zamiast GP rabdowirusa – VSVΔG/SE­BOVGP (korzystając z plazmidów skonstruowanych przez M. Garbutta i wsp. [33]). Szczepionkę podawano rezusom w 20-30 min po domięśniowej iniekcji SEBOV homologicz­nego szczepu Boniface. W przeciwieństwie do wyników badań ze szczepionką VSVΔG/MARVGP-Musoke i zaka­żeniem wirusem MARV, zwierzęta szczepione VSVΔG/ SEBOVGP przeżyły zakażenie SEBOV, niemniej jednak wy­kazywały objawy chorobowe: gorączkę, wysypkę, zmiany w hematologii i poziomie enzymów we krwi. Większość badanych wartości powróciła do normy u szczepionych małp w 14. dniu od infekcji SEBOV. W grupie małp szcze­pionych zaobserwowano wzrost poziomu przeciwciał kla­sy IgM i IgG po iniekcji patogennego wirusa. Natomiast u zwierzęcia kontrolnego nie zauważono zwiększonego miana przeciwciał, co korelowało z rozwojem pełnoobja­wowej gorączki krwotocznej i zejściem śmiertelnym w 17. dniu od ekspozycji na filowirusa [38].

Terapeutycznym działaniem szczepionek przeciwko EBOV zajęli się Feldmann i wsp. wykorzystując system rekombi­nowanego VSV (VSVΔG/ZEBOVGP) opracowany wcześniej (w 2004 r. przez zespół pod kierownictwem U. Ströhera [33]) oraz wirusy EBOV: szczepy ZEBOV adaptowane do my­szy (MA-ZEBOV) i świnki morskiej (GA-ZEBOV). Szczepienie zwierząt VSVΔG/ZEBOVGP odbywało się 24 godz. przed, 30 min lub 24 godz. po iniekcji ZEBOV. Wszystkie zaszczepione myszy, niezależnie od czasu podania szczepionki, przeżyły zakażenie MA-ZEBOV, w przeciwieństwie do grupy kontro­lnej. Ochronne działanie szczepionki w przypadku świnek morskich nie było już tak spektakularne, ponieważ doty­czyło połowy zwierząt poddanych ekspozycji GA-ZEBOV. Podobne wyniki uzyskano u rezusów, połowa zaszczepio­nych małp przetrwała infekcję ZEBOV. Niezależnie od tego czy zwierzęta otrzymały szczepienie, u osobników, które przeżyły zaobserwowano dużo niższą, przejściową wire­mię. Szczepione rezusy rozwinęły odpowiedź humoralną swoistą dla ZEBOV charakteryzującą się niskim mianem przeciwciał IgM oraz umiarkowanym mianem IgG wykry­walnych do 22 dnia od podania ZEBOV. U szczepionych rezusów zauważono również zwiększoną liczbę komórek NK, co w połączeniu ze wspomnianą odpowiedzią humo­ralną, prawdopodobnie wiąże się z bardziej efektywnym zabijaniem komórek zakażonych wirusem i dzięki temu prowadziło do eliminacji infekcji [29].

Bezpieczeństwo stosowania szczepionek opartych na replikującym się wirusie jest szczególnie istotne. Dla­tego bardzo ważne jest określenie tolerancji wektorów wirusowych przez osoby z osłabionym układem odpor­nościowym, np. pacjentów zakażonych HIV, zwłaszcza że wszystkie dotychczasowe ogniska EBOV występowa­ły na terenach Centralnej i Zachodniej Afryki z wysoką częstością zakażeń HIV w populacji. W badaniach oce­ny bezpieczeństwa stosowania szczepionek, przepro­wadzonych pod kierownictwem T. W. Geisberta użyto rezusów zainfekowanych SHIV162p3. Wirus SHIV162p3 powoduje u małp drastyczny spadek liczby dziewiczych limfocytów T CD4⁺ i CD8⁺ oraz limfocytów T CD4⁺ pamię­ci [20]. Zwierzęta z klinicznymi objawami infekcji SHIV szczepiono VSVΔG/ZEBOVGP, a następnie po miesiącu zakażano ZEBOV. U żadnego z zaszczepionych zwierząt nie stwierdzono gorączki ani innych objawów klinicz­nych. Ponadto nie wystąpiły żadne zmiany w hemato­logii lub chemii klinicznej po szczepieniu. Obserwowa­no jedynie łagodną wiremię VSVΔG/ZEBOVGP 2 dni po zaszczepieniu. Szczepionka częściowo chroniła rezusy zakażone SHIV przed rozwojem gorączki krwotocznej. Cztery spośród sześciu szczepionych zwierząt przeżyło infekcję ZEBOV, lecz tylko u trzech z nich wykryto średni poziom przeciwciał IgG swoistych dla ZEBOV. Autorzy pracy podejrzewają, że większą rolę ochronną w orga­nizmie w czasie infekcji ZEBOV spełniają limfocyty T CD4⁺ niż, jak pierwotnie sądzono, przeciwciała swoiste dla tego wirusa, ponieważ dwa szczepione rezusy, które nie przeżyły infekcji, miały najniższy poziom limfocytów T CD4⁺. Wcześniej wykonane badania wykazały także, że z zakażeniem ZEBOV u naczelnych wiąże się spadek liczby komórek CD4⁺ [37,88].

Idealna szczepionka przeciwwirusowa powinna być m.in. bezpieczna, chronić przed rozwojem infekcji, za­pobiegać wystąpieniu objawów chorobowych, wzbu­dzać odpowiedź humoralną i komórkową, najlepiej już po podaniu pierwszej dawki. W przypadku szczepionek przeciwko filowirusom do wymienionych oczekiwań na­leży dodać jeszcze wykazywanie ochronnego działania jednocześnie wobec wirusa Marburg oraz wszystkich (chorobotwórczych u ludzi) gatunków wirusa Ebola. W celu spełnienia powyższych oczekiwań opracowano szczepionkę, która zawierała trzy wektory VSVΔG z gli­koproteinami ZEBOV, SEBOV i MARV. Szczepione grupy makaków jawajskich następnie infekowano różnymi ga­tunkami wirusów Ebola (ZEBOV, SEBOV i CIEBOV) lub wi­rusem MARV. Wszystkie osobniki, którym podano mul­tiwalentną szczepionkę przeżyły zakażenie filowirusem, niezależnie od tego, jakiego był gatunku. Mimo że sero­logiczna odpowiedź po podaniu szczepionki charaktery­zowała się niskim lub średnim poziomem wytwarzanych przeciwciał IgG swoistych dla SEBOV, ZEBOV lub MARV, to zarówno obserwacje kliniczne, jak i ocena poziomu wiremii potwierdziły ochronne działanie zastosowanej szczepionki w 100% badanych przypadków. Jedynie dwie szczepione małpy z grupy zainfekowanej SEBOV miały przejściową gorączkę i limfopenię w szóstym dniu od zarażenia filowirusem [39].

Podsumowanie

Rekombinowany VSV jest niezwykle interesującym kan­dydatem do wykorzystania jako wektor szczepionkowy, nie tylko z powodu charakterystycznej konstrukcji jego genomu (jeden promotor i możliwość wbudowania róż­nego rodzaju insertów), ale również ze względu na jego immunogenność. VSV wyzwala w zainfekowanym organi­zmie zarówno komórkową, humoralną, jak i śluzówkową odpowiedź immunologiczną, nawet po podaniu pojedyn­czej dawki [27]. Jednak mechanizm, dzięki któremu VSV jest w stanie wywołać tak silną odpowiedź w dużej mierze jest nieznany [15]. Wektory VSV są wszechstronnie bada­ne jako potencjalne szczepionki chroniące nie tylko przed pęcherzykowatym zapaleniem jamy ustnej zwierząt ho­dowlanych, ale również w prewencji zakażenia wieloma groźnymi, ludzkimi patogenami, np. wirusem Andów (han­tawirus) [12], wirusem Nipah (paramyksowirus) [14], noro­wirusami [67] czy cytomegalowirusem [89]. Dużą nadzieję wiąże się z wykorzystaniem wektorów VSV w przypadku patogenów wirusowych zbierających największe żniwo w obecnym czasie, tzn. filowirusów [35], HPV [10], wiru­sów zapalenia wątroby typu B i C [16,68] oraz wirusa grypy, groźnego głównie z powodu wywoływanych powikłań [96].

Jedną z głównych przeszkód przy konstruowaniu wektorów szczepionkowych na bazie VSV jest odporność skierowana przeciw samemu wirusowi. Dlatego też tak ważnym jest fakt, że tylko niewielki procent ludzi jest seropozytywnych względem VSV. Potwierdzają to badania przeprowadzone przez E. Paradowską na krwi matek pobranej bezpośred­nio po porodzie [79], a następnie przez K. Zwolińską i wsp. (Laboratorium Wirusologii, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. L. Hirszfelda we Wrocławiu) na próbkach krwi pobranych od około 120 zdrowych wolon­tariuszy. W żadnej z nich nie wykryto przeciwciał neu­tralizujących VSV (dane niepublikowane). Ponadto wiele wirusów konstruowanych na bazie VSV ma substytucję glikoproteiny powierzchniowej, przeciw której, podczas infekcji wytwarzane są przeciwciała neutralizujące. Dzięki temu seropozytywność potencjalnego pacjenta względem VSV przestaje mieć znaczenie [21]. Z kolei problem wytwa­rzania przeciwciał skierowanych przeciw glikoproteinie VSV in vivo w przypadku podawania szczepionek wtórnych można rozwiązać z użyciem wektorów mających heterolo­giczną glikoproteinę (pochodzącą z różnych szczepów VSV lub przedstawicieli rodzaju Vesiculovirus) [93].

Ważną cechą skutecznej szczepionki powinna być trwa­łość indukowanej odporności. Jest to szczególnie istotne w przypadku immunizacji przeciwko patogenom w rejo­nach tropikalnych, gdzie realizacja szczepień wtórnych może być utrudniona. Udowodniono, że szczepionki za­wierające atenuowane wektory wirusowe wykazują dzia­łanie ochronne przeciw żółtej gorączce przez ponad 30 lat [82]. Nie wiadomo czy podobny efekt uda się uzyskać przy zastosowaniu bezpieczniejszych wektorów (replikacyjnie defektywnych) na bazie VSV. Jak do tej pory otrzymano obiecujące wyniki – przy zastosowaniu wektora VSV typu „single-cycle”, podczas szczepienia uzyskano odpowiedź immunologiczną porównywalną do szczepionki z wiru­sem atenuowanym [83].

Pomimo wszystkich wymienionych zalet, rekombinowany VSV nie jest wektorem idealnym. Liczne badania dowodzą, że rVSV podany myszom donosowo wykazuje neurotropizm i neuropatogenność [90]. Rozwiązanie tego problemu wy­daje się coraz bliższe, jak dowodzą badania Ahmeda i wsp. Zamiana jednego aminokwasu w białku M VSV prowadziła do zahamowania jego zdolności do inhibicji ekspresji genów gospodarza. Skutkowało to brakiem neuropatogenności, ale nie wpływało na wzbudzanie odpowiedzi immunologicznej [1]. Johnson i wsp. wykazali, że donosowe podanie dzikiego szczepu VSV nie powodowało u rezusów zmian w ośrodko­wym układzie nerwowym. Natomiast podanie tego wirusa bezpośrednio do mózgu wywoływało wiele objawów neu­rologicznych [56]. Sytuacja może się przedstawiać jednak całkiem inaczej w przypadku zastosowania wirusów VSV z podmienioną glikoproteiną na powierzchni osłonki. Bada­nia z 2012 r. dowiodły, że podanie szczepionek zawierających rVSV-ZEBOV-GP oraz rVSV-MARV-GP nie prowadziło do neuropatogenności u makaków jawajskich, nawet po bez­pośrednim podaniu do mózgu [75]. Wyniki te potwierdzają, że istnieje realna szansa na poddanie badaniom klinicznym opracowywanych szczepionek zawierających rekombinowa­ny VSV, podobnie jak w przypadku szczepionki przeciw HCV – składniki szczepionki (antygeny E1 i E2) wyprodukowano wykorzystując wektory skonstruowane na bazie VSV [32].

PIŚMIENNICTWO

[1] Ahmed M., Marino T.R., Puckett S., Kock N.D., Lyles D.S.: Immune response in the absence of neurovirulence in mice infected with M protein mutant vesicular stomatitis virus. J. Virol., 2008; 82: 9273-9277
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[2] Aiken C.: Pseudotyping human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) by the glycoprotein of vesicular stomatitis virus targets HIV-1 entry to an endocytic pathway and suppresses both the requirement for Nef and the sensitivity to cyclosporin A. J. Virol., 1997; 71: 5871-5877
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Alibek K., Handelman S.: Biohazard: the chilling true story of the largest covert biological weapons program in the world, told from the inside by the man who ran it. Random House, New York 1999

[4] Ball L.A., White C.N.: Order of transcription of genes of vesicular stomatitis virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976; 73: 442-446
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[5] Bartenschlager R., Cosset F.L., Lohmann V.: Hepatitis C virus replication cycle. J. Hepatol., 2010; 53: 583-585
[PubMed]  

[6] Baryluk A., Polz-Dacewicz M., Sendecka M., Piecyk-Sidor M.: Współczesne osiągnięcia dotyczące badań nad opracowaniem szczepionki przeciwko WZW C. Postępy Hig. Med. Dośw., 2005; 59: 98-104
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[7] Boone J.D., Erickson B.K., Huh W.K.: New insights into cervical cancer screening. J. Gynecol. Oncol., 2012; 23: 282-287
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[8] Borio L., Inglesby T., Peters C.J., Schmaljohn A.L., Hughes J.M., Jahrling P.B., Ksiazek T., Johnson K.M., Meyerhoff A., O’Toole T., Ascher M.S., Bartlett J., Breman J.G., Eitzen E.M. Jr, Hamburg M. i wsp.: Hemorrhagic fever viruses as biological weapons: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc., 2002; 287: 2391-2405
[PubMed]  

[9] Boshart M., Gissmann L., Ikenberg H., Kleinheinz A., Scheurlen W., zur Hausen H.: A new type of papillomavirus DNA, its presence in genital cancer biopsies and in cell lines derived from cervical cancer. EMBO J., 1984; 3: 1151-1157
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[10] Brandsma J.L., Shylankevich M., Su Y., Roberts A., Rose J.K., Zelterman D., Buonocore L.: Vesicular stomatitis virus-based therapeutic vaccination targeted to the E1, E2, E6, and E7 proteins of cottontail rabbit papillomavirus. J. Virol., 2007; 81: 5749-5758
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[11] Brandsma J.L., Shlyankevich M., Su Y., Zelterman D., Rose J.K., Buonocore L.: Reversal of papilloma growth in rabbits therapeutically vaccinated against E6 with naked DNA and/or vesicular stomatitis virus vectors. Vaccine, 2010; 28: 8345-8351
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[12] Brown K.S., Safronetz D., Marzi A., Ebihara H., Feldmann H.: Vesicular stomatitis virus-based vaccine protects hamsters against lethal challenge with Andes virus. J. Virol., 2011; 85: 12781-12791
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[13] Casares S., Inaba K., Brumeanu T.D., Steinman R.M., Bona C.A.: Antigen presentation by dendritic cells after immunization with DNA encoding a major histocompatibility complex class II-restricted viral epitope. J. Exp. Med., 1997; 186: 1481-1486
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[14] Chattopadhyay A., Rose J.K.: Complementing defective viruses that express separate paramyxovirus glycoproteins provide a new vaccine vector approach. J. Virol., 2010; 85: 2004-2011
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[15] Cobleigh M.A., Bradfield C., Liu Y., Mehta A., Robek M.D.: The immune response to a vesicular stomatitis virus vaccine vector is independent of particulate antigen secretion and protein turnover rate. J. Virol., 2012; 86: 4253-4261
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[16] Cobleigh M.A., Buonocore L., Uprichard S.L., Rose J.K., Robek M.D.: A vesicular stomatitis virus-based hepatitis B virus vaccine vector provides protection against challenge in a single dose. J. Virol., 2010; 84: 7513-7522
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[17] Cooper D., Wright K.J., Calderon P.C., Guo M., Nasar F., Johnson J.E., Coleman J.W., Lee M., Kotash C., Yurgelonis I., Natuk R.J., Hendry R.M., Udem S.A., Clarke D.K.: Attenuation of recombinant vesicular stomatitis virus-human immunodeficiency virus type 1 vaccine vectors by gene translocations and G gene truncation reduces neurovirulence and enhances immunogenicity in mice. J. Virol., 2008; 82: 207-219
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[18] Corr M., von Damm A., Lee D.J., Tighe H.: In vivo priming by DNA injection occurs predominantly by antigen transfer. J. Immunol., 1999; 163: 4721-4727
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[19] Cougot D., Neuveut C., Buendia M.A.: HBV induced carcinogenesis. J. Clin. Virol., 2005; 34: S75-S78
[PubMed]  

[20] Cristillo A.D., Lisziewicz J., He L., Lori F., Galmin L., Trocio J.N., Unangst T., Whitman L., Hudacik L., Bakare N., Whitney S., Restrepo S., Suschak J., Ferrari M.G., Chung H.K., Kalyanaraman V.S., Markham P., Pal R.: HIV-1 prophylactic vaccine comprised of topical DermaVir prime and protein boost elicits cellular immune responses and controls pathogenic R5 SHIV162P3. Virology, 2007; 366: 197-211
[PubMed]  

[21] Daddario-DiCaprio K.M., Geisbert T.W., Geisbert J.B., Ströher U., Hensley L.E., Grolla A., Fritz E.A., Feldmann F., Feldmann H., Jones S.M.: Cross-protection against Marburg virus strains by using a live, attenuated recombinant vaccine. J. Virol., 2006; 80: 9659-9666
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[22] Daddario-DiCaprio K.M., Geisbert T.W., Ströher U., Geisbert J.B., Grolla A., Fritz E.A., Fernando L., Kagan E., Jahrling P.B., Hensley L.E., Jones S.M., Feldmann H.: Postexposure protection against Marburg haemorrhagic fever with recombinant vesicular stomatitis virus vectors in non-human primates: an efficacy assessment. Lancet, 2006; 367: 1399-1404
[PubMed]  

[23] Dinh P.X., Beura L.K., Panda D., Das A., Pattnaik A.K.: Antagonistic effects of cellular poly(C) binding proteins on vesicular stomatitis virus gene expression. J. Virol., 2011; 85: 9459-9471
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[24] Dorrucci M.: Epidemiology of HIV. Update. Recenti Prog. Med., 2010; 101: 12-15
[PubMed]  

[25] Dürst M., Glitz D., Schneider A., zur Hausen H.: Human papillomavirus type 16 (HPV 16) gene expression and DNA replication in cervical neoplasia: analysis by in situ hybridization. Virology, 1992; 189: 132-140
[PubMed]  

[26] Earl P.L., Wyatt L.S., Montefiori D.C., Bilska M., Woodward R., Markham P.D., Malley J.D., Vogel T.U., Allen T.M., Watkins D.I., Miller N., Moss B.: Comparison of vaccine strategies using recombinant env-gag-pol MVA with or without an oligomeric Env protein boost in the SHIV rhesus macaque model. Virology, 2002; 294: 270-281
[PubMed]  

[27] Fang X., Zhang S., Sun X., Li J., Sun T.: Evaluation of attenuated VSVs with mutated M or/and G proteins as vaccine vectors. Vaccine, 2012; 30: 1313-1321
[PubMed]  

[28] Feldmann H., Geisbert T.W.: Ebola haemorrhagic fever. Lancet, 2011; 377: 849-862
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[29] Feldmann H., Jones S.M., Daddario-DiCaprio K.M., Geisbert J.B., Ströher U., Grolla A., Bray M., Fritz E.A., Fernando L., Feldmann F., Hensley L.E., Geisbert T.W.: Effective post-exposure treatment of Ebola infection. PLoS Pathog., 2007; 3: e2
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[30] Flanagan E.B., Ball L.A., Wertz G.W.: Moving the glycoprotein gene of vesicular stomatitis virus to promoter-proximal positions accelerates and enhances the protective immune response. J. Virol., 2000; 74: 7895-7902
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[31] Flanagan E.B., Zamparo J.M., Ball L.A., Rodriguez L.L., Wertz G.W.: Rearrangement of the genes of vesicular stomatitis virus eliminates clinical disease in the natural host: new strategy for vaccine development. J. Virol., 2001; 75: 6107-6114
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[32] Frey S.E., Houghton M., Coates S., Abrignani S., Chien D., Rosa D., Pileri P., Ray R., Di Bisceglie A.M., Rinella P., Hill H., Wolff M.C., Schultze V., Han J.H., Scharschmidt B., Belshe R.B.: Safety and immunogenicity of HCV E1E2 vaccine adjuvanted with MF59 administered to healthy adults. Vaccine, 2010; 28: 6367-6373
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[33] Garbutt M., Liebscher R., Wahl-Jensen V., Jones S., Möller P., Wagner R., Volchkov V., Klenk H.D., Feldmann H., Ströher U.: Properties of replication-competent vesicular stomatitis virus vectors expressing glycoproteins of filoviruses and arenaviruses. J. Virol., 2004; 78: 5458-5465
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[34] Ge P., Tsao J., Schein S., Green T.J., Luo M., Zhou Z.H.: CryoEM model of the bullet-shaped vesicular stomatitis virus. Science, 2010; 327: 689-693
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[35] Geisbert T.W., Bausch D.G., Feldmann H.: Prospects for immunisation against Marburg and Ebola viruses. Rev. Med. Virol., 2010; 20: 344-357
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[36] Geisbert T.W., Daddario-DiCaprio K.M., Geisbert J.B., Reed D.S., Feldmann F., Grolla A., Ströher U., Fritz E.A., Hensley L.E., Jones S.M., Feldmann H.: Vesicular stomatitis virus-based vaccines protect nonhuman primates against aerosol challenge with Ebola and Marburg viruses. Vaccine, 2008; 26: 6894-6900
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[37] Geisbert T.W., Daddario-DiCaprio K.M., Lewis M.G., Geisbert J.B., Grolla A., Leung A., Paragas J., Matthias L., Smith M.A., Jones S.M., Hensley L.E., Feldmann H., Jahrling P.B.: Vesicular stomatitis virus-based Ebola vaccine is well-tolerated and protects immunocompromised nonhuman primates. PLoS Pathog., 2008; 4: e1000225
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[38] Geisbert T.W., Daddario-DiCaprio K.M., Williams K.J., Geisbert J.B., Leung A., Feldmann F., Hensley L.E., Feldmann H., Jones S.M.: Recombinant vesicular stomatitis virus vector mediates postexposure protection against Sudan Ebola hemorrhagic fever in nonhuman primates. J. Virol., 2008; 82: 5664-5668
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[39] Geisbert T.W., Geisbert J.B., Leung A., Daddario-DiCaprio K.M., Hensley L.E., Grolla A., Feldmann H.: Single-injection vaccine protects nonhuman primates against infection with Marburg virus and three species of Ebola virus. J. Virol., 2009; 83: 7296-7304
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[40] Geisbert T.W., Hensley L.E., Geisbert J.B., Leung A., Johnson J.C., Grolla A., Feldmann H.: Postexposure treatment of Marburg virus infection. Emerg. Infect. Dis., 2010; 16: 1119-1122
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[41] Geisbert T.W., Jones S., Fritz E.A., Shurtleff A.C., Geisbert J.B., Liebscher R., Grolla A., Ströher U., Fernando L., Daddario K.M., Guttieri M.C., Mothé B.R., Larsen T., Hensley L.E., Jahrling P.B. i wsp.: Development of a new vaccine for the prevention of Lassa fever. PLoS Med., 2005; 2: e183
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[42] Gravel K.A., McGinnes L.W., Reitter J., Morrison T.G.: The transmembrane domain sequence affects the structure and function of the Newcastle disease virus fusion protein. J. Virol., 2011; 85: 3486-3497
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[43] Groseth A., Charton J.E., Sauerborn M., Feldmann F., Jones S.M., Hoenen T., Feldmann H.: The Ebola virus ribonucleoprotein complex: a novel VP30-L interaction identified. Virus Res., 2009; 140: 8-14
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[44] Groseth A., Ströher U., Theriault S., Feldmann H.: Molecular characterization of an isolate from the 1989/90 epizootic of Ebola virus Reston among macaques imported into the United States. Virus Res., 2002; 87: 155-163
[PubMed]  

[45] Haglund K., Leiner I., Kerksiek K., Buonocore L., Pamer E., Rose J.K.: Robust recall and long-term memory T-cell responses induced by prime-boost regimens with heterologous live viral vectors expressing human immunodeficiency virus type 1 Gag and Env proteins. J. Virol., 2002; 76: 7506-7517
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[46] Hawkins M.G., Winder D.M., Ball S.L., Vaughan K., Sonnex C., Stanley M.A., Sterling J.C., Goon P.K.: Detection of specific HPV subtypes responsible for the pathogenesis of condylomata acuminata. J. Virol., 2013; 10: 137
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[47] Hepatitis C. World Health Organization. (23.10.2013)
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/

[48] Hunziker I.P., Zurbriggen R., Glueck R., Engler O.B., Reichen J., Dai W.J., Pichler W.J., Cerny A.: Perspectives: towards a peptide-based vaccine against hepatitis C virus. Mol. Immunol., 2001; 38: 475-484
[PubMed]  

[49] Imhof I., Simmonds P.: Genotype differences in susceptibility and resistance development of hepatitis C virus to protease inhibitors telaprevir (VX-950) and danoprevir (ITMN-191). Hepatology, 2011; 53: 1090-1099
[PubMed]  

[50] Inchauspé G., Major M.E., Nakano I., Vitvitski L., Trépo C.: DNA vaccination for the induction of immune responses against hepatitis C virus proteins. Vaccine, 1997; 15: 853-856
[PubMed]  

[51] Iverson L.E., Rose J.K.: Localized attenuation and discontinuous synthesis during vesicular stomatitis virus transcription. Cell, 1981; 23: 477-484
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[52] Jäger S., Gulbahce N., Cimermancic P., Kane J., He N., Chou S., D’Orso I., Fernandes J., Jang G., Frankel A.D., Alber T., Zhou Q., Krogan N.J.: Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods, 2011; 53: 13-19
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[53] Jahrling P.B., Geisbert T.W., Dalgard D.W., Johnson E.D., Ksiazek T.G., Hall W.C., Peters C.J.: Preliminary report: isolation of Ebola virus from monkeys imported to USA. Lancet, 1990; 335: 502-505
[PubMed]  

[54] Jatczak B., Leszek J., Siemieniec I., Sochocka M., Wiśniewska A., Tarkowski R., Bębenek M., Błach-Olszewska Z.: Age- and disease-related innate immunity of human leukocytes ex vivo. Exp. Gerontol., 2012; 47: 8-13
[PubMed]  

[55] Jia B., Ng S.K., DeGottardi M.Q., Piatak M., Yuste E., Carville A., Mansfield K.G., Li W., Richardson B.A., Lifson J.D., Evans D.T.: Immunization with single-cycle SIV significantly reduces viral loads after an intravenous challenge with SIVmac239. PLoS Pathog., 2009; 5: e1000272
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[56] Johnson J.E., Nasar F., Coleman J.W., Price R.E., Javadian A., Draper K., Lee M., Reilly P.A., Clarke D.K., Hendry R.M., Udem SA.: Neurovirulence properties of recombinant vesicular stomatitis virus vectors in non-human primates. Virology, 2007; 360: 36-49
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[57] Johnson J.E., Rodgers W., Rose J.K.: A plasma membrane localization signal in the HIV-1 envelope cytoplasmic domain prevents localization at sites of vesicular stomatitis virus budding and incorporation into VSV virions. Virology, 1998; 251: 244-252
[PubMed]  

[58] Johnson J.E., Schnell M.J., Buonocore L., Rose J.K.: Specific targeting to CD4+ cells of recombinant vesicular stomatitis viruses encoding human immunodeficiency virus envelope proteins. J. Virol., 1997; 71: 5060-5068
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[59] Jones S.M., Feldmann H., Ströher U., Geisbert J.B., Fernando L., Grolla A., Klenk H.D., Sullivan N.J., Volchkov V.E., Fritz E.A., Daddario K.M., Hensley L.E., Jahrling P.B., Geisbert T.W.: Live attenuated recombinant vaccine protects nonhuman primates against Ebola and Marburg viruses. Nat. Med., 2005; 11: 786-790
[PubMed]  

[60] Kuhn L., Aldrovandi G.M., Sinkala M., Kankasa C., Semrau K., Mwiya M., Kasonde P., Scott N., Vwalika C., Walter J., Bulterys M., Tsai W.Y., Thea D.M.: Effects of early, abrupt weaning on HIV-free survival of children in Zambia. N. Engl. J. Med., 2008; 359: 130-141
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[61] Leroy E.M., Baize S., Mavoungou E., Apetrei C.: Sequence analysis of the GP, NP, VP40 and VP24 genes of Ebola virus isolated from deceased, surviving and asymptomatically infected individuals during the 1996 outbreak in Gabon: comparative studies and phylogenetic characterization. J. Gen. Virol., 2002; 83: 67-73
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[62] Letchworth G.J., Rodriguez L.L., Del Cbarrera J.: Vesicular Stomatitis. Vet. J., 1999; 157: 239-260
[PubMed]  

[63] Letvin N.L.: Progress in the development of an HIV-1 vaccine. Science, 1998; 280: 1875-1880
[PubMed]  

[64] Liao J.B., Publicover J., Rose J.K., DiMaio D.: Single-dose, therapeutic vaccination of mice with vesicular stomatitis virus expressing human papillomavirus type 16 E7 protein. Clin. Vaccine Immunol., 2008; 15: 817-824
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[65] Lin Y.L., Borenstein L.A., Ahmed R., Wettstein F.O.: Cottontail rabbit papillomavirus L1 protein-based vaccines: protection is achieved only with a full-length, nondenatured product. J. Virol., 1993; 67: 4154-4162
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[66] Lupberger J., Hildt E.: Hepatitis B virus-induced oncogenesis. World J. Gastroenterol., 2007; 13: 74-81
[PubMed]  

[67] Ma Y., Li J.: Vesicular stomatitis virus as a vector to deliver virus-like particles of human norovirus: a new vaccine candidate against an important noncultivable virus. J. Virol., 2011; 85: 2942-2952
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[68] Majid A.M., Ezelle H., Shah S., Barber G.N.: Evaluating replication-defective vesicular stomatitis virus as a vaccine vehicle. J. Virol., 2006; 80: 6993-7008
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[69] Mao C.P., Hung C.F., Kang T.H., He L., Tsai Y.C., Wu C.Y., Wu T.C.: Combined administration with DNA encoding vesicular stomatitis virus G protein enhances DNA vaccine potency. J. Virol., 2010; 84: 2331-2339
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[70] Marsac D., Loirat D., Petit C., Schwartz O., Michel M.L.: Enhanced presentation of major histocompatibility complex class i-restricted human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag-specific epitopes after DNA immunization with vectors coding for vesicular stomatitis virus glycoprotein-pseudotyped HIV-1 Gag particles. J. Virol., 2002; 76: 7544-7553
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[71] Marthas M.L., Van Rompay K.K., Abbott Z., Earl P., Buonocore-Buzzelli L., Moss B., Rose N.F., Rose J.K., Kozlowski P.A., Abel K.: Partial efficacy of a VSV-SIV/MVA-SIV vaccine regimen against oral SIV challenge in infant macaques. Vaccine, 2011; 29: 3124-3137
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[72] Mast E.E., Weinbaum C.M., Fiore A.E., Alter M.J., Bell B.P., Finelli L., Rodewald L.E., Douglas J.M. Jr, Janssen R.S., Ward J.W.: A comprehensive immunization strategy to eliminate transmission of hepatitis B virus infection in the United States: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) Part II: immunization of adults. MMWR Recomm. Rep., 2006; 55: 1-33
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[73] McEnery R.: Update on pandemic shows new HIV infections steadily declining. IAVI Rep., 2009; 13: 17
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[74] McKenna P.M., Koser M.L., Carlson K.R., Montefiori D.C., Letvin N.L., Papaneri A.B., Pomerantz R.J., Dietzschold B., Silvera P., McGettigan J.P., Schnell M.J.: Highly attenuated rabies virus-based vaccine vectors expressing simian-human immunodeficiency virus89.6P Env and simian immunodeficiency virusmac239 Gag are safe in rhesus macaques and protect from an AIDS-like disease. J. Infect. Dis., 2007; 195: 980-988
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[75] Mire C.E., Miller A.D., Carville A., Westmoreland S.V., Geisbert J.B., Mansfield K.G., Feldmann H., Hensley L.E., Geisbert T.W.: Recombinant vesicular stomatitis virus vaccine vectors expressing filovirus glycoproteins lack neurovirulence in nonhuman primates. PLoS Negl. Trop. Dis., 2012; 6: e1567
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[76] Morisco F., Granata R., Stroffolini T., Guarino M., Donnarumma L., Gaeta L., Loperto I., Gentile I., Auriemma F., Caporaso N.: Sustained virological response: a milestone in the treatment of chronic hepatitis C. World J. Gastroenterol., 2013; 19: 2793-2798
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[77] Orzechowska B., Antoszków Z., Siemieniec I., Lorenc M., Jatczak B., Błach-Olszewska Z.: Cytokine production by human leukocytes with different expressions of natural antiviral immunity and the effect of antibodies against interferons and TNF-α. Arch. Immunol. Ther. Exp., 2007; 55: 111-117
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[78] Panda D., Das A., Dinh P.X., Subramaniam S., Nayak D., Barrows N.J., Pearson J.L., Thompson J., Kelly D.L., Ladunga I., Pattnaik A.K.: RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011; 108: 19036-19041
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[79] Paradowska E., Błach-Olszewska Z., Sender J., Jarosz W.: Antiviral nonspecific immunity of human placenta at term: possible role of endogenous tumor necrosis factors and interferons. J. Interferon Cytokine Res., 1996; 16: 941-948
[PubMed]  

[80] Pineiro D., Martinez-Salas E.: RNA structural elements of hepatitis C virus controlling viral RNA translation and the implications for viral pathogenesis. Viruses, 2012; 4: 2233-2250
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[81] Ploss A., Dubuisson J.: New advances in the molecular biology of hepatitis C virus infection: towards the identification of new treatment targets. Gut, 2012; 61, Suppl. 1: i25-i35
[PubMed]  

[82] Poland J.D., Calisher C.H., Monath T.P., Downs W.G., Murphy K.: Persistence of neutralizing antibody 30-35 years after immunization with 17D yellow fever vaccine. Bull. World Health Organ., 1981; 59: 895-900
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[83] Publicover J., Ramsburg E., Rose J.K.: A single-cycle vaccine vector based on vesicular stomatitis virus can induce immune responses comparable to those generated by a replication-competent vector. J. Virol., 2005; 79: 13231-13238
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[84] Puig M., Major M.E., Mihalik K., Feinstone S.M.: Immunization of chimpanzees with an envelope protein-based vaccine enhances specific humoral and cellular immune responses that delay hepatitis C virus infection. Vaccine, 2004; 22: 991-1000
[PubMed]  

[85] Qiu X., Fernando L., Alimonti J.B., Melito P.L., Feldmann F., Dick D., Ströher U., Feldmann H., Jones S.M.: Mucosal immunization of cynomolgus macaques with the VSVΔG/ZEBOVGP vaccine stimulates strong Ebola GP-specific immune responses. PLoS One, 2009; 4: e5547
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[86] Ramanan P., Shabman R.S., Brown C.S., Amarasinghe G.K., Basler C.F., Leung D.W.: Filoviral immune evasion mechanisms. Viruses, 2011; 3: 1634-1649
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[87] Ramsburg E., Rose N.F., Marx P.A., Mefford M., Nixon D.F., Moretto W.J., Montefiori D., Earl P., Moss B., Rose J.K.: Highly effective control of an AIDS virus challenge in macaques by using vesicular stomatitis virus and modified vaccinia virus Ankara vaccine vectors in a single-boost protocol. J. Virol., 2004; 78: 3930-3940
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[88] Reed D.S., Hensley L.E., Geisbert J.B., Jahrling P.B., Geisbert T.W.: Depletion of peripheral blood T lymphocytes and NK cells during the course of ebola hemorrhagic fever in cynomolgus macaques. Viral Immunol., 2004; 17: 390-400
[PubMed]  

[89] Reuter J.D., Vivas-Gonzalez B.E., Gomez D., Wilson J.H., Brandsma J.L., Greenstone H.L., Rose J.K., Roberts A.: Intranasal vaccination with a recombinant vesicular stomatitis virus expressing cottontail rabbit papillomavirus L1 protein provides complete protection against papillomavirus-induced disease. J. Virol., 2002; 76: 8900-8909
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[90] Roberts A., Kretzschmar E., Perkins A.S., Forman J., Price R., Buonocore L., Kawaoka Y., Rose J.K.: Vaccination with a recombinant vesicular stomatitis virus expressing an influenza virus hemagglutinin provides complete protection from influenza virus challenge. J. Virol., 1998; 72: 4704-4711
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[91] Roberts A., Reuter J.D., Wilson J.H., Baldwin S., Rose J.K.: Complete protection from papillomavirus challenge after a single vaccination with a vesicular stomatitis virus vector expressing high levels of L1 protein. J. Virol., 2004; 78: 3196-3199
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[92] Rose N.F., Marx P.A., Luckay A., Nixon D.F., Moretto W.J., Donahoe S.M., Montefiori D., Roberts A., Buonocore L., Rose J.K.: An effective AIDS vaccine based on live attenuated vesicular stomatitis virus recombinants. Cell, 2001; 106: 539-549
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[93] Rose N.F., Roberts A., Buonocore L., Rose J.K.: Glycoprotein exchange vectors based on vesicular stomatitis virus allow effective boosting and generation of neutralizing antibodies to a primary isolate of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol., 2000; 74: 10903-10910
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[94] Sanjuán R., Bordería A.V.: Interplay between RNA structure and protein evolution in HIV-1. Mol. Biol. Evol., 2011; 28: 1333-1338
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[95] Schell J.B., Rose N.F., Bahl K., Diller K., Buonocore L., Hunter M., Marx P.A., Gambhira R., Tang H., Montefiori D.C., Johnson W.E., Rose J.K.: Significant protection against high-dose simian immunodeficiency virus challenge conferred by a new prime-boost vaccine regimen. J. Virol., 2011; 85: 5764-5772
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[96] Schwartz J.A., Buonocore L., Suguitan A.Jr, Hunter M., Marx P.A., Subbarao K., Rose J.K.: Vesicular stomatitis virus-based H5N1 avian influenza vaccines induce potent cross-clade neutralizing antibodies in rhesus macaques. J. Virol., 2011; 85: 4602-4605
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[97] Takada A., Robison C., Goto H., Sanchez A., Murti K.G., Whitt M.A., Kawaoka Y.: A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997; 94: 14764-14769
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[98] Torresi J., Johnson D., Wedemeyer H.: Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Hepatol., 2011; 54: 1273-1285
[PubMed]  

[99] Towner J.S., Sealy T.K., Khristova M.L., Albarino C.G., Conlan S., Reeder S.A., Quan P.L., Lipkin W.I., Downing R., Tappero J.W., Okware S., Lutwama J., Bakamutumaho B., Kayiwa J., Comer J.A.: Newly discovered Ebola virus associated with hemorrhagic fever outbreak in Uganda. PLoS Pathog. 2008; 4: e1000212
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[100] UNAIDS (27.10.2013)
http://www.unaids.org/en/dataanalysis/datatools/aidsinfo

[101] Van Bogaert L.J.: Are the currently existing anti-human papillomavirus vaccines appropriate for the developing world? Ann. Med. Health Sci. Res., 2013; 3: 306-312
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[102] Van Rompay K.K., Abel K., Earl P., Kozlowski P.A., Easlick J., Moore J., Buonocore-Buzzelli L., Schmidt K.A., Wilson R.L., Simon I., Moss B., Rose N., Rose J., Marthas M.L.: Immunogenicity of viral vector, prime-boost SIV vaccine regimens in infant rhesus macaques: attenuated vesicular stomatitis virus (VSV) and modified vaccinia Ankara (MVA) recombinant SIV vaccines compared to live-attenuated SIV. Vaccine, 2010; 28: 1481-1492
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[103] Van Rompay K.K., Abel K., Lawson J.R., Singh R.P., Schmidt K.A., Evans T., Earl P., Harvey D., Franchini G., Tartaglia J., Montefiori D., Hattangadi S., Moss B., Marthas M.L.: Attenuated poxvirus-based simian immunodeficiency virus (SIV) vaccines given in infancy partially protect infant and juvenile macaques against repeated oral challenge with virulent SIV. J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 2005; 38: 124-134
[PubMed]  

[104] Volchkov V.E., Becker S., Volchkova V.A., Ternovoj V.A., Kotov A.N., Netesov S.V., Klenk H.D.: GP mRNA of Ebola virus is edited by the Ebola virus polymerase and by T7 and vaccinia virus polymerases. Virology, 1995; 214: 421-430
[PubMed]  

[105] Wertz G.W., Perepelitsa V.P., Ball L.A.: Gene rearrangement attenuates expression and lethality of a nonsegmented negative strand RNA virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95: 3501-3506
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[106] Whelan S.P., Ball L.A., Barr J.N., Wertz G.T.: Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995; 92: 8388-8392
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[107] Witko S.E., Johnson J.E., Kalyan N.K., Felber B.K., Pavlakis G.N., Sidhu M.K., Hendry R.M., Udem S.A., Parks C.L.: Refined methods for propagating vesicular stomatitis virus vectors that are defective for G protein expression. J. Virol. Methods, 2010; 164: 43-50
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[108] World Health Organization. Hepatitis B vaccines. Wkly Epidemiol. Rec., 2009; 84: 405-419
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[109] Zaczyńska E., Magott-Procelewska M., Rybka K., Siemieniec I., Błach-Olszewska Z., Klinger M.: Innate antiviral immunity is not impaired in patients with chronic renal failure on hemodialysis. Nephron. Clin. Pract., 2005; 101: c207-c210
[PubMed]  

[110] Zuckerman J.N.: Protective efficacy, immunotherapeutic potential, and safety of hepatitis B vaccines. J. Med. Virol., 2006; 78: 169-177
[PubMed]  

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Full text