Streszczenie

Polimeraza poli(ADP-rybozy) – PARP-1 katalizuje polimeryzację jednostek ADP-rybozy wykorzystując jako ich źródło cząsteczki NAD⁺ i dokonuje ich transferu na białka docelowe i przyłączenia polimerów liniowych lub rozgałęzionych. Ostatnio PARP-1 i łańcuchy ADP-rybozy (PAR) przyciągają znaczną uwagę, ponieważ uczestniczą w wielu procesach komórkowych m.in. modyfikacjach chromatyny, metabolizmie kwasów nukleinowych, regulacji transkrypcji i śmierci komórkowej. Przegląd podsumowuje ostatnie badania nad modułową strukturą cząsteczki PARP-1 uwzględniającą sześć domen funkcjonalnych (A–F), w kontekście trzech klasycznych domen, tj. wiążącej DNA (DBD), automodyfikacyjnej (AD) i katalitycznej (CD), uwalnianych przez enzymy proteolityczne. Szczególną uwagę zwrócono na subkomórkową lokalizację i potranslacyjne modyfikacje PARP-1 [poli(ADP-rybozylacja), fosforylacja, acetylacja, sumoilacja]. Ponadto przedyskutowano główne funkcje PARP-1 skupiając uwagę na roli tego enzymu w detekcji uszkodzeń DNA i jego naprawie, stabilności genomu i śmierci komórki.

Słowa kluczowe:PARP-1 • budowa domenowa • modyfikacje potranslacyjne • naprawa DNA • śmierć komórkowa

Summary

Poly(ADP-ribose)polymerase-1 (PARP-1) catalyzes the polymerization of ADP-ribose units from NAD⁺ modules on target proteins, resulting in the attachment of linear or branched polymers. PARP-1 and its product poly(ADP-ribose) – PAR have recently received considerable attention because of their involvement in a wide range of cellular processes including chromatin modification, metabolism of nucleic acids, transcription regulation, and cell death. This review summarizes recent work on modular structure of six functional domains (A–F) of PARP-1 molecule in the context of three classic domains, i.e., DNA binding (DBD), automodification (AD) and catalytic (CD) released by proteolytic enzymes. A special attention is paid to subcellular localization and molecular mechanisms of PARP-1 posttranslational modifications, such as: poly( ADP-ribosylation), phosphorylation, acetylation and sumolyation. In addition, main functions of PARP-1 are discussed, focusing on the activity of this enzyme in DNA damage detection and repair, genome stability, and cell death.

Key words:PARP-1 • domain structure • posttranslational modifications • DNA repair • cell death

Wykaz skrótów:

aa – aminokwas (amino acid); AD – domena automodyfikacyjna (automodification domain); ADPRT/PARP/PPOL – gen kodujący enzym – polimerazę (ADP-rybozy); AIF – czynnik indukujący apoptozę (apoptosis inducing factor); A-NHEJ, Alt-NHEJ, B-NHEJ – alternatywny/zapasowy szlak naprawy DNA w wyniku łączenia końców niehomologicznych (alternative/backup nonhomologous end joining); AP2 – czynnik transkrypcyjny (activating protein 2); ARH3 – hydrolaza ADP-rybozy 3 (ADP-ribose hydrolase 3); ATM – gen (i kodowana przez niego kinaza), którego mutacja związana jest z wystąpieniem ataksji teleangiektazji (ataxia-telangiectasia mutated gene); ATR – gen homologiczny do ATM i Rad3 (ATM- and Rad3- related); BER – mechanizm naprawy DNA przez wycinanie zasad (base excision repair); BRCA1/2 – białko uczestniczące m.in. w naprawie uszkodzonego DNA, kodowane przez gen supresorowy, którego defekt predysponuje do rozwoju nowotworów piersi (breast cancer); BRCT – C-końcowa domena białka BRCA1; CB – ciałka Cajala lub „ciałka zwinięte” (coiled bodies); CBP/p300 – białka koaktywatorowe o aktywności acetylotransferazy histonowej; CD – domena katalityczna (catalytic domain); CDK – kinaza zależna od cyklin (cyclin-dependent kinase); DBD – domena wiążąca DNA (DNA binding domain); DNA-PK – kinaza zależna od DNA (DNA-dependent protein kinase); DNA-PKcs – podjednostka katalityczna kinazy DNA-PKcs (DNA-PK catalytic subunit); D-NHEJ – szlak naprawy DNA zależny do DNA-PK; Dnmt1 – DNA metylotransferaza 1 (DNA methyltransferase 1); DSB – dwuniciowe pęknięcie DNA (double-strand break); DSE – dwuniciowy koniec DNA (double-strand end); ERK1/2 – kinazy aktywowane sygnałami zewnętrznymi; HDAC 1-4 – deacetylaza histonowa 1-4 (histone deacetylase 1-4); HR – rekombinacja homologiczna (homologous recombination); HRR – szlak naprawy DNA w procesie rekombinacji homologicznej (homologous recombination repair); HMG – białko o dużej ruchliwości elektroforetycznej (high mobility protein group); hnRNP – heterogenna rybonukleoproteina jądrowa (heterogeneous nuclear protein); MNNG – N-metylo-N’-nitro-N-nitrozoguanidyna (N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine); Mre11 – białko odpowiedzialne za wycinanie fragmentu DNA; MRN – kompleks naprawczy złożony z białek Mre11, Rad50, NBS1; mtDNA – mitochondrialny DNA; NAD⁺ – dinukleotyd nikotynoamidowy (nicotinamid dinucleotide); NER – mechanizm naprawy DNA przez wycinanie nukleotydów (nucleotide excision repair); NF-κB – czynnik jądrowy κB (nuclear factor κB); NLS – sygnał lokalizacji jądrowej (nuclear localization signal); PAR – polimery poli(ADP-rybozy) (poly(ADP-ribose) polymer); PARG – glikohydrolaza poli(ADP-ribozy); PARP-1 – polimeraza poli(ADP-rybozy) (poly(ADP-ribose) polymerase-1); PCNA – antygen jądrowy komórki proliferującej (proliferating cell nuclear antigen); PKC – kinaza białkowa C (protein kinase C); PLX – kompleks naprawczy złożony z białek PARP-1, ligazy DNA III i XRCC1 uczestniczący w BER; Rad-18 – enzym naprawczy DNA o aktywności ligazy ubikwitylowej; Rad-51 – enzym naprawczy DNA uczestniczący w rekombinacji homologicznej homologiczny do prokaryotycznego białka RecA; siRNA – małe interferencyjne RNA (small interference RNA); SMC1 – rodzina konserwatywnych białek o aktywności ATP-azowej; SP1 – czynnik transkrypcyjny (stimulatory or specificity protein 1); SSB – jednoniciowe pęknięcie DNA (single-strand break); SUMO – małe ubikwitynopodobne białko (small ubiquitin-like modifier); VEGF – czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (vascular endothelial growth factor); WGR – motyw sekwencyjny wzbogacony w tryptofan, glicynę, argininę występujący w domenie katalitycznej hPARP-1; XRCC1,4 – białko uczestniczące w naprawie DNA (X-ray repair cross-complementing group 1,4); Zn I, II, III – palec cynkowy I, II, III.

Wstęp

Na początku lat sześćdziesiątych ubiegłego stulecia w laboratorium Paula Mandela [16] wykryto enzym odpowiedzialny za syntezę poli(ADP-rybozy). Liczne badania wykazały, że poli- bądź mono-ADP-rybozylacji białek dokonują odpowiednio polimerazy poli(ADP-rybozy) – PARPs oraz transferazy mono(ADP-rybozy) – MARTs [35,117]. W genomie człowieka zidentyfikowano 17 genów PARP/MARTs, których loci znajdują się na 10 chromosomach [2,82]. Dotychczas wykryto ortologi 16 genów tej rodziny w genomach myszy, szczura, słodkowodnej ryby Pufferfisch i roślin (Arabidopsis) [82].

Uznaje się, że ta potranslacyjna modyfikacja, w głównej mierze katalizowana przez polimerazę poli(ADP-rybozy)-1 – PARP-1 (EC 2.4.2.30), odgrywa istotną rolę m.in. w sygnalizacji komórkowej, naprawie DNA i utrzymaniu stabilności genomu, w remodelingu chromatyny, regulacji transkrypcji, w procesach proliferacji, różnicowania, transformacji nowotworowej i śmierci komórki [19,42,72,98]. PARP-1 może ponadto uczestniczyć w regulacji cytoszkieletu [54,55,132]. Polimery poli(ADP-rybozy) – PAR stanowią źródło energii wykorzystywanej w naprawie DNA wykorzystującej mechanizm wycinania zasad – BER (base excision repair) [78]. Akceptuje się, że produkt enzymatycznej aktywności tego enzymu – PAR stanowi bardzo ważną cząsteczkę sygnalizacyjną, uczestniczącą w transferze informacji między jądrem komórkowym i mitochondriami [20]. Cząsteczka ta wpływa na zmianę przepuszczalności błon mitochondrialnych uwalniając z tych organelli m.in. czynnik indukcji apoptozy – AIF (apoptosis inducing factor) [3,119].

W komórkach prawidłowych podstawowa aktywność PARP-1 jest bardzo mała i ulega gwałtownej stymulacji w warunkach stresu genotoksycznego czy oksydacyjnego [19,50]. Aktywacja tego enzymu, m.in. czynnikami uszkadzającymi DNA powoduje 10–500-krotny wzrost poziomu PARP-1 [35].

Przez lata uznawano, że aktywacja PARP-1 jest głównie stymulowana uszkodzeniami DNA [19,21,22,29,30,62]. Należy jednak zwrócić uwagę na doniesienia sygnalizujące, że pewne szczególne struktury DNA [„hairpin” (szpilka do włosów), „cruciforms” (struktury krzyżowe) lub „supercoiled” (superzwinięcie)] mogą stanowić czynniki aktywujące PARP-1 [32,49,56].

Struktura domenowa polimerazy poli(ADP-rybozy)-1 – przedstawiciela wielogenowej rodziny PARP

Gen PARP-1 o długości około 43 kpz (23 eksony), opisywany również symbolami ADPRT/PPOL znajduje się na chromosomie 1.(1q41q42) komórek ludzkich, natomiast jego pseudogeny zidentyfikowano na chromosomach 13. i 14. [4,17,57,82,135]. Wskazuje się, że niewielka ekspresja PARP-1 jest związana z obniżoną stabilnością genomu komórek ulegających transformacji np. w przebiegu raka piersi [10]. Spadek poziomu PARP-1 i zmiany w strukturze tego enzymu odnotowano w kilku liniach komórkowych ludzkich guzów zarodkowych [105].

Jak dotąd sklonowano promotorowe sekwencje genu PARP-1 kilku gatunków ssaków (człowiek, mysz, szczur) i wykazano, że dzielą one strukturalne podobieństwo charakterystyczne dla genów funkcji podstawowych (house keeping genes) m.in. nie zawierają sekwencji TATA box, wykazują dużą zawartość sekwencji GC i obecność sekwencji inicjatorowej (Inr), która pokrywa się z miejscem inicjacji transkrypcji. W regionie promotorowym hPARP-1 wykazano miejsca wiązania dla wielu czynników transkrypcyjnych, m.in. SP1, AP-2, NF-1, YY, Ets [35,36,132]. Uważa się, że w odróżnieniu od aktywności enzymatycznej PARP-1, transkrypcja kodującego ten enzym genu nie jest aktywowana uszkodzeniami DNA, a pula cząsteczek mRNA dla tego enzymu jest regulowana na poziomie zdarzeń potranskrypcyjnych. Cząsteczka mRNA dla PARP-1 występuje powszechnie w tkankach, choć na różnym poziomie. Najwyższy poziom odnotowano w jądrach, śledzionie, mózgu i grasicy [72].

W komórkach ludzkich produktem ekspresji PARP-1 jest enzym hPARP-1 o długości 1014 aa (113 kDa) i w pełni poznanej sekwencji [17,57]. Po biosyntezie inicjująca łańcuch reszta metioniny zostaje odcięta [135]. W połowie lat osiemdziesiątych ubiegłego wieku, stosując ograniczoną proteolizę cząsteczek PARP-1 grasicy cielęcia za pomocą papainy i a-chymotrypsyny, określono w enzymie trzy funkcjonalne domeny: 1° N-końcową wiążącą DNA (DNA binding domain; DBD; m.cz. 46 kDa), 2° centralną – automodyfikacyjną (automodification domain; AD; m.cz. 22 kDa) i 3° C-końcową, katalityczną (catalytic domain; CD; m.cz. 54 kDa) [46]. Wnikliwa analiza struktury pierwszorzędowej potwierdziła, że ładunek domeny DBD i automodyfikacyjnej jest zasadowy, co wynika z dużej zawartości reszt lizyny [19,57]. Dziesięć lat później w laboratorium G. de Murcia [21] zaproponowano wyróżnienie w łańcuchu PARP-1 6 mniejszych regionów opisywanych literami od A do F, na podstawie obecności modułów funkcjonalnych (ryc. 1).

Ryc. 1. Struktura domenowa PARP-1 uwzględniająca domeny: wiążącą DNA (DBD), automodyfikacyjną (AD) i katalityczną (CD) oraz moduły funkcjonalne: A–F. Na rycinie wskazano ponadto miejsce ataku kaspaz, które tną cząsteczkę PARP-1 uwalniając C-końcowy fragment o m.cz. 89 kDa i N-końcowy – o m.cz. 24 kDa. Pozostałe objaśnienia w tekście. Opracowano na podstawie [1,54,110,117]

Domena wiążąca DNA

Domena DBD hPARP-1 obejmuje N-końcowy segment cząsteczki (1-373 aa; domeny A-C). Początkowo w do­menie A zidentyfikowano dwa palce cynkowe (Zn I; 21-56 aa i Zn II; 125-166 aa) o unikatowej budowie: CX₂CX_28,30 H₂X₂C [19,30,43,104]. W wiązaniu jonów Zn²⁺ uczestni­czą Cys21, Cys24, His53 i Cys56 oraz Cys125, Cys128, His159 i Cys162 odpowiednio w Zn I i Zn II. Palce te spi­na 68-aminokwasowy fragment [19]. Unikatowość opisa­nych motywów wynika z tego, że są one dłuższe niż kla­syczne palce cynkowe (28-30 aa), rozpoznają strukturę DNA raczej niż specyficzne jego sekwencje i mogą uczest­niczyć w oddziaływaniach białko-białko [72]. Polimeraza PARP-1 silnie wiąże się, w formie dimeru, do jedno- i dwu­niciowych pęknięć DNA, które powstają w wyniku bez­pośredniego uszkodzenia helisy (oksydacja, alkilacja, de­aminacja, depurynacja, promieniowanie jonizujące) albo pośrednio przez enzymatyczne usunięcie zasad w proce­sie naprawy [19]. Wyniki doświadczeń genetycznych (de­lecje, mutacje punktowe) regionów kodujących potencjalne palce cynkowe wskazują, że palec Zn I uczestniczy w ak­tywacji PARP-1 zarówno przez jedno-, jak i dwuniciowe pęknięcia w DNA, natomiast Zn II funkcjonuje głównie jako sensor jednoniciowych pęknięć [30,43].

Ostatnio, wykorzystując metody spektroskopii i krystalo­grafii, wykryto w domenie C PARP-1 kolejny palec cyn­kowy – Zn III; (ryc. 1) [60,113]. Struktura kryształu tego motywu ujawnia zwinięcie typu „zinc ribbon”, co sugeruje jego oddziaływania międzydomenowe. Zwinięcie opisane między 216. a 366. aa łańcucha zawiera N-końcowy heli­kalny region (225-289 aa), centralne zwinięcie „zinc rib­bon” (290-332 aa) i tzw. C-końcowy ogon (333-359 aa). Subdomeny „zinc ribbon” z resztami Cys295 i Cys298 two­rzą tzw. „kciuk”, a region między Cys311 i Cys321 budu­je tzw. pętlę rozciągniętą. Langelier i wsp. [60] sugerują, że nowo wykryty motyw Zn III może asocjować formując sieć kryształu, przez oddziaływanie głowa-ogon. Jego obec­ność wydaje się ważna w interakcjach białko-białko, które są nieodzowne w procesie aktywacji katalitycznej PARP-1.

Domena B zawiera klasyczny sygnał lokalizacji jądro­wej – NLS (nuclear localization signal). Ten dwuczęścio­wy motyw (207-226 aa) – KRK(X₁₁)KKKSKK zapewnia transport nowo syntetyzowanych cząsteczek enzymu do jądra komórkowego [2]. Na uwagę zasługuje obserwacja, że w obrębie NLS znajduje się sekwencja aminokwasowa DEVD, która stanowi miejsce ataku kaspazy 3 (lub 7) pod­czas apoptozy, tnąc PARP-1 na fragmenty o m.cz. 89 i 24 kDa [47,110]. To cięcie przez kaspazy cząsteczek PARP-1 służy jako marker apoptozy [28]. W C-końcowym fragmen­cie DBD występują dwa motywy (220-220 i 280-285 aa) pętla – skręt – pętla (HTH; helix-turn-helix), które odpo­wiadają za wiązanie enzymu z DNA [19,123].

Domena automodyfikacyjna

W centralnie usytuowanej domenie automodyfikacyjnej PARP-1 (motyw D; 374–525 aa) występuje aż 15 potencjalnych miejsc przyłączenia łańcucha PAR na resztach Glu [135]. W N-końcu domeny AD zidentyfikowano motyw zamka leucynowego, który prawdopodobnie odpowiada za homo- i/albo heterodimeryzację, a zatem za interakcję z innymi białkami [19]. Bardzo ważnym motywem AD, umiejscowionym między 386. a 464. aa, jest domena BRTC (C-terminal domain of breast cancer protein BRCA1). Taki motyw występuje w niektórych białkach uczestniczących w naprawie DNA, a także jest najważniejszy w oddziaływaniach PARP-1 z białkowymi partnerami, w tym z PARP-2 [35,36,98,99,123]. Okazało się, że klon cDNA wydzielony z D. melanogaster, któ­ry kodował wariant PARP-1 pozbawiony AD nie wyka­zywał zdolności interakcji np. z białkiem XRCC1 (X-ray repair cross-complementing group-1), które zawiera do­menę BRCT i wraz z PARP-1 tworzy kompleks uczestni­czący w naprawie DNA przez wycinanie zasad BER [68].

Domena katalityczna

Domena katalityczna hPARP-1 rozciąga się od 526. do 1014. aa (m.cz. 54) i obejmuje motywy funkcjonalne E i F (ryc. 1). W nowych badaniach w jej N-końcu opisano sła­bo dotąd poznany motyw sekwencyjny WGR, wzbogaco­ny w tryptofan, glicynę i argininę, który prawdopodobnie stanowi region oddziaływania enzymu z kwasami nukle­inowymi [35,36,117]. Aktywność katalityczną hPARP-1 wiąże się z tzw. rdzeniem katalitycznym bądź minimal­ną domeną katalityczną usytuowaną między 663. a 1014. aa o m.cz. około 40 kDa [93,117]. Centrum katalityczne opisywane jako „signature PARP” reprezentuje bardzo konserwatywny odcinek około 50 aa występujący u po­znanych dotąd przedstawicieli PARP [2,36]. W PARP-1 komórek ludzkich zidentyfikowano je między 859. a 908. aa. W tym regionie znajduje się miejsce akceptorowe dla NAD⁺ oraz odbywa się zakotwiczenie pierwszej cząsteczki ADP-rybozy (przy automodyfikacji czy modyfikacji sub­stratu), a następnie wydłużenie i rozgałęzienie polime­ru PAR [19,93]. Uważa się, że dla przebiegu poli(ADP-rybozylacji) krytyczne aminokwasy to Asn868, Gly871, Leu877, Phe897, Lys903 i Cys908 [36]. Wyniki badań nad strukturą rdzenia domeny katalitycznej z wykorzystaniem specyficznych inhibitorów PARP-1 (m.in. PD128763) wy­kazały, że w wiązaniu NAD+ istotną rolę odgrywają resz­ty Glu988 i His862 [93]. Za region regulatorowy reakcji katalizowanej przez hPARP-1 uznaje się odcinek między 663. a 796. aa – PRD (PARP regulatory domain) [35,117].

Aktywność enzymatyczna PARP-1

Polimeraza poli(ADP-rybozy) wykorzystuje jako źródło jed­nostek ADP-rybozy koenzym – dinukleotyd nikotynoamidowy (NAD⁺) i katalizuje transfer 2′-(5”-fosforybozylo)-5-AMP na miejsce akceptorowe – głównie grupę karboksylową kwasu glutaminowego (E), rzadziej kwasu asparaginowe­go (D) [50,55], w reakcji opisywanej jako inicjacja (ryc. 2). Polimeryzacja reszt ADP-rybozy następuje przez tworzenie wiązań glikozydowych między C1 rybozy monomeru ADP-rybozy (powstającego z NAD⁺ po odłączeniu amidu kwa­su nikotynowego), a C2′ rybozy kolejnego przyłączonego monomeru (ryboza – ryboza 1″ –> 2″). Formowanie wią­zań między kolejnymi przyłączanymi monomerami ADP-rybozy prowadzi do powstania oligomerów, a następnie po­limerów w tzw. reakcji elongacji. Polimery mogą osiągnąć in vitro 200-400 jednostek; wykazują strukturę helikoidal­ną. W wydłużającym się polimerze ADP-rybozy (PAR) co 20-50 jednostek występują rozgałęzienia [19,37].

Ryc. 2. Poli(ADP-rybozylacja) białek katalizowana przez PARPs. W modyfikacji białek dochodzi do transferu ADP-rybozy z NAD⁺, głównie na reszty Glu substratu. Reakcja może przebiegać z przyłączeniem kolejnych monomerów ADP-rybozy tworząc polimery ADP-rybozy (PAR) proste lub rozgałęzione. Katalizę degradacji PAR dokonuje glikohydrolaza PARG; opracowano wg [14,113]

Modyfikacja PARP-1 per se bądź licznych innych białek jest reakcją odwracalną, w której uczestniczy glikohydrolaza po­li(ADP-rybozy) – PARG. Ta glikohydrolaza w komórkach ludzkich jest kodowana przez jeden gen (PARG; chromo­som 10q11.23) i wykazuje aktywność egzo- i endoglikozy­dazy, która zapewnia usuwanie odpowiednio pojedynczych jednostek ADP-rybozy od końca polimerów i rozgałęzień polimeru [19,50]. PARG odgrywa główną rolę w recyklin­gu automodyfikowanych cząsteczek PARP-1 i w utrzy­maniu prawidłowego poziomu cząsteczek PAR w komór­kach. Usuwanie cząsteczek ADP-rybozy z polimerów PAR może również katalizować ostatnio wykryty enzym hydro­laza ADP-rybozy – ARH3 (m.cz. 39 kDa), który wykazu­je częściową homologię z PARG [81]. Usuwanie pierwszej cząsteczki ADP-rybozy związanej z substratem dokonuje liaza, a sam mechanizm tej reakcji jest słabo poznany [32].

Jak dotąd dobrze scharakteryzowano kilka enzymów z tej rodziny [35,36,82,108,117]. Wyniki obserwacji wskazują, że dwa z nich – PARP-1 i PARP-2 ulegają aktywacji w wy­niku pęknięć helisy DNA [73]. W większości Eukaryota PARP-1 jest powszechnie występującym enzymem, choć nie stwierdzono jej u drożdży. Ocenia się, że enzym ten występuje w 0,2-2×10⁶ cząsteczek w komórce [104,123]. Nazwa enzymów odpowiedzialnych za syntezę PAR (po­liADP-rybozylacja/PARylacja) zmieniała się w czasie od ich wykrycia, od transferaz poli(ADP-rybozy) – ADPRTs, syntetaz PAR – PARs do ostatnio najczęściej stosowanej – polimeraz PAR – PARPs. Enzymy należące do PARPs syntetyzują polimery PAR o różnej długości, których przy­łączanie do licznych substratów (około 200) jest istot­ne dla przebiegu procesów fizjologicznych i patologicz­nych [7,12,73].

Poli(ADP-rybozylacja)/PARylacja substratówbiałkowych

W warunkach prawidłowych tylko niewielka liczba cząste­czek PARP-1 ulega automodyfikacji wypełniając funkcję produktu genu „house-keeping”. Obecność nieaktywnych, nie-ADP-rybozylowych cząsteczek zapewnia natychmia­stową odpowiedź na uszkodzenia materiału genetyczne­go [19]. Jeśli komórki znajdą się w niekorzystnych, stre­sowych warunkach enzym ten syntetyzuje łańcuchy PAR i ich poziom wzrasta około 500-krotnie. Okres połowicz­nego rozpadu PAR spada zwykle szybko z 6-7 minut do kilku sekund.

PARP-1, a także przedstawiciele tzw. „bona fide” rodziny PARP, przyłączają kowalencyjnie jednostki ADP-rybozy albo do własnych cząsteczek (automodyfikacja) albo ka­talizują ich transfer na inne białka (heteromodyfikacja) [36,117]. Uważa się, że cząsteczki PAR występujące w po­staci wolnej, a także związanej kowalencyjnie z białkami są zdolne oddziaływać z substratami niekowalencyjnie [14,35]. Łańcuchy PAR mogą tworzyć swoiste struktury przez wewnątrzcząsteczkowe oddziaływania; struktury te wykazują zdolność przyciągania niekowalencyjnego czy odpychania innych cząsteczek [14,46,84]. W takiej interak­cji ważny jest dwuczęściowy motyw sekwencyjny, zawie­rający dwa konserwatywne regiony zapewniające utworze­nie „kieszeni” dla niekowalencyjnego wiązania PAR [84]. Wykryty motyw jest wzbogacony w reszty aminokwasów zasadowych i hydrofobowych i zwykle zawiera: hxbxhhb­bhhb (h, b, x oznacza odpowiednio aminokwas hydrofo­bowy, zasadowy czy dowolny) [14].

PARP-1, najczęściej ulegający ekspresji enzym z rodzi­ny PARP obejmującej 17 różnych białek, należy do tzw. prawdziwych „bona fide” polimeraz obok PARP-2, PARP-3, PARP-4 (vault), tankyrazy 1 (PARP-5a) i tankyrazy 2 (PARP-5b) [32,35,117]. W budowie prawdziwych „bona fide” PARPs występuje w domenie CD tzw. katalityczna reszta Glu988 oraz motyw sekwencyjny HYE [51]. Wśród wszystkich przedstawicieli rodziny PARP zidentyfikowano domenę katalityczną, zwykle umiejscowioną w C-końcu łańcucha (z wyjątkiem PARP-4/vault) z konserwatywnym motywem „PARP signature” [35,117]. W strukturze pierw­szorzędowej PARP, oprócz domen opisanych w PARP-1 (por. ryc. 1), mogą występować dodatkowe domeny funk­cjonalne związane z pełnionymi aktywnościami, m.in. tzw. powtórzenia ankirynowe, makrodomeny, nietypowe palce cynkowe, domena oddziaływań z RNA (RNA binding motif) czy WWE (z konserwatywnymi resztami Trp i Glu) [32].

W grupie przedstawicieli PARPs poza „bone fide” wystę­pują enzymy uczestniczące przede wszystkim w mono-ADP-rybozylacji białek (PARP 6-8; PARP 10-12 i PARP 14-16), bądź niewykazujące takiej aktywności (np. PARP-9 i PARP-13) [51,117]. Jak dotąd, wydaje się, że poza PARP-1 i PARP-2, aktywność pozostałych członków omawia­nej rodziny nie jest aktywowana uszkodzeniami DNA [1].

Rola niekowalencyjnego wiązania łańcuchówPAR przez białka chromatynowe

Pogląd, że łańcuchy PAR występujące w postaci wolnej, a także związanej kowalencyjnie z białkami są zdolne per se oddziaływać z substratami niekowalencyjnie opiera się na wynikach badań przeprowadzonych w latach 80. ub.w. [96,124]. Łańcuchy PAR wykazują zdolność łączenia się z dodatnio naładowanymi białkami, przede wszystkim z histonami. Interakcje te prawdopodobnie nie polegają na prostym elektrostatycznym przyciąganiu, gdyż ujaw­niono różnice w oddziaływaniu histonów H1, H3 oraz H4 z wolnymi łańcuchami PAR [124]. Dodatkowo stwierdzo­no, że w odróżnieniu od pozostałych histonów, histon H4 cechuje silniejsze powinowactwo do łańcuchów PAR ani­żeli do DNA. Stąd łańcuchy ADP-rybozy mogą konkuro­wać z DNA w wiązaniu się z histonem H4 oraz okazują zdolność do „wypychania” DNA z uprzednio utworzonych kompleksów, co potwierdzono w doświadczeniach z wy­dzielonymi nukleosomami [124; dane niepublikowane]. Należy podkreślić, że histon H1 charakteryzuje się znacz­nie wyższym powinowactwem do DNA niż do PAR, pod­czas gdy H3 nie wykazuje takich różnic. Wyniki tych ob­serwacji pozwoliły na zaproponowanie modelu regulacji struktury chromatyny na poziomie nukleosomów [124].

Strukturę nukleosomów w głównym stopniu warunkują interakcje DNA z histonami H3 i H4 [52,103]. Obydwa wspomniane histony pozostają w bardzo ścisłym kontakcie z DNA w chromatynie nieulegającej replikacji [25]. Z ko­lei oddziaływania histonów H2A i H2B z kwasem nukle­inowym są znacznie słabsze, co umożliwia ich łatwą wy­mianę z cząsteczkami spoza nukleosomów [63]. Zgodnie z tą koncepcją relaksacji struktury chromatyny na poziomie mononukleosomów, łańcuchy PAR zsyntetyzowane w re­gionach z uszkodzeniami DNA byłyby zdolne do miejsco­wego odłączania cząsteczek H4 i DNA, umożliwiając tym samym dostęp „maszynerii” kompleksu naprawczego do pęknięć nici DNA. Zaproponowany model udziału łańcu­chów PAR w relaksacji chromatyny potwierdzają wyniki obserwacji ujawniające nierównomierne rozmieszczenie powstających podczas naprawy DNA „łatek” (repair pat­ches), głównie w miejscach wiązania cząsteczek H4 [59]. Model ten dobrze wpisuje się w koncepcję regulacji struk­tury chromatyny przez PAR na wyższych poziomach jej organizacji. Koncepcja ta dotycząca relaksacji polinukle­osomów przez łańcuchy PAR, kowalencyjnie przyłączone do histonów H1, stanowi atrakcyjne wyjaśnienie szybkich i łatwo odwracalnych zmian w chromatynie na wyższym poziomie jej uporządkowania [86].

Lokalizacja PARP-1 w komórce

Najwcześniej poznane funkcje PARP-1 jako enzymu do­konującego poli (ADP-rybozylacji) białek jądrowych oraz sensora uszkodzeń DNA były przyczyną uznawania tej polimerazy za składnik jądrowy. Główna pula PARP-1 wiąże się z chromatyną i gromadzi w jąderkach [69,74]. Stymulacja określonych swoistych domen koreluje z akty­wacją PARP-1 przez automodyfikację, która prowadzi do jej oddysocjowania z tych miejsc i utraty zdolności synte­zy przez ten enzym cząsteczek PAR [50].

W jąderkach fibroblastów myszy oraz komórkach HeLa PARP-1 (a także PARP-2) oddziałuje z fosfoproteiną – nukleofosminą/B23 i asocjacja ta ma charakter konser­watywny. Okazuje się, że obydwie polimerazy i nukleofo­smina/B23 są usuwane z jąderek w obecności inhibitorów polimerazy RNA I, ale nie w przypadku hamowania poli­merazy RNA II [69]. W komórkach pozbawionych PARP-1 i PARP-2 nie odnotowano zmian w poziomie transkrypcji rRNA. Białko PARP-1 gromadzi się w skupiskach gęste­go składnika włóknistego jąderek. W nukleoplazmie po­ziom tego enzymu wydaje się pozytywnie korelować ze stopniem upakowania chromatyny, natomiast przestrzenie międzychromatynowe wydają się jego pozbawione [74]. Obecność PARP-1 potwierdzono w strukturze utrzymują­cej właściwy kształt jądra komórkowego i odpowiedzialnej za wiele procesów jądrowych, tj. w matriks jądrowej [123].

W 2009 roku doniesiono z laboratorium Scovassi [83] o wiązaniu się PARP-1 z centromerami komórek HeLa. Opublikowane dane są potwierdzeniem wcześniejszych do­świadczeń wskazujących, że enzym ten asocjuje z centro­merami różnych komórek ssaków eksponowanych na pro­mieniowanie g, katalizując ADP-rybozylację białek tych struktur jądrowych, m.in. CENP-A, CENP-B i BuB3 [97]. Opisywana polimeraza prawdopodobnie jest regulatorem białkowego kompleksu centromerowego, który oddziału­je z centromerowym DNA. Porównywalna analiza oceny fluorescencji użytych przeciwciał rozpoznających PARP-1 i składniki kompleksu (CENP-B, -E i -F) za pomocą kon­fokalnego mikroskopu skaningowego w komórkach ży­wych i apoptotycznych potwierdziła m.in. kolokalizację enzymu naprawczego z CENP-B tylko w czasie interfazy. Białko CENP-E zidentyfikowano jednocześnie z PARP-1 podczas późnej fazy G1 oraz mitozy, zarówno we wrze­cionie mitotycznym, jak i cytoplazmie. Z kolei składnik CENP-E nie wykazywał wspólnej lokalizacji z PARP-1 i wykrywano go w komórkach mitotycznych wokół chro­mosomów. W komórkach HeLa indukowanych do apop­tozy etopozydem lub aktynomycyną D obserwowano, że CENP-B i PARP-1 ulegają „wyrzuceniu” poza jądro ko­mórkowe i odnajduje się je w cytoplazmie w pęcherzykach apoptotycznych (apoptotic blebs). W komórkach apopto­tycznych odnotowano produkt proteolizy PARP-1 o m.cz. 89 kDa, który był później usuwany poza jądro komórkowe. Pozostałe składniki kompleksu centromerowego – CENP-E i CENP-F w komórkach apoptotycznych wykazywały po­dobny wzór barwienia immunochemicznego [83].

Ostatnio zwrócono uwagę, że w subjądrowych sferycznych organellach opisywanych jako ciałka Cajala lub „ciałka zwinięte” (coiled bodies; CB), obecne w jądrach prolife­rujących czy metabolicznie aktywnych komórek zwierząt i roślin umiejscowione są PARP-1 [53]. Struktury te są czę­sto powiązane z jąderkami i wykazują w swoim składzie wspólne białka m.in. fibrylarynę i p80 – koilinę. Wykazano, że PARP-1 wchodzi w interakcję z głównymi składnikami CB, tj. koiliną (marker CB) i sn-RNP LSM11 (marker tzw. HLBs; histone locus bodies) w tkankach D. melanogaster i kontroluje ich umiejscowienie w tych strukturach.

Od dawna toczy się dyskusja czy PARP-1 może wystę­pować poza jądrem komórkowym, np. w mitochondriach [13,74,101]. W mitochondriach znajduje się pula NAD, któ­ry może stanowić substrat dla PARP-1. Ponadto potrzeba naprawy autonomicznego mtDNA, narażonego na uszko­dzenia oksydacyjne wskazuje na taką możliwość [101]. Wykorzystanie immunomikroskopii elektronowej i techni­ki wykorzystującej koloidalne złoto pozwoliło na wykrycie PARP-1 w części mitochondriów komórek Sertolego i HeLa [74]. Po raz pierwszy lokalizację PARP-1 zasygnalizowa­no w tych strukturach wydzielonych z gruczołu jądrowego szczura, wołu i chomika wskazując na współwystępowa­nie tego enzymu z reduktazą cytochromu c. Traktowanie digitoniną frakcji mitochondrialnej wskazywało na obec­ność opisywanej polimerazy w mitoplaście [13].

Wyniki badań ostatnich lat potwierdzają detekcję PARP-1 w mitochondriach, a także wewnątrzmitochondrialną poli­(ADP-rybozylację) białek tego organellum i znajdują zarów­no zwolenników [24,58,92], jak i przeciwników [18,87,129]. Adwersarze tej koncepcji uważają, że przejawy mitochon­drialnej aktywności tego enzymu to zanieczyszczenia en­zymem jądrowym. W świetle tych doniesień należy pod­kreślić wyniki doświadczeń Rossiego i wsp. [92], którzy wykorzystując spektrometrię masową współwytrąconych precypitatów lizatów komórkowych i oczyszczonych mi­tochondriów (ludzkie fibroblasty FB1829 i komórki HeLa) za pomocą przeciwciał rozpoznających PARP-1 i składnik mitochondrialny – mitofilinę potwierdzili mitochondrialne umiejscowienie tych białek. Cytowani badacze stosując po­dwójne barwienie immunofluorescencyjne i mikroskopię skaningową przedstawili dowody, że PARP-1 i mitofilina współwystępują w mitochondriach. Potwierdzeniem mi­tochondrialnej lokalizacji PARP-1 była obecność marke­ra tych struktur, tj. HSP70 i mitofiliny. Natomiast wyklu­czeniem zanieczyszczeń jądrowych i cytoplazmatycznych była negatywna reakcja w wydzielonych mitochondriach obecności jądrowego czynnika transkrypcyjnego – SP1 i cytoplazmatycznego białka α-tubuliny. Mitochondrialne usytuowanie PARP-1 wydaje się być regulowane obecno­ścią mitofiliny, składnika błony wewnętrznej tego orga­nellum. Odnotowano, że zahamowanie syntezy PARP-1 przez siRNA powoduje nagromadzenie uszkodzeń DNA. Ponadto dostarczono eksperymentalnych dowodów, że PARP-1 wiąże się z mtDNA i wchodzi w skład komplek­su naprawczego, oprócz ligazy DNA III, co przemawia za udziałem tej polimerazy w utrzymaniu integralności mtD­NA [92]. Poza tym ujawniono, że wysoki poziom aktywa­cji PARP-1 promuje kaskadę zdarzeń prowadzących do zależnej od PAR dysfunkcji mitochondriów i szybkiego uwalniania z tych organelli czynnika proapoptotycznego AIF [129] i jego przemieszczenia do jądra komórkowego. Ta translokacja indukuje aktywację PARP-1 i jest zależna od jej aktywności katalitycznej. Uwolniony w sposób za­leżny od PARP-1, a niezależny od kaspaz – AIF induko­wał śmierć neuronów eksponowanych na H₂O₂, N-metylo-N-nitrozoguanidynę (MNNG) czy N-metyloasparaginian (NMDA). Zdarzenia te odwracał inhibitor poli(ADP-rybozylacji): INH2BP czy FP15 [24]. Inhibicja mito­chondrialnej poli(ADP-rybozylacji) zapobiega dysfunk­cji mitochondriów, indukowanych stresem oksydacyjnym, uwalnianiu AIF i śmierci neuronów. Podejrzewa się, że polimerazy poli(ADP-rybozy) mogą stanowić sygnał do spadku poziomu NAD⁺/ATP i inicjować przemieszczenie glikohydrolazy PARG do jądra komórkowego i jej udział w katabolizmie PAR [87]. Na podkreślenie zasługuje de­tekcja aktywności enzymatycznej enzymów degradujących PAR, tj. PARG i ARH3 w macierzy mitochondriów komó­rek embrionalnych nerki ludzkiej linii 293 [76].

Lai i wsp. [58] wykazali wysoki poziom poli(ADP-rybozylacji) wielu białek w mitochondriach izolowanych z mózgu szczurów, u których wywoływano urazowe uszko­dzenie mózgu przez hipoksemię. Autorzy ci potwierdzili obecność PARP-1 w mitochondriach, jak i jej aktywność w modyfikacji wielu białek tych organelli, w tym: VDAC (voltage-dependent anion chanel-1), mitofiliny, oksydazy cytochromowej, reduktazy cytochromowej, podjednost­ki β F₁F₀ ATP-azy, dehydrogenazy aldehydu 3′-fosfogli­cerynowego i HSP60. Na tym etapie badań wydaje się, że znaczna aktywacja mtPARP może wpływać na spadek NAD⁺ i osłabione wytwarzanie ATP przez zahamowanie łańcucha oddechowego, co prowadzi do dysfunkcji mito­chondriów i śmierci komórek.

Modyfikacje PARP-1

Modyfikacje potranslacyjne PARP-1 stanowią ważny me­chanizm kontroli funkcji tego enzymu.

Poli(ADP-rybozylacja)

Wcześniejsze doniesienia wskazywały, że w cząsteczce PARP-1 występuje 4-28 miejsc akceptorowych dla łańcu­chów PAR, umieszczonych głównie w domenie AD [46]. Wyniki badań nad ADP-rybozylacją histonu H1 sugero­wały, że głównym miejscem modyfikacji przez PARP-1 są reszty Glu domeny AD [80,99]. Ze względu na to, że au­tomodyfikacja domeny AD PARP-1 wpływa na interakcję z licznymi białkami, miejsca akceptorowe nie były długo potwierdzone doświadczalnie testami genetycznymi [1,114].

W 2009 r. Altmeyer i wsp. [1] wykorzystując delecje do­men funkcjonalnych czy substytucje w genie PARP-1 uzy­skali chimery cząsteczek PARP-1/PARP-2/PARP-3, a śle­dząc zdolność do syntezy PAR w obecności DNA przez otrzymane białka podważyli panujące dotąd przekonanie, że to reszty Glu stanowią główne miejsce automodyfika­cji polimerazy. Okazało się, że otrzymane za pomocą in­żynierii genetycznej cząsteczki enzymu, w którym usu­nięto region BRTC (N-końcowy odcinek domeny AD z 9 resztami Glu), a także substytucja 8 reszt Glu w pozosta­łej domenie AD, w pełni zachowywały zdolność do au­tomodyfikacji analogiczną do białka „dzikiego”. Te wy­niki wskazały, że reszty Glu domeny AD polimerazy nie są akceptorami PAR. Kolejne doświadczenia, wykorzy­stujące mutanty delecyjne PARP-1 wykazały, że brak od­cinka między 466. a 525. aa domeny AD w sposób istot­ny ograniczał poziom automodyfikacji enzymu. Stopień automodyfikacji był ograniczony w białku pozbawio­nym fragmentu między 1. a 214. aa domeny DBD, głów­nie odcinków kodujących palce cynkowe Zn I i Zn II. Głównym odkryciem cytowanego doniesienia [1] było wskazanie, że reszty Lys498, Lys521 i Lys524 stanowią miejsca akceptorowe PAR w polimerazie. Ich substytu­cja resztami Arg ograniczała automodyfikację PARP-1. Na tym etapie badań sprawą otwartą jest czy inne reszty Lys, np. w domenie DBD enzymu mogą stanowić miej­sca akceptorowe PAR.

W tym samym czasie, zespół Liu [114,115] opubliko­wał wyniki analizy funkcjonalnej domeny cząsteczki D PARP-1, wykorzystując produkt mutacji z substytucją Glu/Gln (E988Q), który może katalizować mono(ADP-rybozylację) (bez reakcji elongacji). Oczyszczone pro­dukty sklonowanego w E. coli konstruktu kodującego do­menę D (354-525 aa) oraz dodatkowo 21 aminokwasów z nią sąsiadujących, a także mutanta E988Q inkubowano z NAD+, po czym rozdzielono za pomocą wysokociśnie­niowej chromatografii cieczowej (HPLC). W uzyskanych po tej chromatografii dwóch polipeptydach identyfikowa­no miejsce (ADP)-rybozylacji techniką spektrometrii ma­sowej. Okazały się nimi reszty Asp387, Glu488 i Glu491. Ich podstawienie cząsteczkami Ala powodowało spadek poziomu (ADP)-rybozylacji produktu zmutowanego genu, najwyższy w przypadku substytucji trzech ww. aminokwa­sów. Z kolei ocena zdolności automodyfikacji przez pro­dukt ekspresji konstruktu, który był pozbawiony domeny D, czyli białko PARP-1 zawierające w strukturze dome­ny funkcjonalne ABCEF zachowywało tylko około 30% mniejszą aktywność w przyłączaniu PAR w porównaniu z białkiem enzymatycznym typu „dzikiego”.

Wyniki przedstawione przez obydwa zespoły badawcze [1,114] sugerują, że potencjał do przyłączania ADP-rybozy, czy jej polimerów „wykracza” poza domenę AD opisywa­nego enzymu i wymaga dalszych badań. Automodyfikacja PARP-1 wywołuje hamowanie jej aktywności katalitycznej i upośledza zdolność wiązania do DNA [19].

Fosforylacja

Fosforylacja należy do potranslacyjnych zdarzeń, któ­re modulują przebieg wielu procesów fizjologicznych. Fosforylacja białek, poza regulacją aktywności substra­tów, jest powiązana z innymi modyfikacjami, które odpo­wiadają za kontrolę licznych dróg sygnalizacji komórko­wej (cross-talk).

W bogato udokumentowanej publikacji zespołu Swansona [48] badano korelację między szlakiem z udziałem ki­naz rodziny MAPK (mitogen activated protein kinases) – ERK1 i ERK2 (ERK1/2; extracellular signal-regula­ted kinase1/2) a śmiercią neuronów i astrocytów zależ­ną od PARP-1. Farmakologiczne hamowanie aktywno­ści kinaz ERK1/2 zapobiegało aktywacji PARP-1 in vitro i in vivo i przyczyniało się do spadku poziomu umiera­jących komórek nerwowych. Zależna od PARP-1 śmierć komórek eksponowanych na MNNG, MNDA czy nadtle­noazotyn była całkowicie blokowana przez dwa inhibi­tory ERK1/2 (PD98059 i U0126) oraz inhibitor PARP-1 (DPQ). Natomiast inhibitory kinazy p38 i JNK1 w hodowli komórek nie okazywały wpływu na śmierć komórek neu­ronalnych. Ujawniono, że obniżona przez siRNA ekspre­sja ERK1/2, a głównie ERK2 ochraniała astrocyty przed zależną od PARP-1 śmiercią indukowaną przez MNNG. Bezpośrednim dowodem aktywacji PARP-1 przez ERK1/2 był, potwierdzony immunohistochemicznie i techniką we­stern blotting, spadek aktywności polimerazy w tworze­niu PAR w komórkach inkubowanych w obecności alkila­tora DNA – MNNG, inhibitorów ERK1/2, a także siRNA – wyciszającego ekspresję ERK2. Zastosowanie rekom­binowanego białka hPARP-1 wykorzystano do potwier­dzenia jego fosforylacji przez ERK1/2 w obecności ATP oraz wyznaczenia miejsc tej modyfikacji metodą spektro­metrii masowej. Wykazano, że fosforylacja PARP-1 doty­czy reszt Ser372 i Thr373, które są usytuowane w odcin­ku łańcucha między Zn III a domeną BRTC (por. ryc. 1). Substytucja reszt Ser372 i Thr373 przez Ala zapobiega­ła fosforylacji PARP-1 i hamowała aktywność polimera­zy w syntezie PAR, w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Wydaje się, że spadek aktywności PARP-1 może wynikać ze zmian konformacyjnych cząsteczki enzymu spowodo­wanych substytucją [48]. Ponadto zasugerowano, że fos­forylacja ww. aminokwasów może stanowić mechanizm kontrolujący aktywność PARP-1 poprzez regulację od­działywań między domenami enzymu [60].

Wśród istotnych aspektów fosforylacji PARP-1 należy wy­mienić doniesienie wskazujące, że insulinopodobny czynnik wzrostu 1 – IGF1 (insulin-like growth factor), wzmacniają­cy ekspresję naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzro­stu – VEGF (vascular endothelial growth factor) i proces angiogenezy hamuje fosforylację PARP-1. Odnotowano, że inhibicja PARP przez 3-aminobenzamid oraz nikotynamid stymulują ekspresję VEGF w sposób zależny od dawki [5].

Inkubacja lizatów komórek śródbłonka żyły pępowinowej – HUVEC w obecności ATP, inhibitora i aktywatorów ki­nazy białkowej C (PKC) – odpowiednio staurosporyny i TPA (13-octan-12-O-mirystynian forbolu) oraz HCNS (N-heptylo-5-chloronaftylenosulfono-amid), a także fos­fatazy PP1 wskazuje na udział kinazy PKC w fosforylacji PARP-1. Dodanie egzogennego ATP ułatwiało fosforylację PARP-1, a jednocześnie hamowało jej aktywność ocenianą stopniem włączania [14C]-NAD⁺. Ta inhibicja była znoszo­na przez staurosporynę i fosfatazę PP1, a TPA i HCNS do­dawane indywidualnie, obniżały aktywność PARP-1 ponad 60%. Z kolei wyniki elektroforezy białek jądrowych wy­dzielanych z komórek HUVEC znakowanych [³H]-H₃PO₄ (przez 20 godz.) w obecności IGF-1 potwierdziły obecność ufosforylowanego białka PARP-1 o m.cz. ~120 kDa i pro­duktu jego proteolizy o m.cz. 85 kDa oraz modulowanie przez IGF-1 fosforylacji enzymu naprawczego.

W 2009 roku międzynarodowy zespół badawczy pod kie­runkiem G. Poiriera [27] opublikował dane wskazujące na nowe miejsca fosforylacji PARP-1 (oraz PARG). W cyto­wanych badaniach potwierdzono, że in vitro w rekombi­nowanym hPARP-1 w obecności ATP, kilka kinaz może fosforylować ten enzym i są to: PKCα, PKCβ, ERK-1, ERK-2, CK II, JNK-1, CaMK II oraz kinaza związana z prze­biegiem cyklu komórkowego CDK-5. Najwyższy poziom fosforylacji odnotowano w przypadku PKCβ. W dalszych doświadczeniach rozdzielone za pomocą SDS-PAGE pa­smo hPARP-1, po inkubacji w obecności badanych kinaz, wycinano z żelu, poddawano trawieniu za pomocą trypsy­ny i frakcjonowano za pomocą kapilarnej chromatografii HPLC. Następnie poszczególne fosfopeptydy analizowa­no za pomocą spektrometrii masowej. W uzyskanych fos­fopeptydach ujawniono miejsce endogennej fosforylacji, obok nowych czy potwierdzonych miejsc tej modyfikacji PARP-1, a także skorelowano ich występowanie z budową domenową analizowanego enzymu. W krótkim streszczeniu tych obszernych badań należy zwrócić uwagę na detekcję lub potwierdzenie specyficznych miejsc fosforylacji przez:
• PKCβ – (Thr368/Ser372/Thr373/Ser374; w regionie wyprzedzającym mostek leucynowy; Ser504, Ser519 i Thr565 w domenie katalitycznej);
• ERK-1 – (Ser41, Ser177 i Thr420/Thr422, Ser455 i Ser542 odpowiednio w obrębie palca Zn I i Zn II oraz domeny AD na jej pograniczu z motywem WGR; por. ryc. 1).

Ponadto wykazano modyfikację reszt Ser/Thr katalizowaną przez ERK-1, CaMK-II i JNK-1 (Ser257/Thr258 i Ser 782/Ser785/Ser786 – odpowiednio w domenie DBD i CD) oraz niejednoznaczne wyniki dotyczące transferu reszty fosfo­ranowej na PARP-1 przez CK II (Ser257/Thr258, Ser782/Ser785) i CDK5 (Ser782/Ser785/Ser786). Zidentyfikowane in vitro nowe potencjalne miejsca fosforylacji muszą za­pewne zostać zweryfikowane in vivo. Obserwacje potwier­dzające fosforylacje opisanego enzymu w większości istot­nych regionach funkcjonalnych PARP-1 przemawiają za ich ważną rolą w aktywności opisywanego białka.

Acetylacja

W ostatnich latach wykazano, że polimeraza poli(ADP-rybozy)-1 w warunkach stresu ulega acetylacji, a ta mo­dyfikacja wzmaga jej aktywność katalityczną [33,34,90]. W 2006 r. Hassa i wsp. [34] donieśli, że PARP-1 ulega mo­dyfikacji przez acetylazy p300 i CBP (cAMP-response ele­ment-binding protein); p300/CPB. W szeroko udokumen­towanym doniesieniu badacze ci wykazali, że acetylacji ulegają reszty: Lys498, Lys505, Lys508, Lys521 i Lys524 umieszczone między 373. a 524. aa cząsteczki polime­razy. Ich wyniki sugerują również możliwość acetylacji w odcinku N-końcowym łańcucha między 1. a 214. aa. Acetylacja PARP-1 przez p300/CBP promuje zdolność tego enzymu do regulacji transkrypcji genów zależnych od NF-κB (nuclear factor kappa B). Stwierdzono, że PARP-1 i acetylaza p300 synergistycznie aktywują ekspresję ge­nów zależnych od wspomnianego czynnika transkrypcyj­nego w odpowiedzi na czynniki wywołujące stan zapalny [33]. Okazało się, że część domeny AD i C-końcowy od­cinek domeny CD, a nie tzw. minimalna domena CD od­działuje z acetylazą w pełnej koaktywacji NF-κB w od­powiedzi na stymulację TNF-α i liposacharydem [33,34]. Acetylacja PARP-1 na wymienionych resztach Lys jest nieodzowna w interakcji polimerazy z podjednostką p50 NFκB i synergistycznej aktywacji tego czynnika przez ace­tylazę p300 i tzw. kompleks Mediatora, jako odpowiedź na stymulatory stanu zapalnego [34]. Doświadczenia, w któ­rych przeprowadzono koimmunoprecypitację komplek­sów PARP-1 z ekstraktów jądrowych kontrolnych komó­rek HEK293 z ekspresją deacetylaz histonowych klasy I (HDAC 1-6) wykazały, że polimeraza ulega deacetylacji przez HDAC 1, 2 i 3. Ponadto odnotowano, że HDAC 1-3 dokonują represji transkrypcji genów zależnych od NF-κB (np. MIP-2 i iNOS) częściowo przez deacetylację PARP-1 [34]. Niedawno doniesiono, że acetylacja PARP-1 przez acetylazę PCAF (p300/CBP-associated factor) w kardio­miocytach myszy pod wpływem stresu (naprężenia mecha­niczne) prowadzi do aktywacji polimerazy, niezależnej od uszkodzeń DNA [90]. Modyfikacja ta jest odwracalna i ka­talizowana np. przez SIRT1, należącą do III klasy deace­tylaz histonowych, opisywanych jako sirtuiny. Ze względu na to, że zarówno PARP-1, jak i SIRT1, wykorzystują jako kosubstrat NAD⁺ wydaje się, że obydwa enzymy uczestni­czą we wspólnych ścieżkach sygnalizacyjnych i mogą de­cydować o życiu bądź śmierci komórek, które znajdą się w warunkach stresu. PARP-1 wpływa m.in. na transkrypcję czynnika jądrowego NF-κB, natomiast deacetylaza SIRT hamuje jego aktywność [35,36].

Ponadto przedstawiono wyniki doświadczeń potwierdza­jących, że PARP-1 i SIRT1 wiążą się ze sobą i dokonu­ją deacetylacji polimerazy, zarówno in vitro jak i in vivo [90]. Zsyntetyzowane in vitro cząsteczki PARP-1 po in­kubacji z acetylazą PCAF i [3H]-acetyloCoA poddawano immunoprecypitacji. Następnie próby inkubowano z czą­steczkami SIRT1 opłaszczonymi na ziarnach, równolegle przeprowadzając doświadczenia kontrolne z deacetylazą HDAC1 i HDAC4 – odpowiednio jako kontrolą pozytywną i negatywną. Okazało się, że SIRT1 i HDAC1 katalizowa­ły deacetylację PARP-1, natomiast HDAC4 nie przejawiała takiej aktywności. Enzym SIRT1 okazuje zdolność deace­tylacji odcinków: 1-214 i 477-524 aa PARP-1, a HDAC4 – głównie regionu między 477. a 524. aa.

In vivo potwierdzono deacetylację Myc-PARP-1 w obecno­ści SIRT1 oraz HDAC1 w komórkach Cos7. Deacetylacja przez te enzymy blokuje aktywność katalityczną PARP-1. Potwierdzeniem, że endogenny enzym SIRT1 usuwa reszty acetylowe PARP-1 było wykazanie, że kardiomiocyty trans­fekowane adenowirusowym wektorem, syntetyzującym mu­tant i dziki typ cząsteczki SIRT1, potraktowane inhibitorem tej deacetylazy – splitomycyną, stymulowały acetylację po­limerazy. Natomiast aktywator SIRT1 – resweratrol działał przeciwstawnie. Te interesujące wyniki sugerują, że PARP-1 może stanowić cząsteczkę „docelową” stresu wywołanego m.in. hipertrofią i prowadzić do śmierci kardiomiocytów. W warunkach stresu PARP-1 ulega aktywacji przez ace­tylację, co prowadzi do rozległej poli(ADP-rybozylacji) wielu białek. Niewielka aktywacja PARP-1 reguluje róż­ne funkcje fizjologiczne przez modulację odmiennych ko­mórkowych mechanizmów, tj. zmiany struktury chroma­tyny, transkrypcji genów czy metabolizmu komórkowego. Natomiast w warunkach silnego stresu znaczna aktywacja PARP-1 może wyczerpywać zapasy komórkowego NAD⁺, prowadząc do hamowania aktywności SIRT1 i szlaków za­leżnych od NAD⁺. W tej sytuacji wydaje się, że SIRT1 blo­kując aktywność PARP-1 przez deacetylację tego enzymu „pomaga” utrzymać poziom komórkowego NAD⁺.

Sumoilacja

Wykorzystanie osiągnięć wynikających z poznania ludzkie­go genomu wskazało, że PARP-1 może ulegać modyfikacji przez sumoilację polegającą na przyłączeniu do reszt lizy­ny tego enzymu małych białek SUMO (small ubiquitin-like modifiers), w strukturze których występuje podobieństwo do ubikwityny. Modyfikacja ta, podobnie jak ubikwityla­cja, przebiega w trzech etapach, jednakże maszynerie en­zymatyczne (E1, E2 i E3) w sumoilacji i ubikwitylacji są różne [112]. W skrócie – białko SUMO (1 z 4 poznanych dotąd), po usunięciu C-końcowych aminokwasów, odsła­nia dwie reszty Gly. Następnie ulegając aktywacji przez enzym E1 (heterodimer Sua1/hUba2) w obecności ATP, wiąże się tioestrowo z podjednostką hUba2 enzymu. W ko­lejnym etapie SUMO ulega przeniesieniu na enzym koniu­gujący E2 (Ubc9) z wytworzeniem wiązania izopeptydo­wego między grupą karboksylową C-końcowej Gly i grupą e-aminową Lys białka akceptorowego. Sumoilowane biał­ko uwalnia ligaza E3 SUMO [112].

Messner i wsp. [70] podjęli próbę weryfikacji in vivo su­moilacji PARP-1. W komórkach HEK293 przeprowadzono koekspresję PARP-1 oraz SUMO1 lub SUMO3, a w otrzy­manych ekstraktach tych komórek potwierdzono elektrofo­retycznie obecność monosumoilowanej polimerazy. In vitro wykazano, że sumoilacja przez rekombinowane składniki, które ją przeprowadzają dotyczy Lys486. Okazało się, że substytucja Lys486 argininą – zapewne w istotnym miej­scu cząsteczki, zapobiega sumoilacji in vitro i in vivo. Reszta Lys486 znajduje się w domenie AD – w łączniku spinającym motywy funkcjonalne BRCT i WGR (por. ryc. 1). Wydaje się ważnym, że modyfikacja polimerazy przez SUMO1/3 przebiega w sąsiedztwie reszt Lys, które mogą ulegać acetylacji/deacetylacji [34,90].

Na podkreślenie zasługuje obserwacja, że modyfikacja PARP-1 przez SUMO1 czy SUMO3 nie zmienia aktywno­ści enzymu w syntezie łańcuchów PAR oraz w wiązaniu do uszkodzonego DNA. Natomiast sumoilacja PARP-1 w pełni znosi efekty acetylacji tego enzymu przez acetylazę p300, co zapewne stanowi istotne wydarzenie w „cross-talk”, w którym on uczestniczy. Ponadto udowodniono, że su­moilacja PARP-1 osłabia jej funkcje jako koaktywatora transkrypcji niektórych genów [70].

PARP-1 a metylacja DNA

Pod koniec ostatniej dekady ubiegłego wieku opubliko­wano wyniki doświadczeń wskazujące, że blokowanie poli(ADP-rybozylacji) przez kompetycyjne hamowanie 3-benzamidem enzymów PARP indukuje in vivo zmiany metylacji DNA wysp CpG promotora genu Htf w mysich fibroblastach linii L929 [133]. W laboratorium P. Caiafy zasugerowano, że PARP-1 po automodyfikacji, bądź łań­cuchy PAR, przyczyniają się do inaktywacji metylotrans­ferazy DNA-Dnmt1 i nieefektywnej metylacji DNA [134]. Automodyfikowana polimeraza z dużym ujemnym ładun­kiem wiąże się z Dnmt1, wyciszając jej aktywność katali­tyczną. Na taką sugestię wskazują obserwacje ujawniające, że dwie domeny potencjalnego wiązania PAR metylotrans­ferazy wykazują silniejsze powinowactwo do łańcuchów PAR niż do DNA. Ponadto na taką możliwość wskazują wyniki doświadczeń wykorzystujące koimmunoprecypi­tację obydwu enzymów i potwierdzenie w utworzonym kompleksie obecności automodyfikowanej postaci PARP-1 [14,91]. Uważa się, że stosunek między automodyfikowa­nymi i niezmodyfikowanymi cząsteczkami PARP-1, zależ­ny od dynamiki aktywności PARP-1/PARG determinuje wzory metylacji DNA [14]. Spadek bądź wzrost automo­dyfikacji PARP-1 wydaje się odpowiadać odpowiednio za „rozproszoną” hipermetylację bądź hipometylację DNA. Jeśli PARP-1 pozostaje w wolnej postaci metylotransfera­za Dnmt1 może metylować DNA. Z kolei wysoki poziom automodyfikacji PARP-1 wycisza aktywność Dnmt1 za­pobiegając utrzymaniu metylacji widełek replikacyjnych, czego skutkiem jest hipometylacja DNA. Ostatnio wyka­zano, że w wyniku ektopowej nadekspresji glikohydrolazy PARG w fibroblastach linii L929 (po ich transfekcji wek­torem zawierającym Myc-PARG), ekspresja Dnmt1 ulega spadkowi, a wyspy CpG promotora tego genu ulegają me­tylacji [131]. Wyniki tych doświadczeń sugerują, że wyspy CpG promotora Dnmt1 są ochraniane przed metylacją przez automodyfikowany PARP-1 bądź ADP-rybozylowany czyn­nik transkrypcyjny. Ważnym odkryciem wydaje się stwier­dzenie, że w komórkach prawidłowych automodyfikowane cząsteczki PARP-1, a także łańcuchy PAR wiążą się z pro­motorem Dnmt1 „znacząc” te sekwencje i ochraniając je przed metylacją. Na obecnym etapie badań można ocze­kiwać, że ochronna rola promotora Dnmt1 stanowi istot­ną funkcję w epigenetycznej regulacji ekspresji tego genu.

Substraty i główne funkcje PARP-1

PARP-1 in vivo jest najczęściej akceptorem łańcuchów PAR [19,35]. Liczne badania wskazują, że głównymi substratami dla PARP-1 są białka jądrowe, których modyfikacja przez przyłączenie PAR moduluje strukturę chromatyny, wpływa na metabolizm i naprawę DNA oraz jego stabilność, regulu­je transkrypcję genów [49,50,54,99,123]. Enzym ten przez palce cynkowe, występujące w jego domenie DBD może oddziaływać ze specyficznymi sekwencjami w promoto­rach różnych genów [132]. Ponadto PARP-1 może modu­lować poziom transkrypcji genów przez jej zdolność do po­li(ADP-rybozylacji) licznych czynników transkrypcyjnych m.in. NF-κB, TFIIF, Oct YY1 i AP2, przez co zapobiega wiązaniu z ich specyficznymi miejscami w promotorach ge­nów [77,132]. Związane z PARP-1 polimery ADP-rybozy, a także wolne PAR są zdolne do wiązania się niekowalen­cyjnie z konserwatywnymi domenami substratów, a to sta­bilne oddziaływanie jest rozpowszechnione w komórkach modulując funkcją licznych białek [35,84,91,97]. Ostatnio w laboratorium Tulina [45] potwierdzono in vivo interakcję PARP-1 z dwoma białkami Drosophila z rodziny hnRNPs, tj. Squid/hrp40 i Hrb98DE/hrp38. Związanie PAR przez te białka hamuje ich zdolność wiązania z RNA. Wyniki przeprowadzonych doświadczeń wskazują, że modyfika­cja tych hnRNPs reguluje ich interakcję z RNA i modulu­je szlak alternatywnego składania premRNA.

Wśród białek ulegających poli(ADP-rybozylacji) przez PARP-1 należą m.in. p53 czy PCNA (proliferating cell nuclear antigen) uczestniczące w przebiegu cyklu komór­kowego [109,122].

W tabeli 1 przedstawiono główne akceptory polimerów ADP-rybozy uwzględniając efekty biologiczne tej mo­dyfikacji.

Tabela 1. Podstawowe substraty PARP-1; znaczenie ich poli(ADP-rybozylacji) w głównych procesach komórkowych

W dalszej części przeglądu zwrócono uwagę na rolę PARP-1 w naprawie DNA oraz w utrzymaniu stabilności genomu oraz funkcji tego enzymu w procesie śmierci komórek.

Udział PARP-1 w naprawie DNA i utrzymaniu stabilności genomu

Na rolę PARP-1 w usuwaniu uszkodzeń DNA wskazywa­ły m.in. badania z zastosowaniem syntetycznych inhibi­torów tego enzymu, a także technik inżynierii genetycz­nej [19,41]. Nadekspresja domeny DBD białka PARP-1 w transfekowanych komórkach (konstytutywnie oddzia­łującej z DNA, a przez to blokującej dostęp do miejsca jego uszkodzenia endogennemu enzymowi), czy użycie antysensownych oligonukleotydów – hamujących jego ekspresję, obniżało efektywność naprawy uszkodzeń ma­teriału genetycznego indukowanych czynnikami genotok­sycznymi. W konsekwencji prowadziło to do zatrzymania komórek na granicy faz G₂/M cyklu komórkowego oraz ich wzmożonej apoptozy. Ponadto w komórkach ekspono­wanych na czynniki karcynogenne, obserwowano wzrost częstości wymian chromatyd siostrzanych w chromoso­mach, zwiększoną liczbę mikrojąder i nasiloną amplifi­kację genów, wskazującą na zmniejszoną stabilność ge­nomu [19,41,118,120]. Udział PARP-1 w naprawie DNA potwierdziły także doświadczenia z wykorzystaniem mo­dyfikowanych genetycznie organizmów. W laboratorium G. de Murcia [22] udało się wyhodować myszy po „nokau­cie” genu parp-1, które okazały się nadwrażliwe na pro­mieniowanie γ i N-metylonitrozomocznik – czynniki wy­wołujące ich śmierć. Wykazano, że fibroblasty wydzielone z zarodków tak zmutowanych myszy, traciły zdolność do przejścia przez cykl komórkowy. Natomiast splenocyty tych gryzoni, eksponowane na N-metylonitrozomocznik, cechował wzrost poziomu apoptozy w porównaniu z ko­mórkami pochodzącymi z organizmów typu „dzikiego”.

Na uwagę zasługują doniesienia wskazujące, że uszkodze­niom DNA towarzyszy wzrost aktywności PARP-1 oraz powiązanej z nią funkcjonalnie glikohydrolazy PARG, która przemieszcza się z cytosolu do jądra komórkowego [19,50]. W tym organellum PARG atakuje wiązania gli­kozydowe polimerów ADP-rybozy oraz odcina wolne jed­nostki ADP-rybozy (ryc. 2). Uwolnione cząsteczki w pro­cesie nieenzymatycznej glikacji lub glikooksydacji mogą modyfikować liczne białka komórkowe, wpływając na na­prawę i metabolizm DNA. Szacuje się, że czynniki uszka­dzające DNA indukują prawie 9-krotny wzrost zawartości adduktów mono-(ADP-ryboza)-białko w jądrze komórko­wym. Czas połowicznego rozpadu powstałych adduktów w komórce okazuje się dłuższy niż wolnych polimerów PAR i wynosi średnio 8-10 min, podczas gdy około 6 mi­nut dla polimeru rozgałęzionego i poniżej 1 minuty – dla polimeru prostego [19].

Powszechnie akceptuje się pogląd, że cząsteczki PARP-1 wchodzą w skład kompleksu opisywanego jako PLX (PARP-1/ligaza DNA III/XRCC1), który stymuluje napra­wę DNA przez wycinanie zasad – BER oraz uczestniczy w przebiegu naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (do­uble-strand breaks; DSBs) [40,41,108,118].

BER

BER to mechanizm wytworzony przez organizmy w toku ewolucji w celu zapobiegania mutacjom spowodowanym uszkodzeniami zasad azotowych oraz naprawy jednoni­ciowych pęknięć DNA (single-strand breaks; SSBs), któ­re powstają w komórce m.in. w konsekwencji wolnorod­nikowych reakcji chemicznych [39]. Sugeruje się, że BER może przebiegać przynajmniej dwoma sposobami, z udzia­łem różnych polimeraz i ligaz.

W obydwu mechanizmach wyróżnia się kilka etapów, wśród których główną rolę odgrywa faza wycinania uszkodzo­nej zasady azotowej przez glikozylazę DNA z wytworze­niem tzw. miejsca AP (apurynowego/apirymidynowego). Następnie miejsce to jest trawione przez AP endonukle­azę, tworząc SSB w DNA. Celem kolejnych etapów jest naprawa powstałej przerwy w DNA przez wygenerowanie właściwych zakończeń nici („end cleaning”), wbudowanie pojedynczego nukleotydu (w przypadku drogi klasycznej, tzw. SP-BER; short-patch repair), bądź zsyntetyzowanie „łatki” o długości 2-8 nukleotydów, z następczą nukleolizą odsuniętego fragmentu starej nici (w LP-BER; long-patch BER). Ostatecznie dochodzi do odtworzenia brakujących wiązań fosfodiestrowych [8,39].

Jak dotąd rola zarówno PARP-1, jak i PARP-2, w napra­wie typu BER jest słabo poznana. Sugeruje się, że obydwa te enzymy funkcjonują jako „czujniki” (tzw. model sygna­lizacyjny), rozpoznające pęknięcia w DNA, przejściowo wiążące się do jego końców, a następnie przekazujące in­formację o uszkodzeniu na inne białka. Przy użyciu mi­kroskopii elektronowej wykazano, że PARP-1 w postaci homodimeru oddziałuje elektrostatycznie z DNA, obej­mując 7 nukleotydów w górę i w dół od miejsca uszko­dzenia [19]. W oddziaływaniu tym uczestniczy domena DBD enzymu naprawczego. Po związaniu DNA docho­dzi do znacznego (nawet 500-krotnego) wzrostu aktywno­ści enzymatycznej polimeraz i automodyfikacji PARP-1. Automodyfikacja polimerazy prowadzi do jej odłączenia od DNA, a przyłączony polimer PAR może modyfikować inne substraty, w tym p53 lub ulegać degradacji [62] (ryc. 3). Akceptorem ADP-rybozy stają się m.in. histony (głów­nie H1 i H2B modyfikowane preferencyjnie, odpowiednio przez PARP-1 i PARP-2) oraz białka rodziny HMG (1,2, 14,17). Przyłączenie do białek chromatyny ujemnie nała­dowanych polimerów PAR zapewnia niezbędne do napra­wy DNA rozluźnienie jej struktury, co odgrywa zasadniczą rolę w naprawie upakowanej, nietranskrybowanej chro­matyny (model naprawy zależnej od chromatyny) [2,85].

Ryc. 3. Schemat uwzględniający udział PARP-1 (oraz PARP-2) w naprawie jedno- (SSBs) i dwuniciowych (DSBs) pęknięć DNA oraz w śmierci komórek (opracowano na podstawie [2,31,38,85,119,128]. Po syntezie na rybosomach, enzym PARP-1 jest transportowany do jądra komórkowego i mitochondriów, w których enzym ten uczestniczy w naprawie DNA. Przyłączenie PARP-1/2 do jądrowego DNA w miejscu jego uszkodzenia prowadzi do aktywacji polimeraz, poli(ADP-rybozylacji) białek chromatyny i relaksacji włókna 30-nanometrowego chromatyny, co pozwala na funkcjonowanie kompleksu naprawczego. Rozpoznanie SSBs w DNA skutkuje „rekrutacją” i wzrostem aktywności białek komplesu PLX, uczestniczącego w BER. DSBs rozpoznawane są przez białka PARP-1/2 i heterodimer Ku, które przez pewien czas współwystępują w miejscu uszkodzenia. Głównym mechanizmem naprawy DSBs u ssaków jest D-NHEJ (gruba, ciągła linia). Umiejscowiona w pobliżu uszkodzenia polimeraza PARP-1 katalizuje poli(ADP-rybozylację) katalitycznej podjednostki holoenzymu DNA-PK i stymuluje jej aktywność, sama będąc przezeń hamowana. W ten sposób blokowana jest droga alternatywna/zapasowa (B-NHEJ) (przerywana strzałka), a naprawa przebiega na szlaku klasycznym (D-NHEJ) z udziałem m.in. DNA-PK, XRCC4, ligazy IV i czynnika XLF. W przypadku niefunkcjonalnego szlaku D-NHEJ naprawa DSBs odbywa się m.in. z udziałem kompleksu PLX. W pewnych warunkach naprawa może przebiegać w wyniku naprawy rekombinacyjnej. Promieniowanie jonizujące lub niektóre karcynogeny np. N-metylo-N’-nitro-nitrozoguanidyna (MNNG) indukują uszkodzenia DNA, w odpowiedzi na które dochodzi do aktywacji najpierw PARP-1, a następnie kinazy ATM. Powstające w komórce cząsteczki PAR stymulują aktywność ATM, prowadząc do wzrostu stopnia fosforylacji wielu białek (w tym składników kompleksu MRN, p53, SMC1, histonu H2AX), czego konsekwencją jest zatrzymanie cyklu komórkowego i indukcja naprawy DNA. Automodyfikacja PARP jest czynnikiem przyciągającym czynnik Mre11 (składnik MRN) w sąsiedztwo uszkodzenia. Białko to współdziałając z CtIP degraduje dostępny fragment DNA, generując jednoniciowy odcinek, który prawdopodobnie nie wystarcza do stabilnego utrzymania heterodimeru Ku70/Ku80 na DNA. Białko Ku odłącza się od DNA – a wystający, jednoniciowy koniec 3′ rozpoznawany jest przez główne białka naprawcze uczestniczące w rekombinacji homologicznej (cienka, ciągła linia). PARP-1/2 znosi zatem hamujący efekt Ku podczas naprawy rekombinacyjnej i w tym kontekście wydaje się promować HR. Usytuowany w mitochondriach enzym PARP-1 może prawdopodobnie uczestniczyć, wraz z ligazą DNA III, w naprawie uszkodzeń mitochondrialnego DNA. Rozległa naprawa zarówno jądrowego, jak i mitochondrialnego DNA, skutkuje nagromadzeniem w komórce polimerów PAR powstających pod wpływem glikohydrolazy PARG. Polimery te mogą przedostawać się do mitochondriów, gdzie w niewyjaśniony dotąd sposób indukują translokację czynnika AIF do jądra komórkowego lub też mobilizują pulę AIF związaną z zewnętrzną błoną mitochondrialną. W jądrze komórkowym AIF oddziałuje z DNA prowadząc do jego kondensacji i fragmentacji do fragmentów o m.cz. około 50 000 pz., będących znacznikiem zależnej od PARP i AIF śmierci komórek, określanej terminem parthanatos. Czynnik AIF może pozostać w cytosolu w kompleksie z białkiem szoku cieplnego Hsp 70

Kolejny model, tzw. rekrutacyjny zakłada, że aktywne czą­steczki PARP-1 wraz z długimi polimerami ADP-rybozy funkcjonują jako „przynęty”, ułatwiające enzymom na­prawczym dotarcie do miejsc uszkodzenia DNA. ADP-rybozylacja białka XRCC1 zwiększa jego powinowactwo do innych składników szlaku BER, tj. ligazy DNA III i en­donukleazy AP. Ponadto katalizowana przez PARP-1 mo­dyfikacja polimerazy DNA β i endonukleazy Fen-1 (Flap endonuclease-1), odpowiedzialnej za usuwanie „odstają­cej” nici DNA w LP-BER stymuluje ich aktywność [19]. Dodatkowo wykazano, że oddziaływanie ligazy DNA III, zarówno z aktywnym enzymem PARP-1, jak i uwolnionym polimerem PAR zwiększało efektywność ligacji DNA [2]. Wydaje się możliwe, że łańcuchy PAR, w warunkach nie­doboru ATP – niezbędnego do aktywności ligazy, mogą stanowić substrat do jego syntezy, reagując z pirofosfo­ranem, uwalnianym w czasie wbudowywania brakujące­go nukleotydu do uszkodzonej nici DNA wg ciągu reak­cji [66,67,78]:

Wraz ze wzrostem ujemnego ładunku PARP-1, na sku­tek automodyfikacji enzymu, dochodzi do jego odłącza­nia z miejsca pęknięcia nici DNA, co pozwala na wniknię­cie w jego miejsce białek związanych z naprawą [41,108]. Z kolei zmodyfikowane cząsteczki PARP-1 podlegają dzia­łaniu glikohydrolazy PARG, która odcina od nich polime­ry PAR, przywracając funkcję białka „sensorowego” [85].

Mimo iż zdecydowana większość aktywności enzymatycz­nej (nawet 90%) przypisywana jest PARP-1, polimeraza ta jest wspomagana w swej funkcji naprawczej przez kolej­ny enzym – PARP-2, który wydaje się niezbędny w prze­biegu BER [41,126].

NHEJ

Dodatkowo wskazuje się na udział wspomnianego wcze­śniej kompleksu PLX w słabo poznanym szlaku naprawy DSBs w procesie tzw. alternatywnego/zapasowego łącze­nia końców niehomologicznych (alternative/backup non­homologous end joining; Alt-NHEJ, A-NHEJ/B-NHEJ) [1,35,88,118]. Dwuniciowe pęknięcia DNA powstają w ko­mórce zarówno pod wpływem czynników egzogennych, np. promieniowania jonizującego, stresu oksydacyjnego, leków przeciwnowotworowych, jak i endogennych – spe­cyficznych nukleaz uczestniczących np. w programowanej rearanżacji genów immunoglobulin. Ponadto DSBs mogą stanowić wynik zaburzonej segregacji nieprawidłowych, dicentrycznych chromosomów w czasie mitozy [106].

Klasyczny mechanizm naprawy NHEJ, opisywany rów­nież jako D-NHEJ, od nazwy holoenzymu odgrywającego główną rolę w jego przebiegu – DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), reprezentuje dominujący u ssaków szlak usuwania DSBs [44,88]. Poza kinazą DNA-PK, oprócz innych dodatkowych składników, uczestniczą w nim li­gaza DNA IV, nukleaza Artemis, białko XRCC4 i czyn­nik XLF (XRCC4 like factor), opisywany również jako Cernunnos [64,106,128]. W przeciwieństwie do D-NHEJ, w szlaku Alt-NHEJ nie odnotowano aktywności enzymów DNA-PK oraz ligazy IV.

Dwuniciowe pęknięcia w helisie DNA mogą być usuwa­ne również w wyniku naprawy rekombinacyjnej/rekom­binacji homologicznej (homologous recombination repa­ir; HRR). Wybór sposobu naprawy DSBs nie jest znany i prawdopodobnie zależy od wielu czynników, w tym eks­presji, aktywności i dostępności składników kompleksów naprawczych, co podlega regulacji m.in. w wyniku ich po­translacyjnych modyfikacji (fosforylacja czy poliubikwity­lacja), jak również od dostępności matrycy do syntezy DNA [106,128]. W fazie G₀ i G₁ cyklu komórkowego naprawa dwuniciowych pęknięć DNA przebiega preferencyjnie za­leżnie od NHEJ, zaś w późnej fazie S i G₂, ze względu na obecność w chromosomie siostrzanych chromatyd, moż­liwy jest udział w tym procesie rekombinacji homologicz­nej [85,88,95,106,128]. Z kolei pęknięcie widełek replika­cyjnych generuje dwuniciowy koniec DNA (double-strand end; DSE), niestanowiący DSBs sensu stricto, wyklucza­jąc wręcz naprawę uszkodzenia zależnie od NHEJ [106].

Wydaje się, że wzajemne oddziaływania między skład­nikami kompleksów naprawczych mogą również regu­lować wybór drogi eliminacji pęknięć DNA [106,118]. W tych zdarzeniach wydaje się uczestniczyć m.in. poli­meraza PARP-1, której oddziaływanie z DSBs wykaza­no mikroskopowo już w 1987 r. [19]. Cząsteczki PARP-1 rozpoznają DSBs i wiążą się do nich, podobnie jak czy­ni to złożona z podjednostki katalitycznej i białek Ku70 i Ku80 (podjednostka regulatorowa) białkowa kinaza se­rynowo-treoninowa zależna od DNA – DNA-PK, uczest­nicząca w klasycznym szlaku łączenia końców nieho­mologicznych (ryc. 3) [106,118]. Sugeruje się, że przez pewien czas składniki obydwu kompleksów naprawczych współwystępują w obrębie miejsca uszkodzenia DNA, po czym podejmowana jest decyzja dotycząca sposobu jego naprawy [118]. W komórkach o sprawnym mechanizmie D-NHEJ aktywny enzym PARP-1 usytuowany w pobliżu uszkodzenia DNA stymuluje kinazę białkową DNA-PK, a właściwie jego podjednostkę katalityczną – DNA-PKcs (DNA-PK catalytic subunit), sam będąc przezeń hamowa­ny [94,118]. W ten sposób dochodzi do zablokowania drogi alternatywnej/zapasowej – preferowana jest naprawa kla­syczna, która przebiega szybciej (5-30 min w porównaniu z 2-20 godz.) i bardziej precyzyjnie, w porównaniu z me­chanizmem alternatywnym. Z kolei naprawa w sposób alternatywny/zapasowy szlaku NHEJ funkcjonuje zwykle w sytuacji, w której dochodzi do inaktywacji klasycznego mechanizmu NHEJ. Zatem wbrew nazwie, szlak ten po­winien być rozpatrywany wyłącznie jako „wsparcie” dla drogi klasycznej, nie zaś jej alternatywa [118].

Poza wspomnianą wyżej aktywnością „przełącznika” mię­dzy klasycznym a alternatywnym/zapasowym szlakiem NHEJ, prawdopodobny wydaje się także udział PARP-1 w wyborze pomiędzy NHEJ a naprawą DNA w wyniku rekombinacji homologicznej [27,95,106].

Rekombinacja homologiczna

Naprawa DSBs za pośrednictwem HR (homologous recom­bination) jest najbardziej precyzyjnym, właściwie wolnym od błędów, aczkolwiek czasochłonnym, sposobem elimi­nacji tych uszkodzeń. Najczęściej mechanizm ten funk­cjonuje w dzielących się komórkach wykorzystując wy­soką homologię sekwencyjną między uszkodzonym DNA a DNA służącym jako matryca [84,105]. W tym typie na­prawy uczestniczą kinazy ATM (kinaza ATM kodowana przez ATM; ataxia-teleangiectasia mutated gene) lub ATR (ATM- and Rad3-related). Ich aktywacja w odpowiedzi na uszkodzenia DNA prowadzi do fosforylacji licznych bia­łek komórkowych, takich jak białka Chk1/2 (checkpoint homolog 1/2), FANCD2 (Fanconi anemia complemen­tation group D2), BRCA1/2, składniki kompleksu MRN (Mre11/Rad50/NBS1), p53, SMC1 (structural maintenan­ce of chromosomes proteins 1) czy histonu H2AX. W na­stępstwie uruchomienia kaskady fosforylacji dochodzi do zatrzymania cyklu komórkowego i indukcji procesu na­prawy DNA [31,85].

Haince i wsp. [31] wykazali niedawno związek między syntezą cząsteczek PAR a aktywnością kinazy ATM w ko­mórkach poddanych promieniowaniu jonizującemu lub niektórych karcynogenów środowiskowych, np. MNNG. Autorzy ci donieśli, że łańcuchy PAR wydają się funk­cjonować jako cząsteczki sygnałowe, które oddziałując niekowalencyjnie z odpowiednimi domenami wiążącymi w ATM (ale nie ATR), modulują aktywność tej kinazy i promują fosforylację jej substratów. W komórkach róż­nych linii inkubowanych w obecności inhibitorów PARP – PJ-34 i DPQ wykazano kilkukrotny spadek poziomu fos­forylacji białka p53 w odpowiedzi na obecność MNNG. W pierwszej godzinie inkubacji z PJ-34 i MNNG odnoto­wano znaczny 26% spadek poziomu fosforylacji histonu H2AX na Ser139. Zmiany w poziomie fosforylacji sub­stratów dla ATM przebiegały z kinetyką odpowiadającą zmianom w syntezie PAR. Ekspozycja komórek na pro­mieniowanie jonizujące powodowała również gwałtowny wzrost poziomu fosforylacji białek p53, SMC1 i H2AX. Natomiast inkubacja komórek w obecności PJ-34 wywo­ływała znacznie słabszy efekt.

Udział PARP-1 w naprawie homologicznej uszkodzeń DNA pozostaje jednak wciąż mało poznany [100,111]. Wyniki badań z zastosowaniem komórek z niefunkcjonalnym en­zymem PARP-1, przeprowadzonych w kilku laboratoriach i z wykorzystaniem różnych modeli doświadczalnych po­zostają w sprzeczności. W pewnych warunkach ten en­zym naprawczy wydaje się promować rekombinację ho­mologiczną, w innych – hamować ten proces [23,95]. Wyniki doświadczeń opublikowane przez laboratorium Takedy [40,95] ujawniły dużą wrażliwość na inhibitor topoizomerazy I – kamptotecynę ptasich komórek kurzych limfocytów B linii DT-40 i ludzkich komórek raka jelita li­nii SW480sn3 bez ekspresji PARP-1 (i wielokrotnie wyższą podwójnie zmutowanych komórek parp-1/rad18 w porów­naniu z komórkami prawidłowymi z funkcjonalnymi gena­mi PARP-1/RAD-18). Uznaje się, że kamptotecyna blokuje przesuwanie się widełek replikacyjnych, generując uszko­dzenia wymagające naprawy rekombinacyjnej. Wykazano, że jednoczesny defekt w genie kodującym Ku70 obniżał toksyczne działanie kamptotecyny, sugerując, że jego przy­czyną był powodujący uszkodzenia DNA przebieg NHEJ w zablokowanych widełkach replikacyjnych. Cytowani ba­dacze zasugerowali, że białko PARP-1 (i Rad-18) znosi nie­korzystny efekt NHEJ w opisanych warunkach, uniemożli­wiając składnikom kompleksu naprawczego NHEJ dostęp do DSBs i promując rekombinację homologiczną.

Jednocześnie prowadzone badania z wykorzystaniem mo­dyfikacji genów za pośrednictwem rekombinacji homo­logicznej („gene targeting”), wykazały 3-krotny wzrost częstości zdarzeń rekombinacyjnych w komórkach ma­cierzystych myszy ze znokautowanym genem parp-1 [23]. Uzyskane wyniki sugerują ograniczanie naprawy homolo­gicznej z udziałem enzymu i tłumaczą „hiperrekombina­cyjny” fenotyp komórek parp-1-/-, przejawiający się m.in. częstszą wymianą siostrzanych chromatyd, wzrostem liczby mikrojąder, tetraploidią [100]. Hipotezę dotyczącą zdolności PARP-1 do hamowania szlaku HRR potwierdzają ponadto doniesienia o spadku częstości wymian siostrzanych chro­matyd w embrionalnych komórkach chomika chińskiego linii COMF10, stabilnie transfekowanych cDNA PARP-1, indukowanych czynnikami uszkadzającymi DNA [71].

Na podkreślenie zasługuje, że supresorową aktywność PARP-1 w przebiegu procesu HRR zasugerowano już kil­kanaście lat temu [62]. Taka aktywność miała stanowić element mechanizmu ograniczającego niewłaściwą rekom­binację DNA. Jeden z zaproponowanych wówczas modeli zakładał, że związany z DNA enzym PARP-1 uniemożli­wia rozpoznanie DSBs przez utworzony kompleks rekom­binacyjny, a drugi – uwzględniał efekt ujemnego ładunku wydłużającego się polimeru PAR na odpychanie przyle­głych sekwencji rekombinowanego DNA [100].

Udział PARP-1 w HRR in vivo wciąż wzbudza kontrower­sje, choć „hiperrekombinacyjny” fenotyp komórek z de­fektywnym PARP-1 zdaje się potwierdzać antyrekombi­nacyjny model aktywności enzymu. Wyniki te pozostają w sprzeczności z opublikowanymi doniesieniami wskazują­cymi na oddziaływania między PARP-1 a składnikami ma­szynerii naprawczej, tj. białkiem WRN (Werner syndrome protein) i helikazą RecQ (supresor Rad51) in vitro [111].

Schulz i wsp. [100] wykluczyli możliwość bezpośrednie­go uczestnictwa PARP-1 w procesie rekombinacji homo­logicznej. Brak wspomnianej polimerazy w skupiskach (nuclear foci), tworzonych w jądrze komórkowym przez białko uczestniczące w naprawie rekombinacyjnej – Rad-51, które promuje wymianę nici między siostrzanymi chro­matydami, podważa rolę tego enzymu w przebiegu HRR per se. Ponadto wykazano, że brak PARP-1 nie zaburza rekombinacji homologicznej genów w komórkach fibro­blastów płuc chomika chińskiego linii V79(SPD8), wy­kazujących ekspresję endonukleazy I-SceI, generującej DSB w DNA. Rozważa się, że „hiperrekombinacyjny” fe­notyp komórek PARP-1^-/- nie wynika z inhibitorowej ak­tywności enzymu na przebieg HRR, lecz zaburzenia na­prawy SSBs przez niewydolny mechanizm BER. Wydaje się, że powstałe uszkodzenia DNA mogą następnie ulec przekształceniu w widełkach replikacyjnych w DSB, na­prawiane przez HR DSBs, stanowiąc przyczynę wymian chromatyd siostrzanych.

W laboratorium Wanga [127] wykazano, że PARP-1 nie odgrywa istotnej roli w przebiegu HRR w immortalizo­wanych fibroblastach zarodków myszy linii A11 i A12 (PARP-1^-/-), z ekspresją I-SceI, ani w ukierunkowanej HR w komórkach macierzystych myszy (ES6-I i ES17-2), trans­fekowanych wektorem hprt-DRGFP. Badacze ci wykaza­li także, że brak PARP-1 w fibroblastach inkubowanych w obecności hydroksymocznika – związku zatrzymujące­go ruch widełek replikacyjnych (wskutek obniżania puli dNTP niezbędnych do syntezy DNA) – znacząco ograni­czał ich przeżycie w porównaniu z komórkami typu „dzi­kiego”. Z kolei usunięcie tego czynnika z podłoża hodow­lanego przyczyniało się do nagromadzenia białka Rad-51 w zablokowanych widełkach komórek PARP-1^-/-, a także opóźniało ponowne podjęcie przez nie replikacji i przej­ście komórek do fazy G₂ cyklu komórkowego. Obserwacje te wydają się sugerować udział PARP-1 w ponownym star­cie widełek replikacyjnych. Ponadto mechanizm działania tego enzymu wiązano ze stymulacją helikazy Srs2 (usuwa­jącej Rad-51 z miejsc rekombinacji), bądź jego wpływem na aktywność replisomu/primosomu [127]. Sugerowano również, że opóźnione wejście w fazę G₂/M komórek po­zbawionych tej polimerazy, po usunięciu czynnika blo­kującego syntezę DNA, może wynikać z braku modula­cji przez ten enzym funkcji białek punktu kontroli fazy S cyklu komórkowego.

Wyniki doświadczeń z wykorzystaniem konstruktów DNA, naśladujących strukturę zatrzymanych widełek replikacyj­nych sugerują, że PARP-1 (przy współudziale PARP-2), poza DSBs w widełkach replikacyjnych, swoiście rozpo­znaje i wiąże kilkunukleotydowe odcinki ssDNA znajdu­jące się w zablokowanych widełkach. Interakcja ta prowa­dzi do aktywacji i automodyfikacji PARP-1, co „przyciąga” w jego sąsiedztwo białko Mre11 (składnik kompleksu MRN zawierającego czynniki: Mre11, Rad-50, Nbs), odpowie­dzialne za wycinanie fragmentu DNA [11]. Etap ten wy­daje się niezbędny do późniejszej naprawy DNA przez HR i ponownego startu widełek replikacyjnych. W tym kon­tekście enzym PARP-1 promuje HRR, w przeciwieństwie do wcześniejszych doniesień kwestionujących jego rolę w naprawczej rekombinacji homologicznej, indukowanej przez dwuniciowe pęknięcia DNA, generowane niezależ­nie od procesu replikacji. Ujawniono także, że obecność tej polimerazy jest niezbędna do przebiegu HRR w za­trzymanych widełkach replikacyjnych. Okazało się, że in­kubacja fibroblastów płuc chomika chińskiego linii SPD8 w obecności inhibitorów PARP, tj. 1,5-dihydroksyizochi­noliny (ISQ), 4-amino-1,8-naftalimidu lub NU102, bądź wyciszenie ekspresji PARP-1/2 przez siRNA w komór­kach raka jelita człowieka zmniejszało częstość zdarzeń rekombinacyjnych, indukowanych przez hydroksymocznik. Natomiast fibroblasty zarodków myszy z inaktywowanym enzymem (lub przy jego braku) cechowała niewielka licz­ba skupisk białka Rad-51, świadcząca o spadku aktywności rekombinacyjnej. W przebiegu homologicznej rekombina­cji w zatrzymanych widełkach replikacyjnych niezbędne wydają się obie polimerazy, tj. PARP-1 i PARP-2.

Zaprezentowane dane, a także wyniki doświadczeń z inhi­bitorami PARP [122] wskazują, że modyfikacja katalizo­wana przez PARP stanowi ważny czynnik mechanizmów naprawy DNA, których sprawność warunkuje stabilność materiału genetycznego. Uważa się ponadto, że aktywność katalityczna PARP-1 koreluje z długością życia, którą za­pewniają mechanizmy ochraniające DNA [12].

Potwierdzenie w kilku laboratoriach obecności PARP-1 w mitochondriach [24,58,74], w których białko to, współ­działając z ligazą DNA III, promuje prawdopodobnie na­prawę mtDNA i wpływa na jego integralność wydaje się godne podkreślenia. Ponadto wykazano, że aktywność po­limerazy usytuowanej w mitochondriach przewyższa tę, która występuje w jądrze komórkowym [92].

Udział PARP-1 w śmierci komórek

Badania z zastosowaniem znokautowanych organizmów wykazały, że oprócz funkcji ochronnej pełnionej przez PARP-1 po uszkodzeniu DNA, białko to prawdopodob­nie odgrywa rolę czynnika promującego śmierć komórek, m.in. w przebiegu ostrego i przewlekłego stanu zapalnego [2]. Okazało się, że polimeraza ta, aktywowana w odpo­wiedzi na hormony steroidowe, stres, infekcje bakteryjne, poprzez wpływ na organizację chromatyny np. w miej­scach docelowych czynnika NF-κB, reguluje transkryp­cję genów układu odpornościowego i syntezę cząsteczek prozapalnych [33,34]. Wysoka ekspresja PARP-1 zwięk­sza wrażliwość komórek na działanie reaktywnych form tlenu (RFT), generowanych rozwojem procesów zapal­nych. Początkowo niekorzystne skutki nadmiernej aktyw­ności tego enzymu i rozległej syntezy PAR wiązano z zu­życiem źródeł energii w postaci NAD⁺ (a zatem pośrednio ATP) i tzw. „katastrofą energetyczną” (hipoteza samobój­stwa), prowadzącą do nekrozy komórek [8,38]. Okazało się, że nadmierna aktywacja PARP-1 skutkująca śmiercią neuronów może być także spowodowana ischemią (niedo­krwienie) i reperfuzją komórek, jak również ekscytotok­sycznością glutaminianu, towarzyszącą udarom czy cho­robom neurodegeneracyjnym [130].

Wyniki badań z ostatnich lat sugerują jednak, że spadek wewnątrzkomórkowego poziomu NAD⁺ rzadko stanowi sy­gnał do zainicjowania śmierci. Za inicjację tego procesu bezpośrednio odpowiedzialne wydają się cząsteczki PAR, gromadzące się w komórkach, w których doszło do znacz­nych uszkodzeń DNA. Polimery te pełnią funkcję prze­kaźników sygnału o zagrażających integralności genomu uszkodzeniach, których rozległość przewyższa zdolności naprawcze komórek oraz indukują programowaną śmierć, zapobiegając dalszej utracie energii na nieefektywną na­prawę DNA [38,119].

Śmierć komórek zależna od PARP-1, opisywana terminem parthanatos (od głównej cząsteczki sygnalnej tego szla­ku – polimeru ADP-rybozy oraz imienia greckiego boga uosabiającego śmierć – Thanatosa), wykazuje właściwości odmienne zarówno dla apoptozy, jak i nekrozy, jednocze­śnie łącząc cechy obydwu szlaków. W tym typie śmierci nie obserwuje się fragmentacji DNA do odcinków oligo­nukleosomalnych, ani też formowania ciałek apoptotycz­nych. Fragmentacja DNA prowadzi do odcinków o m.cz. około 50 000 pz. oraz przemieszczenie się fosfatydylose­ryny do zewnętrznej warstwy błony komórkowej. Tak jak w nekrozie śmierci komórek zależnej od PARP-1 towa­rzyszy utrata integralności jej błony komórkowej. Z ko­lei podobnie jak w apoptozie, dochodzi do spadku po­tencjału międzybłonowego mitochondriów. Na podstawie wyników doświadczeń przeprowadzonych na komórkach różnych linii w obecności inhibitora kaspaz (z-VAD-fmk) wykazano, że proces ten nie wymaga udziału tych proteaz cysteinowych, ani nie wydaje się regulowany przez białka rodziny Bcl-2 [2,119].

Uznaje się, że głównym efektorem śmierci zależnej od PARP-1 jest mitochondrialny czynnik indukujący apop­tozę – AIF. AIF jest flawoproteiną o aktywności dehydro­genazy NADH, która jest naturalnym składnikiem prze­strzeni międzybłonowej mitochondriów komórek żywych [6]. Pod wpływem docierających do mitochondriów sy­gnałów o uszkodzeniu DNA w niewyjaśniony dotąd spo­sób opuszcza on organellum i przemieszcza się do jądra komórkowego. Z kolei w jądrze pośrednio uczestniczy we fragmentacji DNA (chromatoliza) i kondensacji chromaty­ny [2,119]. W parthanatos uwalnianie AIF jest zdarzeniem wczesnym i wyprzedza wypływ cytochromu c z mitochon­driów [130]. Wiadomo, że białko AIF nie wykazuje aktyw­ności endonukleazowej; jego rola sprowadza się prawdo­podobnie do „rekrutowania” enzymów nukleolitycznych do DNA i zwiększaniu wrażliwości DNA na ich działanie.

Sygnałem śmierci komórkowej zależnej od AIF okazały się polimery PAR [3]. Obecność takich polimerów w mi­tochondriach wykazano już po około 30 min od ekspozy­cji neuronów na NMDA. Natomiast po około 1 godzinie stężenie PAR w tych organellach osiągało prawie 80 nM, czemu towarzyszyła śmierć komórek [119]. Główną rolę cząsteczek PAR w uwalnianiu AIF z mitochondriów po raz pierwszy wykazały badania z użyciem proteinazy K. Później wykazano także, że wprowadzenie do żywych ko­mórek polimerów PAR indukowało uwalnianie AIF z mito­chondriów i jego translokację do jądra komórkowego [130].

Jak dotąd nie wyjaśniono, w jaki sposób dochodzi do translokacji AIF z mitochondriów pod wpływem PAR. Określono, że główna pula AIF (m.cz. 62 kDa) umiejsco­wiona jest w wewnętrznej błonie mitochondriów a uwol­nienie tego białka do przestrzeni międzybłonowej wyma­ga jego proteolizy do rozpuszczalnej postaci (m.cz. 57 kDa), która może opuścić mitochondria [119]. W 2007 roku Moubarak i wsp. [75] zasugerowali, że za aktywację proapoptotycznego białka Bax i translokację AIF z mito­chondriów pod wpływem nadmiernej stymulacji PARP-1 mogą odpowiadać kalpainy – proteazy cysteinowe zależ­ne od Ca²⁺, których obecność stwierdzono ostatnio w prze­strzeni międzybłonowej mitochondriów [38,119].

Z kolei Yu i wsp. [130] opublikowali, że endogenny AIF w komórkach mózgu można wykryć w odmiennych re­gionach mitochondriów. Oprócz puli białka umiejscowio­nej w błonie wewnętrznej organellum pewna jego porcja (około 30%) – znajduje się po cytosolowej stronie mito­chondriów luźno oddziałując z OMM (outer mitochondria membrane). Wydaje się prawdopodobne, że to właśnie te cząsteczki AIF, pod wpływem sygnału śmierci przemiesz­czają się do jądra komórkowego, w którym indukują par­thanatos w komórkach nerwowych [119,129]. Hipotezę tę potwierdzają obserwacje, że indukowaną NMDA śmierć neuronów poprzedza szybki napływ do jądra komórkowe­go cząsteczek AIF, nieulegających uprzedniej proteolizie (m.cz. 62 kDa). Pojawiły się również dane podważające konieczność występowania kalpainy w komórkach ulega­jących parthanatos [129].

Zasadniczą rolę w ochronie wielokomórkowego organi­zmu przed transformacją nowotworową i klonalnym roz­rostem komórek, których DNA uległo licznym mutacjom, odgrywa utrzymanie sprawnych mechanizmów „przełącza­jących” rozległą naprawę DNA na indukcję śmierci [8]. Jednak niezbędne wydaje się zapewnienie sąsiadującym tkankom ochrony przed rozwojem stanu zapalnego, któ­ry mógłby powstać na skutek nekrozy uszkodzonych ko­mórek. Jednym z takich mechanizmów ochronnych może być szybka degradacja białek naprawczych intensywnie wykorzystujących ATP, w tym PARP-1, natychmiast po „podjęciu decyzji” o śmierci komórek. Cięcie PARP za­pobiega „katastrofie energetycznej” i zapewnia właściwe zużytkowanie energii na procesy niezbędne do przeprowa­dzenia apoptozy czy parthanatos oraz utrzymanie funkcji pomp jonowych, które poprzez kontrolę właściwego stęże­nia jonów Ca²⁺ i K⁺ w komórkach, zapobiegają ich pęcz­nieniu i lizie [8].

Proteolizy PARP-1 mogą dokonywać różne enzymy pro­teolityczne [6,15,119]. Ujawniono np., że kalpainy doko­nują cięcia tej polimerazy na fragmenty o m.cz. 40-70 kDa, natomiast granzym B generuje produkty o m.cz. 64 i 54 kDa. Preferencyjne cięcie PARP-1 przez kaspazy (3, 7) z wytworzeniem produktów o m.cz. 89 i 24 kDa uwa­ża się powszechnie za marker zależnego od kaspaz proce­su apoptotycznego, podczas gdy nieswoista fragmentacja tego białka wiązana jest z innymi postaciami śmierci ko­mórki (ryc. 2) [47].

Utworzony przez kaspazy N-końcowy fragment PARP-1 zawiera domenę DBD, która nieodwracalnie wiąże końce DNA (lub RNA) (frozen ends) i uniemożliwia wiązanie się funkcjonalnego enzymu do miejsc jego uszkodzenia. Z kolei dłuższy produkt cięcia polimerazy – p89 zacho­wuje domenę katalityczną enzymu, którą jednak z po­wodu braku interakcji z DNA, cechuje mała aktywność. Dodatkowo peptyd ten oddziałuje z innymi cząsteczkami PARP-1 uniemożliwiając ich homodimeryzację i bloku­jąc ich funkcje [110].

Podsumowanie

Od wykrycia w 1963 roku enzymu o aktywności polime­razy poli(ADP-rybozy) opisano jej kompleksową charak­terystykę i przedstawiono, na poziomie molekularnym, do­wody świadczące o licznych jej aktywnościach, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i procesach patofizjolo­gicznych [7,12,16,35,36,50,109]. Poli(ADP-rybozylacja) wielu białek jądrowych i mitochondrialnych, przez wpro­wadzenie ujemnego ładunku związanego z łańcuchem PAR, zwykle ogranicza bądź hamuje ich aktywność oraz blokuje ich zdolność do wiązania się z DNA.

D’Amours i wsp. [19] dla podkreślenia istotnej roli cząste­czek PAR w przebiegu procesów życiowych zaproponowali wprowadzenie dla nich terminu „trzeci typ kwasów nukle­inowych”. W świetle nowych doniesień podkreśla się, że subkomórkową lokalizację PARP-1 można powiązać z jej udziałem w sygnalizacji komórkowej.

Wysoki stopień aktywacji enzymu katalizującego poli­(ADP-rybozylację) w komórkach/narządach, który towa­rzyszy wielu chorobom (w tym nowotworom, chorobom sercowo-naczyniowym, metabolicznym czy neurodege­neracyjnym) może być blokowany przez liczne inhibito­ry, które mogą funkcjonować jako leki.

Rozwój badań nad budową i molekularnym mechanizmem aktywności licznej grupy inhibitorów PARP będzie przed­miotem kolejnego opracowania.

Podziękowanie

Autorki składają podziękowanie mgr Janowi Gierakowi za pomoc w przygotowaniu niniejszej pracy.

PIŚMIENNICTWO

[1] Altmeyer M., Messner S., Hassa P.O., Fey M., Hottiger M.O.: Molecular mechanism of poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 and identification of lysine residues as ADP-ribose acceptor sites. Nucleic Acids Res., 2009; 37: 3723-3738
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[2] Amé J.C., Spenlehauer C., de Murcia G.: The PARP superfamily. Bioessays, 2004; 26: 882-893
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[3] Andrabi S.A., Kim N.S., Yu S.W., Wang H., Koh D.W., Sasaki M., Klaus J.A., Otsuka T., Zhang Z., Koehler R.C., Hurn P.D., Poirier G.G., Dawson V.L., Dawson T.M.: Poly(ADP-ribose) (PAR) polymer is a death signal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 18308-18313
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[4] Baumgartner M., Schneider R., Auer B., Herzog H., Schweiger M., Hirsch-Kauffmann M.: Fluorescence in situ mapping of the human nuclear NAD+ADP-ribosyltransferase gene (ADPRT) and two secondary sites to human chromosomal bands 1q42, 13q34, and 14q24. Cytogenet. Cell Genet., 1992; 61: 172-174
[PubMed]  

[5] Beckert S., Farrahi F., Ghani Q.P., Aslam R., Scheuenstuhl H., Coerper S., Königsrainer A., Hunt T.K., Hussain M.Z.: IGF-1-induced VEGF expression in HUVEC involves phosphorylation and inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006; 341: 67-72
[PubMed]  

[6] Bednarek J., Kiliańska Z.M.: Białka przestrzeni międzybłonowej mitochondriów uczestniczące w procesie apoptozy. Postepy Biochem., 2005; 51: 447-458
[PubMed]  

[7] Beneke S.: Poly(ADP-ribose) polymerase activity in different pathologies – the link to inflammation and infarction. Exp. Gerontol., 2008; 43: 605-614
[PubMed]  

[8] Bernstein C., Bernstein H., Payne C.M., Garewal H.: DNA repair/pro-apoptotic dual-role proteins in five major DNA repair pathways: fail-safe protection against carcinogenesis. Mutat. Res., 2002; 511: 145-178
[PubMed]  

[9] Bhatia M., Kirkland J.B., Meckling-Gill K.A.: Modulation of poly(ADP-ribose) polymerase during neutrophilic and monocytic differentiation of promyelocytic (NB4) and myelocytic (HL-60) leukaemia cells. Biochem. J., 1995; 308: 131-137
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[10] Bieche L., de Murcia G., Lidereau R.: Poly(ADP-ribose) polymerase gene expression status and genomic instability in human breast cancer. Clin. Cancer Res., 1996; 2: 1163-1167
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[11] Bryant H.E., Petermann E., Schultz N., Jemth A.S., Loseva O., Issaeva N., Johansson F., Fernandez S., McGlynn P., Helleday T.: PARP is activated at stalled forks to mediate Mre11-dependent replication restart and recombination. EMBO J., 2009; 28: 2601-2615
[PubMed]  

[12] Bürkle A., Brabeck C., Diefenbach J., Beneke S.: The emerging role of poly(ADP-ribose)polymerase-1 in longevity. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2005; 37: 1043-1053
[PubMed]  

[13] Burzio L.O., Sáez L., Cornejo R.: Poly (ADP-ribose) synthetase activity in rat testis mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1981; 103: 369-375
[PubMed]  

[14] Caiafa P., Guastafierro T., Zampieri M.: Epigenetics: poly(ADP-ribosyl)ation of PARP-1 regulates genomic methylation patterns. FASEB J., 2009; 23: 672-678
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[15] Chaitanya G.V., Babu P.P.: Differential PARP cleavage: an indication of heterogeneous forms of cell death and involvement of multiple proteases in the infarct of focal cerebral ischemia in rat. Cell. Mol. Neurobiol., 2009; 29: 563-573
[PubMed]  

[16] Chambon P., Weill J.D., Mandel P.: Nicotinamide mononucleotide activation of new DNA-dependent polyadenylic acid synthesizing nuclear enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1963; 11: 39-43
[PubMed]  

[17] Cherney B.W., McBride O.W., Chen D.F., Alkhatib H., Bhatia K., Hensley P., Smulson M.E.: cDNA sequence, protein structure, and chromosomal location of the human gene for poly (ADP-ribose) polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987; 84: 8370-8374
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[18] Cipriani G., Rapizzi E., Vannacci A., Rizzuto R., Moroni F., Chiarugi A.: Nuclear poly(ADP-ribose) polymerase-1 rapidly triggers mitochondrial dysfunction. J. Biol. Chem., 2005; 280: 17227-17234
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[19] D’Amours D., Desnoyers S., D’Silva I., Poirier G.G.: Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions. Biochem. J., 1999; 342: 249-268
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[20] Dawson V.L., Dawson T.M.: Deadly conversations: nuclear-mitochondrial cross-talk. J. Bioenerg. Biomembr., 2004; 36: 287-294
[PubMed]  

[21] de Murcia G., Menissier de Murcia J.: Poly(ADP-ribose) polymerase: a molecular nick-sensor. Trends Biochem. Sci., 1994; 19: 172-176
[PubMed]  

[22] de Murcia J.M., Niedergang C., Trucco C., Ricoul M., Dutrillaux B., Mark M., Oliver F.J., Masson M., Dierich A., LeMeur M., Waltztinger C., Chambon P., de Murcia G.: Requirement of poly(ADP-ribose) polymerase in recovery from DNA damage in mice and in cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997; 94: 7303-7307
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[23] Dominguez-Bendala J., Masutani M., McWhir J.: Down-regulation of PARP-1, but not of Ku80 or DNA-PKcs’, results in higher gene targeting efficiency. Cell Biol. Int., 2006; 30: 389-393
[PubMed]  

[24] Du L., Zhang X., Han Y.Y., Burke N.A., Kochanek P.M., Watkins S.C., Graham S.H., Carcillo J.A., Szabó C., Clark R.S.: Intra-mitochondrial poly(ADP-ribosylation) contributes to NAD⁺ depletion and cell death induced by oxidative stress. J. Biol. Chem., 2003; 278: 18426-18433
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[25] Ebralidse K.K., Mirzabekov A.D. One-domain interaction of histone H4 with nucleosomal core DNA is restricted to a narrow DNA segment. FEBS Lett., 1986; 194: 69-72
[PubMed]  

[26] Eki T.: Poly (ADP-ribose) polymerase inhibits DNA replication by human replicative DNA polymerase α, δ and ε in vitro. FEBS Lett., 1994; 356: 261-266
[PubMed]  

[27] Gagné J.P., Moreel X., Gagné P., Labelle Y., Droit A., Chevalier-Paré M., Bourassa S., McDonald D., Hendzel M.J., Prigent C., Poirier G.G.: Proteomic investigation of phosphorylation sites in poly(ADP-ribose) polymerase-1 and poly(ADP-ribose) glycohydrolase. J. Proteome Res., 2009; 8: 1014-1029
[PubMed]  

[28] Garnier P., Ying W., Swanson R.A.: Ischemic preconditioning by caspase cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase-1. J. Neurosci., 2003; 23: 7967-7973
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[29] Gradwohl G., Mazen A., de Murcia G.: Poly(ADP-ribose) polymerase forms loops with DNA. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987; 148: 913-919
[PubMed]  

[30] Gradwohl G., Ménissier de Murcia J.M., Molinete M., Simonin F., Koken M., Hoeijmakers J.H., de Murcia G.: The second zinc-finger domain of poly(ADP-ribose) polymerase determines specificity for single-stranded breaks in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990; 87: 2990-2994
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[31] Haince J.F., Kozlov S., Dawson V.L., Dawson T.M., Hendzel M.J., Lavin M.F., Poirier G.G.: Ataxia telangiectasia mutated (ATM) signaling network is modulated by a novel poly(ADP-ribose)-dependent pathway in the early response to DNA-damaging agents. J. Biol. Chem., 2007; 282: 16441-16453
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[32] Hakmé A., Wong H.K., Dantzer F., Schreiber V.: The expanding field of poly(ADP-ribosyl)ation reactions. EMBO Rep. 2008; 9: 1094-1100
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[33] Hassa P.O., Buerki C., Lombardi C., Imhof R., Hottiger M.O.: Transcriptional coactivation of nuclear factor-κB-dependent gene expression by p300 is regulated by poly(ADP)-ribose polymerase-1. J. Biol. Chem., 2003; 278: 45145-45153
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[34] Hassa P.O., Haenni S.S., Buerki C., Meier N.I., Lane W.S., Owen H., Gersbach M., Imhof R., Hottiger M.O.: Acetylation of poly(ADP-ribose) polymerase-1 by p300/CREB-binding protein regulates coactivation of NF-κB-dependent transcription. J. Biol. Chem., 2005; 280: 40450-40464
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[35] Hassa P.O., Haenni S.S., Elser M., Hottiger M.O.: Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells: where are we today and were are we going? Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2006; 70: 789-829
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[36] Hassa P.O., Hottiger M.O.: The diverse biological roles of mammalian PARPs, a small but powerful family of poly-ADP-ribose polymerases. Front. Biosci., 2008; 13: 3046-3082
[PubMed]  

[37] Hayashi K., Tanaka M., Shimada T., Miwa M., Shimura T.: Size and shape of poly(ADP-ribose): examination by gel filtration, gel electrophoresis and electron microscopy. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1983; 112: 102-107
[PubMed]  

[38] Heeres J.T., Hergenrother P.J.: Poly(ADP-ribose) makes a date with death. Curr. Opin. Chem. Biol., 2007; 11: 644-653
[PubMed]  

[39] Hegde M.L., Hazra T.K., Mitra S.: Early steps in the DNA base excision/single strand interruption repair pathway in mammalian cells. Cell Res., 2008; 18: 27-47
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[40] Hochegger H., Dejsuphong D., Fukushima T., Morrison C., Sonoda E., Schreiber V., Zhao G.Y., Saberi A., Masutani M., Adachi N., Koyama H., de Murcia G., Takeda S.: Parp-1 protects homologous recombination from interference by Ku and ligase IV in vertebrate cells. EMBO J., 2006; 25: 1305-1314
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[41] Horton J.K., Wilson S.H.: Hypersensitivity phenotypes associated with genetic and synthetic inhibitor-induced base excision repair deficiency. DNA Repair, 2007; 6: 530-543
[PubMed]  

[42] Huang J.Y., Chen W.H., Chang Y.L., Wang H.T., Chuang W.T., Lee S.C.: Modulation of nucleosome-binding activity of FACT by poly(ADP-ribosyl)ation. Nucleic Acids Res., 2006; 34: 2398-2407
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[43] Ikejima M., Noguchi S., Yamashita R., Ogura T., Sugimura T., Gill D.M., Miwa M.: The zinc fingers of human poly(ADP-ribose) polymerase are differentially required for the recognition of DNA breaks and nicks and the consequent enzyme activation. Other structures recognise intact DNA. J. Biol. Chem., 1990; 265: 21907-21913
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[44] Iliakis G., Wang H., Perrault A.R., Boecker W., Rosidi B., Windhofer F., Wu W., Guan J., Terzoudi G., Pantelias G.: Mechanisms of DNA double strand break repair and chromosome aberration formation. Cytogenet. Genome Res., 2004; 104: 14-20
[PubMed]  

[45] Ji Y., Tulin A.V.: Poly(ADP-ribosyl)ation of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins modulates splicing. Nucleic Acids Res., 2009; 37: 3501-3513
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[46] Kameshita I., Matsuda Z., Taniguchi T., Shizuta Y.: Poly (ADP-ribose) synthetase. Separation and identification of three proteolytic fragments as the substrate-binding domain, the DNA-binding domain, and the automodification domain. J. Biol. Chem., 1984; 259: 4770-4776
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[47] Kaufmann S.H., Desnoyers S., Ottaviano Y., Davidson N.E., Poirier G.G.: Specific proteolytic cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase: an early marker of chemotherapy-induced apoptosis. Cancer Res., 1993; 53: 3976-3985
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[48] Kauppinen T.M., Chan W.Y., Suh S.W., Wiggins A.K., Huang E.J., Swanson R.A.: Direct phosphorylation and regulation of poly(ADP-ribose)polymerase-1 by extracellular signal-regulated kinases 1/2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 7136-7141
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[49] Kim M.Y., Mauro S., Gévry N., Lis J.T., Kraus W.L.: NAD⁺-dependent modulation of chromatin structure and transcription by nucleosome binding properties of PARP-1. Cell, 2004; 119: 803-814
[PubMed]  

[50] Kim M.Y., Zhang T., Kraus W.L.: Poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1: „PAR-laying” NAD⁺ into a nuclear signal. Genes Dev., 2005; 19: 1951-1967
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[51] Kleine H., Poreba E., Lesniewicz K., Hassa P.O., Hottiger M.O., Litchfield D.W., Shilton B.H., Lüscher B.: Substrate-assisted catalysis by PARP10 limits its activity to mono-ADP-ribosylation. Mol. Cell, 2008; 32: 57-69
[PubMed]  

[52] Klug A., Rhodes D., Smith J., Finch J.T., Thomas J.O.: A low resolution structure for the histone core of the nucleosome. Nature, 1980; 287: 509-516
[PubMed]  

[53] Kotova E., Jarnik M., Tulin A.V.: Poly (ADP-ribose) polymerase1 is required for protein localization to Cajal body. PLoS Genet., 2009; 5: e1000387
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[54] Kraus W.L.: Transcriptional control by PARP-1: chromatin modulation, enhancer-binding, coregulation, and insulation. Curr. Opin. Cell Biol., 2008; 20: 294-302
[PubMed]  

[55] Kraus W.L., Lis J.T.: PARP goes transcription. Cell, 2003; 113: 677-683
[PubMed]  

[56] Kun E., Kirsten E., Ordahl C.P.: Coenzymatic activity of randomly broken or intact double-stranded DNAs in auto and histone H1 trans-poly(ADP-ribosylation), catalyzed by poly(ADP-ribose)polymerase (PARP1). J. Biol. Chem., 2002; 277: 39066-39069
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[57] Kurosaki T., Ushiro H., Mitsuuchi Y., Suzuki S., Matsuda M., Matsuda Y., Katunuma N., Kangawa K., Matsuo H., Hirose T., Inayama S., Shizuta Y.: Primary structure of human poly(ADP-ribose) syntetase as deduced from cDNA sequence. J. Biol. Chem., 1987; 262: 15990-15997
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[58] Lai Y., Chen Y., Watkins S.C., Nathaniel P.D., Guo F., Kochanek P.M., Jenkins L.W., Szabó C., Clark R.S.: Identification of poly-ADP-ribosylated mitochondrial proteins after traumatic brain injury. J. Neurochem., 2008; 104: 1700-1711
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[59] Lan S.Y., Smerdon M.J.: A nonuniform distribution of excision repair synthesis in nucleosome core DNA. Biochemistry, 1985; 24: 7771-7783
[PubMed]  

[60] Langelier M.F., Servent K.M., Rogers E.E., Pascal J.M.: A third zinc-binding domain of human poly(ADP-ribose) polymerase-1 coordinates DNA-dependent enzyme activation. J. Biol. Chem., 2008; 283: 4105-4114
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[61] Levy-Wilson B.: ADP-ribosylation of trout testis chromosomal proteins: distribution of ADP-ribosylated proteins among DNaseI-sensitive and -resistant chromatin domains. Arch. Biochem. Biophys., 1981; 208: 528-534
[PubMed]  

[62] Lindahl T., Satoh M.S., Poirier G.G., Klungland A.: Post-translational modification of poly(ADP-ribose) polymerase induced by DNA strand breaks. Trends Biochem. Sci., 1995; 20: 405-411
[PubMed]  

[63] Louters L., Chalkley R.: Exchange of histones H1, H2A, and H2B in vivo. Biochemistry, 1985; 24: 3080-3085
[PubMed]  

[64] Mahaney B.L., Meek K., Lees-Miller S.P.: Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochem. J., 2009; 417: 639-650
[PubMed]  

[65] Malanga M., Pleschke J.M., Kleczkowska H.E., Althaus F.R.: Poly(ADP-ribose) binds to specific domains of p53 and alters its DNA binding functions. J. Biol. Chem., 1998; 273: 11839-11843
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[66] Maruta H., Matsumura N., Tanuma S.: Role of (ADP-ribose)_n catabolism in DNA repair. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997; 236: 265-269
[PubMed]  

[67] Maruta H., Okita N., Takasawa R., Uchiumi F., Hatano T., Tanuma S.: The involvement of ATP produced via (ADP-ribose)_n in the maintenance of DNA replication apparatus during DNA repair. Biol. Pharm. Bull., 2007; 30: 447-450
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[68] Masson M., Niedergang C., Schreiber V., Muller S., Menissier-de Murcia J., de Murcia G.: XRCC1 is specifically associated with poly(ADP-ribose) polymerase and negatively regulates its activity following DNA damage. Mol. Cell. Biol., 1998; 18: 3563-3571
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[69] Meder V.S., Boeglin M., de Murcia G., Schreiber V.: PARP-1 and PARP-2 interact with nucleophosmin/B23 and accumulate in transcriptionally active nucleoli. J. Cell Sci., 2005; 118: 211-222
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[70] Messner S., Schuermann D., Altmeyer M., Kassner I., Schmidt D., Schär P., Müller S., Hottiger M.O.: Sumoylation of poly(ADP-ribose) polymerase1 inhibits its acetylation and restrains transcriptional coactivator function. FASEB J., 2009; 23: 3978-3989
[PubMed]  

[71] Meyer R., Müller M., Beneke S., Küpper J.H., Bürkle A.: Negative regulation of alkylation-induced sister-chromatid exchange by poly(ADP ribose) polymerase-1 activity. Int. J. Cancer, 2000; 88: 351-355
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[72] Meyer-Ficca M.L., Meyer R.G., Jacobson E.L., Jacobson M.K.: Poly(ADP-ribose) polymerases: managing genome stability. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2005; 37: 920-926
[PubMed]  

[73] Miwa M., Masutani M.: PolyADP-ribosylation and cancer. Cancer Sci., 2007; 98: 1528-1535
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[74] Mosgoeller W., Steiner M., Hozák P., Penner E., Węsierska-Gądek J.: Nuclear architecture and ultrastructural distribution of poly(ADP-ribosyl)transferase, a multifunctional enzyme. J. Cell Sci., 1996; 109: 409-418
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[75] Moubarak R.S., Yuste V.J., Artus C., Bouharrour A., Greer P.A., Menissier-de Murcia J., Susin S.A.: Sequential activation of poly(ADP-ribose) polymerase 1, calpains, and Bax is essential in apoptosis-inducing factor-mediated programmed necrosis. Mol. Cell. Biol., 2007; 27: 4844-4862
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[76] Niere M., Kernstock S., Koch-Nolte F., Ziegler M.: Functional localization of two poly(ADP-ribose)-degrading enzymes to the mitochondrial matrix. Mol. Cell. Biol., 2008; 28: 814-824
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[77] Oei S.L., Griesenbeck J., Schweiger M., Ziegler M.: Regulation of RNA polymerase II-dependent transcription by poly(ADP-ribosyl)ation of transcription factors. J. Biol. Chem., 1998; 273: 31644-31647
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[78] Oei S.L., Ziegler M.: ATP for the DNA ligation step in base excision repair is generated from poly(ADP-ribose). J. Biol. Chem., 2000; 275: 23234-23239
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[79] Ogata N., Ueda K., Hayaishi O.: ADP-ribosylation of histone H2B. Identification of glutamic acid residue 2 as the modification site. J. Biol. Chem., 1980; 255: 7610-7615
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[80] Ogata N., Ueda K., Kagamiyama H., Hayaishi O.: ADP-ribosylation of histone H1. Identification of glutamic acid residues 2, 14, and the COOH-terminal lysine residue as modification sites. J. Biol. Chem., 1980; 255: 7616-7620
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[81] Oka S., Kato J., Moss J.: Identification and characterization of a mammalian 39-kDa poly(ADP-ribose) glycohydrolase. J. Biol. Chem., 2006; 281: 705-713
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[82] Otto H., Reche P.A., Bazan F., Dittmar K., Haag F., Koch-Nolte F.: In silico characterization of the family of PARP-like poly(ADP-ribosyl)transferases (pARTs). BMC Genomics, 2005; 6: 139
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[83] Perdoni F., Bottone M.G., Soldani C., Veneroni P., Alpini C., Pellicciari C., Scovassi A.I.: Distribution of centromeric proteins and PARP-1 during mitosis and apoptosis. Ann. N Y Acad. Sci., 2009; 1171: 32-37
[PubMed]  

[84] Pleschke J.M., Kleczkowska H.E., Strohm M., Althaus F.R.: Poly(ADP-ribose) binds to specific domains in DNA damage checkpoint proteins. J. Biol. Chem., 2000; 275: 40974-40980
[PubMed]  

[85] Plummer E.R., Calvert H.: Targeting poly(ADP-ribose) polymerase: a two-armed strategy for cancer therapy. Clin. Cancer Res., 2007; 13: 6252-6256
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[86] Poirier G.G., de Murcia G., Jongstra-Bilen J., Niedergang C., Mandel P.: Poly(ADP-ribosyl)ation of polynucleosomes causes relaxation of chromatin structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982; 79: 3423-3427
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[87] Poitras M.F., Koh D.W., Yu S.W., Andrabi S.A., Mandir A.S., Poirier G.G., Dawson V.L., Dawson T.M.: Spatial and functional relationship between poly(ADP-ribose) polymerase 1 and poly(ADP-ribose) glycohydrolase in the brain. Neuroscience, 2007; 148: 198-211
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[88] Popławski J., Błasiak J.: Naprawa DNA przez rekombinację homologiczną w komórkach ssaków. Postepy Biochem., 2006; 52: 180-193
[PubMed]  

[89] Quesada P., Farina B., Jones R.: Poly(ADP-ribosylation) of nuclear proteins in rat testis correlates with active spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta, 1989; 1007: 167-175
[PubMed]  

[90] Rajamohan S.B., Pillai V.B., Gupta M., Sundaresan N.R., Birukov K.G., Samant S., Hottiger M.O., Gupta M.P.: SIRT1 promotes cell survival under stress by deacetylation-dependent deactivation of poly(ADP-ribose) polymerase 1. Mol. Cell. Biol., 2009; 29: 4116-4129
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[91] Reale A., Matteis G.D., Galleazzi G., Zampieri M., Caiafa P.: Modulation of DNMT1 activity by ADP-ribose polymers. Oncogene, 2005; 24: 13-19
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[92] Rossi M.N., Carbone M., Mostocotto C., Mancone C., Tripodi M., Maione R., Amati P.: Mitochondrial localization of PARP-1 requires interaction with mitofilin and is involved in the maintenance of mitochondrial DNA integrity. J. Biol. Chem., 2009; 284: 31616-31624
[PubMed]  

[93] Ruf A., Mennissier de Murcia J., de Murcia G., Schulz G.E.: Structure of the catalytic fragment of poly(ADP-ribose) polymerase from chicken. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 93: 7481-7485
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[94] Ruscetti T., Lehnert B.E., Halbrook J., Le Trong H., Hoekstra M.F., Chen D.J., Peterson S.R.: Stimulation of the DNA-dependent protein kinase by poly(ADP-ribose) polymerase. J. Biol. Chem., 1998; 273: 14461-14467
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[95] Saberi A., Hochegger H., Szuts D., Lan L., Yasui A, Sale J.E., Taniguchi Y., Murakawa Y., Zeng W., Yokomori K., Helleday T., Teraoka H., Arakawa H., Buerstedde J.M., Takeda S.: RAD18 and poly(ADP-ribose) polymerase independently suppress the access of nonhomologous end joining to double-strand breaks and facilitate homologous recombination-mediated repair. Mol. Cell. Biol., 2007; 27: 2562-2571
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[96] Sauermann G., Węsierska-Gądek J.: Poly(ADP-ribose) effectively competes with DNA for histone H4 binding. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1986; 139: 523-529
[PubMed]  

[97] Saxena A., Saffery R., Wong L.H., Kalitsis P., Choo K.H.: Centromere proteins Cenpa, Cenpb, and Bub3 interact with poly(ADP-ribose) polymerase-1 protein and are poly(ADP-ribosyl)ated. J. Biol. Chem., 2002; 277: 26921-26926
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[98] Schreiber V., Amé J.C., Dollé P., Schultz I., Rinaldi B., Fraulob V., Ménnissier-de Murcia J., de Murcia G.: Poly(ADP-ribose) polymerase-2 (PARP-2) is required for efficient base excision DNA repair in association with PARP-1 and XRCC1. J. Biol. Chem., 2002; 277: 23028-23036
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[99] Schreiber V., Dantzer F., Ame J.C., de Murcia G.: Poly(ADP-ribose): novel functions for an old molecule. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2006; 7: 517-528
[PubMed]  

[100] Schultz N., Lopez E., Saleh-Gohari N., Helleday T.: Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP-1) has a controlling role in homologous recombination. Nucleic Acids Res., 2003; 31: 4959-4964
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[101] Scovassi A.I.: Mitochondrial poly(ADP-ribosylation): from old data to new perspectives. FASEB J., 2004; 18: 1487-1488
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[102] Scovassi A.I., Mariani C., Negroni M., Negri C., Bertazzoni U.: ADP-ribosylation of nonhistone proteins in HeLa cells: modification of DNA topoisomerase II. Exp. Cell Res., 1993; 206: 177-181
[PubMed]  

[103] Shick V.V., Belyavsky A.V., Bavykin S.G., Mirzabekov A.D. Primary organization of the nucleosome core particles. Sequential arrangement of histones along DNA. J. Mol. Biol., 1980; 139: 491-517
[PubMed]  

[104] Shieh W.M., Amé J.C., Wilson M.V., Wang Z.Q., Koh D.W., Jacobson M.K., Jacobson E.L.: Poly(ADP-ribose) polymerase null mouse cells synthesize ADP-ribose polymers. J. Biol. Chem., 1998; 273: 30069-30072
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[105] Shiokawa M., Masutani M., Fujihara H., Ueki K., Nishikawa R., Sugimura T., Kubo H., Nakagama H.: Genetic alteration of poly(ADP-ribose) polymerase-1 in human germ cell tumors. Jpn. J. Clin. Oncol., 2005; 35: 97-102
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[106] Shrivastav M., De Haro L.P., Nickoloff J.A.: Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell Res., 2008; 18: 134-147
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[107] Simbulan-Rosenthal C.M., Rosenthal D.S., Boulares A.H., Hickey R.J., Malkas L.H., Coll J.M., Smulson M.E.: Regulation of the expression or recruitment of components of the DNA synthesome by poly(ADP-ribose) polymerase. Biochemistry, 1998; 37: 9363-9370
[PubMed]  

[108] Śledziński T.: Polimeraza poli(ADP-rybozy) i jej udział w naprawie DNA. Postepy Biochem., 2003; 49: 239-249
[PubMed]  

[109] Smith H.M., Grosovsky A.J.: Poly ADP-ribose-mediated regulation of p53 complexed with topoisomerase I following ionizing radiation. Carcinogenesis, 1999; 20: 1439-1443
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[110] Soldani C., Scovassi A.I.: Poly(ADP-ribose) polymerase-1 cleavage during apoptosis: an update. Apoptosis, 2002; 7: 321-328
[PubMed]  

[111] Süsse S., Scholz C.J., Bürkle A., Wiesmüller L.: Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP-1) and p53 independently function in regulating double-strand break repair in primate cells. Nucleic Acids Res., 2004; 32: 669-680
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[112] Synowiec E., Książek D., Błasiak J., Woźniak K.: Rola modyfikacji SUMO w utrzymaniu stabilności genomu. Postepy Biochem., 2008; 54: 234-241
[PubMed]  

[113] Tao Z., Gao P., Hoffman D.W., Liu H.W.: Domain C of human poly(ADP-ribose) polymerase-1 is important for enzyme activity and contains a novel zinc-ribbon motif. Biochemistry, 2008; 47: 5804-5813
[PubMed]  

[114] Tao Z., Gao P., Liu H.W.: Identification of the ADP-ribosylation sites in the PARP-1 automodification domain: analysis and implications. J. Am. Chem. Soc. 2009; 131: 14258-14260
[PubMed]  

[115] Tao Z., Gao P., Liu H.W.: Studies of the expression of human poly(ADP-ribose) polymerase-1 in Saccharomyses cerevisiae and identification of PARP-1 substrates by yeast proteome microarray screening. Biochemistry, 2009; 48: 11745-11754
[PubMed]  

[116] Thibodeau J., Gradwohl G., Dumas C., Clairoux-Moreau S., Brunet G., Penning C., Poirier G.G., Moreau P.: Cloning of rodent cDNA coding the poly(ADP-ribose) polymerase catalytic domain and analysis of mRNA levels during the cell cycle. Biochem. Cell Biol., 1989; 67: 653-660
[PubMed]  

[117] Till S., Diamantara K., Ladurner A.G.: PARP: a transferase by any other name. Nat. Struct. Mol. Biol., 2008; 15: 1243-1244
[PubMed]  

[118] Wang M., Wu W., Wu W., Rosidi B., Zhang L., Wang H., Iliakis G.: PARP-1 and Ku compete for repair of DNA double strand breaks by distinct NHEJ pathways. Nucleic Acids Res., 2006; 34: 6170-6182
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[119] Wang Y., Dawson V.L., Dawson T.M.: Poly(ADP-ribose) signals to mitochondrial AIF: a key event in parthanatos. Expt. Neurol., 2009; 218: 193-202
[PubMed]  

[120] Wang Z.Q., Stingl L., Morrison C., Jantsch M., Los M., Schulze-Osthoff K., Wagner E.F.: PARP is important for genomic stability but dispensable in apoptosis. Genes Dev., 1997; 11: 2347-2358
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[121] Węsierska-Gądek J., Bugajska-Schretter A., Cerni C.: ADP-ribosylation of p53 tumor suppressor protein: mutant but not wild-type p53 is modified. J. Cell. Biochem., 1996; 62: 90-101
[PubMed]  

[122] Węsierska-Gądek J., Ranftler C., Schmid G.: Physiological ageing: role of p53 and PARP-1 tumor suppressors in the regulation of terminal senescence. J. Physiol. Pharmacol., 2005; 56 (Suppl. 2): 77-88
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[123] Węsierska-Gądek J., Sauermann G.: Modification of nuclear matrix proteins by ADP-ribosylation. Association of nuclear ADP-ribosyltransferase with the nuclear matrix. Eur. J. Biochem., 1985; 153: 421-428
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[124] Węsierska-Gądek J., Sauermann G.: The effect of poly(ADP-ribose) on interactions of DNA with histones H1, H3 and H4. Eur. J. Biochem., 1988; 173: 675-679
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[125] Węsierska-Gądek J., Schmid G., Cerni C.: ADP-ribosylation of wild-type p53 in vitro: binding of p53 protein to specific p53 consensus sequence prevents its modification. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996; 224: 96-102
[PubMed]  

[126] Woodhouse B.C., Dianov G.L.: Poly ADP-ribose polymerase-1: an international molecule of mystery. DNA Repair, 2008; 7: 1077-1086
[PubMed]  

[127] Yang Y.G., Cortes U., Patnaik S., Jasin M., Wang Z.Q.: Ablation of PARP-1 does not interfere with the repair of DNA double-strand breaks, but compromises the reactivation of stalled replication forks. Oncogene, 2004; 23: 3872-3882
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[128] Yano K., Morotomi-Yano K., Akiyama H.: Cernunnos/XLF: a new player in DNA double-strand break repair. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2009; 41: 1237-1240
[PubMed]  

[129] Yu S.W., Wang H., Poitras M.F., Coombs C., Bowers W.J., Federoff H.J., Poirier G.G., Dawson T.M., Dawson V.L.: Mediation of poly(ADP-ribose) polymerase-1-dependent cell death by apoptosis-inducing factor. Science, 2002; 297: 259-263
[PubMed]  

[130] Yu S.W., Wang Y., Frydenlund D.S., Ottersen O.P., Dawson V.L., Dawson T.M.: Outer mitochondrial membrane localization of apoptosis-inducing factor: mechanistic implications for release. ASN Neuro., 2009; 1. pii: e00021
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[131] Zampieri M., Passananti C., Calabrese R., Perilli M., Corbi N., De Cave F., Guastafierro T., Bacalini M.G., Reale A., Amicosante G., Calabrese L., Zlatanova J., Caiafa P.: Parp1 localizes within the Dnmt1 promoter and protects its unmethylated state by its enzymatic activity. PLoS One, 2009; 4: e4717
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[132] Zaniolo K., Desnoyers S., Leclerc S., Guérin S.L.: Regulation of poly(ADP-ribose)polymerase-1 (PARP-1) gene expression throught the post-translational modification of SP1: a nuclear target protein of PARP-1. BMC Mol. Biol., 2007; 8: 96
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[133] Zardo G., Caiafa P.: The unmethylated state of CpG islands in mouse fibroblast depends on the poly(ADP-ribosyl)lation process. J. Biol. Chem., 1998; 273: 16517-16520
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[134] Zardo G., Reale A., Passananti C., Pradhan S., Buontempo S., de Matteis G., Adams R.L., Caiafa P.: Inhibition of poly(ADP-ribosyl)ation induces DNA hypermethylation: a possible molecular mechanism. FASEB J., 2002; 16: 1319-1321
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

Autorki deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu