Streszczenie

Opracowanie i rozwój technologii produkcji inżynierowanego jedwabiu stworzyły realne możli­wości jego praktycznych zastosowań. Rekombinowany inżynierowany pajęczy jedwab (IPJ) sta­nowi substrat do produkcji różnych biomateriałów, takich jak: filmy, hydrożele, włókna, ruszto­wania, mikrokapsułki, mikro- i nanosfery. Wytwarzanie in vitro włókien odbywa się w sposób naśladujący warunki naturalnie panujące w gruczole przędnym pająka: w obecności jonów fosfo­ranowych oraz sił ciągnących. Filmy otrzymywane są przez odparowanie rozpuszczalnika z roz­tworu jedwabiu, natomiast rezultatem odparowywania rozpuszczalnika w obecności porogenu są jedwabne rusztowania. Hydrożele powstają w wyniku polimeryzacji cząstek jedwabiu w roz­tworach o niskim pH. Polimer jedwabiu powstający na granicy niemieszających się faz wyko­rzystywany jest do otrzymywania mikrokapsułek. Najmniejsze z opisywanych form – jedwab­ne sfery powstają przez wysolenie białek jedwabiu jonami fosforanowymi. Cechami wspólnymi jedwabnych biomateriałów są biokompatybilność oraz biodegradowalność pozwalające na wy­korzystanie ich w medycynie i farmacji, a strategia konstrukcji białek hybrydowych polegająca na nadaniu metodami inżynierii genetycznej pożądanej funkcji dalej rozszerza możliwości ich wykorzystania.

Słowa kluczowe:jedwab pajęczy • inżynierowany jedwab pajęczy • biomateriał • włókna • film • hydrożel • rusztowania • mikrokapsułki • mikro-, nanosfery

Summary

The development and progress in engineered spider silk manufacturing has enabled its practi­cal application. Recombinant spider silk can assemble in several morphological forms such as films, hydrogels, fibers, scaffolds, microcapsules, and micro- and nanospheres. The in vitro fiber formation takes place by mimicking the natural spinning process in the spider spinning gland: in the presence of phosphate ions and dragging forces. Films are obtained by evaporation of so­lvent from the silk solution, while the result of evaporation of the solvent in the presence of po­rogens is a silk scaffold. Hydrogels are formed by spontaneous polymerization of silk particles in solutions at low pH. The silk film assembled at the interface of two immiscible phases forms microcapsules. The smallest of the described forms – silk spheres – are obtained by salting out the silk protein solution after addition of the phosphate ions. Common properties of the silk bio­materials are biocompatibility and biodegradability, which make them suitable for a number of applications in medicine and pharmacy. Moreover, the strategy of hybrid proteins which provi­des the desired function to biomaterial will further expand their potential use.

Key words:spider silk • engineered proteins • biomaterial • film • hydrogel • fiber • scaffold • microcapsules • micro- and nanospheres

Wprowadzenie

Nadzwyczajne właściwości mechaniczne nici pajęczych, takie jak wytrzymałość, rozciągliwość, odporność na pę­kanie, a przy tym biokompatybilność i biodegradowalność czynią jedwab biomateriałem o licznych potencjalnych za­stosowaniach w medycynie i farmacji. Jednak przez wiele lat postęp badań był ograniczony dostępnością materiału. Poznanie sekwencji genów kodujących białkowy budulec jedwabnych nici (tzw. spidroin) otworzyło drogę do kon­struowania syntetycznych genów, kodujących tzw. inżynie­rowany pajęczy jedwab (IPJ). Strategia ta polega na synte­zie krótkiej nici DNA kodującej sekwencję konsensusową danej spidroiny, tzw. moduł DNA. Konstrukcja modułów DNA zakłada optymalizację kodonów odpowiednio do da­nego systemu ekspresyjnego. Zapewnia to wysoki poziom ekspresji, co wiąże się ze zwiększeniem ilości jedwabne­go materiału. Ponadto dodatkowe polipeptydy tworzące funkcjonalne domeny dodane do IPJ metodami inżynierii genetycznej nadają IPJ dodatkowe funkcje, np. enzyma­tyczne, rozpoznające receptory komórkowe, wiążące me­tale, cukry, adhezji, przechodzenia przez błony komórko­we i inne. Te syntetyczne, funkcjonalne białka jedwabiu stanowią nową klasę spidroin [33]. Zagadnienie konstruk­cji IPJ i ich funkcjonalizacji zostało opisane w części I do­tyczącej inżynierowanego jedwabiu pajęczego.

Zwiększenie dostępności białek jedwabiu stało się punk­tem przełomowym w badaniach prowadzących do praktycz­nych zastosowań biomateriałów opartych na IPJ. Jedwab naturalny, wytwarzany przez larwy jedwabnika morwowe­go, od lat wykorzystywany jest do produkowania różnych morfologicznych biomateriałów [2]. Opracowywane tech­niki pozyskiwania struktur, takich jak: włókna, maty, żele, filmy/błony, porowate rusztowania, kapsułki czy sfery sta­nowią obecnie punkt wyjścia do badań nad możliwościa­mi wytwarzania różnych form morfologicznych również z jedwabiu pajęczego (ryc. 1). Intensywne badania prowa­dzące do poznania procesów zachodzących w gruczołach przędnych pająka przyczyniają się również do zrozumie­nia, a zatem kontroli procesów wytwarzania jedwabnych biomateriałów. Białka jedwabiu zmagazynowane w worku gruczołu przędnego występują w postaci rozpuszczalnej i mają strukturę nieuporządkowanego zwoju (kłębka staty­stycznego). Muszą one zostać poddane składaniu tak, aby ostatecznie otrzymać nierozpuszczalne włókna o domi­nującej strukturze drugorzędowej typu pofałdowana kart­ka β [8]. Analiza procesu przechodzenia białek jedwabiu z roztworu do fazy stałej zachodzącego w gruczole przęd­nym pająka wykazała ważne znaczenie czynników, takich jak: stężenie soli, pH, zawartość wody, stężenie białka oraz działanie sił mechanicznych [8]. Naśladując naturę w wa­runkach sztucznych naukowcy pracują nad kontrolowa­nym przejściem białek jedwabiu z fazy ciekłej do stałej przy jednoczesnym nadawaniu pożądanego kształtu two­rzonemu biomateriałowi [13]. Poniżej przedstawiono do­tychczasowe osiągnięcia w dziedzinie pozyskiwania bio­materiałów opartych na IPJ.

Ryc. 1. Formy morfologiczne (strukturalne) uzyskiwane z jedwabiu naturalnego i inżynierowanego jedwabiu pajęczego; (A) obraz SEM rusztowania, widoczna porowata struktura rusztowania, wstawka: makroskopowy obraz rusztowania, (B) makroskopowy obraz hydrożelu w probówce, wstawka: krążki hydrożelu, (C) obraz SEM włókien uzyskanych metodą elektroprzędzenia, (D) makroskopowy obraz filmu, (E) obraz z mikroskopu świetlnego sfer uzyskanych z IPJ (powiększenie 400×), wstawka: obraz z mikroskopu fluorescencyjnego sfer znakowanych FITC (powiększenie 200×)

Włókna i maty

Większość metod eksperymentalnych użytych dotychczas w próbach uzyskania włókien z rekombinowanych białek bazowała na wytłaczaniu rozpuszczalnika zwanym inaczej mokrym przędzeniem, elektroprzędzeniu oraz na metodach związanych z mikroprzepływami [8]. Metodą produkcji włókien in vitro najbardziej zbliżoną do naturalnego proce­su jest metoda oparta na mikroprzepływach [30]. Warunki przepływu laminarnego zapewniają precyzyjną kontrolę nad stężeniem jonów, wartością pH wzdłuż kanału, szyb­kością przepływu oraz działaniem sił ciągnących [32]. Ważną rolę w formowaniu ostatecznego kształtu i właści­wości włókien jest mechaniczne wyciąganie imitujące siły ciągnące występujące w naturze. Wyciąganie prowadzi do powstania dłuższych oraz cieńszych włókien. Włókno pod­dane wyciąganiu ma większą zawartość struktury β-kartki, a co za tym idzie zwiększoną wytrzymałość [15]. Włókno, które przeciągnięte zostanie przez wodny roztwór nabiera większej odporności na odkształcanie i zerwanie, jest jed­nak mniej rozciągliwe [36]. Na mechaniczną wytrzyma­łość oraz strukturę włókna znaczący wpływ ma wielkość białka użytego do jego produkcji oraz obecność końco­wych niepowtarzających się domen. Wykazano, iż białko oparte na sekwencji MaSp1 złożone z 96-krotnie powtó­rzonych domen alaninowych i glicynowych (czyli wielko­ścią zbliżoną do naturalnego) formuje wytrzymałe włókna o regularnej strukturze. Krótsze, 32-16-merowe białka two­rzą wadliwe włókna o niewielkiej wytrzymałości na rozcią­ganie [45]. Oznacza to, iż chcąc uzyskać in vitro włókno o właściwościach zbliżonych do pajęczej nici należy uzy­skać ekspresję jak najdłuższego białka. Końcowe, niepo­wtarzające się domeny białka jedwabiu odgrywają ważną rolę w procesie formowania się włókien, zapobiegając nie­pożądanej agregacji białek oraz promując agregację białek w sposób równoległy do długiej osi włókna. IPJ pozbawio­ne końcowych domen niepowtarzających się poddane sile ścinającej nie wykazują zmian lepkości, tworzą niewiel­kie, nieprawidłowe, nieuporządkowane agregaty zawiera­jące przypadkowo sparowane struktury β-kartki. W tych samych warunkach białka mające C-końcową domenę for­mują fibrylarne agregaty bogate w struktury β-kartki ukła­dające się wzdłuż osi włókna [7]. IPJ oparte na sekwen­cji ADF-3 (eADF3) tworzyły włókna uzyskane techniką mikroprzepływów po zastosowaniu sił ciągnących i obni­żeniu pH z 8 do 6. Włókna te miały średnicę 10-40 µm. Charakteryzowały się znacznie mniejszą odpornością na rozerwanie niż naturalne nici pajęcze. Na przykładzie tych włókien zaobserwowano, iż proces wyciągania ma znaczą­cy wpływ na wytrzymałość i rozciągliwość włókna [19]. Tą samą techniką uzyskano również włókna z mieszaniny inżynierowanych białek eADF3 i eADF4. Białko eADF4 nie tworzy włókien, polimeryzuje jedynie w sfery o du­żej zawartości β-kartki. Mieszanina obu białek składa się w odpowiednich warunkach z włókna o właściwościach zbliżonych do włókien zbudowanych tylko z białka eADF3 [32]. Włókna z rekombinowanego IPJ produkowane me­todą elektroprzędzenia można układać w porowate maty doskonale imitujące topograficzne właściwości przestrzeni międzykomórkowej [41]. Obecnie podejmowane są próby tworzenia mat powstałych z IPJ jako alternatywy dla na­turalnych włókien stosowanych jako podłoże do hodowli komórek. Przykładowo, rozwór hybrydowego IPJ opartego na sekwencji MaSp1 połączonego z sekwencją trójpeptydu RGD (wspomagającą adhezję komórek) poddano elektro­przędzeniu, uzyskując maty zbudowane z włókien o śred­nicy około 100 nm [4].

Filmy

Cienkie błony złożone z cząstek rekombinowanego IPJ sta­nowią podstawę stabilnego, biokompatybilnego polimeru o obiecujących właściwościach i potencjale do zastoso­wań biomedycznych. Jedwabny film może być uzyskany przez całkowite odparowanie rozpuszczalnika z roztworu IPJ. Przezroczyste filmy o grubości 0,5-1,5 µm otrzyma­no z użyciem rozpuszczalnika HFIP – heksafluoroizopro­panolu zawierającego roztwór białka IPJ opartego na se­kwencjach pajęczych: ADF-3 i ADF-4 [12]. Roztworem tym pokrywano płytki krzemowe i odparowywano rozpusz­czalnik. Uzyskane w ten sposób filmy miały wewnętrzną strukturę zbudowaną z motywów β-kartki, β-zwrotów, α-he­lis oraz nieuporządkowanych fragmentów. Aby wzbogacić zawartość struktury β-kartki, a przez to zwiększyć mecha­niczną wytrzymałość filmu, inkubowano go z roztworem metanolu [12]. Film potraktowany metanolem składał się głównie z krystalicznych struktur β-kartki tworzonych przez motywy polialaninowe [21]. Otrzymane filmy były stabilne w warunkach denaturujących, takich jak wysokie stężenia mocznika i chlorowodorku guanidyny, dorównu­jąc właściwościom naturalnego jedwabiu pajęczego [37]. Powierzchnia filmu doskonale nadaje się do hodowli ko­mórek tkanki łącznej, gdyż pobudza nie tylko ich wzrost, ale także wytwarzanie substancji międzykomórkowej, co wykazano na przykładzie fibroblastów deponujących na jedwabnej matrycy kolagen typu I [44]. Właściwość tę wykorzystano do projektowania opatrunków wspomaga­jących regenerację skóry po oparzeniach. Zastosowanie membrany z rekombinowanych IPJ na poparzone miejsce znacznie przyspieszało gojenie się rany oraz wzmagało ekspresję czynnika wzrostu fibroblastów, przewyższając działanie standardowo stosowanego kolagenu [3]. Jednak do wielu zastosowań niezbędne jest nadanie IPJ nowej funkcji poprzez modyfikacje chemiczne gotowego filmu, bądź genetyczne modyfikacje białka użytego do produk­cji filmu. Zmodyfikowane filmy mogą się stać narzędzia­mi do kontrolowanego uwalniania leków lub innych sub­stancji aktywnych, działać jako biosensory lub stanowić rusztowania do wzrostu komórek w inżynierii tkankowej. Przykładem może być wprowadzenie cysteiny do sekwen­cji IPJ bazującego na sekwencji ADF-4. Modyfikacja skut­kująca pojawieniem się grupy tiolowej na powierzchni fil­mu pozwoliła na zakotwiczenie na błonie takich cząstek jak nanocząstki złota, barwniki, biotyna, β-galaktozydaza oraz inne enzymy [40]. Innym przykładem są białka fuzyj­ne jedwabiu inżynierowanego z sekwencjami konsensuso­wymi lub fragmentami innych białek. Fuzja IPJ z 10-krot­nie powtórzonym pentapeptydem sekwencji konsensusowej elastyny i wykorzystanie go jako podłoże (film) do ho­dowli ludzkich chondrocytów poprawiło warunki wzro­stu komórek w porównaniu z hodowlą na płytkach poli­styrenowych. Uzyskano podobne rezultaty jak w hodowli na płytkach pokrytych kolagenem bądź fibronektyną [35]. Jednak ze względu na brak porównania białka fuzyjnego z białkami składowymi, nie można jednoznacznie stwier­dzić, czy o skuteczności decyduje składowa elastyno­wa, sekwencja IPJ czy też obie [35]. Z rekombinowanego 15-merowego IPJ z peptydem RGD utworzono filmy, któ­re stanowiły matrycę do wzrostu komórek macierzystych szpiku kostnego [4]. Hormonalna indukcja ich różnicowa­nia w kierunku komórek kości prowadziła do wzrostu oste­ocytów i do wzmożonego odkładania soli wapnia w po­równaniu ze standardowymi warunkami hodowli. Bardziej intensywne odkładanie soli wapniowych zaobserwowano jednakże w kontroli z hodowlą komórek na rekombinowa­nym 15-merowym białku pozbawionym sekwencji RGD. Wynik ten może sugerować, iż wzrost tych komórek jest promowany przez samą strukturę filmu z rekombinowane­go białka [4]. Ponadto wykazano, że zawartość struktury kartki β, odpowiedzialnej za sztywność materiału, w dru­gorzędowej strukturze filmu będącego mieszaniną rekom­binowanego IPJ bez oraz z motywem RGD była skorelo­wana z zawartością motywów RGD [23]. Zaobserwowano zwiększoną ilość struktury kartki β w przypadku rekombi­nowanego IPJ z RGD. Co więcej, wykazano, że niezależ­nie od stosunku obu składników mieszaniny, peptyd RGD był zawsze eksponowany na powierzchni filmu [23]. Inne doniesienia opisują fuzję IPJ z peptydami powodującymi odkładanie się substancji nieorganicznych na powierzch­ni biopolimeru. W przypadku dołączania sekwencji kon­sensusowej pochodzącej z białka silafiny (sekwencja R5), na powierzchni filmu odkładała się krzemionka. Uzyskane filmy oraz porowate struktury trójwymiarowe zbudowane z IPJ zostały wzmocnione cząsteczkami krzemionki two­rząc stabilne rusztowanie do wzrostu komórek. Struktura ta może być potencjalnie zastosowana w regeneracji tka­nek kostnych, co potwierdza adhezja ludzkich mezen­chymalnych komórek macierzystych (hMCS). Komórki te, hodowane na podłożu filmu z IPJ-R5 rozmnażały się oraz różnicowały w kierunku komórek kościotwórczych [22]. Obecność komponentu krzemionkowego w filmach wpływała na ekspresję genów związanych z osteogenezą. W komórkach rosnących na filmach pokrytych krzemion­ką zaobserwowano wzrost ekspresji genów markerowych komórek kościotwórczych o prawie 5% w porównaniu z komórkami hodowanymi na jedwabnych filmach pozba­wionych komponentu krzemionkowego [21]. Kolejny przy­kład to połączenie IPJ z C-końcową domeną białka den­tyny 1 (CDMP1) [11]. Domena ta jest odpowiedzialna za wiązanie jonów wapnia. Białko fuzyjne wykazywało zdol­ność do samoistnej agregacji i tworzenia filmu, który po inkubacji z metanolem miał dużą zawartość struktury β­-kartki. Dodana domena dentyny zapewniała białku zdol­ność wiązania i gromadzenia cząsteczek hydroksyapaty­tu. Filmy uzyskane z tego białka podlegały mineralizacji podczas inkubacji z roztworami imitującymi płyny orga­nizmu ludzkiego [11].

Hydrożele

Hydrożele to trójwymiarowe sieci polimerowe mogące chłonąć wodne roztwory bez rozpuszczania się w nich. Żel powstaje z roztworu białek jedwabiu, gdy jego stę­żenie jest dostatecznie duże, aby mogła utworzyć się cią­gła sieć polimeru, w której uwięziona zostaje faza ciekła. Żelowanie promowane jest przez niskie pH oraz obecność jonów Ca2+. Warunki te powodują spontaniczne składanie się białek jedwabiu w nanofibryle o średnicy około 3 nm i długości prawie 1 µm podobne do tych tworzonych przez białka jedwabiu w przewodzie wyprowadzającym gruczo­łów przędnych pająka. Po kilku dniach inkubacji nanofi­bryle asocjują w sieć tworząc hydrożel [14]. Tak powsta­łe hydrożele są lepkimi elastycznymi materiałami o dużej kruchości. Dotychczas większość badań nad konstrukcją i zastosowaniami hydrożeli przeprowadzono z użyciem jedwabiu naturalnego pozyskanego z kokonów jedwabni­ków. Wykorzystywane są one przede wszystkim w inży­nierii tkankowej do formowania podłoży do wzrostu ko­mórek. W celu polepszenia ich właściwości stosuje się także mieszanki protein jedwabiu z glikolem bądź żelaty­ną. Wykazano, iż na hydrożelowych jedwabnych podłożach możliwa jest hodowla i różnicowanie komórek kostnych, które efektywnie regenerują defekty tkanki u zwierząt do­świadczalnych [24]. Bada się również ich zastosowanie jako systemy kontrolowanego, powolnego uwalniania substan­cji aktywnych np. cytokin [42]. Hydrożele powstałe z IPJ będącego 16-merem sekwencji opartej na ADF-4 zbudo­wane były z nanofibryli o średnicy około 3 nm i długo­ści nie więcej niż 1 µm. Nanofibryle o podobnej długości tworzyły wewnątrz hydrożelu półelastyczną sieć. Formy te makroskopowo były przezroczyste, kleiste oraz lepko sprężyste, podobnie jak hydrożele uzyskane z jedwabiu naturalnego. Ze względu na swoją elastyczność oraz dużą stabilność pozwalającą na przechowywanie przez kilka tygodni, w przyszłości hydrożele z rekombinowanego je­dwabiu mogą być wykorzystane jako depot, czyli systemy powolnego uwalniania leku lub podłoże do przestrzennej hodowli komórek [31].

Rusztowania

Jeśli do roztworu białek jedwabiu doda się substancję bę­dącą porogenem, w wyniku odparowania rozpuszczalnika powstaną porowate rusztowania. Substancjami powodują­cymi powstanie porów może być np. chlorek sodu lub glu­koza [25]. Stężenie i rodzaj porogenu warunkuje rozmiar porów, który może wynosić 100-1100 µm. Stanowią one doskonałe rusztowanie do adhezji i wzrostu, różnicowania się komórek, tworzenia połączeń między nimi, a w konse­kwencji budowy tkanki. Przestrzenna hodowla komórek zapewnia również idealne warunki przepływu substancji odżywczych oraz usuwania produktów przemiany mate­rii [15]. Obecnie porowate rusztowania do trójwymiaro­wej hodowli komórek z powodzeniem uzyskuje się z je­dwabiu naturalnego pochodzącego od jedwabników [42]. Podjęte zostały również próby produkcji tych struktur z je­dwabiu pozyskanego z otoczek jaj pajęczych, czyli natural­nego jedwabiu pajęczego. Rusztowania zbudowane z tego materiału, podobnie jak te z jedwabiu jedwabników pod­trzymywały wzrost chondrocytów i produkcję chrząst­ki stawowej [6]. Niedostateczna ilość materiału stanowi jednak poważne ograniczenie tej metody. Istnieją rów­nież doniesienia o zakończonym sukcesem wytworzeniu trójwymiarowych rusztowań z IPJ opartego na sekwencji MaSp1 pająka z gatunku Nephila clavipes. Porowate struk­tury uzyskano przez dodanie do roztworu IPJ kryształków NaCl o średnicach 50-100 i 200-400 µm. Po odparowa­niu rozpuszczalnika i potraktowaniu etanolem otrzyma­no jedwabne rusztowania w postaci dysków o wymiarach 10 mm na 1 mm, w których wielkość porów odpowiada­ła wielkości dodanych zastosowanych kryształków chlor­ku sodu. Rusztowania te wspomagały adhezję i wzrost fi­broblastów 3T3 [1].

Mikrokapsułki

Kolejnym wykorzystaniem właściwości jedwabiu pajęcze­go jest tworzenie mikrokapsułek. System taki może dostar­czać substancje aktywne przez zamknięcie w bańce poli­meru leków, czynników diagnostycznych czy np. substancji odpowiadających za smak. Mikrokapsułkowanie zapew­nia przede wszystkim kontrolę nad wchłanianiem i uwal­nianiem składników aktywnych, obniża ich immunogen­ność, a także chroni je przed zbyt wczesną degradacją, np. przez enzymy trawienne. Mikrokapsułki z IPJ bazującego na sekwencji spidroiny ADF-4 otrzymano poprzez kon­trolowane spontaniczne składanie polimeru na styku fazy olej-woda [10]. Białka jedwabiu adsorbowały się na gra­nicy faz formując film i natychmiastowo zmieniając swoją konformację na strukturę β-kartki. Kropelki fazy wodnej, które przechodziły przez granicę faz były otaczane przez film i w ten sposób kapsułkowane płaszczem polimeru. Struktury te to cienkie powłoki polimeru o grubości ścia­ny 3-80 nm i średnicy 1-30 µm. Ich rozmiar zależał od wielkości kropel emulsji powstałej podczas emulsyfikacji [10]. W płaszczu polimerowym występują otwory, któ­re stanowią wybiórczy filtr umożliwiający kontrolę pro­cesu dyfuzji. W kapsułce zamknięte mogą być związki o dużej masie cząsteczkowej, podczas gdy mniejsze czą­steczki mogą swobodnie dyfundować. Zmierzony ekspe­rymentalnie średni punkt odcięcia dla cząsteczek mogą­cych przechodzić przez powłokę mikrokapsułki to 27 kDa. Wielkość ta świadczy o dobrej ochronie zawartości kap­sułki przed układem immunologicznym, stanowi też do­bry system kontrolowanego transportowania i uwalniania enzymów oraz innych bioaktywnych makrocząsteczek [9]. Nano- i mikrokapsułki mogą być zniszczone, a ich składni­ki uwolnione in vivo chemicznie, fizycznie (np. przez siły rozrywające) lub biologicznie (przez trawienie proteoli­tyczne). Istnieje wiele możliwych zastosowań przedstawio­nych torebek/balonów z pajęczego jedwabiu, poczynając od żywności, do zastosowań kosmetycznych i farmaceu­tycznych. W zastosowaniach farmaceutycznych bariera dy­fuzyjna otoczki białkowej pozwala na powolny (kontrolo­wany) proces uwalniania zakapsułkowanego materiału. Dalsze zaprojektowanie otoczki białkowej może dać opa­kowanie o zdefiniowanych parametrach uwalniania, które uwalnia zawartość jedynie po aktywacji z zastosowaniem określonych proteaz lub innych czynników uruchamiają­cych proces uwalniania [33].

Mikro- i nanosfery

Agregacja białek jedwabiu i tworzenie nano- i mikrosfer przebiega spontanicznie, podobnie jak tworzenie nanofi­bryli. Forma utworzonej struktury zależy przede wszyst­kim od obecności i stężenia jonów fosforanowych. Niskie stężenie fosforanów promuje tworzenie się nanofibryli, stężenie między 300 a 400 mM promuje stan przejścio­wy, natomiast pod wpływem wyższego niż 500 mM stę­żenia fosforanów IPJ eADF4 składają się w struktury sfe­ryczne [38]. Dodanie jonów fosforanowych prowadzi do enukleacji, czyli wyodrębnienia się z roztworu rozproszo­nych kropel fazy bogatej w białko. Zagęszczone cząsteczki zaczynają ze sobą oddziaływać, co powoduje przekształ­cenia konformacyjne. Interakcje te skutkują przekształce­niem się kropelek roztworu bogatego w białko w stabilne mikrosfery [18,38]. Jedwabne sfery wykazują niezwykłą odporność chemiczną na czynniki denaturujące, takie jak mocznik czy chlorowodorek guanidyny, co porównywal­ne jest ze stabilnością chemiczną naturalnych nici paję­czych. Obie struktury zawdzięczają tę właściwość bogatej zawartości regionów β-kartki zbudowanej z motywów po­lialaninowych [20]. Mikrosfery i nanosfery uzyskać moż­na w bardzo prostym procesie mieszania roztworu biał­ka przy odpowiedniej zawartości jonów fosforanowych. Badano trzy metody mieszania: poprzez dializę, proste mieszanie za pomocą pipety oraz z użyciem pomp zapew­niających szybki przepływ i mieszanie o określonej pręd­kości. Wykazano, iż wraz ze wzrostem intensywności mie­szania maleje średnica otrzymywanych sfer. Na rozmiar uzyskiwanych struktur wpływa również stężenie białka jedwabiu: przy większej jego koncentracji otrzymujemy sfery o większej średnicy. Opracowane metody miesza­nia pozwalają na uzyskanie stabilnych sfer o zróżnicowa­nych wielkościach. Sfery powstałe podczas dializy mają wielkość 2-1 µm. Mieszanie pipetą formuje sfer o średni­cy 350 i 510 nm, odpowiednio przy stężeniu białka jedwa­biu 0,5 i 1 mg/ml. Najmniejsze cząsteczki otrzymać można dzięki zautomatyzowanej metodzie mieszania pozwalają­cej osiągnąć prędkość przepływu 50 ml/min. Średnia wiel­kość średnicy sfer otrzymanych w ten sposób wynosi 250 nm dla białka o stężeniu 0,5 mg/ml i 320 nm dla białka o stężeniu 1 mg/ml [17].

Mikro- i nanosfery jako system dostarczania substancji czynnych umożliwiają precyzyjną przestrzenną oraz cza­sową kontrolę uwalniania leku, zapewniając pożądany efekt terapeutyczny. Sfery używane jako rezerwuar substancji aktywnej powinny być zdolne do przenoszenia leku bez zmiany jego aktywności, powinny mieć także zdolność uwalniania leku oraz nie wykazywać toksyczności i immu­nogenności [43]. Szczegółowa analiza procesu ładowania 12 przykładowych leków do mikrosfer wykazała, iż cząstecz­ki te wnikają do wnętrza sfery według następującego me­chanizmu. Cząsteczki leku są przyciągane do powierzchni jedwabnej sfery przez siły elektrostatyczne. Następnie, po wysyceniu powierzchni sfery, niskocząsteczkowe leki wni­kają do wnętrza sfery. We wnętrzu cząsteczki leku wiążą się z biopolimerem przez oddziaływania hydrofobowe bądź elektrostatyczne. Uwalnianie leków z powierzchni zachodzi spontanicznie wraz z upływem czasu. Szybsze uwalnianie może być indukowane obniżeniem poziomu pH [39]. Co najważniejsze, substancja aktywna nie upośledza składania cząstek jedwabiu, białko natomiast nie zaburza aktywności dostarczanego leku [27]. Ponadto uzyskany w ten sposób system depot jest całkowicie biodegradowalny. Proteazy serynowe, obecne w organizmie mają zdolność do całko­witej degradacji jedwabnej sfery, a co ważniejsze degra­dacja proteolityczna odbywa się powoli, bez zaburzania wewnętrznej struktury sfery. Badania wykazały, że inku­bacja sfer niosących lek z proteazami serynowymi powo­duje stopniowy i powolny proces uwalniania leku w ciągu 7 dni [16]. Inne badania donoszą, iż wyprodukowane inży­nierowane białko bazujące na sekwencji spidroiny ADF-4 użyte zostało do stworzenia modelowego systemu dostar­czania leku o właściwościach hydrofobowych. Betakaroten, będący substancją słabo rozpuszczalną w wodzie, zyskuje możliwość rozproszenia się w roztworze wodnym dzięki uwięzieniu go w strukturze jedwabiu. Uwolnienie takiego składnika może się odbywać poprzez proteolityczny roz­kład sfery przez enzymy obecne w komórkach lub w su­rowicy. System ten może być wykorzystany do dostarcza­nia substancji nierozpuszczalnych w wodzie w farmacji, czy też w kosmetyce i odżywianiu [20].

Kompleksy białka jedwabiu-DNA

Nośnik DNA do transfekcji komórek to kolejne zastoso­wanie nadzwyczajnego biomateriału jakim jest jedwab pa­jęczy. Wykazano, iż białko fuzyjne składające się z czę­ści opartej na sekwencji IPJ, łańcucha polilizynowego oraz powtórzonych motywów RGD po zmieszaniu z plazmido­wym DNA tworzy stabilne kompleksy [26]. Białka fuzyj­ne zachowywały właściwości samoskładania w roztworze charakterystyczne dla IPJ oraz wiązały plazmidowy DNA w wyniku oddziaływań jonowych. Najbardziej trwałe oka­zały się kompleksy, w których stosunek liczby aminokwa­sów w białkowej części kompleksu do liczby reszt fosfora­nowych w DNA wynosił 2. Kompleksy te wykorzystano jako efektywny czynnik transfekcyjny komórek zawie­rających integryny wiążące peptyd RGD. Domena RGD warunkowała proces transfekcji. Kompleksy bez moty­wu RGD nie wprowadzały DNA do komórek, a im wię­cej domen RGD, tym wyższy był stopień transfekcji [26]. Analogicznie zastosowano IPJ połączone z oddziałującą z DNA domeną polilizynową oraz domeną destabilizują­cą błony [28]. Fuzja prowadziła do ułatwienia penetracji kompleksu jedwabiu z DNA do wnętrza komórki. Uzyskane kompleksy zapobiegały enzymatycznej degradacji DNA przez DNazę, a stopień uwalniania DNA z kompleksu po­przez enzymatyczną degradację białkowego komponentu był regulowany zawartością struktur β-kartki. W przypad­ku fuzyjnego IPJ i dimerycznej domeny destabilizującej błonę uzyskano dużą wydajność transfekcji, porównywal­ną ze standardowo stosowanym czynnikiem transfekcyj­nym Lipofektaminą 2000 [28].

Podsumowanie

Biokompatybilność, biodegradowalność oraz zdolność sa­moskładania białek jedwabiu czyni z nich podstawę do wy­twarzania biomateriałów o korzystnych z punktu widzenia medycyny właściwościach, a ostatnie osiągnięcia w dziedzi­nie optymalizacji metod produkcji i oczyszczania sztucz­nych spidroin stwarzają realne możliwości wprowadzenia jedwabnych biomateriałów na rynek. Polimery uzyskiwa­ne z IPJ można formować w zależności od zastosowanych warunków w struktury nici (włókien), filmów, hydrożeli, rusztowań, mikrokapsułek, mikro- i nanosfer oraz kom­pleksów jedwab/DNA. Ponadto strategia białek hybrydo­wych umożliwia nadanie funkcji biomateriałom. Można zbudować materiał spełniający określoną rolę nadaną mu poprzez dołączoną metodami inżynierii genetycznej do­menę funkcyjną. W zależności od formy morfologicznej oraz zastosowanej modyfikacji jedwabne biopolimery mogą mieć wiele zastosowań (tabela 1). Potencjał biomateriałów uzyskanych z IPJ może zostać wykorzystany w medycy­nie regeneracyjnej, np. rusztowanie do odbudowy tkanki. Hydrożele oraz filmy znaleźć mogą zastosowanie w produk­cji opatrunków oraz projektowaniu systemów kontrolowa­nego, opóźnionego uwalniania leku. Podobnie mikrosfery i kapsułki poddane stosownym modyfikacjom mogą łączyć cechy systemu depot oraz celowanego dostarczania leków do wybranych komórek organizmu. Biomateriały oparte na inżynierowanym jedwabiu pajęczym stwarzają ogrom­ne możliwości zachęcające do dalszych badań nad eksplo­rowaniem ich możliwych zastosowań in vivo.

Tabela 1. Formy morfologiczne (strukturalne) wykonane z rekombinowanego jedwabiu pajęczego i ich potencjalne zastosowania

Podziękowania

Autorzy dziękują prof. Davidowi Kaplanowi, Department of Biomedical Engineering, Department of Chemical and Biological Engineering Tufts University, Medford, USA za udostępnienie obrazu SEM.

PIŚMIENNICTWO

[1] Agapov I.I., Pustovalova O.L., Moisenovich M.M., Bogush V.G., Sokolova O.S., Sevastyanov V.I., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P.: Three-dimensional scaffold made from recombinant spider silk protein for tissue engineering. Dokl. Biochem. Biophys., 2009; 426: 127-130
[PubMed]  

[2] Altman G.H., Diaz F., Jakuba C., Calabro T., Horan R.L., Chen J., Lu H., Richmond J., Kaplan D.L.: Silk-based biomaterials. Biomaterials, 2003; 24: 401-416
[PubMed]  

[3] Baoyong L., Jian Z., Denglong C., Min L.: Evaluation of a new type of wound dressing made from recombinant spider silk protein using rat models. Burns, 2010; 36: 891-896
[PubMed]  

[4] Bini E., Foo C.W., Huang J., Karageorgiou V., Kitchel B., Kaplan D.L.: RGD-functionalized bioengineered spider dragline silk biomaterial. Biomacromolecules, 2006; 7: 3139-3145
[PubMed]  

[5] Fang J.Y., Chen J.P., Leu Y.L., Wang H.Y.: Characterization and evaluation of silk protein hydrogels for drug delivery. Chem. Pharm. Bull., 2006; 54: 156-162
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[6] Gellynck K., Verdonk P., Almqvist K.F., Van Nimmen E., Gheysens T., Mertens J., Van Langenhove L.: Chondrocyte growth in porous spider silk 3D-scaffolds. Eur. Cells Materials, 2005; 10 (Suppl. 2): 45
[Full Text PDF]  

[7] Hagn F., Eisoldt L., Hardy J.G., Vendrely C., Coles M., Scheibel T., Kessler H.: A conserved spider silk domain acts as a molecular switch that controls fibre assembly. Nature, 2010; 465: 239-242
[PubMed]  

[8] Heim M., Keerl D., Scheibel T.: Spider silk: from soluble protein to extraordinary fiber. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2009; 48: 3584-3596
[PubMed]  

[9] Hermanson K.D., Harasim M.B., Scheibel T., Bausch A.R.: Permeability of silk microcapsules made by the interfacial adsorption of protein. Phys. Chem. Chem. Phys., 2007; 9: 6442-6446
[PubMed]  

[10] Hermanson K.D., Huemmerich D., Scheibel T., Bausch A.R.: Engineered microcapsules fabricated from reconstituted spider silk. Adv. Materials, 2007; 19: 1810-1815
[Abstract]  

[11] Huang J., Wong C., George A., Kaplan D.L.: The effect of genetically engineered spider silk-dentin matrix protein 1 chimeric protein on hydroxyapatite nucleation. Biomaterials, 2007; 28: 2358-2367
[PubMed]  

[12] Huemmerich D., Slotta U., Scheibel T.: Processing and modification of films made from recombinant spider silk proteins. Appl. Phys. A, 2006; 82: 219-222
[Abstract]  

[13] Humenik M., Smith A.M., Scheibel T.: Recombinant spider silks-biopolymers with potential for future applications. Polymers, 2011; 3: 640-661
[Abstract]  [Full Text PDF]  

[14] Kim U.J., Park J., Li C., Jin H.J., Valluzzi R., Kaplan D.L.: Structure and properties of silk hydrogels. Biomacromolecules, 2004; 5: 786-792
[PubMed]  

[15] Kluge J.A., Rabotyagova O., Leisk G.G., Kaplan D.L.: Spider silks and their applications. Trends Biotechnol., 2008; 26: 244-251
[PubMed]  

[16] Lammel A., Schwab M., Hofer M., Winter G., Scheibel T.: Recombinant spider silk particles as drug delivery vehicles. Biomaterials, 2011; 32: 2233-2240
[PubMed]  

[17] Lammel A., Schwab M., Slotta U., Winter G., Scheibel T.: Processing conditions for the formation of spider silk microspheres. ChemSusChem, 2008; 1: 413-416
[PubMed]  

[18] Lammel A.S., Hu X., Park S.H., Kaplan D.L., Scheibel T.R.: Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials, 2010; 31: 4583-4591
[PubMed]  

[19] Lazaris A., Arcidiacono S., Huang Y., Zhou J.F., Duguay F., Chretien N., Welsh E.A., Soares J.W., Karatzas C.N.: Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science, 2002; 295: 472-476
[PubMed]  

[20] Liebmann B., Hümmerich D., Scheibel T., Fehr M.: Formulation of poorly water-soluble substances using self-assembling spider silk protein. Colloids Surfaces A, 2008; 331: 126-132
[Abstract]  

[21] Metwalli E., Slotta U., Darko C., Roth S.V., Scheibel T., Papadakis C.M.: Structural changes of thin films from recombinant spider silk proteins upon post-treatment. Appl. Phys. A, 2007; 89: 655-661
[Abstract]  

[22] Mieszawska A.J., Nadkarni L.D., Perry C.C., Kaplan D.L.: Nanoscale control of silica particle formation via silk-silica fusion proteins for bone regeneration. Chem. Mater., 2010; 22: 5780-5785
[PubMed]  

[23] Morgan A.W., Roskov K.E., Lin-Gibson S., Kaplan D.L., Becker M.L., Simon C.G. Jr.: Characterization and optimization of RGD-containing silk blends to support osteoblastic differentiation. Biomaterials, 2008; 29: 2556-2563
[PubMed]  

[24] Motta A., Migliaresi C., Faccioni F., Torricelli P., Fini M., Giardino R.: Fibroin hydrogels for biomedical applications: preparation, characterization and in vitro cell culture studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 2004; 15: 851-864
[PubMed]  

[25] Nazarov R., Jin H.J., Kaplan D.L.: Porous 3-D scaffolds from regenerated silk fibroin. Biomacromolecules, 2004; 5: 718-726
[PubMed]  

[26] Numata K., Hamasaki J., Subramanian B., Kaplan D.L.: Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release, 2010; 146: 136-143
[PubMed]  

[27] Numata K., Kaplan D.L.: Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev., 2010; 62: 1497-1508
[PubMed]  

[28] Numata K., Kaplan D.L.: Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules, 2010 (w druku)
[PubMed]  

[29] Numata K., Subramanian B., Currie H.A., Kaplan D.L.: Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials, 2009; 30: 5775-5784
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[30] Pérez-Rigueiro J., Biancotto L., Corsini P., Marsano E., Elices M., Plaza G.R., Guinea G.V.: Supramolecular organization of regenerated silkworm silk fibers. Int. J. Biol. Macromol., 2009; 44: 195-202
[PubMed]  

[31] Rammensee S., Huemmerich D., Hermanson K.D., Scheibel T., Bausch A.R.: Rheological characterization of hydrogels formed by recombinantly produced spider silk. Appl. Phys. A, 2006; 82: 261-264
[Abstract]  

[32] Rammensee S., Slotta U., Scheibel T., Bausch A.R.: Assembly mechanism of recombinant spider silk proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008; 105: 6590-6595
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[33] Scheibel T.: Spider silks: recombinant synthesis, assembly, spinning, and engineering of synthetic proteins. Microb. Cell Fact., 2004; 3: 14
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[34] Scheibel T., Bausch A.R., Huemmerich D., Hermanson K.D.: Sposób otrzymywania nano- i mikrokapsułek z białka pajęczego jedwabiu. Patent PL/EP1757276, 2007

[35] Scheller J., Henggeler D., Viviani A., Conrad U.: Purification of spider silk-elastin from transgenic plants and application for human chondrocyte proliferation. Transgenic Res., 2004; 13: 51-57
[PubMed]  

[36] Seidel A., Liivak O., Calve S., Adaska J., Ji G., Yang Z., Grubb D., Zax D.B., Jelinski L.W.: Regenerated spider silk: processing, properties, and structure. Macromolecules, 2000; 33: 775-780
[Abstract]  

[37] Slotta U., Tammer M., Kremer F., Koelsch P., Scheibel T.: Structural analysis of spider silk films. Supramolecular Chemistry, 2006; 18: 465-471

[38] Slotta U.K., Rammensee S., Gorb S., Scheibel T.: An engineered spider silk protein forms microspheres. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2008; 47: 4592-4594
[PubMed]  

[39] Spiess K., Lammel A., Scheibel T.: Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci., 2010; 10: 998-1007
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[40] Spiess K., Wohlrab S., Scheibel T.: Structural characterization and functionalization of engineered spider silk films. Soft Matter, 2010; 6: 4168-4174
[Abstract]  

[41] Vendrely C., Scheibel T.: Biotechnological production of spider-silk proteins enables new applications. Macromol. Biosci., 2007; 7: 401-409
[PubMed]  

[42] Vepari C., Kaplan D.L.: Silk as a biomaterial. Prog. Polym. Sci., 2007; 32: 991-1007
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[43] Wang X., Yucel T., Lu Q., Hu X., Kaplan D.L.: Silk nanospheres and microspheres from silk/pva blend films for drug delivery. Biomaterials, 2010; 31: 1025-1035
[PubMed]  

[44] Widhe M., Bysell H., Nystedt S., Schenning I., Malmsten M., Johansson J., Rising A., Hedhammar M.: Recombinant spider silk as matrices for cell culture. Biomaterials, 2010; 31: 9575-9585
[PubMed]  

[45] Xia X.X., Qian Z.G., Ki C.S., Park Y.H., Kaplan D.L., Lee S.Y.: Native-sized recombinant spider silk protein produced in metabolically engineered Escherichia coli results in a strong fiber. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010; 107: 14059-14063
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu