Streszczenie

Unikalne właściwości nici pajęczej, takie jak wytrzymałość, rozciągliwość, energia pękania (wiąz­kość), biokompatybilność oraz biodegradowalność spowodowały intensywny rozwój technologii biomateriałów opartych na białkach jedwabiu pajęczego. Postęp badań naukowych był hamowany przez długi czas brakiem metod pozyskiwania odpowiedniej ilości materiału. Przełomem techno­logicznym było opracowanie strategii biologii molekularnej, które doprowadziło do stworzenia warunków do produkcji inżynierowanych pajęczych białek jedwabiu (IPJ). Strategia ta polega na konstruowaniu sztucznych białek jedwabiu, których sekwencje oparte są na motywach konsensu­sowych białek naturalnych. Ponadto białka inżynierowane genetycznie, można skonstruować tak, aby nadać im „nowe” funkcje. Strategia białek hybrydowych zakłada, iż IPJ są rdzeniem, nośni­kiem, nadającym strukturę, do którego można dołączyć (na poziomie DNA) sekwencję nadającą funkcję np. rozpoznającą receptory komórkowe, enzymy, wiążącą metale, cukry i inne. Obecnie prowadzone są intensywne badania, które z jednej strony skupiają się na ustaleniu szczegółowej budowy i zrozumieniu procesu tworzenia się jedwabnej nici w naturze, a z drugiej strony próbu­je się udoskonalić metody produkcji IPJ. Dzięki zdobytej wiedzy i rozwojowi powyższej techno­logii inżynierowany jedwab stanie się „inteligentnym” biomateriałem przyszłości, a otrzymywa­ny na skalę przemysłową wywoła rewolucję biotechnologiczną.

Słowa kluczowe:jedwab pajęczy • inżynierowany jedwab pajęczy • białka hybrydowe • produkcja rekombinowanych białek • biomateriał

Summary

The unique properties of spider silk such as strength, extensibility, toughness, biocompatibility and biodegradability are the reasons for the recent development in silk biomaterial technology. For a long time scientific progress was impeded by limited access to spider silk. However, the de­velopment of the molecular biology strategy was a breaking point in synthetic spider silk protein design. The sequences of engineered spider silk are based on the consensus motives of the cor­responding natural equivalents. Moreover, the engineered silk proteins may be modified in order to gain a new function. The strategy of the hybrid proteins constructed on the DNA level combi­nes the sequence of engineered silk, which is responsible for the biomaterial structure, with the sequence of polypeptide which allows functionalization of the silk biomaterial. The functional domains may comprise receptor binding sites, enzymes, metal or sugar binding sites and others. Currently, advanced research is being conducted, which on the one hand focuses on establishing the particular silk structure and understanding the process of silk thread formation in nature. On the other hand, there are attempts to improve methods of engineered spider silk protein produc­tion. Due to acquired knowledge and recent progress in synthetic protein technology, the engine­ered silk will turn into intelligent biomaterial of the future, while its industrial production scale will trigger a biotechnological revolution.

Key words:spider silk • engineered spider silk • hybrid proteins • recombinant protein production • biomaterial

Wprowadzenie

Pająki pojawiły się na Ziemi około 400 milionów lat temu. Podczas długiej drogi ewolucji stały się producentami sub­stancji o unikalnych właściwościach: jedwabnej nici. Pająki potrafią wytwarzać nawet do siedmiu rodzajów jedwabiu różniących się właściwościami, takimi jak: wytrzymałość, rozciągliwość, czy wiązkość (energia pękania) [29,49]. Sieci pajęcze fascynują ludzkość. Potrafią one nie tylko za­trzymać owada w locie, ale są na tyle mocne by utrzymać ofiarę. Ocenia się, że pajęcza lina o grubości ołówka by­łaby w stanie zatrzymać lądujący odrzutowiec wojskowy [41]. Jedwab pajęczy jest wytrzymalszy od stali, a przy tym bardziej rozciągliwy niż nylon [67]. Ponadto jest oporny na rozdarcie, może pochłonąć ogromną ilość energii i nie pękać. Oprócz znakomitych parametrów mechanicznych, jedwab pajęczy ma także inne cenne zalety. Jego budul­cem jest białko rozpuszczalne w wodzie, jest wytwarzany w temperaturze otoczenia w roztworach wodnych. Ponadto produkt końcowy, który jest nierozpuszczalny w wodzie, z czasem ulega enzymatycznej biodegradacji.

Unikalne cechy sprawiają, że jedwab pajęczy jest obiektem zainteresowań wielu różnych dziedzin nauki. W przemyśle może posłużyć do produkcji nowych materiałów, które wy­trzymałością znacznie przewyższałyby syntetyczne mate­riały, takie jak nylon czy Kevlar. Białka jedwabiu pajęcze­go mogą być użyte do produkcji ultralekkiego i nadzwyczaj wytrzymałego włókna, które mogłoby być wykorzystane w produkcji spadochronów, kamizelek kuloodpornych, czę­ści samolotów, samochodów, tkanin czy produktów sporto­wych [78]. Duże możliwości jego zastosowania upatrywane są również w medycynie. Przykładem są bardzo wytrzyma­łe, nietoksyczne nici chirurgiczne, które nie zużywałyby się mimo częstego rozciągania, byłyby odporne na uderzenia i wysokie ciśnienie, a jednocześnie z czasem ulegałyby de­gradacji. Możliwe jest również wykorzystanie jedwabiu do produkcji rozciągliwych bandaży czy opatrunków na rany. Ponadto konstruować można implanty, sztuczne więzadła i ścięgna, trójwymiarowe rusztowania do wzrostu komó­rek biorących udział w odbudowie włókien nerwowych, ko­ści, chrząstek, mięśni czy skóry [78]. Możliwe jest to dzięki dużej biokompatybilności i długiemu czasowi biodegrada­cji jedwabiu. Struktury z jedwabiu zawierające białka lub specyficzne czynniki wzrostu komórek, mogą zachowywać się jak matrix zewnątrzkomórkowa i powodować wiązanie, rozprzestrzenianie, proliferację i różnicowanie się komórek. Niedawno opublikowane wyniki prac doświadczalnych wy­kazały wiązanie, rozprzestrzenianie się, proliferację osteobla­stów, komórek podścieliska szpikowego (bone-marrow stro­mal cells), komórek Schwanna czy fibroblastów [2,10,71,78]. Jako cząsteczki samoorganizujące się, łatwo funkcjonalizo­walne i ulegające biodegradacji, białka jedwabiu mogą słu­żyć jako nośnik substancji aktywnych. Obecnie prowadzo­ne są prace nad wykorzystaniem białek jedwabiu pajęczego do produkcji nano- i mikrokapsułek oraz nano- i mikrosfer. Struktury takie mogłyby zawierać nie tylko składniki farma­ceutyczne (leki), ale również kosmetyczne i żywnościowe.

Wymienione i inne potencjalne zastosowania jedwabiu pa­jęczego są obecnie przedmiotem intensywnych badań na­ukowych. Badania skupiają się nad poznaniem biologii pa­jąków, rozpracowaniem powstawania różnych jedwabnych struktur, np. pajęczyny, poznaniem nici ją budujących, bia­łek wchodzących w skład włókien, czy procesów zacho­dzących w gruczołach przędnych. Wiedza ta służy opraco­wywaniu sekwencji IPJ, a następnie metod ich produkcji i oczyszczania. Analiza procesu przechodzenia białek je­dwabiu z roztworu do fazy stałej zachodzącego w gruczole przędnym pająka przyczynia się do zrozumienia, a zatem kontroli procesów wytwarzania jedwabnych biomateria­łów. Naśladując naturę w warunkach sztucznych naukow­cy pracują nad kontrolowanym przejściem fazowym IPJ przy jednoczesnym nadawaniu pożądanego kształtu two­rzonego biomateriału. Wiadomości dotyczące jedwab­nych biomateriałów opisano w dwóch częściach. W pre­zentowanej pracy (część I) zebrano wiadomości dotyczące biologii wytwarzania pajęczych nici oraz opracowywania metod produkcji rekombinowanych IPJ. Natomiast zesta­wienie osiągnięć w dziedzinie wytwarzania jedwabnych biomateriałów przedstawiono w części drugiej.

Gruczoły przędne, jedwabne nici, ich funkcje i właściwości

Pająki wytwarzają kilka rodzajów jedwabnych nici, a każ­dy z nich jest wytwarzany w odrębnym gruczole przędnym [23,31]. Chociaż liczba i rodzaj gruczołów zależy od gatun­ku pająka, wszystkie pająki przędą przynajmniej jeden ro­dzaj nici. Pająki z rodziny krzyżakowatych wytwarzają 5-7 rodzajów jedwabnej przędzy. Gruczoły przędne znajdują się w brzusznej części odwłoka, a ich ujścia są umiejscowione na końcu odwłoka w tzw. kądziołkach przędnych, zwanych inaczej brodawkami przędnymi. Największym gruczołem przędnym jest gruczoł ampułkowaty większy (major ampul­late gland), który wytwarza jedwab wiodący (dragline silk). Służy on do budowy szkieletu pajęczyny i nici asekuracyj­nej, umożliwiającej pająkowi ucieczkę podczas ataku [49].

Gruczoły ampułkowate mniejsze (minor ampullate gland) odpowiadają z kolei za wytwarzanie jedwabiu pomocni­czego, który pająk wykorzystuje do budowy wewnętrznej spirali pajęczyny [79]. Nić ta jest pozbawiona kleistej wy­dzieliny i służy pająkowi jako rusztowanie podczas budowy właściwej, lepkiej spirali łownej. Rusztowanie to, po wypeł­nieniu swojej funkcji, jest zjadane przez „budowniczego”. Gruczoł koroniasty (flagelliform gland) wytwarza jedwab łowny tworzący spiralę łowną, pokrytą lepką wydzieliną gruczołu złożonego (aggregate gland), tzw. jedwab powło­kowy [27]. Łączenie poszczególnych elementów sieci łow­nej, a także przytwierdzanie sieci do podłoża odbywa się za pomocą jedwabiu spoinowego wytwarzanego w gruczołach gruszkowatych (pyriform gland). Gruczoły rurkowate (tubu­liform gland) oraz gronkowate (aciniform gland) służą do wytwarzania jedwabiu tworzącego kokony chroniące jaja: odpowiednio jedwab osłonowy i taśmowy. Jedwab osłono­wy tworzy zewnętrzną powłokę kokonu, a taśmowy wyście­la jego wnętrze. Jedwab taśmowy służy ponadto do owijania schwytanych ofiar [49]. Rodzaje gruczołów i wytwarzany przez nie jedwab przedstawiono na ryc. 1A oraz w tabeli 1.

Tabela 1. Rodzaje gruczołów przędnych, produkowanych jedwabi, ich naturalna funkcja oraz charakterystyka białek budujących dane włókna

Motywy aminokwasowe występujące w białkach pochodzących odpowiednio od: ^a – Nephila clavipes,
^b – Latrodectus hesperus, ^c – Argiope bruennichi, ^d – Argiope trifasciata, NZ – nie ma zastosowania. Dane opracowano na podstawie [31,57,66,79].

Ryc. 1. (A) Gruczoły przędne pająka, rodzaje i funkcje jedwabiu pajęczego; (B) Budowa gruczołu przędnego. Poszczególne części gruczołu pełnią określoną funkcję. Spidroiny wydzielane są w części cewkowatej gruczołu, a magazynowane są w worku gruczołowym. Formowanie włókien zaczyna się w chwili przejścia białka do przewodu, gdzie na skutek zmian fizyko-chemicznych następuje przejście fazowe ciecz/ciało stałe. Ostateczne dojrzewanie włókna odbywa się w chwili wyciągania nici przez ujście znajdujące się na kądziołku przędnym

Gruczoły przędne mają różną wielkość i kształt, jednak ich organizacja funkcjonalna opiera się na podobnym schemacie. Najlepiej poznanym gruczołem, ze względu na duży rozmiar jest gruczoł ampułkowaty większy (ryc. 1B). Możemy wyróż­nić cztery podstawowe elementy jego struktury anatomicznej: (i) część cewkowata gruczołu przędnego, w której odbywa się ekspresja i sekrecja białka, (ii) worek gruczołowy będą­cy miejscem przechowywania roztworu białka, (iii) przewód gruczołu przędnego, w którym dochodzi do przemian fizyko­-chemicznych roztworu białkowego oraz (iv) ujście przewo­du gruczołu przędnego, przez które włókno opuszcza orga­nizm pająka. Ujścia przybierają kształt rurek lub stożków [57].

Właściwości mechaniczne jedwabnych włókien

Poszczególne rodzaje jedwabiu różnią się właściwo­ściami mechanicznymi, co umożliwia wyróżnienie wśród nich jedwabiu bardzo wytrzymałego na zerwa­nie, bardzo rozciągliwego lub mającego znamiona obu tych cech w różnym nasileniu. Jedwab taśmowy ma naj­większą wiązkość (energia pękania) ze wszystkich je­dwabi oraz większości znanych materiałów (tabela 2). Jedwab wiodący cechuje się niezwykłą wytrzymało­ścią podobną do Kevlaru przy jednoczesnej znacznie większej rozciągliwości (odpowiednio, jedwab wiodą­cy 35%, Kevlar 5%) [68]. Wprawdzie przy pękaniu po­chłania ponad 10 000 razy mniej energii niż jedwab ta­śmowy, jego wiązkość (energia pękania) jest nadal 10 razy większa od Kevlaru i ponad 100-krotnie większa od wiązkości ludzkiego ścięgna. Jedwab pomocniczy jest również bardzo wytrzymały, ale wykazuje małą spręży­stość. Nieodwracalnie odkształca się w czasie rozcią­gania [15]. Jedwab łowny budujący spiralę łowną jest najbardziej sprężysty, powraca do swej pierwotnej dłu­gości nawet po trzykrotnym rozciągnięciu. Jest jednak tylko w połowie tak wytrzymały jak jedwab nici wio­dącej [27,68,79].

Tabela 2. Zestawienie właściwości mechanicznych wybranych jedwabi pajęczych i innych materiałów

Dane opracowane na podstawie [49]

Wytwarzanie jedwabiu pajęczego

Mechanizm wytwarzania jedwabiu pajęczego jest niezwy­kły. Pająk w wyniku ewolucji wytworzył maszynerię zdol­ną do wytwarzania różnych pod względem właściwości mechanicznych nici, które są zbudowane prawie wyłącz­nie z białek (tzw. spidroin). Proces ekspresji i przemian fizycznych białek pajęczych w bardzo krótkim czasie do­starcza odpowiedniej ilości budulca do wytworzenia nici pozwalającej pająkowi np. na ucieczkę. System replikacji i transkrypcji genów jest bardzo sprawny, mimo że geny kodujące spidroiny są bardzo duże, zawierają sekwencje po­wtarzające się i bogate w cytozyny i guaniny [6]. Nabłonek wnętrza gruczołu ma zdolność powielania całego genomu bez jednoczesnego podziału mitotycznego komórki [24]. Ponadto poszczególne geny mogą występować w wielu ko­piach [7,65]. Komórki nabłonkowe gruczołów zawierają bardzo dużą pulę t-RNA glicyny i alaniny ze względu na dominującą zawartość tych aminokwasów w spidroinach [12]. Spidroiny łatwo ulegają samoagregacji, ale mimo to pająkowi udaje się utrzymać je w postaci rozpuszczalnej wewnątrz gruczołu [30] zachowując bardzo duże stężenie białka osiągające 30-50% (w/v) [14]. Proces formowania włókien podlega ścisłej kontroli, umożliwiając niemal nie­przerwany proces przędzenia pajęczej nici [87].

Najlepiej poznano proces powstawania nici wiodącej zło­tego pająka jedwabnego. Ekspresja i wydzielanie białek budujących włókno odbywa się w części cewkowatej gru­czołu przędnego, w komórkach walcowatych nabłonka [9]. Spidroiny są wydzielane do worka gruczołowego, gdzie utrzymywane są w postaci roztworu o stężeniu 300-500 g/l. Na tym etapie łańcuchy polipeptydowe układają się w kształt kłębka statystycznego (random-coil) i struktury przypominające helisę poliprolinową typu II [48]. Worek gruczołowy pełni funkcję magazynu białka, a gdy pojawi się zapotrzebowanie na nową nić, część jego zawartości przesuwana jest do krętego przewodu gruczołu przędne­go. Podczas przepływu przez przewód roztwór białek pod wpływem sił fizycznych oraz przemian chemicznych zo­staje przekształcony w nierozpuszczalne w wodzie włókno o dominującej strukturze drugorzędowej typu pofałdowa­nej kartki β. Średnica przewodu sukcesywnie zmniej­sza się, osiągając minimum na końcu. Malejąca średnica przewodu powoduje, że zwiększa się przepływ wzdłuż­ny przy jednoczesnym zwiększeniu działania sił ścinają­cych. Ponadto, dochodzi do zmiany stężenia niektórych jonów, lekkiego zakwaszenia środowiska (8-6 pH) oraz zagęszczenia roztworu. Stężenie jonów Na⁺ w roztworze białka wpuszczanego do przewodu gruczołu wynosi 3,1 mg/g w przeliczeniu na suchą masę (s.m.), natomiast za­wartość tych jonów we włóknie opuszczającym przewód gruczołowy osiąga 0,3 mg/g. Stężenie jonów K⁺ wzrasta odpowiednio z 0,75 mg/g (s.m.) do 2,9 mg/g, a zawartość jonów fosforanowych wzrasta w przewodzie pięciokrot­nie [22]. Wzrost zawartości jonów potasowych i fosfora­nowych determinuje stan wysolenia, który sprzyja agre­gacji białek. Dalsze przemiany są związane z obniżeniem pH, co zwiększa udział oddziaływań hydrofobowych [17]. W ostatnim ramieniu przewodu przędnego następuje szyb­kie usunięcie wody za pośrednictwem konwekcji. Jest to możliwe dzięki komórkom nabłonkowym wyścielającym przewód, które poprzez mikrokosmki znacząco zwiększa­ją powierzchnię kontaktu nabłonka z roztworem białka.

Przemiany biochemiczne i fizyczne determinują przejście białek jedwabiu z fazy ciekłej do stałej, co prowadzi do utworzenia niedojrzałych włókien. Mechanizm przemia­ny fazowej nie jest do końca poznany. Obecnie uważa się, iż może on przebiegać dwojako. Jedna z teorii zakłada, że roztwór białka zachowuje się jak ciekły kryształ, co może wynikać z jego dużej koncentracji w przewodzie gruczołu przędnego i ruchu wszystkich cząsteczek w jednym kierun­ku [80]. Według drugiego modelu, białka w roztworze łą­czą się początkowo tworząc micele o średnicy 100-200 nm, które grupując się tworzą globule o wielkości kilku mikro­metrów. Przepływ wzdłużny i siły ścinające powodują wy­dłużanie się globuli, co ostatecznie prowadzi do formowa­nia włókien [40]. Niedojrzałe włókno wyciskane jest przez ujście zaopatrzone w zastawkę mięśniową. Zastawka ści­śle przylega do wychodzącego włókna, co umożliwia dal­sze usuwanie wody oraz regulację średnicy włókna w gra­nicach 0,1-0,8 µm [16,80]. Wychodzące nici dojrzewają poprzez ostateczne odparowanie wody na powietrzu oraz działanie sił, takich jak ciągnięcie i/lub naprężanie. Ma to bardzo duże znaczenie w kształtowaniu właściwości me­chanicznych włókien. Pająki regulują to zarówno w spo­sób bierny jak i czynny. Biernie wykorzystują swoją masę oraz siły grawitacji. Aktywnie używają tylnych odnóży do wyciągania nici regulując przy tym szybkość przędzenia. Najmocniejsze włókna wytwarzane są najwolniej. Innym aktywnym sposobem może być przędzenie mocnego je­dwabiu. Pająki stosując technikę pionowego schodzenia po powierzchni, używają sił tarcia w celu pozyskania siły ciągnącej, która jest dwa razy większa od tej uzyskiwanej dzięki swojej masie ciała [63]. Niezależnie od stosowa­nej techniki ciągnięcia/naprężania właściwości włókien są również zależne od czynników środowiskowych, takich jak: dieta, temperatura, wilgotność [29,51].

Spidroiny i ich struktura organizacyjna

W białkach budujących włókna (spidroinach) możemy wyróżnić trzy regiony: (i) niepowtarzająca się domena N-końcowa licząca około 130 aminokwasów, (ii) dominu­jący fragment zbudowany z motywów powtarzających się oraz (iii) niepowtarzający się koniec C zawierający około 110 aminokwasów [5,25]. Region najdłuższy zbudowany jest z wielu powtórzeń sekwencji peptydowych, które ukła­dają się w następujące grupy: (i) (GPGXX)_n, (GPGGX)_n, (ii) (GGX)_n, (iii) łańcuchy alaninowe A_n lub (GA)_n oraz (iv) unikalne sekwencje rozdzielające [68,74]. Sekwencja ami­nokwasowa jest najważniejsza w kształtowaniu struktury przestrzennej, a tym samym właściwości mechanicznych jedwabiu. Pierwsze dwie grupy sekwencji powtórzonych odpowiadają prawdopodobnie za rozciągliwość jedwabiu, przy czym różnią się przyjmowaną konformacją przestrzen­ną. Sekwencje (GPGXX)_n i (GPGGX)_n są zaangażowane w tworzenie struktury spirali β-zwrotnej. Występują głów­nie w białku Flag (flagelliform) budującym najbardziej roz­ciągliwy z jedwabi – jedwab łowny. Motywy te obecne są również w białkach tworzących rozciągliwy jedwab wio­dący od pająka jedwabnego Nephila clavipes, tj. w białku MaSp2 (major ampullate spidroins), czy w białkach nici wiodącej wytwarzanej przez pająka krzyżaka ogrodowego Araneus diadematus ADF-3 i ADF-4 (araneus diadema­tus fibroin). Jedwab wiodący nie jest tak rozciągliwy jak jedwab łowny (35% versus >200%), co koreluje z liczbą nieprzerwanych ciągów motywu GPGXX (odpowiednio najwyżej 9 razy powtórzony versus przynajmniej 43 razy) [68]. Bogata w glicynę sekwencja (GGX)_n tworząca po­trójną helisę prawdopodobnie warunkuje również rozcią­gliwość jedwabi. Jest ona charakterystyczna dla białek jedwabiu pomocniczego MiSp (minor ampullate spidro­ins), a także występuje w białkach MaSp1, ADF3 i Flag. Powtórzone motywy alaninowe i (GA)_n przyjmujące kon­formację β-kartki zapewniają wytrzymałość jedwabiu. Są one dominującymi sekwencjami w białkach bardzo wy­trzymałego jedwabiu wiodącego i pomocniczego [66,68]. Nie występują w białku Flag budującym najbardziej roz­ciągliwą nić łowną. Unikalne sekwencje rozdzielające dzie­lą motywy powtarzające się na skupiska, a ich wpływ na strukturę białek nie jest znany. Są one charakterystyczne dla białek MiSp1, MiSp2, czy Flag. Niedawno przepro­wadzone badania udowodniły, że domeny N- i C-końcowa odgrywają ważną rolę w procesie formowania się włó­kien. Zapobiegają niepożądanej agregacji białek w czasie magazynowania, a także promują odpowiednie grupowa­nie białek wzdłuż osi włókna w trakcie procesu powsta­wania jedwabnej nici [5,25]. Domena N-końcowa reaguje na zmiany odczynu. W pH panującym w worku gruczo­łowym (pH powyżej 7) domena ta hamuje agregację pro­mując postać rozpuszczalną białek jedwabiu. Natomiast w pH wynoszącym około 6,3 promuje grupowanie spidro­in i formowanie się włókien [5]. Domena znajdująca się na karboksylowym końcu białka również wpływa zarów­no na proces przechowywania jak i formowania nici [25]. Warunki panujące w worku gruczołu powodują, że dome­na C-końcowa stabilizuje rozpuszczalną postać spidroin. Podczas procesu wysalania białka jonami fosforanowymi domena C-końcowa działa wraz z umiejscowionym w jej obrębie mostkiem dwusiarczkowym jako kotwica odpo­wiedniego pozycjonowania sekwencji powtarzających się między cząsteczkami białka. Domena ta jest niewrażliwa na zmiany pH [25]. W trakcie przemieszczania się bia­łek jedwabiu wzdłuż przewodu gruczołowego następuje zmiana pH i kompozycji soli, co powoduje, że domeny N- i C-końcowe działają jak mediatory przemian prowadzących do zbliżania się spidroin. Następnie przepływ wzdłużny i siły ścinające indukują tworzenie struktur pofałdowanej kartki β, co ostatecznie skutkuje tworzeniem się włókien [66]. Zestawienie domen wraz z ich miejscami występo­wania przedstawiono w tabeli 1.

Biotechnologiczne strategie wytwarzania białek jedwabiu pajęczego

Próby uzyskania naturalnych nici jedwabnych od pająków na skalę przemysłową okazały się trudne do realizacji. W przeciwieństwie do jedwabników, pająków nie udaje się hodować, gdyż są kanibalami i pożerają się wzajemnie. Ponadto jednocześnie wytwarzają różne rodzaje jedwabiu [79]. Brak dostępności wystarczającej ilości tego materiału zmusił naukowców do podjęcia prób odtworzenia jedwab­nych włókien pajęczych. Badania skupiają się na pozna­niu szczegółów budowy i zrozumieniu procesu tworzenia się jedwabnej nici, w celu wytworzenia jej syntetyczne­go odpowiednika, a także próbuje się udoskonalać meto­dy produkcji i oczyszczania rekombinowanego jedwabiu pajęczego. Stosowane są dwie strategie wytwarzania re­kombinowanego jedwabiu (ryc. 2) [78]. Pierwsza wyko­rzystuje znane fragmenty cDNA kodujące naturalne biał­ka jedwabiu, druga stosuje techniki inżynierii genetycznej. Próbuje się tworzyć syntetyczne geny kodujące inżyniero­wany pajęczy jedwab (IPJ), których sekwencje są zbliżo­ne do sekwencji białek naturalnych [66].

Ryc. 2. Biotechnologiczne strategie wytwarzania białek jedwabiu pajęczego. Pierwsza strategia zakłada użycie fragmentów cDNA kodujących naturalne spidroiny. Strategia białek inżynierowanych wykorzystuje moduły DNA powstałe w oparciu o motywy powtarzające się spidroin. Zoptymalizowane do potencjalnego gospodarza pod względem preferencji kodonów moduły klonuje się w różnych kombinacjach, co prowadzi do powstania syntetycznych genów. Moduły DNA: Ala – kodujący polipeptyd alaninowy, GlyX – kodujący polipeptyd bogaty w glicynę, NR – kodujący niepowtarzającą się domenę N- lub C-końcową spidroin

Wytwarzanie naturalnych białek jedwabiu pajęczego

Do wytwarzania rekombinowanych białek pajęczych są wykorzystywane organizmy prokariotyczne i eukario­tyczne. Jako systemy ekspresyjne stosuje się bakterie (np. Escherichia coli) [3], drożdże (np. Pichia pastoris) [19], komórki owadzie i ssacze [35,46], a także transgeniczne rośliny [69,70,71] i zwierzęta [83]. Powyższe systemy róż­nią się wydajnością, złożonością procesu technologiczne­go, stopniem zanieczyszczenia oraz kosztami. Wiele bia­łek eukariotycznych wymaga modyfikacji potranslacyjnych (glikozylacja, fosforylacja), zapewniających prawidłowe fałdowanie i aktywność biologiczną [44]. Może mieć to znaczenie w procesie wytwarzania białek jedwabiu, gdyż w spidroinach obserwuje się fosforylację reszt tyrozyny i seryny. Wpływ tych modyfikacji na fizyczne właściwo­ści jedwabiu pajęczego pozostaje jednak niewyjaśniony [55]. Sekwencja nukleotydowa spidroin, ze względu na długość, wielokrotne powtórzenia oraz obecność licznych reszt guaniny i cytozyny, do niedawna była poznana jedy­nie częściowo. W ostatnim czasie udało się całkowicie zse­kwencjonować pierwsze geny kodujące spidroiny. Poznano pełną sekwencję DNA białek MaSp1 i MaSp2 pająka czar­na wdowa (Latrodectus hesperus) oraz białka Flag złote­go pająka jedwabnego (Nephila clavipes) [6,26]. Poznane częściowo sekwencje spidroin próbowano wykorzystać do produkcji rekombinowanych białek jedwabiu. Napotkano jednak wiele trudności wynikających z wielkości genów kodujących te białka (do 15000 kpz) oraz powtarzalnych sekwencji. Ponadto, ekspresji rekombinowanych białek je­dwabiu towarzyszyła genetyczna niestabilność insertów, bę­dąca wynikiem rekombinacji homologicznej [3,19,20,64]. Możliwe także, że cięcie insertów oraz niski poziom eks­presji wynikały z ograniczonej liczby niektórych tRNA. Komórki wytwarzające spidroiny u pająków, w przeciwień­stwie do komórek pochodzących z innych źródeł, mają wy­specjalizowaną pulę tRNA, które biorą udział w translacji sekwencji bogatych w Ala i Gly [12]. Niska ekspresja biał­ka może również wynikać z tego, że sekwencja mRNA spi­droin wykazuje tendencję do tworzenia wyższych struktur drugorzędowych, co prawdopodobnie powoduje przerwy w translacji oraz odłączenie od rybosomów [20]. Istotnym problemem jest również tworzenie zagregowanych, nieroz­puszczalnych białek oraz trudności uzyskania białek se­krecyjnych. Prowadzi to w trakcie procesu oczyszczania do utraty istotnej ilości wytworzonego białka oraz wyma­ga stosowania czynników denaturujących. Konieczna jest więc optymalizacja warunków produkcji (np. dostosowa­nie kodonów [20], modyfikacja składu pożywki [72]) oraz zastosowanie różnych systemów ekspresyjnych.

Pierwsze próby ekspresji naturalnych spidroin złotego pa­jąka jedwabnego Nephila clavipes przeprowadzono w sys­temie Escherichia coli. Wykorzystano 1500 oligonukle­otydowy fragment sekwencji cDNA C-końca białka MaSp [3]. Proces był mało wydajny prawdopodobnie dlatego, że Escherichia coli nie rozpoznaje efektywnie kodonów se­kwencji jedwabiu pajęczego. Zaobserwowano brak cią­głości translacji i związane z tym produkty o mniejszej masie cząsteczkowej. Inne próby prowadzono w bakulo­wirusowym systemie ekspresyjnym, który ze względu na filogenetyczne pokrewieństwo owadów i pająków, wyda­wał się najbardziej odpowiedni [35,54]. Podczas wytwa­rzania cytoplazmatycznego, fragment C-końcowy białka ADF-3 pozostawał w postaci rozpuszczalnej, natomiast region C-końca białka ADF-4 przybierał postać włókien [35]. Przypuszczalnie potranslacyjne modyfikacje zacho­dzące w warunkach naturalnych w gruczołach pajęczych zwiększają rozpuszczalność tych białek. W związku z tym, że modyfikacje dotyczą głównie białek sekrecyjnych, biał­ko ADF-4 zmodyfikowano tak, aby mogło być wydzie­lane z komórki. W tym celu do sekwencji cDNA białka ADF-4 dołączono sekwencję sygnałową genu melityny pszczoły miodnej. Wydzielane białka wykazywały lep­szą rozpuszczalność, jednak analiza roli potranslacyjnych modyfikacji wymaga dalszych badań [78]. Najbardziej zaawansowana technologia produkcji białek wykorzystu­je komórki ssaków. Udane próby ekspresji fragmentów cDNA kodujących białka MaSp pająków Nephila clavipes i Araneus diadematus uzyskano w komórkach nabłonko­wych bydlęcych gruczołów piersiowych (MAC-T) oraz komórkach nerkowych chomika (BHK) [46]. Inna strate­gia obejmuje ekspresję fragmentów spidroin w roślinach czy zwierzętach transgenicznych. Białka jedwabiu o cięża­rze cząsteczkowym do 100 kDa otrzymano w transgenicz­nym tytoniu i ziemniaku [53,70]. Kanadyjscy naukowcy wyprodukowali spidroiny wydzielane do mleka kóz trans­genicznych. Wadą tej metody było jednak niewielkie stę­żenie białek jedwabiu w mleku [83]. Najnowsze donie­sienia opisują ekspresję fragmentu białka MaSp1 pająka Nephila clavipes w kokonach transgenicznych jedwabni­ków morwowych (Bombyx mori) [81]. 1500 nukleotydo­wy fragment genu MaSp1 będący pod kontrolą promotora genu serycyny (Ser1) jedwabnika morwowego wbudowa­no do genomu B. mori przez zastosowanie systemu pig­gyBac. Otrzymany rekombinowany jedwab odznaczał się niewiele lepszą wytrzymałością i rozciągliwością niż je­dwab naturalny.

Wytwarzanie inżynierowanych pajęczych jedwabi (IPJ)

Ze względu na ograniczenia związane z użyciem natu­ralnych sekwencji cDNA spidroin (wydajność a koszty) do pozyskiwania rekombinowanych białek jedwabiu bar­dziej obiecujące jest stosowanie strategii wykorzystującej syntetyczne geny [42,68]. Technologia ta polega na synte­zie krótkiej nici DNA kodującej sekwencję konsensusową danej spidroiny (tzw. moduł DNA) (ryc. 2). Konstrukcja modułów DNA zakłada optymalizację kodonów do da­nego systemu ekspresyjnego. Na końcach 3′ i 5′ znajdu­ją się odcinki DNA pozwalające na kontrolowaną ligację. Są one rozpoznawane przez dwa różne enzymy restryk­cyjne, generujące komplementarne do siebie lepkie koń­ce. Sekwencja DNA jest podwajana w procesie ligacji, a prawidłowa orientacja insertu jest weryfikowana w wy­niku analizy restrykcyjnej. W pozycji połączenia sekwen­cji, miejsce restrykcyjne nie jest odtwarzane. W ten sposób można łączyć dowolną liczbę powtarzających się moty­wów. Znane są przykłady 4-96 powtórzeń inżynierowa­nych białek pajęczych opartych głównie na sekwencjach konsensusowych białek MaSp1, MaSp2 i Flag pochodzą­cych od złotego pająka jedwabnego oraz pająka krzyżaka ogrodowego (tabela 3).

Tabela 3. Produkcja rekombinowanych inżynierowanych i naturalnych fragmentów białek jedwabiu pajęczego w różnych systemach ekspresyjnych

No – nieokreślono. Dane uzupełnione na podstawie referencji [29,66,78].

Wielkość cząsteczkowa uzyskiwanych analogów IPJ opartych na sekwencji MaSp złotego pająka je­dwabnego była heterogenna i wynosiła 12-285 kDa [20,21,34,50,64,77,84,88]. Za pośrednictwem multimery­zacji otrzymano warianty genów różniące się liczbą powtó­rzeń modułów, a tym samym wielkością białka. Przykładem modułu opartego na białku MaSp1 jest polipeptyd GRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQGTS [10]. Użycie bioreaktora zwiększa wydajność produkcji inżynierowanych IPJ. Niestety w wyniku niespecyficznych oddziaływań i precypitacji białka, obserwowano duże stra­ty w trakcie procesu oczyszczania. Zastosowanie bioreak­tora pozwoliło uzyskać 1500 mg 15-meru powyższego po­lipeptydu z jednego litra hodowli. Po procesie oczyszczania jego ilość została oceniona tylko na 2,5 mg/l [10]. Proces oczyszczania rekombinowanych IPJ istotnie wpływa na ostateczną ilość pozyskanego białka. Zastosowanie kwa­su organicznego do lizy komórek bakteryjnych pozwala na uzyskanie 4-5-krotnie większej ilości białka niż użycie bu­foru zawierającego 8M mocznik [52]. Użycie kwasu orga­nicznego zwiększyło rozpuszczalność jedwabiu, przy jed­noczesnej denaturacji białek bakteryjnych, co pozwoliło na odzyskanie większej ilości oczyszczonego IPJ (pochodnego MaSp1 od Nephila clavipes) [52]. W mikrobiologicznych systemach ekspresyjnych wydajność otrzymywania oczysz­czonego IPJ wynosi 2-40 mg na litr pożywki [3,21,64,84]. Ponadto zaobserwowano spadek wydajności produkcji IPJ w miarę wzrostu wielkości insertu wprowadzanego do wek­tora ekspresyjnego [64,84,85]. Problemy związane z pro­dukcją rekombinowanych IPJ w systemie bakteryjnym, wynikające głównie z dużej zawartości glicyny (43-45%), można zminimalizować poprzez modyfikację samych bak­terii ekspresyjnych. Przykładem jest wprowadzenie zmian w szlaku metabolicznym glicylo-tRNA Escherichia coli [88]. Glicylo-tRNA jest syntetyzowany poprzez przyłącze­nie glicyny do odpowiedniej cząsteczki tRNA (tRNA^Gly) w obecności syntetazy glicylo-tRNA. Nadekspresja odpo­wiednich tRNA^Gly (rozpoznających GGC i GGU) pozwoli­ła na zwiększenie puli glicylo-tRNA, co z kolei zapewni­ło bardziej wydajne wytwarzanie większych fragmentów białka. Dalsze podwyższenie wydajności uzyskano dzię­ki wprowadzeniu genu odpowiedzialnego za syntezę gli­cyny (glyA). W oparciu o tę strategię wyprodukowano in­żynierowane białka MaSp1, uzyskując produkty o różnej liczbie powtórzeń monomerów (32-96). Masa cząstecz­kowa otrzymanych białek wynosiła odpowiednio 100,7-284,9 kDa. Największe uzyskane IPJ osiągnęło wielkość podobną do spidroin naturalnych (250-320 kDa) wytwa­rzanych w gruczołach pajęczych [88].

Kolejnymi białkami, które wyprodukowano stosując powyż­szą technologię były białka oparte na sekwencjach ADF-3 i ADF-4 [34]. Skonstruowano dwa syntetyczne modu­ły naśladujące powtarzalną sekwencję ADF-3: (i) poli(A) przypominający bogatą w alaninę pajęczą sekwencję kon­sensusową oraz (ii) poli(Q) o dużej zawartości glutami­ny. Analogicznie zaprojektowano pojedynczy motyw dla konsensusowej, powtarzającej się sekwencji białka ADF-4 (moduł C). Ponadto utworzono białka hybrydowe polega­jące na połączeniu inżynierowanego cDNA z naturalną se­kwencją pajęczą kodującą niepowtarzający się region koń­ca 3′ genu ADF-3 (NR3) [34]. Sekwencję regionu NR3 zamplifikowano z użyciem reakcji PCR. Kodony sekwen­cji NR3 utrudniające ekspresję białka w systemie bakte­ryjnym zostały wymienione za pośrednictwem ukierunko­wanej mutagenezy. Produkt reakcji PCR (NR3) następnie połączono z syntetyczną, powtarzającą się sekwencją ADF-3. Podobnie skonstruowano powtarzającą się sekwencję białka ADF-4 zawierającą wielokrotnie powtórzony mo­tyw konsensusowy (moduł C) oraz sekwencję kodującą re­gion NR końca 3′ genu ADF4 (NR4). Inżynierowane biał­ka (AQ)₁₂, (AQ)₁₂NR3, (QAQ)₈, (QAQ)₈NR3, C₁₆, C₁₆NR4 wyprodukowano w systemie Escherichia coli z porówny­walną wydajnością (10-30 mg/l pożywki hodowlanej). Zastosowanie bioreaktora pozwoliło na uzyskanie dużej wydajności rzędu 140-360 mg oczyszczonego białka na litr pożywki hodowlanej [34]. Białka oczyszczono stosu­jąc bardzo prostą, dwustopniową metodę. Lizat bakteryjny poddawano termicznej denaturacji (70-80°C), co powodo­wało denaturację białek bakteryjnych. IPJ następnie wytrą­cano siarczanem amonu (20-30%) [34]. Metoda ta, prosta, szybka, tania, niewymagająca technik chromatograficznych stwarza realne możliwości wykorzystania jedwabiu paję­czego w przemyśle.

Oprócz bakteryjnych systemów nadekspresji stosowano tak­że drożdżowy system produkcji Pichia pastoris. IPJ uzy­skiwano w ilościach zadowalających (do 1000 mg/l), jed­nak występowały problemy z procesem jego oczyszczania z powodu tworzących się agregatów [19]. Ponadto prze­prowadzono pierwsze próby produkcji rekombinowanych IPJ w transgenicznych roślinach, takich jak tytoń [8,53,70], ziemniak [70,71] czy rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana) [8,69,90]. IPJ były kierowane do różnych orga­nów roślinnych w celu osiągnięcia możliwie najwyższej wydajności. W liściach tytoniu i ziemniaka produkowano wariant naśladujący białko MaSp1 od Nephila clavipes. W przypadku liści tytoniu uzyskano wydajność na pozio­mie 2% całkowitego rozpuszczalnego białka [70]. Przy produkcji w rzodkiewniku pospolitym kierowanie do apo­plastów liści pozwoliło uzyskać akumulację rzędu 8,5% (w/w), natomiast do retikulum endoplazmatycznego na­sion – 18% białka całkowitego [90]. Produkcja IPJ w sys­temach roślinnych wydaje się obiecującą alternatywą, jed­nak zwiększenie efektywności produkcji wymaga dalszych badań. Próbuje się również uzyskać wysokocząsteczkowy inżynierowany jedwab pajęczy wykorzystując zwierzęta transgeniczne np. myszy [89]. Wydajność produkcji jest jednak niska, a koszt bardzo wysoki.

Produkcja naturalnych i inżynierowanych białek jedwa­biu pajęczego w różnych systemach ekspresyjnych zosta­ła przedstawiona w tabeli 3.

Funkcjonalizacja IPJ

Istotną zaletą IPJ jest możliwość tworzenia różnych ich wa­riantów o określonych właściwościach fizycznych i funk­cjonalnych. Funkcjonalizację inżynierowanych genetycznie białek jedwabiu można modulować na etapie konstruowa­nia modułów DNA. Strategia ta polega na przyłączaniu do sekwencji konsensusowych multimeru jedwabiu synte­tycznych oligonukleotydów kodujących domeny funkcyj­ne. Sekwencje „obce” mogą nadawać nową cechę powsta­łej chimerze. Mogą to być miejsca chemicznie reaktywne, pozwalające na późniejszą (po utworzeniu odpowiedniej struktury) „dekorację” biotworzywa, czy też sekwencje peptydowe rozpoznające/wiążące metale, enzymy, recep­tory komórkowe, itp. Przykład mechanizmu modyfikowa­nia rekombinowanych IPJ przedstawia ryc. 3.

Ryc. 3. Białka hybrydowe – przykład funkcjonalizacji inżynierowaych białek jedwabiu pajęczego. Moduły DNA kodujące polipeptydy spełniające określone funkcje są przyłączane za pomocą klonowania do modułów DNA kodujących inżynierowane białka jedwabiu pajęczego. Pajęcze domeny nadają strukturę, np. włókna, film, hydrożel, rusztowania, mikrokapsułki, mikro-, nanosfery

Znane są przykłady wprowadzania pojedynczych amino­kwasów np. cysteiny, metioniny [75,77], czy też wprowa­dzanie sekwencji polipeptydowych. Pojedyncze amino­kwasy wprowadzają grupę funkcyjną wykorzystywaną do przyłączania aktywnych cząstek, np. barwników, czy też pozwalają na kontrolę struktury jedwabiu [75]. Najczęściej wykorzystywanym motywem polipeptydowym nadającym funkcję jest peptyd RGD [10,58,59]. Domena RGD będą­ca składową fibronektyny odpowiada za wiązanie do re­ceptorów znajdujących się na powierzchni błony komór­kowej [43]. Jest ona wykorzystywana w celu zwiększenia adhezji komórek do biotworzywa. Inny przykład, to nowy system dostarczania genów, który opiera się na fuzji po­limerów opartych na IPJ z kationowymi modułami poli­(L-lizyny) [60,61]. Polipeptydy kationowe mają zdolność interakcji z DNA poprzez elektrostatyczne oddziaływa­nia, mogą więc być wykorzystane do transfekcji komó­rek. Ponadto dołączenie domeny RGD do domen poli(L­-lizyny) warunkuje wydajność procesu [59]. Najnowsze doniesienia opisują fuzję IPJ z krótkimi peptydami prze­nikającymi i destabilizującymi błonę komórkową (CPPs) [60]. Ich przyłączenie wraz z zastosowaniem domen poli­(L-lizyn) wzmaga również transfer genów. Inne przykłady to funkcjonalizacja dla potrzeb medycyny regeneracyjnej. Przykładem jest przyłączenie do inżynierowanej sekwencji MaSp1 fragmentu białka elastyny (ELP) [71]. Modyfikacja IPJ poprzez wprowadzenie domen selektywnie oddziału­jących z komponentami nieorganicznymi generuje nowa­torskie organiczno-nieorganiczne kompozytowe systemy materiałowe [32,56,86]. W przypadku dołączenia pepty­du R5 pochodzącego od białka silafiny na powierzchni je­dwabnego biopolimeru odkłada się krzemionka. Inżynieria genetyczna posłużyła także do skonstruowania hybrydo­wych białek jedwabiu pajęczego z fragmentem białka ma­cierzy dentyny 1 (DMP1) [32]. Domena białkowa będąca składową macierzy dentyny zapewniała IPJ zdolność wią­zania i gromadzenia cząsteczek hydroksyapatytu wapnia (HA). Kompozytowe materiały mogą być wykorzystywa­ne w medycynie regeneracyjnej kości.

Podsumowanie

Nadzwyczajne właściwości nici pajęczych, takie jak wy­trzymałość, rozciągliwość, odporność na pękanie, a przy tym biokompatybilność i biodegradowalność inspirują na­ukowców do poszukiwania rozwiązań produkcji białek je­dwabiu i wytwarzania z nich biomateriałów. W ostatnich dwudziestu latach obserwujemy olbrzymi postęp w po­znaniu biologii jedwabnych nici, począwszy od genety­ki, poprzez biochemię, a skończywszy na badaniach bio­fizycznych. Wiedza ta zaowocowała rozwojem technologii inżynierowanych pajęczych jedwabi (IPJ), czego konty­nuacją jest idea białek hybrydowych (struktura plus funk­cja). Celem są białka hybrydowe, dzięki którym jedwab pajęczy będzie inteligentnym biomateriałem przyszło­ści. Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie optymalizacji me­tod produkcji i oczyszczania spidroin przełamują barierę dostępności materiału, co pozwala na rozwijanie techno­logii pozyskiwania różnych postaci morfologicznych bio­materiałów. Biokompatybilne i biodegradowalne filmy, hydrożele, włókna, zręby, mikrokapsułki, mikro- i nanos­fery, kompleksy jedwab/DNA mogą mieć duże zastosowa­nie nie tylko w medycynie. Sposoby wytwarzania jedwab­nych biomateriałów oraz potencjalnego ich wykorzystania przedstawiono w części drugiej pracy przeglądowej doty­czącej inżynierowanego jedwabiu pajęczego.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Pawłowi Szymkowiakowi i prof. dr hab. Jackowi Dabertowi za pomoc w trakcie powstawa­nia manuskryptu.

PIŚMIENNICTWO

[1] Agapov I.I., Pustovalova O.L., Moisenovich M.M., Bogush V.G., Sokolova O.S., Sevastyanov V.I., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P.: Three-dimensional scaffold made from recombinant spider Silk protein for tissue engineering. Dokl. Biochem. Biophys., 2009; 426: 127-130
[PubMed]  

[2] Allmeling C., Jokuszies A., Reimers K., Kall S., Vogt P.M.: Use of spider silk fibres as an innovative material in a biocompatible artificial nerve conduit. J. Cell Mol. Med., 2006; 10: 770-777
[PubMed]  

[3] Arcidiacono S., Mello C., Kaplan D., Cheley S., Bayley H.: Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1998; 49: 31-38
[PubMed]  

[4] Arcidiacono S., Mello C.M., Butler M., Welsh E., Soares J.W., Allen A., Ziegler D., Laue T., Chase S.: Aqueous processing and fiber spinning of recombinant spider silk. Macromolecules, 2002; 35: 1262-1266

[5] Askarieh G., Hedhammar M., Nordling K., Saenz A., Casals C., Rising A., Johansson J., Knight S.D.: Self-assembly of spider silk proteins is controlled by a pH-sensitive relay. Nature, 2010; 465: 236-238
[PubMed]  

[6] Ayoub N.A., Garb J.E., Tinghitella R.M., Collin M.A., Hayashi C.Y.: Blueprint for a high-performance biomaterial: full-length spider dragline silk genes. PLoS One, 2007; 2: e514
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[7] Ayoub N.A., Hayashi C.Y.: Multiple recombining loci encode MaSp1, the primary constituent of dragline silk, in widow spiders (Latrodectus: Theridiidae). Mol. Biol. Evol., 2008; 25: 277-286
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[8] Barr L.A., Fahnestock S.R., Yang J.: Production and purification of recombinant DP1B silk-like protein in plants. Mol. Breeding, 2004; 13: 345-356

[9] Bell A.L., Peakall D.B.: Changes in fine structure during silk protein production in the ampullate gland of the spider Araneus sericatus. J. Cell Biol., 1969; 42: 284-295
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[10] Bini E., Foo C.W., Huang J., Karageorgiou V., Kitchel B., Kaplan D.L.: RGD-functionalized bioengineered spider dragline silk biomaterial. Biomacromolecules, 2006; 7: 3139-3145
[PubMed]  

[11] Bogush V.G., Sokolova O.S., Davydova L.I., Klinov D.V., Sidoruk K.V., Esipova N.G., Neretina T.V., Orchanskyi I.A., Makeev V.Y., Tumanyan V.G., Shaitan K.V., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P.: A novel model system for design of biomaterials based on recombinant analogs of spider silk proteins. J. Neuroimmune Pharmacol., 2009; 4: 17-27
[PubMed]  

[12] Candelas G.C., Arroyo G., Carrasco C., Dompenciel R.: Spider silkglands contain a tissue-specific alanine tRNA that accumulates in vitro in response to the stimulus for silk protein synthesis. Dev. Biol., 1990; 140: 215-220
[PubMed]  

[13] Cappello J., Crissman J., Dorman M., Mikolajczak M., Textor G., Marquet M., Ferrari F.: Genetic engineering of structural protein polymers. Biotechnol. Prog., 1990; 6: 198-202
[PubMed]  

[14] Chen X., Knight D.P., Vollrath F.: Rheological characterization of nephila spidroin solution. Biomacromolecules, 2002; 3: 644-648
[PubMed]  

[15] Colgin M.A., Lewis R.V.: Spider minor ampullate silk proteins contain new repetitive sequences and highly conserved non-silk-like „spacer regions”. Protein Sci., 1998; 7: 667-672
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[16] Colgin M.A., Lewis R.V.: Spider silk: A biomaterial for the future. Chem. Industry, 1995; 24: 1009-1012

[17] Dicko C., Kenney J.M., Vollrath F.: β-silks: enhancing and controlling aggregation. Adv. Protein Chem., 2006; 73: 17-53
[PubMed]  

[18] Eisoldt L., Hardy J.G., Heim M., Scheibel T.R.: The role of salt and shear on the storage and assembly of spider silk proteins. J. Struct. Biol., 2010; 170: 413-419
[PubMed]  

[19] Fahnestock S.R., Bedzyk L.A.: Production of synthetic spider dragline silk protein in Pichia pastoris. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997; 47: 33-39
[PubMed]  

[20] Fahnestock S.R., Irwin S.L.: Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997; 47: 23-32
[PubMed]  

[21] Fukushima Y.: Genetically engineered syntheses of tandem repetitive polypeptides consisting of glycine-rich sequence of spider dragline silk. Biopolymers, 1998; 45: 269-279
[PubMed]  

[22] Gaines W.A., Sehorn M.G., Marcotte W.R.Jr: Spidroin N-terminal domain promotes a pH-dependent association of silk proteins during self-assembly. J. Biol. Chem., 2010; 285: 40745-40753
[PubMed]  

[23] Gosline J.M., Demont E.M., Denny M.W.: The structure and properties of spider silk. Endeavor, 1986; 10: 37-43

[24] Gregory T.R., Shorthouse D.P.: Genome sizes of spiders. J. Hered., 2003; 94: 285-290
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[25] Hagn F., Eisoldt L., Hardy J.G., Vendrely C., Coles M., Scheibel T., Kessler H.: A conserved spider silk domain acts as a molecular switch that controls fibre assembly. Nature, 2010; 465: 239-242
[PubMed]  

[26] Hayashi C.Y., Lewis R.V.: Molecular architecture and evolution of a modular spider silk protein gene. Science, 2000; 287: 1477-1479
[PubMed]  

[27] Hayashi C.Y., Lewis R.V.: Spider flagelliform silk: lessons in the protein design, gene structure, and molecular evolution. BioEssays, 2001; 23: 750-756

[28] Heim M., Ackerschott C.B., Scheibel T.: Characterization of reombinantly produced spider flagelliform silk domains. J. Struct. Biol., 2010; 170: 420-425
[PubMed]  

[29] Heim M., Keerl D., Scheibel T.: Spider silk: from soluble protein to extraordinary fiber. Angew Chem. Int. Ed. Engl., 2009; 48: 3584-3596
[PubMed]  

[30] Hijirida D.H., Do K.G., Michal C., Wong S., Zax D., Jelinski L.W.: 13C NMR of Nephila clavipes major ampullate silk gland. Biophys. J., 1996; 71: 3442-3447
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[31] Hu X., Vasanthavada K., Kohler K., McNary S., Moore A.M., Vierra C.A.: Molecular mechanisms of spider silk. Cell Mol. Life Sci., 2006; 63: 1986-1999
[PubMed]  

[32] Huang J., Wong C., George A., Kaplan D.L.: The effect of genetically engineered spider silk-dentin matrix protein 1 chimeric protein on hydroxyapatite nucleation. Biomaterials, 2007; 28: 2358-2367
[PubMed]  

[33] Huang W., Lin Z., Sin Y.M., Li D., Gong Z., Yang D.: Characterization and expression of a cDNA encoding a tubuliform silk protein of the golden web spider Nephila antipodiana. Biochimie, 2006; 88: 849-858
[PubMed]  

[34] Huemmerich D., Helsen C.W., Quedzuweit S., Oschmann J., Rudolph R., Scheibel T.: Primary structure elements of spider dragline silks and their contribution to protein solubility. Biochemistry, 2004; 43: 13604-13612
[PubMed]  

[35] Huemmerich D., Scheibel T., Vollrath F., Cohen S., Gat U., Ittah S.: Novel assembly properties of recombinant spider dragline silk proteins. Curr. Biol., 2004; 14: 2070-2074
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[36] Huemmerich D., Slotta U., Scheibel T.: Processing and modification of films made from recombinant spider silk proteins. Applied Physics A: Materials Sci. Proces., 2006; 82: 219-222

[37] Ittah S., Barak N., Gat U.: A proposed model for dragline spider silk self-assembly: insights from the effect of the repetitive domain size on fiber properties. Biopolymers, 2010; 93: 458-468
[PubMed]  

[38] Ittah S., Cohen S., Garty S., Cohn D., Gat U.: An essential role for the C-terminal domain of a dragline spider silk protein in directing fiber formation. Biomacromolecules, 2006; 7: 1790-1795
[PubMed]  

[39] Ittah S., Michaeli A., Goldblum A., Gat U.: A model for the structure of the C-terminal domain of dragline spider silk and the role of its conserved cysteine. Biomacromolecules, 2007; 8: 2768-2773
[PubMed]  

[40] Jin H.J., Kaplan D.L.: Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature, 2003; 424: 1057-1061
[PubMed]  

[41] Klauza I.: Pajęczy jedwab. 2007 http://www.biotechnolog.pl

[42] Kluge J.A., Rabotyagova O., Leisk G.G., Kaplan D.L.: Spider silks and their applications. Trends Biotechnol., 2008; 26: 244-251
[PubMed]  

[43] Krzyzanowska-Golab D., Lemanska-Perek A., Katnik-Prastowska I.: Fibronektyna jako aktywny składnik macierzy pozakomórkowej. Postępy Hig. Med. Dośw., 2007; 61: 655-663
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[44] Kukuruzinska M.A., Lennon K.: Protein N-glycosylation: molecular genetics and functional significance. Crit. Rev. Oral Biol. Med., 1998; 9: 415-448
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[45] Lammel A., Schwab M., Slotta U., Winter G., Scheibel T.: Processing conditions for the formation of spider silk microspheres. ChemSusChem., 2008; 1: 413-416
[PubMed]  

[46] Lazaris A., Arcidiacono S., Huang Y., Zhou J.F., Duguay F., Chretien N., Welsh E.A., Soares J.W., Karatzas C.N.: Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science, 2002; 295: 472-476
[PubMed]  

[47] Lee K.S., Kim B.Y., je Y.H., Woo S.D., Sohn H.D., Jin B.R.: Molecular cloning and expression of the c-terminus of spider flagelliform silk protein from Araneus ventricosus. J. Biosci., 2007; 32: 705-712
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[48] Lefevre T., Leclerc J., Rioux-Dube J.F., Buffeteau T., Paquin M.C., Rousseau M.E., Cloutier I., Auger M., Gagne S.M., Boudreault S., Cloutier C., Pezolet M.: Conformation of spider silk proteins in situ in the intact major ampullate gland and in solution. Biomacromolecules, 2007; 8: 2342-2344
[PubMed]  

[49] Lewis R.V.: Spider silk: ancient ideas for new biomaterials. Chem. Rev., 2006; 106: 3762-3774
[PubMed]  

[50] Lewis R.V., Hinman M., Kothakota S., Fournier M.J.: Expression and purification of a spider silk protein: a new strategy for producing repetitive proteins. Protein Expr. Purif, 1996; 7: 400-406
[PubMed]  

[51] Madsen B., Shao Z.Z., Vollrath F.: Variability in the mechanical properties of spider silks on three levels: intrerspecific, intraspecific and intraindividual. Int. J. Biol. Macromol., 1999; 24: 301-306
[PubMed]  

[52] Mello C.M., Soares J.W., Arcidiacono S., Butler M.M.: Acid extraction and purification of recombinant spider silk proteins. Biomacromolecules, 2004; 5: 1849-1852
[PubMed]  

[53] Menassa R., Zhu H., Karatzas C.N., Lazaris A., Richman A., Brandle J.: Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant. Biotechnol. J., 2004; 2: 431-438
[PubMed]  

[54] Miao Y., Zhang Y., Nakagaki K., Zhao T., Zhao A., Meng Y., Nakagaki M., Park E.Y., Maenaka K.: Expression of spider flagelliform silk protein in Bombyx mori cell line by a novel Bac-to-Bac/BmNPV baculovirus expression system. Appl. Microbiol Biotechnol., 2006; 71: 192-199
[PubMed]  

[55] Michal C.A., Simmons A.H., Chew B.G., Zax D.B., Jelinski L.W.: Presence of phosphorus in Nephila clavipes dragline silk. Biophys. J., 1996; 70: 489-493
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[56] Mieszawska A.J., Nadkarni L.D., Perry C.C., Kaplan D.L.: Nanoscale control of silica particle formation via silk-silica fusion proteins for bone regeneration. Chem. Mater., 2010; 22: 5780-5785
[PubMed]  

[57] Mikulska I.: Pająk. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa 1953; 53-54

[58] Morgan A.W., Roskov K.E., Lin-Gibson S., Kaplan D.L., Becker M.L., Simon C.G.Jr: Characterization and optimization of RGD-containing silk blends to support osteoblastic differentiation. Biomaterials, 2008; 29: 2556-2563
[PubMed]  

[59] Numata K., Hamasaki J., Subramanian B., Kaplan D.L.: Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control Release, 2010; 146: 136-143
[PubMed]  

[60] Numata K., Kaplan D.L.: Silk-Based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules, 2010; 11: 3189-3195
[PubMed]  

[61] Numata K., Subramanian B., Currie H.A., Kaplan D.L.: Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials, 2009; 30: 5775-5784
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[62] Patel J., Zhu H., Menassa R., Gyenis L., Richman A., Brandle J.: Elastin-like polypeptide fusions enhance the accumulation of recombinant proteins in tobacco leaves. Transgenic Res., 2007; 16: 239-249
[PubMed]  

[63] Perez-Rigueiro J., Elices M., Plaza G., Real J.I., Guinea G.V.: The effect of spinning forces on spider silk properties. J. Exp. Biol., 2005; 208: 2633-2639
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[64] Prince J.T., McGrath K.P., DiGirolamo C.M., Kaplan D.L.: Construction, cloning, and expression of synthetic genes encoding spider dragline silk. Biochemistry, 1995; 34: 10879-10885
[PubMed]  

[65] Rising A., Johansson J., Larson G., Bongcam-Rudloff E., Engstrom W., Hjalm G.: Major ampullate spidroins from Euprosthenops australis: multiplicity at protein, mRNA and gene levels. Insect. Mol. Biol., 2007; 16: 551-561
[PubMed]  

[66] Rising A., Widhe M., Johansson J., Hedhammar M.: Spider silk proteins: recent advances in recombinant production, structure-function relationships and biomedical applications. Cell Mol. Life Sci., 2010; 68: 169-184
[PubMed]  

[67] Romer L., Scheibel T.: The elaborate structure of spider silk: structure and function of a natural high performance fiber. Prion, 2008; 2: 154-161
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[68] Scheibel T.: Spider silks: recombinant synthesis, assembly, spinning, and engineering of synthetic proteins. Microb. Cell Fact., 2004; 3: 14
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[69] Scheller J., Conrad U.: Plant-based material, protein and biodegradable plastic. Curr. Opin. Plant. Biol., 2005; 8: 188-196
[PubMed]  

[70] Scheller J., Guhrs K.H., Grosse F., Conrad U.: Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol., 2001; 19: 573-577
[PubMed]  

[71] Scheller J., Henggeler D., Viviani A., Conrad U.: Purification of spider silk-elastin from transgenic plants and application for human chondrocyte proliferation. Transgenic. Res., 2004; 13: 51-57
[PubMed]  

[72] Schmidt M., Romer L., Strehle M., Scheibel T.: Conquering isoleucine auxotrophy of Escherichia coli BLR(DE3) to recombinantly produce spider silk proteins in minimal media. Biotechnol. Lett., 2007; 29: 1741-1744
[PubMed]  

[73] Slotta U.K., Rammensee S., Gorb S., Scheibel T.: An engineered spider silk protein forms microspheres. Angew Chem. Int. Ed. Engl., 2008; 47: 4592-4594
[PubMed]  

[74] Spiess K., Lammel A., Scheibel T.: Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci., 2010; 10: 998-1007
[PubMed]  

[75] Spiess K., Wohlrab S., Scheibel T.: Structural characterization and functionalization of engineered spider silk films. Sott. Matter., 2010; 6: 4168-4174

[76] Sponner A., Unger E., Grosse F., Weisshart K.: Conserved C-termini of spidroins are secreted by the major ampullate glands and retained in the silk thread. Biomacromolecules, 2004; 5: 840-845
[PubMed]  

[77] Szela S., Avtges P., Valluzzi R., Winkler S., Wilson D., Kirschner D., Kaplan D.L.: Reduction-oxidation control of beta-sheet assembly in genetically engineered silk. Biomacromolecules, 2000; 1: 534-542
[PubMed]  

[78] Vendrely C., Scheibel T.: Biotechnological production of spider-silk proteins enables new applications. Macromol. Biosci., 2007; 7: 401-409
[PubMed]  

[79] Vollrath F.: Pajęcze sieci i jedwabie. Świat Nauki, 1992; 5: 60-67

[80] Vollrath F., Knight D.P.: Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature, 2001; 410: 541-548
[PubMed]  

[81] Wen H., Lan X., Zhang Y., Zhao T., Wang Y., Kajiura Z., Nakagaki M.: Transgenic silkworms (Bombyx mori) produce recombinant spider dragline silk in cocoons. Mol. Biol. Rep., 2010; 37: 1815-1821
[PubMed]  

[82] Werten M.W., Moers A.P., Vong T., Zuilhof H., van Hest J.C., de Wolf F.A.: Biosynthesis of an amphiphilic silk-like polymer. Biomacromolecules, 2008; 9: 1705-1711
[PubMed]  

[83] Williams D.: Sows’ ears, silk purses and goats’ milk: new production methods and medical applications for silk. Med. Device Technol., 2003; 14: 9-11
[PubMed]  

[84] Winkler S., Szela S., Avtges P., Valluzzi R., Kirschner D.A., Kaplan D.: Designing recombinant spider silk proteins to control assembly. Int. J. Biol. Macromol., 1999; 24: 265-270
[PubMed]  

[85] Winkler S., Wilson D., Kaplan D.L.: Controlling beta-sheet assembly in genetically engineered silk by enzymatic phosphorylation/dephosphorylation. Biochemistry, 2000; 39: 12739-12746
[PubMed]  

[86] Wong Po Foo C., Patwardhan S.V., Belton D.J., Kitchel B., Anastasiades D., Huang J., Naik R.R., Perry C.C., Kaplan D.L.: Novel nanocomposites from spider silk-silica fusion (chimeric) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 9428-9433
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[87] Work R.: Mechanisms of major ampullate silk fiber formation by orb-web-spinning spiders. Trans Am. Microsc. Soc., 1977; 96: 170-189

[88] Xia X.X., Qian Z.G., Ki C.S., Park Y.H., Kaplan D.L., Lee S.Y.: Native-sized recombinant spider silk protein produced in metabolically engineered Escherichia coli results in a strong fiber. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010; 107: 14059-14063
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[89] Xu H.T., Fan B.L., Yu S.Y., Huang Y.H., Zhao Z.H., Lian Z.X., Dai Y.P., Wang L.L., Liu Z.L., Fei J., Li N.: Construct synthetic gene encoding artificial spider dragline silk protein and its expression in milk of transgenic mice. Anim. Biotechnol., 2007; 18: 1-12
[PubMed]  

[90] Yang J., Barr L.A., Fahnestock S.R., Liu Z.B.: High yield recombinant silk-like protein production in transgenic plants through protein targeting. Transgenic. Res., 2005; 14: 313-324
[PubMed]  

[91] Yang M., Asakura T.: Design, expression and solid-state NMR characterization of silk-like materials constructed from sequences of spider silk, Samia cynthia ricini and Bombyx mori silk fibroins. J. Biochem., 2005; 137: 721-729
[PubMed]  

[92] Zhou C.Z., Confalonieri F., Jacquet M., Perasso R., Li Z.G., Janin J.: Silk fibroin: structural implications of a remarkable amino acid sequence. Proteins, 2001; 44: 119-122
[PubMed]  

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu