Streszczenie

W pracy przedstawiono jak rozwój znaczników fluorescencyjnych, począwszy od odkrycia biał­ka zielonej fluorescencji i jego różnobarwnych odmian, aż do opracowania metod analizy od­działywań międzycząsteczkowych w oparciu o różne warianty białek wpłynął na zrewidowanie poglądów dotyczących budowy i organizacji komórki bakteryjnej. Użycie nowych metod mikro­skopowych umożliwiło lokalizację poszczególnych białek oraz fragmentów chromosomu, a tak­że śledzenie ich migracji w czasie rzeczywistym. Badania te ujawniły przestrzenną organizację komórki bakteryjnej obejmującą swoistą subkomórkową lokalizację białek, obecność dynamicz­nych struktur cytoszkieletowych, uporządkowaną i aktywną segregację chromosomów oraz cza­sowo-przestrzenną regulację ekspresji genów.

Słowa kluczowe:mikroskopia fluorescencyjna • białka fluorescencyjne • FRET • FRAP • cytoszkielet bakteryjny • organizacja komórki bakteryjnej

Summary

We have reviewed how the development of fluorescent markers, triggered by the discovery of green fluorescence protein and its other color variants leading to the establishment of methods for studies of protein interactions with application of fluorescent proteins, affected the view of bacterial cell organization. Application of the new microscopic methods allowed localization of proteins and chromosomal regions, and observation of their migration in real time. These stu­dies revealed the spatial organization of bacterial cells which includes specific subcellular loca­lization of proteins, the presence of dynamic cytoskeletal structures, orchestrated and active se­gregation of chromosomes, and spatiotemporal gene regulation.

Key words:fluorescence microscopy • fluorescent proteins • FRET • FRAP • bacterial cytoskeleton • organization of bacterial cell

Wstęp

Ostatnie lata przyniosły radykalną zmianę poglądów na te­mat budowy i struktury komórki bakteryjnej. Przyczyniły się do tego przede wszystkim najnowsze techniki mikro­skopowe, a szczególnie wykorzystanie zjawiska fluorescen­cji. Zastosowanie barwników fluorescencyjnych wiążą­cych DNA (DAPI czy jodek propidyny), błonę komórkową i peptydoglikan (lipofilowy barwnik FM6-64 oraz znako­wane wankomycyną lub aglutyniną) umożliwiło wizuali­zację struktur subkomórkowych, odpowiednio nukleoidu, błony i ściany komórkowej.Natomiast zastosowanie zna­kowanych przeciwciał pozwoliło na subkomórkową detek­cję białek i ich kompleksów (immunolokalizacja). Jednak metoda ta jest obecnie wypierana przez coraz częstsze wy­korzystanie białek fluorescencyjnych, jako znaczników do lokalizacji białek fuzyjnych. Mikroskopia fluorescencyjna pozwala zarówno na analizę preparatów utrwalonych, jak i obserwacje przyżyciowe umożliwiające śledzenie migra­cji poszczególnych białek oraz fragmentów chromosomu w czasie rzeczywistym. Wyniki uzyskane w tych ekspe­rymentach zostały uzupełnione badaniami biochemiczny­mi oraz strukturalnymi. Dzięki nim wiadomo, że bakteria nie jest, jak długi czas uważano, „zbiornikiem” wypeł­nionym mieszaniną białek, ale komórką o ściśle uporząd­kowanej organizacji, w której umiejscowienie białek i ich kompleksów podlega precyzyjnej czasowo-przestrzennej kontroli sprawowanej przez struktury białkowe o charakte­rze cytoszkieletowym [50]. Są one tworzone przez homo­logi białek cytoszkieletu eukariotycznego i odpowiadają, podobnie jak u Eukariota, za utrzymanie kształtu komór­ki (CreS, homolog filamentów pośrednich nadający księ­życowaty kształt Caulobacter crescentus czy MreB, ho­molog aktyny zapewniający wydłużony kształt bakteriom pałeczkowatym), za podział komórkowy (FtsZ, homo­log tubuliny inicjujący powstanie przegrody podziałowej i MinD kontrolujące jej pozycje) oraz za właściwą segrega­cję chromosomów (ParA, zapewniające aktywny rozdział chromosomów po replikacji) [32,41]. Badania wewnątrz­komórkowych struktur u bakterii mają nie tylko znaczenie poznawcze, ale również praktyczne, ponieważ dostarczają informacji na temat możliwych sposobów kontroli wzrostu i namnażania bakterii. Przykładem może być FtsZ, które jest obecnie badane jako potencjalny cel dla antybiotyków.

Początki badań nad lokalizacją białek bakteryjnych

Pierwsze doniesienia wskazujące na swoistą lokalizację określonych białek w komórce bakteryjnej pochodzą z lat 90. ubiegłego wieku. Używając mikroskopii immunoelek­tronowej wykazano, że białko FtsZ jest umiejscowione w środku komórki, czyli w miejscu powstawania przegrody podziałowej [7]. Natomiast dzięki zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej w połączeniu z technikami immunoflu­orescencyjnymi wykazano swoistą lokalizację białek kom­pleksu chemoreceptora na biegunie komórki Escherichia coli [34]. Metody immunologiczne, chociaż nie ingerują w strukturę przestrzenną białka, są czasochłonne, a także kosztowne, ponieważ wymagają wysokiej jakości przeciw­ciał: pierwszorzędowego, które swoiście rozpoznaje bada­ne białko oraz drugorzędowego, znakowanego np. barwni­kiem fluorescencyjnym. Co więcej, komórki muszą zostać utrwalone, a struktura ich błony i ściany komórkowej naru­szona tak, aby przeciwciało mogło przeniknąć do wnętrza. Uniemożliwia to prowadzenie obserwacji w czasie rzeczy­wistym z zastosowaniem żywych komórek.

Zastosowanie białka zielonej fluorescencji GFP (green fluorescent protein) w biologii komórki rozpoczęło roz­wój technologii znaczników fluorescencyjnych. To nie­duże (25,9 kDa) fluorescencyjne białko, występujące na­turalnie u meduzy Aequorea victoria, odkryli już w 1962 r. Shimomura i wsp. [53], jednak dopiero 30 lat później zastosowano je jako znacznik biologiczny. GFP jest zbu­dowane głównie z beta-harmonijek tworzących strukturę beta-baryłki, w środku której znajduje się chromofor zbu­dowany z trzech aminokwasów Ser65-Tyr66-Gly67 pod­danych posttranslacyjnej cyklizacji i oksydacji (ryc. 1).

Ryc. 1. Struktura przestrzenna białka zielonej fluorescencji [ID: 1EMA, PDB]

Tworzenie chromoforu trwa około 2 godzin, a jego najwol­niejszym i limitującym etapem jest oksydacja. Proces ten nie wymaga obecności żadnego enzymu, również do samej fluorescencji nie są potrzebne dodatkowe kofaktory bądź substraty. Fluorescencja jest zazwyczaj odporna na wy­gaszanie światłem. Główną zaletą zastosowania GFP jest możliwość obserwacji białek, kompleksów oraz określo­nych fragmentów chromosomów w żywej komórce w cza­sie rzeczywistym, a także to, że GFP i jego pochodne nie są toksyczne dla bakterii i organizmów eukariotycznych. Natomiast wadą GFP jest tendencja do tworzenia nieroz­puszczalnych agregatów, zwłaszcza w wyższych tempe­raturach. Ponadto fuzja z GFP może zaburzać strukturę natywną analizowanego białka, a tym samym wpływać na zmianę jego funkcjonalności i lokalizacji. Najczęściej w celu zachowania funkcjonalności obu białek wstawia się pomiędzy nie krótki łącznik (składający się z kilku, kil­kunastu aminokwasów), który umożliwia niezależne fał­dowanie się obu białek. W 1994 r. Chalfie i wsp. po raz pierwszy poddali ekspresji gen gfp w komórkach bakte­ryjnych (Escherichia coli) oraz eukariotycznych (nicień Caenorhabditis elegans) i zastosowali go jako gen repor­terowy do analizy aktywności promotorów [11]. Rok póź­niej zespół Losicka [3] wykorzystał GFP do lokalizacji białka SpoIIE, które jest zaangażowane w proces sporula­cji Bacillus subtilis. Wykazano, że umiejscowienie GFP-SpoIIE zmienia się w czasie trwania cyklu komórkowego – przed rozpoczęciem tworzenia asymetrycznej przegrody obserwowano dwa skupiska fluorescencyjne, a po jej utwo­rzeniu już tylko jedno, w miejscu powstawania przegrody.

Jednym z pierwszych interesujących doświadczeń z uży­ciem fuzyjnego białka GFP była wizualizacja w komór­kach E. coli wspomnianego już białka FtsZ – struktural­nego homologu eukariotycznej tubuliny oraz FtsA. FtsZ wyznacza miejsce podziału komórki bakteryjnej poprzez polimeryzację w postaci wewnątrzkomórkowego pierście­nia Z, związanego z błoną komórkową (ryc. 2), natomiast białko FtsA jest zasocjowane z powstającym pierście­niem Z [33]. Jednak obecność w komórce samych białek fuzyjnych nie była wystarczająca do prawidłowej lokali­zacji i polimeryzacji FtsZ; funkcjonalne polimery białek fuzyjnych tworzyły się jedynie w obecności niezmodyfi­kowanych białek.

Ryc. 2. Tworzenie pierścienia Z przez białko FtsZ-GFP w centrum komórki E. coli [33, za zgodą]; A, B – obrazy przedstawiające komórkę z w pełni ukształtowanym pierścieniem Z; C, D – obrazy komórki zawierającej niekompletny pierścień Z; skala: 1 µm

W ciągu następnych paru lat, GFP wykorzystano do wizu­alizacji wielu innych białek [40]. Opisano umiejscowienie w komórkach E. coli lub B. subtilis białek zaangażowanych w główne etapy cyklu komórkowego, na przykład: uczest­niczących w podziale komórkowym: MinC [23], MinD [36,47], MinE [22,46], FtsI [63], FtsH [62], FtsL [21,54] FtsQ [12], ZipA [22], odpowiadających za organizację chro­mosomu HU [64] i SMC [9], zaangażowanych w replikację DNA PolC [24,29] i SeqA [8,38] oraz uczestniczących w se­gregacji potomnych chromosomów ParA, ParB [31,35,44], FtsK [67] i DivIVA [18]. Określono również lokalizację w komórkach E. coli i Caulobacter crescentus białek CckA [25], Che [55], DivJ i PleC [65], DivK [26] uczestniczących w przekazywaniu sygnału oraz w komórkach B. subtilis CotE [61], DacF [30], SigE [28], SpoIIE [3,5], SpoIIGA [19], SpoIVA [30,42], SpoIVFB zaangażowanych w spo­rulację. Pierwsze zastosowania GFP ograniczały się głów­nie do modelowych organizmów – E. coli, B. subtilis, C. crescentus, ale później zaczęto je stosować do lokalizacji białek w komórkach innych gatunków bakterii szczególnie chorobotwórczych np. Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae, Helicobacter pylori [45,60,66]. Ciekawym zasto­sowaniem GFP była wizualizacja cytoszkieletowych białek, krescentyny i Ccrp, które nadają komórkom bakteryjnym charakterystyczny kształt: krescentyna odpowiada za księ­życowaty kształt C. crescentus, natomiast białko Ccrp (co­iled coil rich protein) za helikalny kształt H. pylori [4,60].

Nowe warianty i kolory białek fluorescencyjnych

Coraz szersze stosowanie GFP sprawiło, że zaczęto po­szukiwać jego ulepszonych wariantów. Wprowadzane mo­dyfikacje dotyczyły głównie: zwiększenia intensywności fluorescencji i fotostabilności białka, rozszerzenia zakre­su spektralnego, zmniejszenia tendencji do oligomeryza­cji i wrażliwości na pH, a także przyspieszenia dojrzewa­nia chromoforu. Pierwszym udoskonalonym białkiem było EGFP (enhanced green fluorescent protein) [14,15], któ­re uzyskano wymieniając jedynie dwa aminokwasy w ob­rębie chromoforu białka GFP. EGFP wykazuje znacznie wyższą (ponad 35 razy) intensywność fluorescencji w po­równaniu do GFP oraz obniżoną tendencję do agregacji w 37°C. Później, głównie przez wprowadzanie przypad­kowych mutacji w GFP, uzyskano białka fluorescencyjne emitujące w różnych zakresach spektralnych: niebieskim (blue fluorescent protein – BFP), niebiesko-zielonym (cyan fluorescent protein – CFP) oraz żółtym (yellow fluorescent protein – YFP). Wszystkie wymienione białka mają struk­turę białka GFP, a jedyne różnice dotyczą chromoforu.

Największym wyzwaniem w konstrukcji znaczników fluore­scencyjnych stało się otrzymanie białek emitujących w za­kresie czerwonych i pomarańczowych regionów spektral­nych. Wielokrotnie podejmowane próby konstrukcji tych białek w wyniku mutacji wprowadzanych w obrębie chro­moforu białka GFP nie dawały żadnych rezultatów. Przełom nastąpił dopiero po odkryciu białka czerwonej fluorescen­cji (DsRed) pochodzącego z koralowca Discosoma striata [37]. Białko DsRed przyjmuje postać tetrameru. Struktura monomeru DsRed, mimo bardzo niskiej homologii ami­nokwasowej (~23%), wykazuje wiele podobieństw z kon­formacją przestrzenną białka GFP. W oparciu o białko DsRed w wyniku losowej i ukierunkowanej mutagenezy, uzyskano warianty, które utraciły zdolność do tetramery­zacji: dTomato, mRFP1, mStrawberry, mPlum i mCher­ry [49]. Wśród obecnie dostępnych białek fluoryzujących w czerwonym zakresie spektralnym najlepsze własności ma mCherry: charakteryzuje się wysoką fotostabilnością i intensywnością fluorescencji (około połowa intensywno­ści EGFP) oraz może być stosowane w eksperymentach z długim czasem obrazowania [48].

Zastosowanie nowych wariantów białek fluorescencyjnych uruchomiło lawinę doniesień dotyczących już nie tylko swo­istej lokalizacji pojedynczych białek, ale przede wszyst­kim umożliwiło jednoczesną wizualizację kilku białek w komórce. Dzięki wykorzystaniu białek fluorescencyj­nych wykazano obecność w komórce bakteryjnej złożo­nych i dynamicznych struktur białkowych potwierdzając wstępne doniesienia o istnieniu cytoszkieletu bakteryjnego.

W wielu badaniach skupiono się na białkach będących ho­mologami eukariotycznych białek cytoszkieletu – FtsZ, MreB i unikalnym dla bakterii systemie MinCDE, który kontroluje miejsce podziału komórki. Białko MinC, wraz z MinD, hamuje polimeryzację FtsZ i co za tym idzie two­rzenie pierścienia Z w pobliżu biegunów komórki, nato­miast MinD znosi inhibicję MinCD w centrum komórki. Wykorzystanie dwóch kolorów YFP i CFP umożliwiło np. jednoczesną lokalizację w komórkach E. coli białek MinD, które oscyluje pomiędzy biegunami komórki oraz MinE, które tworzy dynamiczny pierścień (ryc. 3). Dzięki zasto­sowaniu dwóch białek fluorescencyjnych pokazano, że dy­namiczna lokalizacja MinD zależy od MinE, a także zi­dentyfikowano mutanty MinE, w których oscylacja MinD była zaburzona [51]. Jednoczesną lokalizację MinD-YFP wraz z FtsZ-CFP udało się także zbadać w komórkach mu­tanta E. coli pozbawionych białka MreB, które zapewnia utrzymanie wydłużonego kształtu komórki [52]. Okazało się, że oscylacja MinD i tworzenie pierścienia FtsZ nie są zaburzone w kulistych mutantach pozbawionych mreB.

Ryc. 3. Umiejscowienie białek MinD oraz MinE w szczepie E. coli wytwarzającym jednocześnie YFP-MinD oraz MinE-CFP [51, za zgodą]. A – Nomarski, B – fluorescencja YFP, C – fluorescencja CFP, D – nakładające się fluorescencje YFP i CFP; skala: 1 µm

Lokalizacja białek MreB i MreC w komórkach Caulobacter crescentus była jednym z pierwszych eksperymentów wy­korzystujących znacznik mCherry i mRFP1 do badań bio­logii komórki bakteryjnej [17]. Na podstawie mikroskopo­wych obserwacji zaproponowano, że MreB polimeryzuje tworząc spiralny filament, który stanowi rusztowanie po­zwalające na odpowiednie rozmieszczenie białek odpo­wiedzialnych za syntezę ściany komórkowej (ryc. 4). Co więcej, zauważono, że również MreC wykazuje zdolność do tworzenia spiralnych filamentów, które są niezbędne do prawidłowej lokalizacji prekursorów peptydoglikanu.

Ryc. 4. Mikroskopia fluorescencyjna białek fuzyjnych GFP-MreB i MreC-mCherry w komórkach C. crescentus [17]. Projekcja to złożenie obrazów z 10 płaszczyzn, schemat – interpretacja graficzna; skala 1 µm

Nowe metody znakowania białek

Jeden z nowych typów znaczników opiera się na wyko­rzystaniu dwóch domen zamka leucynowego eukariotycz­nych czynników transkrypcyjnych Jun i Fos (Jun^LZ, Fos^LZ). W systemie tym jedna z domen występuje w połączeniu z analizowanym białkiem, natomiast druga z białkiem flu­orescencyjnym; utworzenie dimeru pomiędzy Jun^LZ i Fos^LZ umożliwia wizualizację analizowanego białka. Największą zaletą stosowania tej metody jest to, że w przeciwieństwie do GFP obie dimeryzujące domeny są dość krótkie (dłu­gość Jun^LZ i Fos^LZ wynosi odpowiednio 41 i 77, a GFP 240 aminokwasów) i dlatego w znacznie mniejszym stopniu za­burzają funkcjonalność analizowanego białka.

Oddziaływanie domen zamka leucynowego białek Jun i Fos posłużyło do określenia lokalizacji białka SpoIIIE w sporulujących komórkach B. subtilis [43]. SpoIIIE pełni funkcję translokazy wykorzystującej energię pochodzącą z ATP do przeniesienia nowo zreplikowanego chromoso­mu z komórki macierzystej do prespory. W prowadzonych badaniach próbowano ustalić wpływ obecności subdome­ny γ (wchodzącej w skład domeny translokacyjnej białka SpoIIIE) na miejsce wiązania się translokazy do przegro­dy, a tym samym na kierunek przenoszenia nowo zrepli­kowanego chromosomu. Analizowano komórki szczepu B. subtilis, w których białko SpoIIIE poddano ekspresji w fuzji z Jun^LZ, natomiast wytwarzanie znacznika fluore­scencyjnego, GFP-Fos^LZ odbywało się w presporze lub w komórce macierzystej w zależności od badanego szcze­pu. W przypadku niezmutowanego białka SpoIIIE fluore­scencyjne skupiska obserwowano wyłącznie w szczepie, w którym GFP-Fos^LZ wytwarzane było w komórce ma­cierzystej, a zatem SpoIIIE umiejscowione było po jed­nej stronie przegrody (ryc. 5A). Natomiast białko SpoIIIE pozbawione subdomeny γ umiejscowione było po obydwu stronach przegrody (ryc. 5B).

Ryc. 5. Umiejscowienie białka SpoIIIE w sporulujących komórkach B. subtilis [43, za zgodą]. Zdjęcia mikroskopowe oraz schematy (umieszczone z prawej strony) przedstawiają fluorescencję pochodzącą od białka Fos^LZ-GFP obecnego w szczepach wytwarzających odpowiednio: (A) niezmutowane białko SpoIIIE oraz (B) białko SpoIIIE pozbawione domeny γ. Grotami strzałek oznaczono skupiska GFP, procenty określają liczbę komórek, w których skupiska SpoIIIE-Jun^LZ obserwowane były po stronie komórki macierzystej lub prespory, n – liczba wszystkich komórek

Obecnie coraz częściej stosowane są syntetyczne barwni­ki stanowiące alternatywę dla białek fluorescencyjnych, np. FlasH i ReAsH. Barwniki te silnie wiążą sekwencje zawierające cztery reszty cysteinowe (Cys-Cys-X-X-Cys-Cys), a zatem badane białko musi mieć jedynie krótki ogon heksapeptydowy. Największą zaletą stosowania tego typu znaczników jest niewielka zmiana w strukturze trzeciorzę­dowej analizowanego białka, a także możliwość usunięcia barwnika. Barwniki te znalazły zastosowanie w lokaliza­cji białka FliC w komórkach E. coli [13]. FliC jest mono­merem flagelliny, kurczliwego białka, które polimeryzując tworzy włókna – podstawę konstrukcji rzęski bakteryjnej.

Stosunkowo niedawno wprowadzono znaczniki o ściśle kontrolowanej i odwracalnej fluorescencji [39]; jednym z pierwszych takich białek było PA-GFP (photoactivable – GFP). Znacznik ten stanowi pewnego rodzaju przełącz­nik molekularny, który z łatwością przechodzi ze stanu „uśpionego” w stan fluorescencyjnie wzbudzony wsku­tek intensywnego naświetlania. Co więcej białko to może przechodzić nawet kilkaset takich cykli. Dotychczas biał­ko PA-GFP wykorzystano w badaniach nad organizmami eukariotycznymi.

Badanie dynamicznej lokalizacji białek bakteryjnych

Jedną z technik pozwalających na badanie dynamiki/ruchu białek w komórkach jest FRAP (fluorescence recovery after photobleaching). Metoda ta polega na wygaszeniu fluore­scencji we fragmencie struktury subkomórkowej zawiera­jącego znakowane fluorescencyjnie białko. Do wygasze­nia używa się lasera o wysokiej intensywności, a następnie, w określonym czasie, monitoruje się dyfuzję nowych czą­stek fluorescencyjnych w miejscu, w którym wygaszono flu­orescencję. Pozwala to na analizę własności kinetycznych i motorycznych białek, współczynnika dyfuzji czy szybko­ści transportu w żywej komórce. Przywrócenie fluorescen­cji w wygaszonym miejscu w krótkim czasie oznacza, że w badanej strukturze zachodzą aktywne procesy wymia­ny. Zastosowanie metody FRAP pozwoliło śledzić zmiany w umiejscowieniu białek w żywych komórkach i znacz­nie przyspieszyło badania nad dynamiką bakteryjnych bia­łek cytoszkieletowych, np. białka FtsZ, które podobnie jak tubulina ma aktywność GTP-azową i wykazuje zdolność do tworzenia protofilamentów in vitro [2]. Badania meto­dą FRAP nad znakowanym fluorescencyjnie FtsZ w ko­mórkach E. coli i B. subtilis wykazały, że struktura „pier­ścienia Z” tworzonego przez białko FtsZ jest niezwykle dynamiczna – połowiczny czas przywracania fluorescen­cji wynosi 8-9 s u tych bakterii. To oznacza, że następu­je intensywna wymiana „wygaszonych” cząsteczek FtsZ-GFP na nowe, pochodzące prawdopodobnie z cytoplazmy (ryc. 6) [56].

Ryc. 6. Przykład techniki FRAP wykorzystanej do obserwacji pierścieni FtsZ w komórkach E. coli [56, za zgodą]. Strzałką oznaczono fragment pierścienia Z, w którym fluorescencja została wygaszona. Dla każdego zdjęcia podano czas, jaki minął po wygaszeniu fluorescencji; skala: 2 µm

Badania z wykorzystaniem techniki FRAP pozwoliły tak­że na analizę dynamicznego zachowania cząsteczek MreB w komórkach B. subtilis (ryc. 7); przywrócenie fluorescencji po wygaszeniu znakowanych GFP filamentów MreB nastę­puje już po 2 min, co oznacza, że białko to tworzy struktu­ry charakteryzujące się stosunkowo dużą dynamiką [16].

Ryc. 7. Analiza ruchu białka GFP-MreB w komórkach B. subtilis wykorzystująca technikę FRAP [16, za zgodą]. Obrazy mikroskopowe obserwowane: Pre – przed wygaszeniu laserem; 0 – w chwili wygaszenia; 1, 2, 3, 4, 5 – kolejno po wygaszeniu w odstępach 1-minutowych. Przerywanym kółkiem oznaczono region, w którym wygaszono fluorescencję; strzałkami miejsce w komórce po wygaszeniu fluorescencji; trójkątami dynamiczną lokalizację filamentów MreB-GFP; kreskami oznaczono końce komórek lub septy pomiędzy komórkami; skala: 2 µm

Znaczniki fluorescencyjne wbadaniu oddziaływań białek

Obecnie do najważniejszych metod wykorzystujących znaczniki fluorescencyjne w celu obserwacji oddziały­wań białkowych w komórce w czasie rzeczywistym na­leżą BiFC i FRET.

Pierwsza z nich, BiFC (bimolecular fluorescence comple­mentation) jest techniką opartą na rekonstrukcji znacznika fluorescencyjnego wewnątrz komórki. Każde z badanych (potencjalnie oddziałujących ze sobą) białek (lub pepty­dów) podlega ekspresji w fuzji z połową funkcjonalnego białka fluorescencyjnego. Rekonstrukcja znacznika (naj­częściej jest nim YFP lub GFP) nie zachodzi spontanicz­nie w komórce, lecz jest następstwem oddziaływania mię­dzy białkami (lub peptydami), które są połączone z danym fragmentem chromoforu. Co więcej, pomiar intensywności fluorescencji technikami mikroskopii fluorescencyjnej po­zwala na oszacowanie siły oddziaływań między białkami.

Technika BiFC stanowiła podstawę badań, których celem było określenie oddziaływań między białkami MreB i MbI w żywych komórkach B. subtilis [16]. Obserwacje prowa­dzono na komórkach szczepów kodujących kombinacje dwóch białek fuzyjnych: YN-MreB i YC-MbI. W przypad­ku szczepów wytwarząjących pojedyncze białka YN-MreB (ryc. 8A), YC-MbI (ryc. 8B) oraz YC-MbI i sam fragment YN (ryc. 8C) widoczne było jedynie tło fluorescencyjne. W obrazie mikroskopowym komórek wytwarzających jed­nocześnie białka YN-MreB oraz YC-MbI (ryc. 8D) moż­na było dostrzec wyraźne sygnały fluorescencyjne w wielu miejscach wzdłuż ściany komórkowej. Badania te potwier­dziły istnienie oddziaływań między analizowanymi białkami.

Ryc. 8. Analiza oddziaływań międzybiałkowych wykorzystująca technikę BiFC [16, za zgodą]. Szczepy B. subtilis wytwarzające białka: A – YN-MreB, B – YC-MbI, C – YC-MbI i YN, D – YN-MreB oraz YC-MbI; skala: 2 µm

FRET (Förster/fluorescence resonance energy transfer) po­dobnie jak BiFC jest techniką wykorzystującą znakowane fluorescencyjnie białka. Opiera się na zastosowaniu zja­wiska przenoszenia energii między dwoma chromofora­mi będącymi w odległości nie większej niż 10 nm. Jeden z chromoforów, będący w stanie wzbudzonym (chromofor donorowy), przekazuje energię rezonansu drugiemu chro­moforowi (chromofor akceptorowy). Wzbudzenie chro­moforu będącego donorem następuje po naświetleniu go falą o długości odpowiadającej maksimum jego absorp­cji. Potwierdzeniem istnienia oddziaływań międzybiał­kowych jest emisja fali o długości odpowiadającej maksi­mum emisji chromoforu stanowiącego akceptor. Technika FRET została wykorzystana do analizy procesu chemotaksji w komórkach E. coli [58]. Szczególną uwagę skupiono na dwóch białkach o aktywności fosfatazy cytoplazmatycznej, CheY i CheZ oraz kinazie CheA, która wchodzi w skład kompleksu receptorowego znajdującego się wewnątrz bło­ny komórkowej na jednym z biegunów komórek E. coli. Skonstruowano szczep, w którym jednocześnie poddano ekspresji białka CheZ i CheY w fuzji z odpowiednio CFP i YFP. Na podstawie otrzymanych wyników dowiedziono oddziaływania białek CheY i CheZ oraz możliwe stało się także określenie przestrzennego rozmieszczenia komplek­sów oddziałujących białek wewnątrz komórki.

Znaczniki fluorescencyjne w badaniu dynamiki chromosomu

Zastosowanie białek w fuzji z GFP pozwoliło także na badanie dynamiki chromosomów w trakcie cyklu komór­kowego. Czasoprzestrzenna organizacja replikowanego chromosomu opisywana jest głównie poprzez lokalizację i analizę dynamiki swoistych chromosomalnych loci oraz analizę globalnej topologii nowo syntetyzowanego DNA. Lokalizacja poszczególnych regionów chromosomów jest możliwa dzięki zastosowaniu systemu FROS (fluorescent repressor-operator system), który polega na wprowadze­niu w różne regiony chromosomu (np. w okolice regionu oriC – inicjującego replikację) kasety swoiście wiązanej przez białko połączone z fluorescencyjnym znacznikiem.

Jako kasety wykorzystuje się powtórzone (kilkasetkrotnie) sekwencje operatorowe tetR i/lub lacO. Ekspresja w ko­mórce białek represorowych TerR i/lub LacI w fuzji z biał­kami fluorescencyjnymi (np. TetR-YFP oraz LacI-CFP), pozwala na wizualizację kompleksu nukleoproteinowe­go utworzonego w miejscu wprowadzenia kasety. FROS, w przeciwieństwie do wcześniej stosowanej techniki FISH (fluorescence in situ hybridization, lokalizacja określo­nych miejsc na chromosomie za pomocą hybrydyzacji ze znakowanymi sondami), umożliwia badania przyżyciowe. System ten wykorzystano m.in. do lokalizacji kilkudzie­sięciu różnych loci chromosomalnych podczas cyklu ko­mórkowego C. crescentus wprowadzając za pomocą trans­pozonów kasety w różne miejsca chromosomu. Badania te wykazały istnienie mechanizmu, który warunkuje upo­rządkowany transport kolejnych nowo zreplikowanych frag­mentów chromosomu z miejsca replikacji w stronę przeciw­ległego bieguna komórki [59]. W przypadku V. cholerae, Gram-ujemnych pałeczek, które mają dwa koliste chromo­somy (I i II) system FROS umożliwił jednocześnie śledze­nie lokalizacji regionów oriC obu chromosomów (oriCI i oriCII) w trakcie procesu replikacji. Analiza mikrosko­powa pozwoliła stwierdzić, że powielone regiony oriCI są umiejscowione najczęściej w pobliżu biegunów komórki, podczas gdy nowo zreplikowane regiony oriCII są umiej­scowione w pozycji 1/4 i 3/4 komórki (ryc. 9). Proces prze­mieszczania się regionów oriC jest skoordynowany z cy­klem komórkowym V. cholerae. Zaproponowano ciekawy mechanizm rozdziału nowo zreplikowanych regionów oriC – oriCI ulega niesymetrycznej segregacji z pozycji polar­nej, z jednym oriCI pozostającym na biegunie i drugim, który ulega przemieszczeniu na przeciwległy biegun ko­mórki, natomiast oriCII podlega symetrycznej segregacji z centrum komórki do pozycji 1/4 i 3/4 [20].

Ryc. 9. Wizualizacja regionów oriCI (A) i oriCII (B) w komórkach Vibrio cholerae systemem FROS (fluorescent repressor-operator system) [20]. A – fluorescencja pochodząca od LacI-CFP, swoiście wiązanego do sekwencji operatorowych lacO znajdujących się przy oriCI_VC, B – fluorescencja pochodząca od TetR-CFP, swoiście wiązanego do sekwencji operatorowych tetO znajdujących się przy oriCII_VC, Strzałkami oznaczono komórki, w których dwa nowo zreplikowane regiony oriC znajdują się blisko siebie; skala: 2 µm

Zastosowanie białek fluorescencyjnych w badaniach ekspresji genów

Badania przeprowadzone przez Chalfiego i wsp. po raz pierwszy ukazały użyteczność GFP w analizie aktywności promotorów [11]. Zaletą stosowania gfp jako genu repor­terowego jest łatwość detekcji tego białka i fluorescencja niezależna od kofaktorów. Zastosowanie białek fluorescen­cyjnych może też pozwolić na jednoczesne badanie kilku promotorów przez zastosowanie wariantów białka emitują­cego w różnych długościach fali. Problemem podczas ozna­czeń ilościowych zwłaszcza w badaniach prowadzonych in situ, gdzie nie jest możliwa ścisła kontrola warunków eks­perymentu jest długi czas fałdowania GFP i tworzenia się chromoforu. Może to uniemożliwić pomiary aktywności promotora w czasie, ponieważ utrudnione jest określenie czasu rozpoczęcia transkrypcji.

Zastosowanie GFP w badaniach ekspresji genów bakteryj­nych pozwoliło na weryfikację tez o czasowo-przestrzen­nej regulacji ekspresji genów bakteryjnych. Pierwsze do­niesienie o wykorzystaniu GFP, jako genu reporterowego w bakteriach pojawiło się w 1995 r. Zespół Losicka [61] badając sporulację B. subtilis wykazał swoistą dla komórki macierzystej lub dla prespory aktywność promotorów za­leżnych odpowiednio od podjednostek sigma polimerazy RNA sigE lub sigF. Zróżnicowanie przestrzenne aktyw­ności tych dwóch czynników sigma pozwala na różnico­wanie się dwóch kompartmentów komórki (komórki ma­cierzystej i prespory). Pod kontrolą SigE znajduje się m.in. gen cotE, którego produkt odpowiedzialny jest za opłasz­czenie endospory. Wprowadzenie genu gfp pod kontrolą promotora genu cotE wykazało, że ekspresja cotE wystę­puje w komórce macierzystej – fluorescencja pochodzą­ca od białka GFP obserwowana była jedynie w tym kom­partmencie. Gen gfp wklonowany do plazmidu pBET131 pod kontrolą promotora regulowanego przez sigF (aktyw­ny jedynie w presporze), wykorzystano w badaniach se­gregacji plazmidów niskiej kopii w komórkach B. subtilis [6]. Obserwowana fluorescencja wskazywała na obecność plazmidu pBET131w presporze (ryc. 10). W ostatnich 15 latach GFP i inne białka fluorescencyjne były wykorzysty­wane jako geny reporterowe dla wielu różnych mikroor­ganizmów np. Helicobacter pylori, Borrelia burgdorferi, Streptomyces coelicolor, Anabaena do badania regula­cji rozmaitych procesów, takich jak na przykład różnico­wanie, wirulencja, transport czy biosynteza metabolitów wtórnych [1,10,27,57].

Ryc. 10. Wykorzystanie gfp jako genu reporterowego w komórkach B. subtilis w celu zbadania segregacji plazmidu pBET131 do prespory [6, za zgodą]. Strzałkami oznaczono presporę; skala: 1 µm

Podsumowanie

Badania biologii komórki rozwinęły się dzięki uhonorowanym w 2008 r. Nagrodą Nobla badaniom Osama Shimomura (od­krywca GFP), Martina Chalfie (zastosował GFP, jako fluore­scencyjny znacznik) oraz Rogera Tsiena (zmodyfikował GFP otrzymując ulepszone warianty). Wprowadzenie w ostatnich kilku latach nowych, różnorodnych znaczników fluorescen­cyjnych oraz nowoczesnych technik obrazowania pozwala obserwować w czasie rzeczywistym umiejscowienie, prze­mieszczanie i działanie jednocześnie kilku białek i/lub okre­ślonych struktur komórkowych oraz regionów chromosomów wewnątrz żywej komórki. Nowe techniki wizualizacji umożli­wiają również śledzenie zmian lokalizacji określonych struk­tur komórkowych pod wpływem różnorodnych czynników.

Wyniki badań, w których zastosowano techniki fluorescen­cyjne całkowicie zrewolucjonizowały nasze poglądy na te­mat komórki bakteryjnej. Do niedawna pokutował pogląd, że w przeciwieństwie do komórek eukariotycznych, w ko­mórce bakteryjnej nie można wyróżnić określonych struktur subkomórkowych (odpowiedników eukariotycznych organel­li) – wyobrażano sobie, że wnętrze komórki bakteryjnej to amorficzny twór złożony z różnorodnych makrocząsteczek. Z takim obrazem komórki bakteryjnej można jeszcze spotkać się w wielu podręcznikach. Obecnie wiemy, że bakterie mają cytoszkielet, który uczestniczy w aktywnej segregacji potom­nych chromosomów i cytokinezie oraz utrzymywaniu okre­ślonego kształtu komórki bakteryjnej. Należy podkreślić, że oprócz omówionych tu zastosowań, techniki obrazowania są wykorzystywane w mikrobiologii lekarskiej i środowiskowej.

PIŚMIENNICTWO

[1] Aldea M.R., Mella-Herrera R.A., Golden J.W.: Sigma factor genes sigC, sigE, and sigG are upregulated in heterocysts of the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol., 2007; 189: 8392-8396
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[2] Anderson D.E., Gueiros-Filho F.J., Erickson H.P.: Assembly dynamics of FtsZ rings in Bacillus subtilis and Escherichia coli and effects of FtsZ-regulating proteins. J. Bacteriol., 2004; 186: 5775-5781
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Arigoni F., Pogliano K., Webb C.D., Stragier P., Losick R.: Localization of protein implicated in establishment of cell type to sites of asymmetric division. Science, 1995; 270: 637-640
[PubMed]  

[4] Ausmees N., Kuhn J.R., Jacobs-Wagner C.: The bacterial cytoskeleton: an intermediate filament-like function in cell shape. Cell, 2003; 115: 705-713
[PubMed]  

[5] Barák I., Behari J., Olmedo G., Guzmán P., Brown D.P., Castro E., Walker D., Westpheling J., Youngman P.: Structure and function of the Bacillus SpoIIE protein and its localization to sites of sporulation septum assembly. Mol. Microbiol., 1996; 19: 1047-1060
[PubMed]  

[6] Becker E., Herrera N.C., Gunderson F.Q., Derman A.I., Dance A.L., Sims J., Larsen R.A., Pogliano J.: DNA segregation by the bacterial actin AlfA during Bacillus subtilis growth and development. EMBO J., 2006; 25: 5919-5931
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[7] Bi E.F., Lutkenhaus J.: FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature, 1991; 354: 161-164
[PubMed]  

[8] Brendler T., Sawitzke J., Sergueev K., Austin S.: A case for sliding SeqA tracts at anchored replication forks during Escherichia coli chromosome replication and segregation. EMBO J., 2000; 19: 6249-6258
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[9] Britton R.A., Lin D.C., Grossman A.D.: Characterization of a prokaryotic SMC protein involved in chromosome partitioning. Genes Dev., 1998; 12: 1254-1259
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[10] Carroll J.A., Stewart P.E., Rosa P., Elias A.F., Garon C.F.: An enhanced GFP reporter system to monitor gene expression in Borrelia burgdorferi. Microbiology, 2003; 149: 1819-1828
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[11] Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C.: Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994; 263: 802-805
[PubMed]  

[12] Chen J.C., Weiss D.S., Ghigo J.M., Beckwith J.: Septal localization of FtsQ, an essential cell division protein in Escherichia coli. J. Bacteriol., 1999; 181: 521-530
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[13] Copeland M.F., Flickinger S.T., Tuson H.H., Weibel D.B.: Studying the dynamics of flagella in multicellular communities of Escherichia coli by using biarsenical dyes. Appl. Environ. Microbiol., 2010; 76: 1241-1250
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[14] Cormack B.P., Valdivia R.H., Falkow S.: FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene, 1996; 173: 33-38
[PubMed]  

[15] Cubitt A.B., Woollenweber L.A., Heim R.: Understanding structure-function relationship in the Aequorea victoria green fluorescent protein. Methods Cell Biol., 1999; 58: 19-30
[PubMed]  

[16] Defeu Soufo H.J., Graumann P.L.: Dynamic localization and interaction with other Bacillus subtilis actin-like proteins are important for the function of MreB. Mol. Microbiol., 2006; 62: 1340-1356
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[17] Dye N.A., Pincus Z., Theriot J., Shapiro L., Gitai Z.: Two independent spiral structures control cell shape in Caulobacter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005; 102: 18608-18613
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[18] Edwards D.H., Thomaides H.B., Errington J.: Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J., 2000; 19: 2719-2727
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[19] Fawcett P., Melnikov A., Youngman P.: The Bacillus SpoIIGA protein is targeted to sites of spore septum formation in a SpoIIE-independent manner. Mol. Microbiol., 1998; 28: 931-943
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[20] Fogel M.A., Waldor M.K.: A dynamic, mitotic-like mechanism for bacterial chromosome segregation. Genes Dev., 2006; 20: 3269-3282
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[21] Ghigo J.M., Weiss D.S., Chen J.C., Yarrow J.C., Beckwith J.: Localization of FtsL to the Escherichia coli septal ring. Mol. Microbiol., 1999; 31: 725-737
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[22] Hale C.A., de Boer P.A.: Direct binding of FtsZ to ZipA, an essential component of the septal ring structure that mediates cell division in E. coli. Cell, 1997; 88: 175-185
[PubMed]  

[23] Hu Z., Lutkenhaus J.: Topological regulation of cell division in Escherichia coli involves rapid pole to pole oscillation of the division inhibitor MinC under the control of MinD and MinE. Mol. Microbiol., 1999; 34: 82-90
[PubMed]  

[24] Imai Y., Ogasawara N., Ishigo-Oka D., Kadoya R., Daito T., Moriya S.: Subcellular localization of Dna-initiation proteins of Bacillus subtilis: evidence that chromosome replication begins at either edge of the nucleoids. Mol. Microbiol., 2000; 36: 1037-1048
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[25] Jacobs C., Domian I.J., Maddock J.R., Shapiro L.: Cell cycle-dependent polar localization of an essential bacterial histidine kinase that controls DNA replication and cell division. Cell, 1999; 97: 111-120
[PubMed]  

[26] Jacobs C., Hung D., Shapiro L.: Dynamic localization of a cytoplasmic signal transduction response regulator controls morphogenesis during the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001; 98: 4095-4100
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[27] Josenhans C., Friedrich S., Suerbaum S.: Green fluorescent protein as a novel marker and reporter system in Helicobacter sp. FEMS Microbiol. Lett., 1998; 161: 263-273
[PubMed]  

[28] Ju J., Luo T., Haldenwang W.G.: Forespore expression and processing of the SigE transcription factor in wild-type and mutant Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 1998; 180: 1673-1681
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[29] Lemon K.P., Grossman A.D.: Localization of bacterial DNA polymerase: evidence for a factory model of replication. Science, 1998; 282: 1516-1519
[PubMed]  

[30] Lewis P.J., Errington J.: Use of green fluorescent protein for detection of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. Microbiology, 1996; 142: 733-740
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[31] Lin D.C., Levin P.A., Grossman A.D.: Bipolar localization of a chromosome partition protein in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997; 94: 4721-4726
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[32] Löwe J., Amos L.A.: Evolution of cytomotive filaments: the cytoskeleton from prokaryotes to eukaryotes. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2009; 41: 323-329
[PubMed]  

[33] Ma X., Ehrhardt D.W., Margolin W.: Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 93: 12998-13003
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[34] Maddock J.R., Shapiro L.: Polar location of the chemoreceptor complex in the Escherichia coli cell. Science, 1993; 259: 1717-1723
[PubMed]  

[35] Marston A.L., Errington J.: Dynamic movement of the ParA-like Soj protein of B. subtilis and its dual role in nucleoid organization and developmental regulation. Mol. Cell, 1999; 4: 673-682
[PubMed]  

[36] Marston A.L., Thomaides H.B., Edwards D.H., Sharpe M.E., Errington J.: Polar localization of the MinD protein of Bacillus subtilis and its role in selection of the mid-cell division site. Genes Dev., 1998; 12: 3419-3430
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[37] Mizuno H., Sawano A., Eli P., Hama H., Miyawaki A.: Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. Biochemistry, 2001; 40: 2502-2510
[PubMed]  

[38] Onogi T., Niki H., Yamazoe M., Hiraga S.: The assembly and migration of SeqA-Gfp fusion in living cells of Escherichia coli. Mol. Microbiol., 1999; 31: 1775-1782
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[39] Patterson G.H., Lippincott-Schwartz J.: A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science, 2002; 297: 1873-1877
[PubMed]  

[40] Phillips G.J.: Green fluorescent protein – a bright idea for the study of bacterial protein localization. FEMS Microbiol. Lett., 2001; 204: 9-18
[PubMed]  

[41] Pogliano J.: The bacterial cytoskeleton. Curr. Opin. Cell Biol., 2008; 20: 19-27
[PubMed]  

[42] Price K.D., Losick R.: A four-dimensional view of assembly of a morphogenetic protein during sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 1999; 181: 781-790
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[43] Ptacin J.L., Nollmann M., Becker E.C., Cozzarelli N.R., Pogliano K., Bustamante C.: Sequence-directed DNA export guides chromosome translocation during sporulation in Bacillus subtilis. Nat. Struct. Mol. Biol., 2008; 15: 485-493
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[44] Quisel J.D., Lin D.C., Grossman A.D.: Control of development by altered localization of a transcription factor in B. subtilis. Mol. Cell, 1999; 4: 665-672
[PubMed]  

[45] Rajagopalan M., Maloney E., Dziadek J., Poplawska M., Lofton H., Chauhan A., Madiraju M.V.: Genetic evidence that mycobacterial FtsZ and FtsW proteins interact, and colocalize to the division site in Mycobacterium smegmatis. FEMS Microbiol. Lett., 2005; 250: 9-17
[PubMed]  

[46] Raskin D.M., de Boer P.A.: The MinE ring: an FtsZ-independent cell structure required for selection of the correct division site in E. coli. Cell, 1997; 91: 685-694
[PubMed]  

[47] Raskin D.M., de Boer P.A.: Rapid pole-to-pole oscillation of a protein required for directing division to the middle of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999; 96: 4971-4976
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[48] Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N., Palmer A.E., Tsien R.Y.: Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol., 2004; 22: 1567-1572
[PubMed]  

[49] Shaner N.C., Patterson G.H., Davidson M.W.: Advances in fluorescent protein technology. J. Cell Sci., 2007; 120: 4247-4260
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[50] Shapiro L., McAdams H.H., Losick R.: Why and how bacteria localize proteins. Science, 2009; 326: 1225-1228
[PubMed]  

[51] Shih Y.L., Fu X., King G.F., Le T., Rothfield L.: Division site placement in E. coli: mutations that prevent formation of the MinE ring lead to loss of the normal midcell arrest of growth of polar MinD membrane domains. EMBO J., 2002; 21: 3347-3357
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[52] Shih Y.L., Le T., Rothfield L.: Division site selection in Escherichia coli involves dynamic redistribution of Min proteins within coiled structures that extend between the two cell poles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: 7865-7870
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[53] Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y.: Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol., 1962; 59: 223-239
[PubMed]  

[54] Sievers J., Errington J.: The Bacillus subtilis cell division protein FtsL localizes to sites of septation and interacts with DivIC. Mol. Microbiol., 2000; 36: 846-855
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[55] Sourjik V., Berg H.C.: Localization of components of the chemotaxis machinery of Escherichia coli using fluorescent protein fusions. Mol. Microbiol., 2000; 37: 740-751
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[56] Stricker J., Maddox P., Salmon E.D., Erickson H.P.: Rapid assembly dynamics of the Escherichia coli FtsZ-ring demonstrated by fluorescence recovery after photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002; 99: 3171-3175
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[57] Sun J., Kelemen G.H., Fernández-Abalos J.M., Bibb M.J.: Green fluorescent protein as a reporter for spatial and temporal gene expression in Streptomyces coelicolor A3(2). Microbiology, 1999; 145: 2221-2227
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[58] Vaknin A., Berg H.C.: Single-cell FRET imaging of phosphatase activity in the Escherichia coli chemotaxis system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004; 101: 17072-17077
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[59] Viollier P.H., Thanbichler M., McGrath P.T., West L., Meewan M., McAdams H.H., Shapiro L.: Rapid and sequential movement of individual chromosomal loci to specific subcellular locations during bacterial DNA replication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004; 101: 9257-9262
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[60] Waidner B., Specht M., Dempwolff F., Haeberer K., Schaetzle S., Speth V., Kist M., Graumann P.L.: A novel system of cytoskeletal elements in the human pathogen Helicobacter pylori. PLoS Pathog., 2009; 5: e1000669
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[61] Webb C.D., Decatur A., Teleman A., Losick R.: Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 1995; 177: 5906-5911
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[62] Wehrl W., Niederweis M., Schumann W.: The FtsH protein accumulates at the septum of Bacillus subtilis during cell division and sporulation. J. Bacteriol., 2000; 182: 3870-3873
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[63] Weiss D.S., Chen J.C., Ghigo J.M., Boyd D., Beckwith J.: Localization of FtsI (PBP3) to the septal ring requires its membrane anchor, the Z ring, FtsA, FtsQ, and FtsL. J. Bacteriol., 1999; 181: 508-520
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[64] Wery M., Woldringh C.L., Rouviere-Yaniv J.: HU-GFP and DAPI co-localize on the Escherichia coli nucleoid. Biochimie, 2001; 83: 193-200
[PubMed]  

[65] Wheeler R.T., Shapiro L.: Differential localization of two histidine kinases controlling bacterial cell differentiation. Mol. Cell, 1999; 4: 683-694
[PubMed]  

[66] Yamaichi Y., Duigou S., Shakhnovich E.A., Waldor M.K.: Targeting the replication initiator of the second Vibrio chromosome: towards generation of vibrionaceae-specific antimicrobial agents. PLoS Pathog., 2009; 5: e1000663
[PubMed]  

[67] Yu X.C., Tran A.H., Sun Q., Margolin W.: Localization of cell division protein FtsK to the Escherichia coli septum and identification of a potential N-terminal targeting domain. J. Bacteriol., 1998; 180: 1296-1304
[PubMed]  

Autorki deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu