Streszczenie

Zakażenia pałeczkami należącymi do rodziny Enterobacteriaceae są jednym z poważniejszych problemów współczesnego społeczeństwa. Chociaż niektóre gatunki obecne w przewodzie po­karmowym człowieka nie wywołują objawów chorobowych, to znaczna część tej rodziny została uznana za ważne patogeny. Szczepy z rodzajów Shigella, Salmonella, Escherichia czy Yersinia, są bezpośrednią przyczyną biegunek, czerwonki bakteryjnej, duru brzusznego i innych schorzeń jelitowych, a także zakażeń układu moczowo-płciowego, czy krwionośnego. Według WHO na 4,5 miliarda przypadków zachorowań, zatrucia pokarmowe są przyczyną śmierci 1,9 mln osób rocznie i pod względem śmiertelności zajmują trzecie miejsce wśród chorób trapiących ludzi na całym świecie. W pracy omówiono wybrane zagadnienia dotyczące metod identyfikacji czyn­nika etiologicznego zakażeń, mechanizmu wnikania bakterii i zakażenia organizmu gospodarza oraz charakteru wzbudzanej odpowiedzi układu odpornościowego. Opisano mechanizmy leko­oporności pałeczek jelitowych oraz możliwości leczenia i zapobiegania zakażeniom przez do­skonalenie metod detekcji, konstruowanie szczepionek i zastosowanie szczepień ochronnych. Szczególną uwagę zwrócono na białko OMP38 wyizolowane ze ściany komórkowej S. flexneri 3a, które dzięki zdolności do wzbudzania odpowiedzi komórkowej i humoralnej jest potencjal­nym antygenem lub nośnikiem do szczepionki koniugatowej.

Słowa kluczowe:Enteriobacteriaceae • zakażenia jelitowe • Shigella • oporność na antybiotyki • białka błony zewnętrznej • odporność • szczepionka

Summary

Intestinal infections caused by rod-shaped bacteria of the Enterobacteriaceae genus are one of the major health hazards in countries where sanitation standards are low. Strains of Shigella, Salmonella, Escherichia and Yersinia are responsible for diarrhea, severe bacillary dysentery, typhoid, other intestinal diseases, as well as genitourinary tract and blood infections. According to the WHO there are 4.5 billion cases every year, of which 1.9 million end in death. This ma­kes intestinal infections third in terms of human disease mortality. In this work we discuss me­thods of pathogen identification, the mechanism of host-pathogen interaction, and the nature of the host’s immunological response. Due to rising drug resistance we discuss the importance of better pathogen detection, vaccine design and the use of vaccines as a preventive measure aga­inst intestinal infections. Special attention is paid to OMP38, a protein isolated from S. flexneri 3a outer membrane. Since it is known that this protein has good immunogenic properties, it can be used as an antigen or carrier for conjugate vaccines.

Key words:Enterobacteriaceae • intestinal infection • Shigella • antibiotic resistance • OMP • immunity • vaccine

Rodzina Enterobacteriaceae

Mikroflorę przewodu pokarmowego człowieka tworzy około 400-500 gatunków różnorodnych mikroorgani­zmów. Szacuje się, że w organizmie dorosłego osobnika na każdy gram treści jelitowej przypada około 10¹¹-10¹² mikroorganizmów, co sugeruje, że drobnoustroje stano­wią około 1 kg masy ludzkiego ciała [16]. Florę bakte­ryjną przewodu pokarmowego u ludzi stanowią zarówno drobnoustroje, korzystnie wpływające na zdrowie gospo­darza, jak i szkodliwe patogeny. Zachwianie równowa­gi między liczbą występujących mikroorganizmów nale­żących do obydwu tych grup, może prowadzić do wielu poważnych schorzeń [38]. Drobnoustroje należące do rodziny Enterobacteriaceae tworzą dużą grupę bakte­rii, podobnych pod względem morfologicznym i fizjo­logicznym. Wykazują one również duże podobieństwo pod względem cech antygenowych i genetycznych [77]. Enterobacteriaceae, a zwłaszcza tolerujące tlen gatunki E. coli, są uważane za jedną z najbardziej charakterystycznych grup zasiedlających przewód pokarmowy człowieka, mimo że pod względem liczebności nie stanowią w nim przewa­żającej większości. Innymi przedstawicielami tej rodziny, obecnymi w układzie pokarmowym są gatunki z rodzaju: Citrobacter, Enterobacter i Klebsiella, będące również fa­kultatywnymi beztlenowcami [30,38]. Większość bakterii należących do rodziny Enterobacteriaceae to nieszkodliwe i niewywołujące objawów chorobowych gatunki występu­jące w wodzie, zamieszkujące przewód pokarmowy czło­wieka i powierzchnię jego skóry. Znaczna grupa bakterii z tej rodziny to drobnoustroje oportunistyczne, stanowią­ce zagrożenie dla osób w podeszłym wieku, osłabionych, chorych lub będących w stanie supresji immunologicznej [43]. Przeważająca większość bakterii obecnych w prze­wodzie pokarmowym jest nieszkodliwa dla człowieka, jednak niektóre gatunki z rodziny Enterobacteriaceae uznawane są za organizmy patogenne, odpowiedzialne za zakażenia różnego typu, w tym schorzenia jelitowe [115]. Istnieje grupa patogenów, takich jak przedstawiciele ro­dzajów Shigella, Salmonella, Escherichia czy Yersinia, będących głównymi czynnikami zakażeń pokarmowych (ryc. 1) [50,59,67].

Ryc. 1. Patogenność szczepów należących do rodziny Enterobacteriaceae

Bakteryjne zakażenia pokarmowe wywoływane przez pa­łeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae są bezpo­średnią przyczyną biegunek, czerwonki bakteryjnej, duru brzusznego i innych dolegliwości jelitowych, które są jed­nym z poważniejszych problemów współczesnego społe­czeństwa. Zmagają się z nimi przede wszystkim ludzie zamieszkujący kraje, gdzie zarówno standard życia, jak i higiena sanitarna znajdują się na niskim poziomie, a do­stęp do czystej wody pitnej jest ograniczony. Wszystkie te czynniki przyspieszają rozprzestrzenianie się zatruć jelitowych [33]. Zakażenia te są szczególnie groźne u dzie­ci z niedojrzałym lub uszkodzonym układem odpornościo­wym, których organizm skłonny jest do szybkich odwod­nień [68]. Według Światowej Organizacji Zdrowia (World Health Organization – WHO) na prawie 4,5 miliarda przy­padków – zatrucia pokarmowe są przyczyną śmierci 1,9 miliona osób rocznie i pod względem śmiertelności zaj­mują trzecie miejsce wśród chorób trapiących ludzkość na całym świecie. Ponadto szacuje się, że do około 99% wszystkich zgonów dochodzi w krajach słabo rozwinię­tych [33,118]. Wysoki odsetek zgonów notuje się wśród noworodków i dzieci poniżej piątego roku życia (ryc. 2).

Ryc. 2. Diagram ilustrujący przyczyny śmierci dzieci poniżej 5 roku życia [118]

W konsekwencji w krajach rozwijających się, gdzie dzie­ci są narażone nawet na 12 zakażeń jelitowych rocznie; procent śmiertelności spowodowany zakażeniami prze­wodu pokarmowego waha się w granicach 15-34% [33]. W ostatnich latach potwierdzono wyniki badań sugerujące, że przebyte we wczesnym dzieciństwie zatrucia pokarmo­we mają swoje negatywne konsekwencje w późniejszym okresie życia, co może się objawiać np. osłabioną poten­cją i reproduktywnością [39]. Mimo że epidemie czerwon­ki czy duru brzusznego występują przeważnie na terenach o słabym stopniu uprzemysłowienia, są one przenoszone także na inne regiony, głównie poprzez geograficzne prze­mieszczanie się ludności: uchodźców, żeglarzy czy tury­stów [33]. Z danych statystycznych wynika, że prawie 50% wszystkich podróżujących do krajów Trzeciego Świata zostaje dotkniętych tzw. „biegunką podróżnych” [25]. Jej podstawowa przyczyna to spożycie żywności i wody zaka­żonych bakteriami (85% przypadków), pasożytami (10%) czy wirusami (5%) [73].

Diagnostyka zakażeń pałeczkami jelitowymi

Poznanie etiologii zakażenia i identyfikacja patogenu, mają fundamentalne znaczenie dla podjęcia właściwego lecze­nia. Czynniki etiologiczne chorób oraz mechanizmy pa­togenności bakterii z rodziny Enterobacteriaceae zostały w większości poznane. Należy jednak zauważyć, że bar­dzo duża liczba przypadków zakażeń notowanych w kra­jach słabo rozwiniętych, nie pozwala na szybką diagnozę choroby i rozpoczęcie leczenia. Prawidłowa identyfikacja poszczególnych patogenów jest tam możliwa jedynie w la­boratoriach badawczych, które nie tylko nie są w stanie działać usługowo na szeroką skalę, lecz nie zawsze mogą sprostać chociażby obsłudze potrzeb miejscowych szpita­li [36]. Nowoczesne metody szybkiej diagnostyki zakażeń jelitowych, dające wiarygodne i dokładne wyniki, wyma­gają najczęściej zarówno dużych nakładów finansowych, jak i czasowych.

Jedną z pierwszych i najczęściej stosowanych metod iden­tyfikacji mikroorganizmów było określanie ich zdolności do przeprowadzania charakterystycznych dla nich reakcji biochemicznych. Testy metaboliczne opierają się na typo­waniu bakterii na podstawie obecności swoistych aktyw­ności enzymatycznych, świadczących o obecności danego enzymu w badanych komórkach. Na przykład bakterie bę­dące Gram-ujemnymi pałeczkami, bezwzględnie lub fakul­tatywnie tlenowymi, fermentujące glukozę oraz wykazujące ujemną reakcję oksydazy, należy – uwzględniając charakte­rystykę metaboliczną bakterii z rodziny Enterobacteriaceae – zakwalifikować do tej grupy pod warunkiem, że rosną na agarze MacConkeya [3]. Możliwość identyfikacji po­szczególnych gatunków z rodziny Enterobacteriaceae daje hodowla bakterii na podłożu agarowym z dodatkiem żół­ci i eskuliny. Niektóre szczepy mają zdolność hydrolizy eskuliny do eskuletyny i glukozy. Eskuletyna w obecno­ści jonów Fe³⁺ tworzy zielono-oliwkowe, prawie czarne kompleksy. Na tej podstawie można zidentyfikować ta­kie szczepy, jak np. Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens i Serratia rubidaea. Bakterie te wykazują zdolność do hy­drolizy eskuliny w 100% w czasie 4 godzin. Jednocześnie metoda ta pozwala na wykluczenie w badanym materiale obecności takich szczepów, jak: Shigella sonnei, Arizona hinshawii, Proteus mirabilis, Proteus morganii, Providencia alcalifaciens, Providencia stuartii czy różnych gatunków Salmonella, ze względu na brak zdolności wymienionych szczepów do hydrolizy eskuliny [69]. Hydroliza eskuliny jest tylko jednym z wielu popularnych testów pozwalających na identyfikację pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae. Inne stosowane w bakteriologii testy biochemiczne opiera­ją się na zdolności poszczególnych szczepów do fermenta­cji glukozy, melibiozy, czy ramnozy, wytwarzaniu indolu, dekarboksylacji niektórych aminokwasów, takich jak np. lizyna, arginina, kwas glutaminowy, czy ureazy powodu­jącej rozkład mocznika itp.

U bakterii należących do rodzaju Shigella należy się spo­dziewać następujących cech metabolicznych: zdolności do fermentacji glukozy, wzrostu na agarze MacConkeya oraz fermentacji laktozy. Jednocześnie rodzaj ten powinien wy­kazywać ujemny wynik w teście wytwarzania siarkowodo­ru (wykrywany np. w teście z octanem ołowiu tworzącym w obecności H₂S nierozpuszczalny, czarny siarczek oło­wiu). Negatywny odczyn Voges-Proskauera (wytwarzanie acetoiny – acetylometylokarbinolu, produktu pośredniego w szlaku wytwarzania glikolu butylenowego), brak aktyw­ności ureazy w teście z mocznikiem, brak aktywności de­aminazy fenyloalaniny (test PAD) oraz brak ruchliwości w 22°C, to również cechy metaboliczne charakterystycz­ne dla bakterii rodzaju Shigella [3]. Należy jednak zauwa­żyć, że pojawiają się prace wskazujące na istnienie zdol­ności do ruchu bakterii tego rodzaju [34]. Ze względu na podobieństwo bakterii z rodzajów Shigella i Escherichia istnieje wiele technik pozwalających na ich różnicowanie. W praktyce rodzaj Shigella różnicuje się stwierdzając nie­zdolność komórek do ruchu i dekarboksylacji lizyny oraz niezdolność wielu szczepów do fermentacji laktozy [21]. Do różnicowania tych dwóch rodzajów pałeczek lub do ich selektywnej hodowli, wykorzystywane są również podło­ża selektywne zawierające związki selenu. Podłoża sele­nowe są bardziej toksyczne dla pałeczek Escherichia niż Salmonella lub Shigella i mogą służyć do wybiórczego na­mnożenia dwóch ostatnich z wymienionych rodzajów bak­terii obecnych w badanej próbce [21].

Wyniki uzyskiwane za pomocą wyżej wymienionych tech­nik pozwalają zawęzić krąg poszukiwań czynnika etiolo­gicznego. Nie dają one jednak pełnej gwarancji, że dany szczep został precyzyjnie zidentyfikowany, gdyż więk­szość szczepów bakterii jest zdolna do przeprowadzania wielu reakcji biochemicznych. Wadą tej metody jest rów­nież to, że jest ona bardzo praco- i czasochłonna [95]. Inne opracowane testy diagnostyczne opierają się na immuno­chemicznej detekcji specyficznych markerów, takich jak np. toksyny, czy na oznaczaniu serotypu lipopolisacha­rydów (LPS), wytwarzanych przez poszczególne szcze­py. Identyfikację bakterii z rodzaju Shigella umożliwiają również techniki elektroforezy w polu impulsowym (pul­sed field gel electrophoresis – PFGE). Po lizie komórek bakteryjnych w buforowanym roztworze zawierającym de­tergent oraz środki chelatujące (np. SDS, EDTA), prowa­dzi się trawienie uzyskanego materiału enzymami prote­olitycznymi. Kolejnym etapem identyfikacji jest trawienie uwolnionego materiału genetycznego enzymami restryk­cyjnymi i elektroforeza uzyskanych fragmentów DNA w polu impulsowym oraz analiza rodzaju i rozkładu uzyska­nych fragmentów. Identyfikację bakterii z rodzaju Shigella umożliwia traktowanie materiału proteinazą K, a następ­nie enzymami restrykcyjnymi XbaI lub SfiI; po elektrofo­rezie otrzymuje się 15-23 fragmentów DNA o wielkości 10-700 par zasad (pz) [149].

Rozprzestrzenianie się zakażeń pokarmowych wywoływa­nych przez poszczególne patogeny w dużej mierze zwią­zane jest z wiekiem zakażonych oraz regionem, w jakim schorzenia te występują. Zakażenia pokarmowe powodo­wane infekcjami wirusowymi są główną przyczyną bie­gunek w krajach uprzemysłowionych. Z kolei biegunko­genne szczepy E.coli (DEC), będące przyczyną zakażeń bakteryjnych, występują zarówno w krajach rozwiniętych jak i rozwijających się [10]. Większość danych epidemio­logicznych, pochodzących z krajów rozwijających się i do­tyczących biegunek wywołanych patogenami bakteryjnymi jest nieuporządkowana i rozproszona. Dotyczy to w szcze­gólności patogennych szczepów E. coli. Do tej pory w kra­jach słabo rozwiniętych nie był dostępny żaden test diagno­styczny umożliwiający rozróżnienie wszystkich patogenów związanych z biegunkami szczepów E. coli (EHEC – ente­rokrwotoczne; EPEC – enteropatogenne; EAEC – entero­agregacyjne; ETEC – enterotoksyczne; DAEC – dyfuzyj­no-adherentne; EIEC – enteroinwazyjne). Jedyną dostępną i stosowaną tam metodą detekcji oraz identyfikacji bakterii jest analiza kału, której wyniki uzyskiwane są najwcześniej po 24 godzinach, a stosowany test nie pozwala na stwierdze­nie czy pochodzące z kału bakterie to patogenne pałeczki E. coli [36]. W związku z tym, wywołujące biegunki pałeczki E. coli, a zwłaszcza te należące do grupy EAEC, mogą nie zostać zidentyfikowane, jako groźne dla zdrowia patogeny, ponieważ nie zostaną wykryte podczas rutynowych analiz laboratoryjnych [88]. Biegunkogenne szczepy E. coli (DEC) zostały podzielone na 6 grup ze względu na ich specyficz­ne czynniki wirulencji. Szczepy ETEC wywołują biegunki wskutek wytwarzania ciepłostabilnych (ST) i ciepłolabil­nych (LT) endotoksyn. Szczepy EIEC są blisko spokrew­nione ze szczepami Shigella, a ich geny wirulencji przeno­szone są na plazmidzie pINV. Toksyna Shiga wytwarzana przez enterokrwotoczne szczepy E. coli (STEC/EHEC) po­woduje zarówno biegunkę niekrwotoczną, jak i krwotocz­ne zapalenie okrężnicy, które może prowadzić do zespołu hemolityczno-mocznicowego (HUS – haemolytic ureamic syndrome). Do czynników wirulencji EHEC należą tok­syny Shiga 1 i 2 (Stx1, Stx2) i wyspy patogenności LEE („locus of enterocyte effacement”). Szczepy EPEC przy­legają do ścian jelita cienkiego, a wskutek działania czyn­ników wirulencji kodowanych na wyspach patogenności LEE, wywołują zmiany histopatologiczne prowadzące do zniszczenia struktury mikrokosmków i w konsekwencji do zaburzeń transportu elektrolitów. Szczepy mające plazmi­dy kodujące czynniki adherencji EPEC (EAF – EPEC ad­herence factor) zostały nazwane „typowymi” EPEC, pod­czas gdy szczepy bez EAF nazwano „nietypowymi” EPEC. Drobnoustroje z grupy EAEC są najczęściej diagnozowa­ne u dzieci z ostrą biegunką, u ludzi zakażonych wirusem HIV lub dotkniętych biegunką podróżnych [45]. Biorąc pod uwagę, że sama charakterystyka morfologii bakterii i oznaczenie przeprowadzanych przez nie reakcji bioche­micznych, nie są wystarczające do ich identyfikacji, zaczę­to drobnoustroje charakteryzować metodami PCR (PCR – polymerase chain reaction). Różnorodne techniki PCR umożliwiające zidentyfikowanie genów kodujących czynni­ki wirulencji zostały opisane w wielu pracach [49,89,107].

Rodzaj Shigella, podobnie jak Salmonella, E. coli, Yersinia, Campylobacter, Listeria i Vibrio, to grupa bakterii będą­cych najczęstszą przyczyną chorób zakaźnych przenoszo­nych przez żywność. Na świecie prowadzonych jest wiele krajowych i międzynarodowych programów monitorowa­nia zakażeń wywoływanych przez tę grupę drobnoustrojów. Wykorzystanie metod biologii molekularnej ułatwia ich de­tekcję. O obecności pałeczek z rodzaju Shigella świadczy wykrycie w badanej próbce sekwencji genu ipaD (ozna­czonego jako SHIG1), a gatunek Shigella flexneri o sero­typie 2a można dodatkowo zróżnicować poprzez obecność genu ipaH (SHIG2) [44]. Obecnie dostępne są komer­cyjne systemy wykrywania patogennych bakterii z rodzi­ny Enterobacteriaceae wykorzystujące reakcję PCR ilo­ściowego (RT-PCR – real time PCR, qPCR – quantitative PCR). W systemie potrójnego PCR (triplex PCR) możli­wa jest detekcja bakterii z rodzaju Salmonella, Shigella oraz Campylobacter [78]. Metody biologii molekularnej nie zawsze jednak prowadzą do pewnej identyfikacji bak­terii z rodziny Enterobacteriaceae. Sekwencjonowanie DNA kodującego rybosomalne 16S RNA (16S rDNA) może prowadzić do pomyłek w identyfikacji gatunków E. coli oraz Shigella flexneri, w których geny te są identyczne [150]. Należy w takich przypadkach przeprowadzić dodat­kowe różnicowanie związane ze wzrostem na podłożu se­lektywnym Salmonella-Shigella lub testami metabolicz­nymi (np. test indolowy, badający zdolność organizmu do hydrolizy tryptofanu do indolu). Do różnicowania wyko­rzystywany jest również agar cytrynianowy Simmonsa, w którym kwas cytrynowy stanowiący jedyne źródło wę­gla, umożliwia wzrost bakterii z rodzaju Salmonella, lecz nie Escherichia bądź Shigella [21].

Niedawno opisana przez Hardegena i wsp. [45] technika Multiplex TaqMan PCR jednocześnie pozwala na detekcję szczepów ETEC, EIEC, EHEC, EPEC i EAEC w badanej próbce, czyli aż pięciu z wszystkich sześciu grup biegun­kogennych szczepów E. coli DEC. Do identyfikacji EPEC Hardegen i wsp. [45] użyli dwóch sekwencji matrycowych: jedną składającą się z 107 pz sekwencję plazmidu kodują­cą czynnik adherencji E. coli (EAF) i drugą złożoną z 189 pz sekwencję genu intiminy (eae). Sekwencją matrycową do wykrycia tą metodą EAEC była sekwencja plazmidu pCVD432 (152 pz). Drugi Multiplex TaqMan PCR posłu­żył do wykrycia szczepów ETEC i EIEC w badanych prób­kach. Matrycą dla ETEC był fragment genu ST (107 pz) oraz sekwencja genu LT (113 pz), a dla EIEC sekwencja plazmidu wirulencji pINV (107 pz), najważniejszego dla inwazyjności tych szczepów. Trzecia analiza PCR umoż­liwiła detekcję szczepów EHEC dzięki zastosowaniu ma­trycy 87 pz toksyny Shiga 1 (Stx1) i matrycy 82 pz toksy­ny Shiga 2 (Stx2). Metoda ta należy do jednej z najbardziej czułych, najdokładniejszych i najszybszych technik iden­tyfikacji mikroorganizmów, lecz nie jest pozbawiona wad [45]. Wiadomo, że przeprowadzenie samej reakcji PCR nie jest czasochłonne i w krótkim czasie mamy dostęp do wyników analizy. Duża czułość tej metody może być tak­że jej wadą. Nawet niewielkie zanieczyszczenie badanej próbki materiałem DNA obcego pochodzenia i jego am­plifikacja, może dać niemiarodajne rezultaty. Metoda ta może także dawać fałszywe wyniki w przypadku detekcji DNA bakteryjnego u pacjentów po zastosowaniu wstępnej terapii przeciwbakteryjnej. W takim przypadku nie można określić, czy DNA wykryte w próbce pochodzi od żywego, czy już martwego patogenu. Należy podkreślić także, że wykrycie DNA drobnoustroju testem PCR bez wystąpie­nia objawów klinicznych u pacjenta, nie musi oznaczać, że choroba wystąpiła na pewno. Znane są przypadki wy­krycia DNA paciorkowców Streptococcus pneumoniae w krwi osobników bez jakichkolwiek objawów chorobo­wych. Ponadto niewątpliwą wadą tej metody jest również koszt wykonania testu, który szacuje się na około 125 do­larów kanadyjskich [74]. Kraje, w których poziom higieny sanitarnej pozostawia wiele do życzenia, borykają się za­tem nie tylko z problemami zakażeń jelitowych, lecz także z ograniczonymi możliwościami ich szybkiego diagnozo­wania, a co za tym idzie – skutecznego leczenia. Dlatego też niezwykle potrzebne jest ogólnodostępne narzędzie o dużej swoistości i czułości, które jednocześnie będzie umożliwiało przeprowadzenie szybkiego testu, potwier­dzającego obecność patogennych bakterii.

Obiecującą metodą pozwalającą na szybką identyfikację bakterii jest technika spektrometrii masowej. Najczęściej wykorzystywana jest technika jonizacji próbki poprzez desorpcję laserem z matrycy połączonej z pomiarem cza­su przelotu jonów (MALDI-TOF MS – matrix assisted la­ser desorption/ionisation – time of flight mass spectrome­try). W technice tej próbka mierzona umieszczana jest wraz z substancją wspomagającą jonizację – matrycą – na płytce podłożowej i suszona. Promień lasera przeprowadza obojęt­ne cząsteczki próbki w naładowane jony, które z kolei ule­gają przyspieszeniu w polu elektrycznym. Pomiar czasu ich przelotu pozwala na precyzyjne określenie ich masy czą­steczkowej. W przypadku analizy całych komórek bakte­ryjnych, analizowany jest cały profil masowy składający się z wszystkich cząsteczek komórki ulegających w danych wa­runkach jonizacji. Przy analizie szczepu wzorcowego uzy­skany profil masowy, po wprowadzeniu do bazy danych, służy jako próba wzorcowa do określenia gatunku bakterii w badanej próbce [130]. Analiza przeprowadzana tą techni­ką jest szybka i pomijając koszt aparatury jest tania, a licz­ba gatunków i szczepów w dostępnych bazach danych sys­tematycznie rośnie. Automatyzacja zarówno przygotowania próbek, jak i samej analizy masowej oraz obróbki danych, umożliwia szybkie badanie dużej liczby szczepów. Technika ta ma jednak wiele ograniczeń, do których należy koniecz­ność wcześniejszej klasyfikacji badanego preparatu meto­dą Grama, ze względu na różnice w protokole przygotowy­wania próbki oraz ograniczenie identyfikacji do szczepów objętych przez dostępną bazę danych. Poważną trudność stanowi analiza preparatów, które nie są czystymi kultu­rami pojedynczego szczepu. Problematyczna jest również analiza blisko spokrewnionych szczepów, dla których uzy­skane profile masowe będą bardzo zbliżone lub identycz­ne [20]. Technika MALDI-TOF MS znalazła w biochemii niezwykle szerokie zastosowanie w analizach proteomicz­nych, sekwencjonowaniu i analizie strukturalnej cząsteczek białkowych. Mimo wymienionych ograniczeń dotyczących analizy profili masowych do celów identyfikacji mikrobio­logicznej, technika ta jest intensywnie rozwijana i jej wyko­rzystanie w przyszłości będzie z pewnością coraz szersze.

Oporność bakterii na antybiotyki

Zastosowanie antybiotyków w terapii zakażeń bakteryj­nych umożliwiło leczenie wielu groźnych dla zdrowia in­fekcji, co przyczynia się do poprawy jakości i wydłużenia średniego okresu życia ludzkiego, zwłaszcza w krajach rozwiniętych. Jednak niekontrolowane i nieograniczo­ne użycie ich w medycynie, weterynarii, rolnictwie czy w przemyśle spożywczym spowodowało ich powszech­ną obecność w środowisku. Presja selekcyjna wywierana przez wysokie stężenie antybiotyków w środowisku spra­wia, że bakterie wykształcają przeciwko nim swoiste me­chanizmy obronne, a to z kolei jest powodem stale rosną­cej oporności bakterii na stosowane antybiotykoterapie. Miejscami szczególnie sprzyjającymi rozwojowi szcze­pów opornych są miejsca wysokiej koncentracji antybio­tyków, na przykład ścieki komunalne, zwłaszcza w pobli­żu ośrodków szpitalnych. Ścieki przemysłowe uchodzące często do rzek i zbiorników wodnych są bogate w anty­biotyki i bakterie oporne na antybiotyki – w szczególno­ści bakterie z rodziny Enterobacteriaceae [37].

Wśród bakterii Gram-ujemnych należących do rodzi­ny Enterobacteriaceae, są patogeny wywołujące za­każenia układu moczowego (E. coli), pokarmowego (Salmonella, Shigella, E. coli) i krwionośnego (Yersinia enterocolitica), a także powodujące zapalenia płuc (Klebsiella, Enterobacter). Większość gatunków bakterii należących do rodziny pałeczek jelitowych może być tak­że przyczyną zapalenia otrzewnej czy dróg żółciowych. Wymienione infekcje to często skutek zakażeń szpitalnych lub zaniedbań ze strony systemu ochrony zdrowia. Dlatego też wobec zagrożenia, jakim jest pojawianie się kolejnych szczepów bakterii opornych na antybiotyki, zagadnienia te wymagają od nas nieustannej uwagi [97]. Od odkrycia w 1959 roku oporności na antybiotyki przenoszonej przez plazmidy u szczepów Shigella wiadomo, że te ruchome elementy genetyczne odgrywają główną rolę w przeno­szeniu genów oporności wśród bakterii. Bakteryjna opor­ność na antybiotyki może zostać nabyta poprzez zmianę (mutację) w sekwencji DNA chromosomalnego lub wsku­tek przeniesienia elementów genetycznych przez plazmi­dy, bakteriofagi czy transpozony [136]. Plazmidy są do­datkowymi pozachromosomalnymi elementami, złożonymi z podwójnie skręconej kolistej cząsteczki DNA. Niektóre z nich, nazywane czynnikami R, zawierają geny kodują­ce mechanizmy oporności na antybiotyki. Plazmidy zdol­ne są do samoreplikacji, a część z nich dzięki koniugacji zdolna jest także do transfekcji innych bakterii, co z ko­lei może być przyczyną oporności na większą liczbę an­tybiotyków. Jedna komórka bakteryjna może jednocześnie przyjąć kilka różnych plazmidów [70]. Bakteriofagi, za­wierające cząsteczki DNA oraz białka są wirusami infeku­jącymi bakterie poprzez transdukcję. Mogą one przenosić informację genetyczną kodującą oporność na antybiotyki zawartą zarówno w ich własnych genach, jak i pochodzą­cą z transpozonów lub wcześniej zainfekowanych chromo­somów bakteryjnych [8]. Transpozony są także mobilnymi elementami genetycznymi, a ściślej mówiąc cząsteczkami DNA zdolnymi do samoistnej insercji wewnątrz plazmi­dów, chromosomów i bakteriofagów. Mogą one zawierać jeden lub kilka genów oporności na antybiotyki [4].

W procesie reprodukcji bakterii można wyznaczyć trzy główne, a zarazem fundamentalne procesy:
1) replikacja DNA, w której uczestniczą enzymy, takie jak polimeraza DNA i gyraza DNA;
2) transkrypcja (synteza RNA) z udziałem polimerazy RNA;
3) translacja (synteza białek), która przebiega w ryboso­mach złożonych z dwóch podjednostek 30S i 50S.

Ważnym procesem życiowym bakterii jest również synteza osłon zewnętrznych: ściany oraz zewnętrznej błony komór­kowej. Białka mogą w tych procesach pełnić funkcję kata­lityczną jako enzymy, strukturalną jako składniki błon lub regulatorową będąc represorami. Podczas tych trzech eta­pów rozwoju bakterii, antybiotyki, wpływając na działa­nie tych białek, mogą hamować lub uniemożliwiać wzrost i rozwój komórki [119].

Mechanizm oporności bakterii na antybiotyki może po­legać na:
• bezpośredniej inaktywacji aktywnej cząsteczki antybio­tyku,
• zmianie wrażliwości organizmu na lek poprzez mody­fikację miejsca oddziaływania z antybiotykiem lub
• redukcji stężenia leku w miejscu jego działania (ryc. 3) [103].

Ryc. 3. Mechanizmy oporności na antybiotyki; A – bezpośrednia inaktywacja cząsteczki leku, B – modyfikacja miejsca oddziaływania z antybiotykiem, C – redukcja stężenia leku w miejscu jego działania

Jednym z mechanizmów należących do pierwszej z wyżej wymienionych kategorii, jest synteza enzymów zdolnych do degradacji lub modyfikacji cząsteczek leków. Antybiotyki β-laktamowe oddziałują na białka wiążące penicylinę (PBPs – penicylin-binding protein), które są obecne na powierzch­ni błon cytoplazmatycznych. Białka te katalizują syntezę peptydoglikanu, który wchodzi w skład bakteryjnej ściany komórkowej. Najbardziej rozpowszechnionym mechani­zmem oporności na antybiotyki β-laktamowe jest synte­za białek zwanych β-laktamazami. Enzymy te inaktywują cząsteczkę leku poprzez rozcięcie wiązania amidowego we­wnątrz pierścienia β-laktamu [119]. Bakterie Gram-dodatnie, takie jak gatunki z rodzaju Staphylococcus wydzielają β-laktamazy na zewnątrz komórki, co uniemożliwia wniknię­cie cząsteczki leku do ich wnętrza. W przypadku bakterii Gram-ujemnych enzymy te są ulokowane w przestrzeni pe­ryplazmatycznej. Dlatego też antybiotyk, który pokona ba­rierę błony zewnętrznej, przedostając się przez poryny, jest inaktywowany w tym miejscu, czyli jeszcze przed związa­niem się do PBPs. Wśród Enterobacteriaceae znane są dwa główne typy β-laktamaz: TEM-1, TEM-2 (popularne szcze­gólnie wśród szczepów E. coli i K. pneumoniae) i SHV-1 (najczęściej występujące u K. pneumoniae), kodowanych na plazmidach i transpozonach [97,98,119].

Za hydrolizę pierścienia β-laktamu odpowiedzialna jest resz­ta Ser70, umiejscowiona w miejscu aktywnym β-laktamazy. Zamiana jednego, dwóch lub trzech aminokwasów położonych blisko miejsca aktywnego enzymu, może spowodować zmiany w hydrolizie substratu. Jest to szczególny rodzaj β-laktamaz o szerokim zakresie działania [55]. Pojawienie się oraz roz­przestrzenianie oporności na antybiotyki wśród pałeczek Enterobacteriaceae jest groźnym, wymagającym szczególnej uwagi zjawiskiem. W przypadku oporności na cefalospory­ny jednym z rozwiązań problemu była synteza cefalosporyn o szerokim zakresie (extended-spectrum cephalosporins), nie­wrażliwych na hydrolizę przez β-laktamazy TEM-1 i SHV-1. Niestety, w latach osiemdziesiątych XX w. okazało się, że wystąpienie nowej mutacji punktowej spowodowało, że en­zymy TEM-1 i SHV-1 nazwane β-laktamazami o szerokim zakresie (extended-spectrum β-lactamases – ESBLs), naby­ły zdolność do hydrolizy oksyimino-β-cefalosporyn (takich jak np. cefotaxime, cefpodoksym, ceftazimide) i aztreona­mu, zwanych ogólnie cefalosporynami trzeciej generacji. Syntetyzowanie przez bakterie β-laktamaz o szerokim za­kresie, jest jednym z najpoważniejszych problemów, związa­nych z rosnącą opornością bakterii na antybiotyki [56,97,141]. Z raportu Międzynarodowego Nadzoru Zakażeń Szpitalnych (NNIS – National Nosocomial Infections Surveillance) z 2003 roku wynika, że w Stanach Zjednoczonych aż 20,6% szcze­pów Klebsiella pneumoniae izolowanych od chorych z od­działów intensywnej terapii (ICUs – intensive care units), było opornych na cefalosporyny trzeciej generacji [97]. Oporność ta została także stwierdzona wśród szczepów Enterobacter (31,1%) oraz E. coli (5,8%) [99].

Innymi, odkrytymi nieco później β-laktamazami, były ESBLs typu CTX-M, które warunkowały oporność na cefotaxime, ceftriaxone i aztreonam [71]. Syntezę tych enzymów wy­kryto u szczepów E. coli, K. pneumoniae i K. oxytoca [141].

Poważnym problemem są także oporne na cefalosporyny trzeciej generacji pałeczki jelitowe z rodzaju Salmonella, które wytwarzają β-laktamazy AmpC (AmpC β-lactamases) [23]. Oporność ta jest w szczególności związana z plazmi­dem CMY-2 i powoduje, że szczepy Salmonella są niewraż­liwe na działanie leków, takich jak np. ceftriaxone. Cecha ta nie jest jeszcze szeroko rozpowszechniona wśród szcze­pów inwazyjnych w Stanach Zjednoczonych, jednakże jej nabycie przez szczepy wrażliwe jest kwestią czasu i wy­maga więc stałej obserwacji [97].

Wśród szczepów z rodziny Enterobacteriaceae wytwa­rzających ESBLs i wywołujących zakażenia przewodu pokarmowego, są niewrażliwe na działanie antybiotyków pałeczki: Salmonella, Shigella oraz wytwarzające toksy­nę Shiga szczepy E. coli [52,58,65,87,101]. Antybiotyki aminoglikozydowe, oddziaływając na mniejszą podjed­nostkę rybosomu (30S), utrudniają odczyt cząsteczki RNA podczas translacji, powodując wskutek tego skrócenie syn­tezy białka. Jednym z najbardziej powszechnych mechani­zmów inaktywacji tych leków, jest chemiczna modyfika­cja aminoglikozydu przez N-acetylację, O-nukleotydylację i O-fosforylację [42]. Enterobacteriaceae należą do orga­nizmów wykorzystujących ten właśnie mechanizm [119].

Acetylotransferaza chloramfenikolu jest enzymem indu­kującym acetylację dwóch grup hydroksylowych w czą­steczce chloramfenikolu. Po takiej modyfikacji antybiotyk ten staje się niezdolny do wiązania podjednostki 50S ry­bosomu, a tym samym nie pozwala na zablokowanie syn­tezy białek bakteryjnych. Enzym ten występuje zarówno u bakterii Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych, włącza­jąc w to m.in. Enterobacteriaceae [119]. Wśród pałeczek Enterobacteriaceae oporność na chloramfenikol charakte­ryzuje wiele szczepów E. coli i K. pneumoniae [7].

Białka wiążące penicylinę (PBPs) odgrywają bardzo waż­ną rolę w biosyntezie ściany komórkowej bakterii. Podczas syntezy peptydoglikanu uczestniczą one w reakcjach trans­peptydacji i transglikozylacji. Nadmierne wytwarzanie PBPs oraz mutacje w obrębie tych białek, powodujące zmniejszenie ich powinowactwa do β-laktamaz, należą do drugiej grupy wcześniej wymienianych mechanizmów oporności [142].

Innym przykładem modyfikacji genetycznej, powodują­cej zmianę powinowactwa enzymu do antybiotyku, jest zmiana w sekwencji gyrazy DNA. Enzym ten odpowiada za wprowadzanie superskrętów w DNA podczas replika­cji i transkrypcji. Chinolony to antybiotyki, które działają bakteriobójczo przez zahamowanie syntezy DNA patoge­nu wskutek inhibicji gyrazy. Wystąpienie u bakterii muta­cji w obrębie genów gyrazy powoduje utratę powinowac­twa enzymu do chinolonów i działanie tych antybiotyków staje się nieefektywne [119]. Stwierdzono, że wśród pałe­czek Enterobacteriaceae przyczyną oporności na chino­lony jest mutacja w obrębie genu gyrazy gyrA na kodonie 83, występująca zwłaszcza u szczepów E. coli, Citrobacter freundii i różnych gatunków Shigella [113].

Ostatni z wymienianych wcześniej mechanizmów oporno­ści bakterii na antybiotyki, polega na zmianie przepusz­czalności błony bakteryjnej, a co za tym idzie utrudnieniu przepływu przez nią antybiotyków. Wymiana makroczą­steczek między komórką a otaczającym ją środowiskiem jest możliwa dzięki białkom obecnym w błonie zewnętrz­nej (Omps – outer membrane proteins). Białka te zwane porynami są obecne w błonie zewnętrzej ściany komór­kowej bakterii Gram-ujemnych. Poryny, takie jak OmpF, mające kanały o większej średnicy, mogą być zastępowa­ne przez mniejsze poryny, takie jak OmpC. Taka zamiana zapobiega przedostawaniu się do wnętrza komórki więk­szych cząsteczek, takich jak np. ujemnie naładowana i wy­soce hydrofobowa karbenicylina [90]. Duże znaczenie dla stężenia leków w komórce bakteryjnej mają pompy jonowe obecne na powierzchni komórek bakteryjnych, które dzięki zdolności wykorzystania energii mogą zredukować koncen­trację antybiotyków w komórce do poziomu dla niej nie­toksycznego. E. coli jest jednym z gatunków wykorzystu­jących swoistość transportera kasety wiążącej ATP (ABC – ATP-binding cassete) do usuwania szkodliwych cząste­czek na zewnątrz komórki [60].

Rozprzestrzenianie się mechanizmów oporności wśród pa­togennych bakterii, a także pojawienie się szczepów wyka­zujących oporność wielolekową, jest ważnym problemem terapeutycznym. Wyjściem z tej sytuacji wydaje się nie tyl­ko zachowanie odpowiedniej higieny sanitarnej oraz skie­rowanie uwagi na badania dotyczące nowych leków i sku­tecznych szczepionek, ale także opracowanie dodatkowych markerów umożliwiających szybką diagnostykę zakażeń.

Shigeloza, jako jedna z istotniejszych chorób wywoływanych przez Enterobacteriaceae

Liczba zachorowań na shigelozę – czerwonkę bakteryjną – w krajach rozwijających się sięga 167 milionów przy­padków rocznie, z czego około milion przypadków koń­czy się śmiercią [104]. Do najbardziej charakterystycznych objawów shigelozy należą wodniste lub krwawe biegun­ki, często zawierające śluz, gorączka i bóle brzucha. Do wywołania choroby wystarczy niewielka liczba komórek bakteryjnych (10-100), które nie giną w kwaśnej treści żo­łądka. Zakażenia takie występują często u ludzi starszych i małych dzieci. W tych grupach wiekowych ze względu na skutki, jakie wywołują one w organizmie chorego, mogą one stanowić zagrożenie życia.

Pałeczki Shigella to Gram-ujemne, nieruchome i niefer­mentujące laktozę drobnoustroje należące do rodziny Enterobacteriaceae. Gatunek S. flexneri obejmuje 16 se­rotypów, S. dysenteriae – 13 serotypów, S. boydii – 18 se­rotypów a S. sonnei – 1 serotyp. S. dysenteriae typ 1 wy­twarza jedną z najsilniejszych znanych toksyn, jaką jest toksyna Shiga. Pałeczki S. sonnei i S. boydii powodują za­trucia o łagodniejszym przebiegu niż szczepy S. flexneri i S. dysenteriae. Oporność na antybiotyki wśród rodzaju Shigella jest bardzo częsta i wykazuje tendencję wzrosto­wą. Do antybiotyków nieskutecznych w walce z shigelozą, możemy zaliczyć obecnie m.in. ampicylinę czy trimetho­prim-sulfametoksazol. Prowadzone są badania nad sku­teczną szczepionką przeciwko shigelozie, która chroniłaby przed zakażeniami spowodowanymi przez wszystkie sero­typy z gatunku Shigella. Szczegółowa wiedza dotycząca epidemiologii shigelozy, to zagadnienie podstawowe dla wyboru potencjalnych kandydatów do skutecznej szczepion­ki, pozwalającej na zapanowanie nad tą chorobą [104,135].

Niewiele wiadomo na temat struktur odpowiedzialnych za adhezję oraz mechanizmów oddziaływania bakterii Shigella z komórkami gospodarza w trakcie zakażenia. W odróż­nieniu od innych enteropatogenów, które przeważnie kolo­nizują ściany jelita cienkiego, Shigella preferencyjnie za­siedla inne odcinki przewodu pokarmowego, wybierając nabłonek wyścielający okrężnicę i odbytnicę. To, że wiąza­nie się bakterii do nabłonka nie jest hamowane przez mo­nosacharydy wskazuje, że występujący u Shigella recep­tor adhezyn jest sacharydem o złożonej strukturze [108].

Białka odpowiedzialne za adhezję pałeczek Shigella, są jednocześnie białkami zapoczątkowującymi proces inwa­zji tych bakterii. Po udanej adhezji bakterie Shigella ini­cjują aktywację systemu sekrecji typu III (T3SS – type III secretion systems) oraz wydzielanie białek efektorowych do komórek gospodarza. Systemy sekrecji typu III są głów­nymi determinantami wirulencji bakterii Gram-ujemnych, pełniącymi rolę mediatorów w transporcie czynników wi­rulencji z cytoplazmy bakterii do komórek gospodarza. System T3SS występujący u Shigella składa się z około 20 różnych białek, włączając w to integralne białka bło­nowe, chaperony i inne białka towarzyszące. Białka te zo­stały podzielone na dwie główne grupy: bakteryjne białka zakotwiczone w błonie i zewnątrzkomórkowe wypustko­podobne filamenty (zwane często kanałem translokują­cym), umożliwiające wstrzykiwanie białek efektorowych [82]. Transport białek efektorowych przez kanały translo­kujące do przestrzeni peryplazmatycznej gospodarza jest napędzany przez energię uzyskiwaną z ATP. Geny odpo­wiedzialne za translokację u Shigella oraz kodujące biał­ka efektorowe, włączając w to 4 bakteryjne chaperony, są umiejscowione na wyspach patogenności (31 kpz) wewnątrz dużego plazmidu wirulencji (213 kpz) [48].

Po udanej adhezji pałeczki Shigella zapoczątkowują proces wnikania do wnętrza komórki gospodarza (ryc. 4). Białko IpaB wiąże się do receptora kwasu hialuronowego (CD44), podczas gdy kompleks IpaB/IpaC oddziałuje z recepto­rem fibronektynowym integryny (a5b1). Następnie IpaB/IpaC tworzy struktury przypominające pory, występujące wewnątrz błony komórkowej gospodarza. Pory te umoż­liwiają włączenie systemu T3SS do cytoplazmy komórki eukariotycznej oraz dostarczanie innych białek efektoro­wych. Najprawdopodobniej w tworzeniu się por w błonie gospodarza uczestniczą cząsteczki cholesterolu obecne na tratwach lipidowych, do których wiąże się białko IpaB [47]. Podczas wnikania do komórek gospodarza komórki Shigella mają zdolność do przekształcania i przemiesz­czania fragmentów błony. W miejsca te kierowane są tak­że białka sygnałowe, stanowiące przyszły cel dla bakterii. Białko efektorowe IpaD, znajdujące się na powierzchni T3SS jest zaangażowane w rozpoznanie i kontakt z błoną gospodarza, a także odpowiada za uwalnianie innych bia­łek efektorowych [26].

Ryc. 4. Schemat wnikania pałeczek Shigella do komórek gospodarza

Po utworzeniu porów w błonie komórki M lub komórki na­błonka, kompleks IpaB/IpaC inicjuje proces polimeryzacji aktyny. C-końcowa domena IpaC aktywuje białko Cdc42, które z kolei włącza aktywność białka Rac1, czego skut­kiem jest indukcja formowania przedłużeń filopodii i la­mellipodii [126]. Bakterie Shigella aktywują kinazę tyro­zynową Src (pp60c), biorącą udział w fosforylacji białek odpowiedzialnych za polimeryzację aktyny, takich jak kor­taktyna. Dokładny mechanizm tej aktywacji nie jest do­tąd poznany [22].

Receptor kwasu hialuronowego, aktywowany przez białko IpaB przyciąga ezrynę do miejsca wejścia, co wydaje się zjawiskiem zależnym od białka Rho, którego aktywacja jest wspomagana przez kompleks IpaB-CD44. Ezryna łączy się z F-aktyną i pełni w strukturach filopodii funkcję łączni­ka pomiędzy błoną a cytoszkieletem [121]. VirA jest biał­kiem kodowanym przez plazmid wirulencji i wydzielanym w sposób niezależny od Ipa. Oddziałuje ono i destabilizu­je heterodimery a/b-tubuliny, stymulując przy tym praw­dopodobnie aktywność Rac-1, co wspomaga formowanie struktur lamellipodialnych wokół miejsc wnikania bakterii [152]. Dwoma innymi białkami, wydzielanymi przez T3SS są białka IpgD i IpaA. IpgD jest fosfatazą, wykazującą ho­mologię do białek SopB/SigD występujących u Salmonella. Białko to katalizuje defosforylację 4,5-difosforanu fosfa­tydyloinozytolu – PtdIns(4,5)P₂ – do monofosforanu – PtdIns(5)P – w miejscu wejścia, a to z kolei pobudza ak­tywację szlaku kinaza PI-3/Akt i wspomaga przetrwanie komórki bakteryjnej [100]. IpaA tworzy kompleks z jed­nym z białek ogniskowych – winkuliną i aktywuje pokrywa­nie winkuliną szybko rosnący koniec F-aktyny, powodując jej depolimeryzację [105]. Pałeczki Shigella po wniknię­ciu przez komórki M do komórek nabłonka pęcherzyko­watego (FAE – follicular-associated epithelium), niszczą błony wakuol w procesie zależnym od inwazyjnych białek IpaB i IpaC oraz przedostają się do cytoplazmy komórek gospodarza, gdzie się namnażają. W cytoplazmie komó­rek eukariotycznych patogeny te akumulują spolimeryzo­waną aktynę, którą następnie wykorzystują jako „ogon”, umożliwiający im poruszanie się w cytoplazmie i wnika­nie do komórek sąsiadujących. Polimeryzacja aktyny uza­leżniona jest od aktywności białka błony zewnętrznej IcsA (IcsA – intracellural spread A), nazywanego także VirG, które ma rozkład polarny na powierzchni komórki bakte­ryjnej. IcsA wykorzystuje białka komórek cytoszkieletu go­spodarza, oddziałując na białko N-WASP oraz zwiększa­jąc jego powinowactwo do Arp2/3. Tworzy ono kompleks IcsA/N-WASP/Arp2/3, który indukuje powstawanie akty­ny. IcsA angażuje także winkulinę, która mimo że nie jest niezbędna patogenowi do ruchu, może się przyczyniać do polimeryzacji aktyny. Ponadto czynniki depolimeryzacji aktyny, takie jak (ADF)/kofilina, pokrywając białka i wyka­zując właściwości profilujące, są zaangażowane w stabili­zację „ogona”. Poruszanie się pałeczek Shigella w komórce gospodarza jest także uzależnione od białka VirA, odpo­wiedzialnego za rozkład tubuliny. Dzięki niemu komórka bakteryjna może się przemieszczać przez sieć mikrotubu­li [152]. Kiedy bakteria dociera do wewnętrznej, bazolate­ralnej powierzchni błony komórki gospodarza, formowana jest palcopodobna wypustka, przebijająca się do sąsiadu­jących komórek nabłonkowych. Komórki Shigella, które raz uległy endocytozie, uwalniane są następnie z wakuol, namnażają się w cytoplazmie gospodarza oraz przedosta­ją się do kolejnych komórek, przyczyniając się do rozprze­strzeniania zakażenia. Proces ten powoduje rozluźnienie spójności sąsiadujących komórek poprzez zmianę ekspre­sji białek odpowiedzialnych za połączenia międzykomór­kowe. Zniszczenie integralności błony śluzowej prowadzi do masowej inwazji komórek bakteryjnych [41].

Wskutek inwazji bakterii komórki nabłonkowe zaczyna­ją wytwarzać cytokiny prozapalne, takie jak IL-8, które wspólnie z zakażającymi bakteriami silnie przyciągają leu­kocyty wielojądrzaste (PMN – polymorphonuclear leuko­cyte) z warstwy nabłonkowej do światła jelita. Przenikanie PMN może zaostrzać inwazję bakteryjną w początkowym stadium zakażenia. W późniejszym etapie hamuje ono in­fekcję do czasu, kiedy PMN są w stanie powstrzymać pa­togenne bakterie przed przedostaniem się przez nabłonek pęcherzykowaty (FAE – follicle – associated epithelium) do krwiobiegu. Niekorzystną konsekwencją wydziela­nia PMN jest ostre zapalenie oraz zniszczenie nabłonka okrężnicy, prowadzące do powstania owrzodzeń i ropni śluzówki [120].

Po przejściu pałeczek Shigella przez komórki M, bakterie znajdują się w komórkach FAE, czyli w regionie niezwy­kle bogatym w makrofagi i komórki dendrytyczne. W dal­szym etapie dochodzi do pyroptozy makrofagów, która jest konsekwencją przemieszczenia się białka IpaB, aktywu­jącego kaspazę 1. Enzym ten rozcina IL-1b i IL-18 oraz umożliwia przekształcenie prekursorów w dojrzałe i ak­tywne cytokiny [40]. W aktywację kaspazy 1 przez IpaB wydaje się być zaangażowane białko Ipaf, odpowiadające za rozpoznanie komórki bakteryjnej. Białko to należy do receptorów NOD-podobnych (NLRs – NOD like receptors), zlokalizowanych w błonach plazmatycznych i endosomal­nych [123]. Uwalnianie IL-1b powoduje przerwanie ba­riery, jaką stanowi nabłonek i wspomaga tym samym roz­przestrzenianie się bakterii, a w konsekwencji prowadzi do indukcji zakażenia i zniszczenia tkanek w okrężnicy. Jednoczesne uwalnianie IL-18 i IFN-γ poprzez aktywację komórek układu odpornościowego wspomaga walkę z pa­togenami [137]. Pałeczki Shigella poprzez system T3SS wydzielają także białka efektorowe, które są zaangażowane w regulację stanu zapalnego i mogą ułatwiać wczesne eta­py zakażenia. Jak wiadomo, akumulowane w jądrze białko IpaH wiąże się do czynnika splicing U2AF ssaków, stymu­lując ekspresję cytokin prozapalnych [110].

Odpowiedź układu immunologicznego na zakażenie pałeczkami Shigella

Ostry stan zapalny spowodowany czerwonką bakteryj­ną może się utrzymywać w jelicie nawet ponad miesiąc. Przez ten czas komórki układu odpornościowego wytwa­rzają ogromne ilości cytokin, takich jak: IL-1, TNF-α, IL-6, IFN-γ, TNF-β, IL-4, IL-10, TGF-β i IL-8 [106]. Kliniczne objawy shigelozy mogą być bezpośrednim skutkiem wy­dzielania cytokin. Jednocześnie cząsteczki te uczestni­czą w regulacji i kontroli zapalenia na zasadzie sprzęże­nia zwrotnego.

Obecne w tkance makrofagi i naciekające monocyty są zdolne do efektywnego zabijania komórek Shigella flexneri w swoich fagosomach i apoptozy [46,154]. Uwalnianie IL-18 podczas apoptozy makrofagów może aktywować ko­mórki NK i limfocyty T, indukując tym samym wytwarza­nie IFN-γ [6]. Doświadczenia przeprowadzone na myszach z nieczynnym genem odpowiedzialnym za syntezę IFN-γ wykazują, że są one pięć razy bardziej podatne na infekcje pałeczkami Shigella niż te zwierzęta, których makrofagi i komórki fibroblastów wytwarzają go w naturalny sposób. IFN-γ sprzyja oczyszczaniu zakażonych komórek, a także hamuje dalszy rozwój patogenów w organizmie gospoda­rza [137]. Jednym z najważniejszych skutków odpowiedzi immunologicznej gospodarza, związanym z wydzielaniem cytokin, jest migracja komórek PMN. Czynnik transkryp­cyjny NF-κB jest aktywowany przez zakażone pałeczka­mi Shigella komórki nabłonkowe. Mechanizm tej aktywa­cji zależny jest od lipopolisacharydu bakterii i prowadzi do sekrecji IL-8 przez zakażone komórki [61]. IL-8 jest potencjalnym chemoatraktantem komórek PMN, a także czynnikiem powodującym wydzielanie IL-1 podczas apop­tozy makrofagów. Bakterie Shigella są degradowane we­wnątrz fagosomu [80]. Badania wykazały także, że ludzka elastaza neutrofilów, jedno z głównych białek występują­cych w granulocytach obojętnochłonnych, jest zdolna do degradacji wirulentnych białek pałeczek Shigella już po 10 min od zakażenia neutrofilów [140]. Komórki PMN, ogra­niczając zarówno wnikanie patogenów do wnętrza komórki gospodarza, jak i ich rozprzestrzenianie się w całym orga­nizmie, odgrywają niewątpliwie główną rolę w kontrolo­waniu zakażenia pałeczkami Shigella [116].

Inny mechanizm skierowany przeciwko drobnoustrojom z rodzaju Shigella jest związany z jedną z glikoprotein – lak­toferryną. Jest ona obecna w wydzielinie śluzowej, mleku matki i komórkach fagocytarnych. Białko to, dzięki ekspo­zycji kompleksu IpaB/IpaC na działanie degradujących go proteaz, może osłabiać zdolność bakterii S. flexneri do wni­kania do komórek HeLa. Proces ten prowadzi do zniszcze­nia powierzchni komórki bakteryjnej [35]. Znacznie mniej wiadomo na temat odpowiedzi komórkowej gospodarza na zakażenia wywoływane przez bakterie z rodzaju Shigella. Islam i Christensson wykazali znaczny wzrost liczby ak­tywnych limfocytów T CD8⁺ w krwi obwodowej i w biop­tatach tkanki z końcowego odcinka przewodu pokarmowego pacjentów cierpiących na shigelozę [53]. Z wcześniejszych badań wynika, że limfocyty T pochodzące od pacjentów z czerwonką bakteryjną proliferowały w odpowiedzi na an­tygeny S. flexneri [153]. Cytokiny indukowane przez antyge­ny Shigella wskazują na odpowiedź limfocytów Th1 i Th2 [63,132]. Natomiast badania Waya i wsp. [139], prowadzo­ne na myszach z uszkodzonym genem odpowiedzialnym za wytwarzanie limfocytów T wykazały, że u zwierząt, którym podano najpierw atenuowany szczep Shigella flexneri, a na­stępnie ten sam szczep dziki, nie rozwijało się zakażenie. Autorzy ci uważają, że nawet jeśli występuje odpowiedź lim­focytów T na antygeny bakterii, to nie odgrywa ona ważnej roli w ochronie przed zakażeniem [139].

Dotychczasowe badania dostarczają coraz więcej danych na to, że główną rolę w odpowiedzi na zakażenie pałeczkami czerwonki odgrywa odpowiedź humoralna, włączając w to odpowiedź układową i śluzówkową, skierowaną przeciw­ko LPS i białkom kodowanym na plazmidach wirulencji. Lipopolisacharyd jest przypuszczalnie jednym z głównych antygenów indukujących odpowiedź immunologiczną komó­rek gospodarza. Przebyta infekcja lub szczepienie wywołu­je swoistą dla danego serotypu bakterii Shigella odpowiedź immunologiczną na zakażenie, głównie w układzie homo­logicznym, lecz niestety nie gwarantuje ochrony w układzie heterologicznym [24,31,84]. Należy jednak podkreślić, że przeciwciała skierowane przeciwko wspólnym epitopom antygenu O, obecne w surowicach ludzi (ochotnicy) i im­munizowanych zwierząt (małpy), wykazują pewien stopień reaktywności krzyżowej [131]. W odpowiedzi humoralnej na swoiste serotypowo antygeny S. flexneri są wytwarzane przeciwciała klasy IgG, IgM oraz wydzielnicze IgA (sIgA – secretory IgA). sIgA składają się z dwóch jednostek IgA i dwóch polipeptydów, łańcucha J i składnika wydzielnicze­go (SC – secretory component). Wydzielnicze IgA ulegają transcytozie do światła jelita, gdzie składnik wydzielniczy wiąże się do warstwy śluzówkowej nabłonka, tworząc war­stwę pokrywającą komórki nabłonkowe [102]. sIgA mogą także pokrywać błonę zewnętrzną komórek bakteryjnych blokując wnikanie bakterii przez zapobieganie adhezji bak­terii do powierzchni śluzówki, obniżanie ich cytotoksycz­ności, a także dzięki ich rozkładowi przez czynniki wzrostu [51]. Przeciwciała sIgA anty-LPS obecne w mleku matek dotkniętych uprzednio shigelozą, prawdopodobnie są bar­dzo ważne w redukcji objawów chorobowych u noworod­ków zakażonych pałeczkami Shigella [11].

Chociaż shigeloza to schorzenie związane głównie z zaka­żeniem błon śluzowych, to w surowicy ludzi dotkniętych tą chorobą obecne są przeciwciała klasy IgG i IgM skie­rowane przeciwko antygenom bakterii kodowanym przez geny obecne na plazmidach wirulencji, jak i przeciw LPS [13,54,94]. W badaniach Waya i wsp. [138], przeprowadzo­nych na myszach z uszkodzonym genem odpowiedzialnym za wytwarzanie IgA wykazano, że po immunizacji zwie­rząt preparatem LPS są wytwarzane przeciwciała klasy IgG i IgM, które w układzie homologicznym zapobiega­ją rozwojowi zakażenia pałeczkami Shigella, gwarantując zwierzętom pełną ochronę [138].

Kierunki rozwoju badań nad szczepionkami przeciwko pałeczkom jelitowym

Najważniejszym zadaniem układu odpornościowego jest obrona przed zagrożeniami jakimi są wirusy, bakterie, pa­sożyty czy substancje toksyczne. Jeżeli w organizmie czło­wieka pojawiają się obce antygeny dochodzi do wzbudzenia reakcji immunologicznej. Jest to możliwe dzięki prawidło­wo działającemu układowi odpornościowemu, który roz­poznaje obce komórki czy substancje, celem ich znisz­czenia i co więcej ich zapamiętania. Odpowiedź na obce antygeny musi być swoista, ograniczona w czasie i prze­strzeni, odpowiednio kontrolowana i regulowana. W zde­cydowanej większości przypadków układ odpornościowy człowieka skutecznie eliminuje zagrożenie. Niemniej jed­nak zdarza się, że organizm nie jest w stanie skutecznie przeciwstawić się drobnoustrojom. Jednym ze sposobów wzbudzenia ochrony przed rozwojem zakażenia jest stoso­wanie systemu szczepień. Szczepionka to zwykle preparat pochodzenia biologicznego, który zawiera żywe lub zabite drobnoustroje chorobotwórcze lub fragmenty ich struktury, czy metabolity. Antygeny te muszą być zdolne do induk­cji procesów immunologicznych i powstania trwałej swo­istej odporności bez wywoływania działań toksycznych. Szczepionka może być stosowana w celach profilaktycz­nych bądź leczniczych.

Za ojca wakcynologii, nauki zajmującej się badaniami nad szczepionkami i ich wpływem na odporność, uważa się Ludwika Pasteura, który przygotował pierwszą szczepion­kę dla ludzi w postaci atenuowanych mikroorganizmów. Stwierdził także, że poddanie bakterii działaniu różnych czynników fizycznych, takich jak np. temperatura, zawar­tość tlenu czy różne składniki dodawane do podłoża, pro­wadziło do zmniejszenia stopnia ich zjadliwości. Pasteur w wyniku zastosowania doświadczalnych warunków ho­dowli, uzyskał niezjadliwe szczepy wąglika i cholery pta­siej [72]. Od czasów Pasteura obserwuje się stały wzrost zainteresowania szczepionkami, a nowe odkrycia w dzie­dzinie immunologii, mikrobiologii molekularnej, biotech­nologii dają szansę na tworzenie nowoczesnych, bezpiecz­nych i skutecznych szczepionek [5].

Zanim nastąpił rozwój metod biologii molekularnej, do two­rzenia szczepionek przeciw zakażeniom bakteriami z ro­dziny Enterobacteriaceae używano między innymi szcze­pów atenuowanych lub antygenów zdolnych do stymulacji układu odpornościowego. Celem zapobiegania biegunkom wywoływanym przez szczepy ETEC, u ochotników za­stosowano doustną szczepionkę, której składnikiem były oczyszczone białka fimbrialne CFA/I i CFA/ II (swoiste an­tygeny rzęskowe, biorące udział w kolonizacji jelit) [27]. Cryz i wsp. [15] opracowali szczepionkę, w skład której wchodziło sześć różnorodnych serotypów polisacharydów otoczkowych (K2, K3, K10, K21, K30, K55). Preparat ten był nietoksyczny i obserwowano znaczny wzrost poziomu przeciwciał klasy IgG w surowicy [15].

W badaniach modelowych na zwierzętach wykazano, że immunizacja myszy preparatem LPS z Klebsiella O3 ma silne działanie adiuwantowe na wytwarzanie przeciw­ciał IgM i IgG [151]. Natomiast podanie myszom mo­noklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw antyge­nom O szczepu Klebsiella pneumoniae O1: K2 chroniło zwierzęta przed śmiertelną dawką otoczkowego szczepu Klebsiella pneumoniae tego samego serotypu [81]. W przy­padku zakażeń szczepami z rodzaju Salmonella stwierdzo­no, że skuteczniejszą ochronę zapewniało podanie żywych atenuowanych niż inaktywowanych bakterii [64,76]. Jest to prawdopodobnie spowodowane lepszą aktywacją ko­mórek nabłonka wyścielającego przewód pokarmowy do wytwarzania IgA.

Celem opracowania skutecznych szczepionek przeciwko Enterobacteriaceae prowadzone są badania nad różno­rodnymi antygenami, których użycie zapewni uzyskanie odporności zabezpieczającej przed zachorowaniem. Są to badania wielokierunkowe, znajdujące się aktualnie na róż­nych stopniach zaawansowania [32,122,147]. Podobieństwo tej grupy bakterii pod względem antygenowym daje real­ne szanse na opracowanie skutecznej, wieloważnej szcze­pionki chroniącej przed zakażeniami wieloma gatunkami należącymi do rodziny Enterobacteriaceae [77].

Potencjalneantygeny do tworzenia szczepionek przeciwko shigelozie

Mechanizm odpowiedzi immunologicznej przeciwko pa­łeczkom Shigella nie został do końca wyjaśniony. Istnieją jednak dane, że zarówno naturalne, jak i wywołane eks­perymentalnie zakażenia pałeczkami jelitowymi z rodza­ju Shigella, indukują typową, swoistą odpowiedź immuno­logiczną o określonej trwałości. Jednym z potencjalnych antygenów do szczepionki przeciw shigelozie, wywołują­cym taką odpowiedź immunologiczną jak naturalna infek­cja, jest polisacharyd O-swoisty. Wstępne badania wyka­zały, że po naturalnej infekcji szczepami Shigella obecne są w surowicy przeciwciała klasy IgG, IgA i IgM skiero­wane przeciwko tym polisacharydom [29,109,124].

Białka błony zewnętrznej ściany komórkowej pałeczek jelitowych (outer membrane proteins – OMPs) mogą być odpowiednim antygenem lub nośnikiem do opracowywa­nej szczepionki przeciwko shigelozie. Jak wynika z wcze­śniejszych rezultatów Witkowskiej i wsp. [144,145,148], immunizacja zwierząt białkami wyizolowanymi z błony zewnętrznej (OMPs) ściany komórkowej Shigella, powo­duje wzbudzenie zarówno komórkowej, jak i humoralnej odpowiedzi immunologicznej [146].

Jak dotąd nie pojawiła się jeszcze na rynku dostępna, li­cencjonowana szczepionka przeciwko shigelozie, chociaż w wielu laboratoriach prowadzone są badania w tym kie­runku i rozważane są różne koncepcje jej konstruowania. Pod uwagę brane są także możliwości przygotowania szcze­pionki hybrydowej Shigella – E. coli (lub S. typhi) [62], szczepionki z atenuowanym szczepem Shigella flexneri 2a [92], szczepionki opartej na antygenach, np. lipopo­lisacharyd/polisacharyd (LPS/PS) [75], czy białka błony zewnętrznej ściany komórkowej pałeczek Shigella [144].

Koszty związane z leczeniem shigelozy z użyciem anty­biotyków są bardzo wysokie, zwłaszcza w krajach rozwi­jających się. Stąd też celowość prac nad szczepionkami przeciwko shigelozie wydaje się nie tylko zasadna, lecz również konieczna. Idealna szczepionka przeciwko czer­wonce bakteryjnej, aby mogła skutecznie chronić przed rozwojem zakażenia, musi spełniać kilka podstawowych kryteriów. Przede wszystkim powinna wzbudzać długo­trwałą odporność układu immunologicznego związanego z jelitem, nie wywołując przy tym objawów niepożądanych lub ograniczając je do minimum. Z ekonomicznego punk­tu widzenia koszt produkcji i dystrybucji idealnej szcze­pionki powinien być niewielki, ponieważ jej odbiorcy będą pochodzić przede wszystkim z krajów rozwijających się. Ponadto szczepionka taka powinna być także łatwa w po­daniu i odporna na działanie czynników zewnętrznych, ta­kich jak temperatura.

Szczepionki podjednostkowe

Zasadniczą cechą szczepionek podjednostkowych jest obec­ność w ich składzie antygenu charakterystycznego dla da­nego patogenu, który znajduje się na innym, przeważnie większym nośniku. Wykorzystanie w tego typu szczepion­ce tylko wybranego antygenu eliminuje ryzyko zakażenia poszczepiennego, jakie istnieje w przypadku użycia całej komórki bakteryjnej.

W badaniach nad szczepionkami koniugatowymi oparty­mi na nośniku białkowym sprzężonym z O-swoistym po­lisacharydem pochodzącym z LPS S. flexneri 2a lub S. sonnei, uzyskano obiecujące wyniki. Podając je zarówno dzieciom (w wieku 4-7 lat), jak i dorosłym stwierdzono, że są bezpieczne i wywołują silną odpowiedź immunolo­giczną. Już po jednorazowym podaniu szczepionki uzy­skiwano znaczny poziom swoistych przeciwciał klasy IgG.

Miano swoistych przeciwciał klasy IgM i IgA kształtowało się na nieco niższym poziomie [2,66,96,127]. Wykazano także ochronne właściwości kompleksu (Invaplex), które­go składnikami były białka IpaB, IpaC, IpaD i LPS. Myszy i świnki morskie immunizowane oczyszczonym komplek­sem tych inwazyn i LPS, były chronione przed letalną daw­ką wirulentnego szczepu S. flexneri [128]. Interesujące wydają się wyniki badań uzyskane przez Turbyfilla i wsp. [129], w których preparat Invaplex 50 zawierający skom­pleksowane IpaB, IpaC i LPS z S. flexneri 2a, zastosowa­ny został u ludzi w badaniach przedklinicznych. Preparat ten podany w aerozolu donosowo, jednorazowo lub wie­lokrotnie w różnych dawkach, ogólnie był dobrze tolero­wany, jedynie z niewielkimi, krótkotrwałymi objawami za­palnymi w obrębie miejsca podania i wzbudzał ochronną odpowiedź układu immunologicznego [129].

Doustne szczepionki zawierające zabite szczepy bakteryjne

Interesujących wyników dostarczyły próby zastosowa­nia szczepionki, zawierającej zabite wysoką temperatu­rą szczepy Shigella flexneri. W badaniach modelowych na zwierzętach wykazano, że immunizacja królików czy świnek morskich zabitym patogenem zapewniała im cał­kowitą ochronę i 100% zwierząt przeżywało zakażenie żywym, wirulentnym patogenem tego samego gatunku [9,85]. Należy jednak zauważyć, że w przypadku świnek morskich immunizacja taka gwarantowała pełną ochronę jedynie w układzie homologicznym, natomiast nie chroniła zwierząt przed zakażeniem szczepem innego gatunku (S. dysenteriae 1). W surowicach immunizowanych zwierząt obecne były przeciwciała skierowane przeciw całej osłonie komórkowej bakterii i przeciw białkom błony zewnętrznej (OMP) [85]. Trzeba jednak podkreślić, że jeśli nawet wy­niki badań nad tego typu szczepionką uzyskane na mode­lach zwierzęcych wydają się obiecujące, to potwierdzenie jej skuteczności w odniesieniu do organizmu ludzkiego jest, jak na razie, wciąż na etapie badań.

Żywe szczepionki atenuowane

Przygotowanie szczepionki składającej się z żywych nie­inwazyjnych szczepów jest możliwe dzięki wprowadzaniu mutacji w obrębie chromosomu lub plazmidu wirulencji. Tak zmieniony szczep staje się niezdolny do inwazji i zaka­żenia organizmu, do którego zostaje wprowadzony. Delecja wprowadzona w kodowanym na chromosomie białku aroA oraz plazmidzie wirulencji VirG u Shigella flexneri 2a CVD 1203 pozwalała bakterii na wniknięcie do komórki gospo­darza, ale chroniła go przed niekontrolowaną proliferacją oraz rozprzestrzenianiem się patogenu wewnątrz jego orga­nizmu. Zaledwie dwie dawki bakterii po 10⁹ CFU, podane w odstępach 2-tygodniowych świnkom morskim, powodo­wały wytwarzanie sIgA i zapewniały zwierzętom ochronę przed zakażeniem S. flexneri 2a [93]. Atenuowane szczepy Shigella flexneri w większości były bezpieczne dla człowie­ka i indukowały pewien stopień odpowiedzi immunologicz­nej. Jedną z najbardziej znanych i skutecznych szczepionek tego rodzaju jest szczepionka przygotowana przez wprowa­dzenie mutacji w plazmidzie wirulencji szczepu Shigella flexneri 2a Istrati T32. Szczep ten był w 100% bezpieczny dla człowieka i gwarantował 85% ochrony przed zakażeniem pałeczkami Shigella flexneri. Jednak wadą tej szczepionki było to, że powinna być podawana wielokrotnie (w odstę­pach 6-miesięcznych) w dużych dawkach (10¹¹ CFU) [83]. Innym branym pod uwagę szczepem atenuowanym jest S. flexneri 2a SC602 z delecją w genie icsA (odpowiedzial­nym za rozprzestrzenianie się patogenu w organizmie go­spodarza), znajdującym się na plazmidzie wirulencji oraz chromosomalnym locus iuc (kodującym aerobaktynę). Podanie tego szczepu w dawce nieprzekraczającej 10⁴ CFU wywoływało jednak objawy chorobowe w postaci niewiel­kiej gorączki i słabej biegunki (u 2 spośród 15 pacjentów). Taka immunizacja ochotników stymulowała wytwarzanie przeciwciał, które chroniły ich przed rozwojem zakażenia w okresie poszczepiennym. Niemniej jednak stosowanie jej było obarczone ryzykiem związanym z doborem odpo­wiedniej dawki, zapewniającej odporność i niewywołują­cej ostrych objawów chorobowych [14].

Szczepionki hybrydowe

Innym podejściem do konstrukcji skutecznej szczepionki jest opracowanie szczepionki hybrydowej. Początki two­rzenia szczepionki hybrydowej to lata 70 ubiegłego wie­ku. Głównym zadaniem szczepionki hybrydowej, podob­nie jak w przypadku każdej skutecznej szczepionki, jest wzbudzenie odpowiedzi odpornościowej organizmu, któ­ra w pełni ochroni go przed zakażeniem. W skład takiej szczepionki może wchodzić żywy szczep jednego gatun­ku bakterii, będący nośnikiem materiału genetycznego in­nego gatunku bakterii. Przykładem takiej szczepionki było opracowanie hybrydy EcSf2a-1. Hybryda ta powstała dzię­ki przeniesieniu 140 MDa plazmidu wirulencji, kodującego antygeny związane z inwazyjnością bakterii S. flexneri 5a oraz chromosomalnych genów kodujących grupowo- i ty­powoswoisty antygen O szczepu S. flexneri 2a do komó­rek E. coli K-12. Podanie szczepu hybrydowego w daw­ce 1×10⁹ CFU wywoływało objawy chorobowe (gorączka, biegunka, czerwonka) u 31% wolontariuszy, którym poda­no pojedynczą dawkę. Szczepionka ta, podana w mniejszej dawce (5×10⁶-5×10⁷ CFU) nie zapewniała ochrony prze­ciwko zakażeniu szczepem S. flexneri 2a. Atenuowany mu­tant tej hybrydy (gen aroD – EcSf2a-2) podany małpom (w ilości 1,5×10¹¹ CFU), nie wywoływał u tych zwierząt żadnych skutków niepożądanych, w porównaniu z gru­pą placebo, której podano E. coli K-12. Stwierdzono, że szczepionka ta w porównaniu z grupą kontrolną zapew­niała zwierzętom 60% ochrony przed rozwojem zakażenia pałeczkami S. flexneri 2a. U ludzi szczepionka EcSf2a-2 była wprawdzie dobrze tolerowana w dawce 5×10⁶-2,1×10⁹ CFU, aczkolwiek pojedyncza dawka 2,5×10⁹ CFU wywo­ływała skutki niepożądane (gorączka, biegunka) u 17% badanych, a dawka 1,8×10¹⁰ CFU była przyczyną czer­wonki u 50% wolontariuszy. Trzykrotne podanie tej szcze­pionki w dawce 1,2×10⁹-2,5×10⁹ CFU, powodowało pod­wyższenie miana immunoglobulin przeciwko LPS (61%) i przeciw antygenom kodowanym przez plazmid wirulen­cji (44%) w surowicy. Wywoływało także podwyższe­nie miana immunoglobulin wydzielniczych IgA w jeli­cie, odpowiednio o 100% anty-LPS i o 60% w przypadku immunoglobulin skierowanych przeciwko antygenom ko­dowanym przez plazmid wirulencji. Chociaż szczepionka ta wzbudzała bardzo silną odpowiedź układu immunolo­gicznego, to jej właściwości ochronne nie były zadowa­lające i kształtowały się na poziomie 36% [62]. Cohen i wsp. [12] badali skuteczność szczepionki składającej się z oczyszczonego LPS z S. sonnei skoniugowanego z re­kombinowanym białkiem toksyny A (Ps. aeruginosa) i pre­parat zawierający żywe atenuowane szczepy E. coli oraz S. flexneri 2a. Ochrona jaką uzyskali kształtowała się na poziomie 74% [12]. Pochodzący z E. coli gen cs3 kodu­jący antygen CFA/II został przeniesiony w miejsce genu asd szczepu S. flexneri 2a T32, co powodowało dezakty­wację genu asd. Niezależnie przeprowadzono klonowanie genu kodującego antygen O szczepu S. sonnei do wektora pXL378, otrzymując plazmid pXL390. Transformacja zmu­towanego genu asd S. flexneri 2a T32 do pXL390, pozwo­liła na otrzymanie biwalentnej szczepionki FS01 przeciw­ko S. flexneri 2a i S. sonnei. Uzyskane wyniki wykazały, że rekombinowany plazmid pXL390 był niezwykle stabilny w szczepie asd – T32. Szczep FS01 był zarówno stabilny pod względem genetycznym, jak i zdolny do ekspresji an­tygenów Shigella na powierzchni komórki, nie powodując przy tym toksyczności szczepu. Podanie podskórnie my­szom szczepionki zawierającej FS01, pozwoliło na osią­gnięcie 100% ochrony przed zakażeniem wywoływanym przez wirulentne szczepy S. flexneri 2a i S. sonnei [112].

Na marginesie omawianego tematu należy również zauwa­żyć, że wspomniany wcześniej szczep Δasd S. flexneri jest bardzo użytecznym wektorem dostarczającym szczepionki DNA do tkanek limfatycznych związanych z błoną śluzo­wą. Wektor ten może mieć znakomite zastosowanie do kon­strukcji szczepionek skierowanych nie tylko przeciwko pa­łeczkom Enterobacteriaceae. Po transfekcji plazmidu DNA wirusa odry (MV – measles virus) do Δasd S. flexneri i za­szczepieniu nim myszy, które wcześniej przeszły zakażenie Shigella flexneri 2a, występuje ostra odpowiedź typu Th1 (wytwarzanie CD8⁺CTL i IFN-γ) oraz jest obniżona odpo­wiedź typu Th2 (niski poziom IgG i IgA w surowicy) [28]. Powierzchnia błony śluzowej jest bardzo ważnym miejscem indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko wirusowi grypy. Badania przeprowadzone na modelu mysim wykaza­ły, że atenuowany szczep Shigella flexneri Δasd 15D, nio­sący konstrukt kodujący hemaglutyninę (HA) wirusa gry­py, gwarantuje ochronę przeciwko śmiertelnej dawce wirusa grypy A/WSN/33. U zwierząt po immunizacji stwierdzono niskie miano populacji limfocytów T wytwarzających IFN-γ oraz obecność przeciwciał anty-HA klasy IgG. Po podaniu wirusa myszom immunizowanym atenuowanym szczepem Shigella zawierającym konstrukt HA, zauważalny był także wzrost miana przeciwciał anty-HA klasy IgA. Rezultaty te sugerują, że wektor Δasd S. flexneri 15D może mieć podsta­wowe znaczenie w tworzeniu szczepionek DNA przeciwko wirusowi grypy jak i innych patogenów związanych z błona­mi śluzowymi [134]. Próby wykorzystania szczepu Shigella flexneri Δasd 15D jako wektora w szczepionkach DNA, po­dejmowano także w ośrodkach naukowych zajmujących się opracowywaniem szczepionki przeciwko HIV. Zauważono bowiem, że donosowe podanie tego wektora myszom indu­kowało odpowiedź limfocytów T skierowaną przeciwko prze­noszeniu się wirusa HIV drogą płciową [133].

Strategie opracowania szczepionki chroniącej w układzie heterologicznym

Z wcześniejszych badań wynika, że immunogenność S. flexneri zależy od serotypu tych bakterii, a szczepionka prze­ciwko określonemu serotypowi działa ochronnie w przy­padku zakażenia szczepem homologicznym [85]. Wiadomo również, że występowanie poszczególnych serotypów ga­tunku S. flexneri pozostaje w ścisłej korelacji z określonym regionem geograficznym, dlatego też przy opracowywaniu idealnej szczepionki przeciwko pałeczkom tego gatunku, należałoby tę zależność geograficzną uwzględnić. Wśród pałeczek należących do gatunku S. flexneri rozróżniamy 16 serotypów, które z wyjątkiem serotypu 6 mają identyczny, wspólny dla wszystkich szkielet cukrowy antygenu O. Jest on zbudowany z czterocukru, w skład którego wchodzą N-acetyloglukozamina i 3 cząsteczki ramnozy. Dodatkowa grupa glikozydowa i/lub O-acetylowa, którą może być pod­stawiony szkielet czterocukru, jest podstawą do wyróżnie­nia antygenów typowych (I-VI i X, Y) i grupowych (3,4; 6; 7,8,9), których występowanie determinuje określony se­rotyp bakterii S. flexneri. Każdy serotyp bakterii tego ga­tunku ma charakterystyczny zestaw antygenów typowych i grupowych. Często kilka różnych serotypów może mieć wspólne antygeny grupowe lub typowe [1].

Van De Verg i wsp. [131] wykazali, że w surowicach ludzi, którzy mieli kontakt z antygenem O-swoistym pałeczek S. flexneri 2a, obecne są przeciwciała klasy IgA, wykazujące reaktywność krzyżową z innymi serotypami tego gatun­ku bakterii. Może to wynikać z tego, że np. dla bakterii o serotypach 2a i 2b charakterystyczny jest ten sam anty­gen typowy II, a dla bakterii o serotypach 1a,5a i Y wspól­ny jest antygen grupowy 4 lub 3,4. Szczepy te zatem mają antygeny typowo- lub grupowoswoiste wspólne z antyge­nem O szczepu S. flexneri 2a. Obecne w surowicach im­munizowanych świnek morskich przeciwciała klasy IgA i IgG wykazywały reaktywność krzyżową ze szczepami o serotypach 1a,5a, i Y oraz nie reagowały ze szczepami o serotypie 2b. Krzyżowa reaktywność przeciwciał klasy IgG (silniejsza niż IgA) z bakteriami o serotypach 1a,2b i Y charakterystyczna była dla surowic immunizowanych małp. Rezultaty tych badań wskazują, że immunizacja an­tygenem O pochodzącym z S. flexneri 2a indukuje wytwa­rzanie przeciwciał o reaktywności krzyżowej. Przeciwciała te zdolne są do rozpoznawania podobnych antygenów wy­stępujących u różnych serotypów. Wyniki te sugerują tak­że, że antygen ten mógłby zostać wykorzystany w poliwa­lentnej szczepionce przeciwko S. flexneri [131].

Badania przeprowadzone na świnkach morskich z użyciem szczepionki zawierającej atenuowane szczepy S. flexneri 2a CVD 1207 oraz S. flexneri 3a CVD 1211 wykazały, że wy­wołuje ona pewien stopień odporności na zakażenie pałecz­kami Shigella. Obecne w surowicy przeciwciała wykazywa­ły reaktywność krzyżową, a także chroniły immunizowane świnki morskie przed rozwojem zakażenia szczepami S. flexneri o serotypach 1b, 2b, 5b i Y. Natomiast nie uzyska­no ochrony w przypadku zakażenia bakteriami tego gatun­ku o serotypach 1a, 4b [91]. Biorąc pod uwagę wszystkie uzyskane dotąd wyniki należy jednak podkreślić, że ko­nieczne są dalsze szczegółowe badania, które pozwolą na dokładne określenie roli reaktywności krzyżowej w odpo­wiedzi immunologicznej człowieka przeciwko shigelozie.

Białka błony zewnętrznej (OMP) jako potencjalne antygeny w szczepionkach koniugatowych

Cechą charakterystyczną wszystkich bakterii Gram-ujemnych jest określona budowa osłony komórkowej. Osłona ta składa się z błony zewnętrznej (OM – outer membrane) i wewnętrznej, czyli cytoplazmatycznej (IM – inner membrane) oddzielonych od siebie cienką warstwą peryplazmy zawierającej peptydoglikan (mureinę). Mimo że zarówno błona zewnętrzna, jak i wewnętrzna zbudowa­ne są z warstwy lipidowej, w której usytuowane są białka, to ich właściwości i funkcje jakie pełnią w komórce róż­nią się zasadniczo. Jest to w głównej mierze związane ze środowiskiem zewnętrznym, z którym się stykają. Błona wewnętrzna sąsiaduje z cytoplazmą i warstwą perypla­zmy, błona zewnętrzna graniczy z peryplazmą i środowi­skiem zewnętrznym komórki. Najważniejszą funkcją bło­ny zewnętrznej jest rola bariery, zapobiegającej wnikaniu do komórki toksycznych substancji, takich jak antybioty­ki czy sole żółciowe, co wydaje się mieć podstawowe zna­czenie dla przetrwania bakterii w różnych środowiskach [114]. Transport substancji odżywczych do wnętrza komórki umożliwiają integralne białka błony zewnętrznej (OMPs – outer membrane proteins), zwane powszechnie porynami. Białka te tworzą w błonie zewnętrznej otwarte, wypełnione wodą kanały, które umożliwiają przemieszczanie się ma­łych hydrofilowych cząsteczek, takich jak aminokwasy, czy węglowodany w wyniku biernego transportu. Białka bło­nowe pełnią wiele różnorodnych funkcji związanych m.in. z wydzielaniem innych białek czy usuwaniem z komórki substancji toksycznych i leków. Białka te są także enzyma­mi [125]. Wszystkie składniki białek błony zewnętrznej są syntetyzowane w cytoplazmie lub wewnętrznej części IM, a następnie transportowane w kierunku OM. Podczas, gdy w większości integralnych białek błonowych, włączając w to białka błony wewnętrznej, występują struktury typu α-helisy, bakteryjne OMPs reprezentują zupełnie inne struk­tury. Białka te tworzą β-baryłki, złożone z naprzemiennie występujących amfipatycznych β-zwojów. Reszty hydro­fobowe tych zwojów są wyeksponowane do lipidowego środowiska błony, podczas gdy reszty hydrofilowe tworzą wewnętrzny kanał, wypełniony wodą, umożliwiający mi­grację cząsteczek o podobnym charakterze [125]. Białka błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych mają podsta­wowe znaczenie dla wzrostu tych drobnoustrojów, zapew­niając im przetrwanie w niekorzystnych warunkach, a tak­że umożliwiając adhezję i inwazję do komórek gospodarza. Błona zewnętrzna bakterii i białka w niej występujące, to pierwsze elementy struktury ściany komórkowej bakterii, dzięki którym dochodzi do kontaktu z atakowanymi ko­mórkami gospodarza. W związku z tym OMPs są brane pod uwagę jako potencjalne składniki szczepionek prze­ciw wielu zakażeniom wywoływanym przez patogenne pa­łeczki jelitowe. Białka obecne w błonie zewnętrznej wystę­pują w postaci pojedynczych cząsteczek lub tworzą w niej kompleksy, zależne od kowalencyjnych lub niekowalencyj­nych oddziaływań. Kompleksy te pełnią także ważną rolę w fizjologii i patogenezie bakterii [79]. Białka błony ze­wnętrznej bakterii są ważnymi z punktu widzenia immu­nogenności składnikami osłony komórkowej. Są one wy­eksponowane na powierzchni patogenu i w związku z tym mają łatwy kontakt z komórkami zakażanego organizmu.

Jeżeli weźmiemy pod uwagę zagrożenie spowodowane za­równo wzrostem liczby zakażeń wywoływanych przez pa­łeczki jelitowe na całym świecie i rosnącą lekooporność szczepów, a także udział białek błony zewnętrznej w pato­genezie tych drobnoustrojów oraz ich właściwości immu­nostymulacyjne, to białka te mogą być doskonałymi skład­nikami szczepionek koniugatowych [82,104,106]. Badania ostatnich lat pokazują, że OMP wyizolowane z patogen­nych drobnoustrojów mogą pełnić rolę antygenów szcze­pionki. Białka te bowiem, nie niosąc ryzyka wystąpienia zakażenia, wzbudzają odpowiedź układu immunologicz­nego i indukują działanie ochronne, a także utrudniają ko­lonizację, stając się realną bronią w walce z patogenami [57]. Konstrukcja szczepionki podjednostkowej przeciw­ko shigelozie opierać się powinna na odpowiedniej charak­terystyce immunochemicznej antygenu, który po podaniu w postaci szczepionki będzie wzbudzał taką odpowiedź układu odpornościowego, która ochroni uodporniany or­ganizm przed ewentualnym zakażeniem [129].

Analizy immunochemiczne głównych białek błony ze­wnętrznej Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii i Shigella sonnei wykazały wśród wszystkich czterech gatunków Shigella, podobny profil białkowy oraz reaktyw­ność krzyżową [86,111,143]. Badania shigelozy prowadzo­ne na modelu zwierzęcym sugerują, że główne białka o ma­sie cząsteczkowej 35-38 kDa są dobrymi immunogenami i indukują ochronną odpowiedź immunologiczną [85, 111].

Białka błony zewnętrznej ściany komórkowej Shigella flexneri wzbudzają zarówno odpowiedź komórkową jak i humoralną. Doświadczenia przeprowadzone na nieimmu­nizowanych wcześniej zwierzętach potwierdzają, że poda­nie im limfocytów B i T pochodzących od myszy immuni­zowanych wieloskładnikowym preparatem OMP, chroniło je przed zakażeniem pałeczkami Shigella. U tych zwierząt odporność na zakażenie występowała już między 4 a 8 dniem po podaniu im komórek odpornościowych [148]. Natomiast immunizacja myszy preparatem białek błony zewnętrznej S. flexneri 3a stymulowała makrofagi zwie­rząt do fagocytozy pałeczek Shigella flexneri i Salmonella Typhimurium [17]. Bierna immunizacja myszy surowicą z przeciwciałami anty-OMP Shigella flexneri 3a, pocho­dzących od zwierząt szczepionych uprzednio preparatem OMP, chroniła w 100% zwierzęta przed zakażeniem za­równo szczepem homologicznym, jak i innymi bakteria­mi należącymi do rodziny Enterobacteriaceae. Co więcej, podanie nieimmunizowanym zwierzętom rozcieńczonej nawet 5000 razy surowicy, pochodzącej od zwierząt im­munizowanych OMP, gwarantowało ochronę przed roz­wojem zakażenia [145]. Wieloskładnikowy preparat OMP okazał się także skuteczny w stymulacji cytokin in vitro. Doświadczenia przeprowadzone na splenocytach i makro­fagach myszy wykazały, że preparaty OMP wpływają na aktywność cytokin prozapalnych (TNF, IL-6 i IL-2), sty­mulujących podziały limfocytów B, T i NK, a także wzbu­dzających aktywność innych cytokin [18,19].

Badania Sansonettiego i Phalipon [117] potwierdziły, że podczas naturalnej infekcji pałeczkami Shigella dochodzi do wzmożonego wydzielania lokalnych immunoglobulin sIgA, a także surowiczych IgG, swoistych dla kilku białek należących do OMP. Nie zauważono jednak podczas za­każenia wytwarzania przeciwciał IgM skierowanych prze­ciwko OMP [117].

Jednym z białek błony zewnętrznej ściany komórkowej pałeczek Shigella flexneri branych pod uwagę jako poten­cjalny antygen w szczepionce koniugatowej, jest zalicza­ne do tzw. białek głównych (major protein) białko o ma­sie 38 kDa (OMP-38). Białko to jest rozpoznawane przez ludzkie przeciwciała klasy IgG i IgA, a jego immunore­aktywność z przeciwciałami obecnymi w ludzkiej suro­wicy jest charakterystyczna dla białka OMP-38 z Shigella flexneri (z wyjątkiem serotypu 6) oraz OMP z E. coli, Citrobacter, Hafnia i innych szczepów należących do ro­dziny Enterobacteriaceae. Ponadto stwierdzono występo­wanie przeciwciał anty-OMP-38 w surowicach krwiodaw­ców, a także w surowicy pępowinowej, co może sugerować ich charakter ochronny [146].

Wyniki badań dotyczące białka OMP-38 są obiecujące i stwarzają nadzieję na wykorzystanie go w szczepionce nie tylko przeciwko pałeczkom Shigella flexneri 3a, z któ­rych zostało wyizolowane, ale także skierowanej przeciw­ko pozostałym szczepom Shigella i gatunkom należącym do rodziny Enterobacteriaceae. Jednocześnie białko to może służyć jako specyficzny marker niedoborów odpor­nościowych, a także wskaźnik rozwoju odporności anty­bakteryjnej [146].

PIŚMIENNICTWO

[1] Allison G.E., Verma N.K.: Serotype-converting bacteriophages and O-antigen modification in Shigella flexneri. Trends Microbiol., 2000; 8: 17-23
[PubMed]  

[2] Ashkenazi S., Passwell J.H., Harlev E., Miron D., Dagan R., Farzan N., Ramon R., Majadly F., Bryla D.A., Karpas A.B., Robbins J.B., Schneerson R.: Safety and immunogenicity of Shigella sonnei and Shigella flexneri 2a O-specific polysaccharide conjugates in children. J. Infect. Dis., 1999; 179: 1565-1568
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Aslanzadeh J.: Biochemical profile-based microbial identification systems. W: Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology, t. 1, red.: Tang Y.W., Stratton C. W. Springer, Nashville 2006, 84-116

[4] Badge R.M., Brookfield J.F.: The role of host factors in the population dynamics of selfish transposable elements. Theor. Biol., 1997; 187: 261-271
[PubMed]  

[5] Barquet N., Domingo P.: Smallpox: the triumph over the most terrible of the ministers of death. Ann. Intern. Med., 1997; 127: 635-642
[PubMed]  

[6] Biet F., Locht C., Kremer L.: Immunoregulatory functions of interleukin 18 and its role in defense against bacterial pathogens. J. Mol. Med., 2002; 80: 147-162
[PubMed]  

[7] Bischoff K.M., White D.G., McDermott P.F., Zhao S., Gaines S., Maurer J.J., Nisbet D.J.: Characterization of chloramphenicol resistance in beta-hemolytic Escherichia coli associated with diarrhea in neonatal swine. J. Clin. Microbiol., 2002; 40: 389-394
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[8] Boyd E.F., Davis B.M., Hochhut B.: Bacteriophage-bacteriophage interactions in the evolution of pathogenic bacteria. Trends Microbiol., 2001; 9: 137-144
[PubMed]  

[9] Chakrabarti M.K., Bhattacharya J., Bhattacharya M.K., Nair G.B., Bhattacharya S.K., Mahalanabis D.: Killed oral Shigella vaccine made from Shigella flexneri 2a protects against challenge in the rabbit model of shigellosis. Acta Paediatr., 1999; 88: 161-165
[PubMed]  

[10] Cheng A.C., McDonald J.R., Thielman N.M.: Infectious diarrhea in developed and developing countries. J. Clin. Gastroenterol., 2005; 39: 757-773
[PubMed]  

[11] Clemens J.D., Stanton B., Stoll B., Shahid N.S., Banu H., Chowdhury A.K.: Breastfeeding as a determinant of severity in shigellosis: evidence for protection throughout the first three years of life in Bangladeshi children. Am. J. Epidemiol., 1986; 123: 710-720
[PubMed]  

[12] Cohen D., Ashkenazi S., Green M.S., Gdalevich M., Robin G., Slepon R., Yavzori M., Orr N., Block C., Ashkenazi I., Shemer J., Taylor D.N., Hale T.L., Sadoff J.C., Pavliakova D., Schneerson R., Robbins J.B.: Double-blind vaccine-controlled randomised efficacy trial of an investigational Shigella sonnei conjugate vaccine in young adults. Lancet, 1997; 18: 155-159
[PubMed]  

[13] Cohen D., Block C., Green M.S., Lowell G.H., Ofek I.: Immunoglobulin M, A and G antibody response to lipopolysaccharide O antigen in symptomatic and asymptomatic Shigella infections. J. Clin. Microbiol., 1989; 27: 162-167
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[14] Coster T.S., Hoge C.W., VanDeVerg L.L., Hartman A.B., Oaks E.V., Venkatesan M.M., Cohen D., Robin G., Fontaine-Thompson A., Sansonetti P.J., Hale T.L.: Vaccination against shigellosis with attenuated Shigella flexneri 2a strain SC602. Infect. Immun., 1999; 67: 3437-3443
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[15] Cryz S.J. Jr, Mortimer P., Cross A.S., Fürer E., Germanier R.: Safety and immunogenicity of a polyvalent Klebsiella capsular polysaccharide vaccine in humans. Vaccine, 1986; 4: 15-20
[PubMed]  

[16] Cummings J.H., Macfarlane G.T.: The control and consequences of bacterial fermentation in the human colon. J. Appl. Bacteriol., 1991; 70: 443-459
[PubMed]  

[17] Czarny A., Witkowska D., Mulczyk M.: Phagocytic and bactericidal properties of macrophages of mice immunized with outer membrane proteins (OMP) of Shigella. Arch. Immunol. Ther. Exp., 1988; 36: 701-709
[PubMed]  

[18] Czarny A., Witkowska D., Mulczyk M.: Induction of tumor necrosis factor and interleukin 6 by outer membrane proteins of Shigella in spleen cells and macrophages of mice. Arch. Immunol. Ther. Exp., 1993; 41: 153-157
[PubMed]  

[19] Czarny A., Witkowska D., Mulczyk M.: Effect of outer membrane proteins (OMP) of Shigella on interleukin 2 (IL-2) production by spleen cells of mice. Arch. Immunol. Ther. Exp., 1994; 42: 159-161
[PubMed]  

[20] Dare D.: Rapid bacterial characterization and identification by MALDI-TOF mass spectrometry. W: Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology, t. 1, red.: Tang Y.W., Stratton C. W. Springer, Nashville 2006, 117-133

[21] Dart R.K.: Microbiology for the Analytical Chemist. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK 1996

[22] Duménil D., Olivo J.C., Pellegrini S., Fellous M., Sansonetti P.J., Tran Van Nhieu G.: Inteρferon a inhibits a Src-mediated pathway necessary for Shigella-induced cytoskeletal rearrangements in epithelial cells. J. Cell Biol., 1998; 143: 1003-1012
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[23] Dunne E.F., Fey P.D., Kludt P., Reporter R., Mostashari F., Shillam P., Wicklund J., Miller C., Holland B., Stamey K., Barrett T.J., Rasheed J.K., Tenover F.C., Ribot E.M., Angulo F.J.: Emergence of domestically acquired ceftriaxone-resistant Salmonella infections associated with AmpC beta-lactamase. JAMA, 2000; 284: 3151-3156
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[24] DuPont H.L., Hornick R.B., Snyder M.J., Libonati J.P., Formal S.B., Gangarosa E.J.: Immunity in shigellosis. II. Protection induced by oral live vaccine or primary infection. J. Infect. Dis., 1972; 125: 12-16
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[25] Ericsson C.D.: Travellers’ diarrhoea. Int. J. Antimicrob. Agents, 2003; 21: 116-124
[PubMed]  

[26] Espina M., Olive A.J., Kenjale R., Moore D.S., Ausar S.F., Kaminski R.W., Oaks E.V., Middaugh C.R., Picking W.D., Picking W.L.: IpaD localizes to the tip of the Type III Secretion System needle of Shigella flexneri. Infect. Immun., 2006; 74: 4391-4400
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[27] Evans D.G, Graham D.Y, Evans D.J Jr.: Administration of purified colonization factor antigens (CFA/I, CFA/II) of enterotoxigenic Escherichia coli to volunteers. Response to challenge with virulent enterotoxigenic Escherichia coli. Gastroenterology, 1984; 87: 934-940
[PubMed]  

[28] Fennelly G.J., Khan S.A., Abadi M.A., Wild T.F., Bloom B.R.: Mucosal DNA vaccine immunization against measles with a highly attenuated Shigella flexneri vector. J. Immunol., 1999; 162: 1603-1610
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[29] Ferreccio C., Prado V., Ojeda A., Cayyazo M., Abrego P., Guers L., Levine M.M.: Epidemiologic patterns of acute diarrhea and endemic Shigella infections in children in a poor periurban setting in Santiago, Chile. Am. J. Epidemiol., 1991; 134: 614-627
[PubMed]  

[30] Finney M., Smullen J., Foster H.A., Brokx S., Storey D.M.: Evaluation of Chromocult coliform agar for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae from faecal samples from healthy subjects. J. Microbiol. Meth., 2003; 54: 353-358
[PubMed]  

[31] Formal S.B., Oaks E.V., Olsen R.E., Wingfield-Eggleston M., Snoy P.J., Cogan J.P: Effect of prior infection with virulent Shigella flexneri 2a on the resistance of monkeys to subsequent infection with Shigella sonnei. J. Infect. Dis., 1991; 164: 533-537
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[32] Gamian A, Witkowska D., Mieszała M., Staniszewska M., Przondo-Mordarska A.: Fimbriae as a Cartier for antibacterial vaccines. Nova Acta Leopoldina, 1999; 80: 265-272

[33] Girard M.P., Steele D., Chaignat C.L., Kieny M.P.: A review of vaccine research and development: human enteric infections. Vaccine, 2006; 24: 2732-2750
[PubMed]  

[34] Girón J.A.: Expression of flagella and motility by Shigella. Mol. Microbiol., 1995; 18: 63-75
[PubMed]  

[35] Gomez H.F., Ochoa T.J., Carlin L.G., Cleary T.G.: Human lactoferrin impairs virulence of Shigella flexneri. J. Infect. Dis., 2003; 187: 87-95
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[36] Gómez-Duarte O.G., Bai J., Newell E.: Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, and Campylobacter spp. enteropathogens by 3-reaction multiplex polymerase chain reaction. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2009; 63: 1-9
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[37] Goni-Urriza M., Capdepuy M., Arpin C., Raymond N., Caumette P., Quentin C.: Impact of an urban effluent on antibiotic resistance of riverine Enterobacteriaceae and Aeromonas spp. Appl. Environ. Microbiol., 2000; 66: 125-132
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[38] Górska S., Jarząb A, Gamian A.: Bakterie probiotyczne w przewodzie pokarmowym człowieka jako czynnik stymulujący układ odpornościowy. Postępy Hig. Med. Dośw., 2009; 63: 653-667
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[39] Guerrant R.L., Kosek M., Moore S., Lorentz B., Brantley R., Lima A.A.: Magnitude and impact of diarrheal diseases. Arch. Med. Res., 2002; 33: 351-355
[PubMed]  

[40] Guichon A., Hersh D., Smith M.R., Zychlinsky A.: Structure-function analysis of the Shigella virulence factor IpaB. J. Bacteriol., 2001; 183: 1269-1276
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[41] Guttman J.A., Finlay B.B.: Subcellular alterations that lead to diarrhea during bacterial pathogenesis. Trends Microbiol., 2008; 16: 535-542
[PubMed]  

[42] Haas M.J., Dowding J.E.: Aminoglycoside-modifying enzymes. Methods Enzymol., 1975; 43: 611-628
[PubMed]  

[43] Hale Boothe D.D., Smith M.C., Gattie D.K., Das K.C.: Characterization of microbial populations in landfill leachate and bulk samples during aerobic bioreduction. Adv. Environ. Res., 2001; 5: 285-294

[44] Han J.: Molecular differential diagnoses of infectious diseases: is the future now? W: Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology, t. 1, red.: Tang Y.W., Stratton C. W. Springer, Nashville 2006, 472-504

[45] Hardegen C., Messler S., Henrich B., Pfeffer K., Würthner J., MacKenzie C.R.: A set of novel multiplex Taqman real-time PCRs for the detection of diarrhoeagenic Escherichia coli and its use in determining the prevalence of EPEC and EAEC in a university hospital. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob., 2010; 9: 5
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[46] Hathaway L.J., Griffin G.E., Sansonetti P.J., Edgeworth J.D.: Human monocytes kill Shigella flexneri but then die by apoptosis associated with suppression of proinflammatory cytokine production. Infect. Immun., 2002; 70: 3833-3842
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[47] Hayward R.D., Cain R.J., McGhie E.J., Phillips N., Garner M.J., Koronakis V.: Cholesterol binding by the bacterial type III translocon is essential for virulence effector delivery into mammalian cells. Mol. Microbiol., 2005; 56: 590-603
[PubMed]  

[48] Hodgkinson J.L., Horsley A., Stabat D., Simon M., Johnson S., da Fonseca P.C., Morris E.P., Wall J.S., Lea S.M., Blocker A.J.: Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol., 2009; 16: 477-485
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[49] Hong Y., Liu T., Lee M.D., Hofacre C.L., Maier M., White D.G., Ayers S., Wang L., Berghaus R., Maurer J.J.: Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles. BMC Microbiol., 2008; 8: 178
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[50] Huilan S., Zhen L.G., Mathan M.M., Mathew M.M., Olarte J., Espejo R., Khin Maung U., Ghafoor M.A., Khan M.A., Sami Z., Sutton R.G.: Etiology of acute diarrhoea among children in developing countries: a multicentre study in five countries. Bull. World Health Organ., 1991; 69: 549-555
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[51] Iijima H., Takahashi I., Kiyono H.: Mucosal immune network in the gut for the control of infectious diseases. Rev. Med. Virol., 2001; 11: 117-133
[PubMed]  

[52] Ishii Y., Kimura S., Alba J., Shiroto K., Otsuka M., Hashizume N., Tamura K., Yamaguchi K.: Extended-spectrum beta-lactamase-producing Shiga toxin gene (Stx1)-positive Escherichia coli O26:H11: a new concern. J. Clin. Microbiol., 2005; 43: 1072-1075
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[53] Islam D., Christensson B.: Disease dependent changes in T-cell populations in patients with shigellosis. APMIS, 2000; 108: 251-260
[PubMed]  

[54] Islam D., Veress B., Bardhan P.K., Lindberg A.A., Christensson B.: Quantitative assessment of IgG and IgA subclass producing cells in rectal mucosa during shigellosis. J. Clin. Pathol., 1997; 50: 513-520
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[55] Jacoby G.A., Medeiros A.A.: More extended-spectrum beta-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother., 1991; 35: 1697-1704
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[56] Jarlier V., Nicolas M.H., Fournier G., Philippon A.: Extended broad-spectrum beta-lactamases conferring transferable resistance to newer beta-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev. Infect. Dis., 1988; 10: 867-878
[PubMed]  

[57] Kawai K., Liu Y., Ohnishi K., Oshima S.: A conserved 37 kDa outer membrane protein of Edwardsiella tarda is an effective vaccine candidate. Vaccine, 2004; 22: 3411-3418
[PubMed]  

[58] Kim S., Kim J., Kang Y., Park Y., Lee B.: Occurrence of extended spectrum beta-lactamases in members of the genus Shigella in the Republic of Korea. J. Clin. Microbiol., 2004; 42: 5264-5269
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[59] Klee S.R., Tzschaschel B.D., Singh M., Fält I., Lindberg A.A., Timmis K.N., Guzmán C.A.: Construction and characterization of genetically-marked bivalent anti-Shigella dysenteriae 1 and anti-Shigella flexneri Y live vaccine candidates. Microb. Pathog., 1997; 22: 363-376
[PubMed]  

[60] Kobayashi N., Nishino K., Yamaguchi A.: Novel macrolide-specific ABC-type efflux transporter in Escherichia coli. J. Bacteriol., 2001; 183: 5639-5644
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[61] Kohler H., Rodrigues S.P., McCormick B.A.: S. flexneri interactions with the basolateral membrane domain of polarized model intestinal epithelium: role of LPS in cell invasion and in activation of the mitogen activated protein kinase ERK. Infect. Immun., 2002; 70: 1150-1158
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[62] Kotloff K.L., Herrington D.A., Hale T.L., Newland J.W., Van De Verg L., Cogan J.P., Snoy P.J., Sadoff J.C., Formal S.B., Levine M.M..: Safety, immunogenicity, and efficacy in monkeys and humans of invasive Escherichia coli K-12 hybrid vaccine candidates expressing Shigella flexneri 2a somatic antigen. Infect. Immun., 1992; 60: 2218-2224
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[63] Kotloff K.L., Noriega F., Losonsky G.A., Sztein M.B., Wasserman S.S., Nataro J.P., Levine M.M.: Safety, immunogenicity, and transmissibility in humans of CVD 1203, a live oral Shigella flexneri 2a vaccine candidate attenuated by deletions in aroA and virG. Infect. Immun., 1996; 64: 4542-4548
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[64] Kramer T.T., Roof M.B., Matheson R.R.: Safety and efficacy of an attenuated strain Salmonella choleraesuis for vaccination of swine. Am. J.Vet. Res., 1992, 53: 444-448
[PubMed]  

[65] Kruger T., Szabo D., Keddy K.H., Deeley K., Marsh J.W., Hujer A.M., Bonomo R.A., Paterson D.L.: Infections with nontyphoidal Salmonella species producing TEM-63 or a novel TEM enzyme, TEM-131, in South Africa. Antimicrob. Agents Chemother., 2004; 48: 4263-4270
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[66] Kubler-Kielb J., Vinogradov E., Mocca C., Pozsgay V., Coxon B., Robbins J.B., Schneerson R.: Immunochemical studies of Shigella flexneri 2a and 6, and Shigella dysenteriae type 1 O-specific polysaccharide-core fragments and their protein conjugates as vaccine candidates. Carbohydr. Res., 2010; 345: 1600-1608
[PubMed]  

[67] Laupland K.B., Schonheyder H.C., Kennedy K.J., Lyytikainen O., Valiquette L., Galbraith J., Collignon P., International Bacteremia Surveillance Collaborative.: Salmonella enterica bacteraemia: A multi-national population-based cohort study. BMC Infect. Dis., 2010; 10: 95-100
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[68] Levine M.M., Kaper J.B., Black R.E., Clements M.L.: New knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infections as applied to vaccine development. Microbiol. Rev., 1983; 47: 510-550
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[69] Lindell S.S., Quinn P.: Use of bile-esculin agar for rapid differentiation of Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol., 1975; 1: 440-443
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[70] Lipps G.: Plasmids: Current Research and Future Trends. Caister Academic Press. 2008, University of Bayreuth, Germany 2008

[71] Livermore D.M., Brown D.F.: Detection of beta-lactamase-mediated resistance. J. Antimicrob. Chemother., 2001; 48 Suppl.1: 59-64
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[72] Lombard M., Pastoret P.P., Moulin A.M.: A brief history of vaccines and vaccination. Rev. Sci. Tech., 2007; 26: 29-48
[PubMed]  

[73] López-Gigosos R., García-Fortea P., Reina-Dona E., Plaza-Martín E.: Effectiveness in prevention of travellers’ diarrhoea by an oral cholera vaccine WC/rBS. Travel Med. Infect. Dis., 2007; 5: 380-384
[PubMed]  

[74] Louie M., Louie L., Simor A.E.: The role of DNA amplification technology in the diagnosis of infectious diseases. CMAJ, 2000; 163: 301-309
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[75] Lowell G.H., Kaminski R.W., Grate S., Hunt R.E., Charney C, Zimmer S., Colleton C.: Intranasal and intramuscular proteosome-staphylococcal enterotoxin B (SEB) toxoid vaccines: immunogenicity and efficacy against lethal SEB intoxication in mice. Infect. Immun., 1996; 64: 1706-1713
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[76] Lumsden J.S., Wilkie B.N., Clarke R.C.: Resistance to fecal shedding in pigs and chickens vaccinated with an aromatic depend mutant of Salmonella typhimurium. Am. J. Vet. Res., 1991, 52: 1784-1787
[PubMed]  

[77] Mac Aogáin M., Mooij M.J., Adams C., Clair J., O’Gara F.: Emergence of extended-spectrum beta-lactamase and fluoroquinolone resistance genes among Irish multidrug-resistant isolates. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2010; 67:106-109
[PubMed]  

[78] Mackay I. M.: Real-Time PCR in Microbiology. From Diagnosis to Characterization. Caister Academic Press, Norfolk, UK 2007

[79] Macmillan H., Norimine J., Brayton K.A., Palmer G.H., Brown W.C.: Physical linkage of naturally complexed bacterial outer membrane proteins enhances immunogenicity. Infect. Immun., 2008; 76: 1223-1229
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[80] Mandic-Mulec I., Weiss J., Zychlinsky A.: Shigella flexneri is trapped in polymorphonuclear leukocyte vacuoles and efficiently killed. Infect. Immun., 1997; 65: 110-115
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[81] Mandine E., Salles M.F., Zalisz R., Guenounou M., Smets P.: Murine monoclonal antibodies to Klebsiella pneumoniae protect against lethal endotoxemia and experimental infection with capsulated K. pneumoniae, Infect. Immun., 1990; 58: 2828-2833
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[82] Marlovits T.C., Kubori T., Sukhan D.R., Thomas D.R., Galán J.E., Unger V.M.: Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science, 2004; 306: 1040-1042
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[83] Meitert T., Pencu E., Ciudin L., Tonciu M.: Vaccine strain Sh. flexneri T32-Istrati. Studies in animals and in volunteers. Antidysentery immunoprophylaxis and immunotherapy by live vaccine Vadizen (Sh. flexneri T32-Istrati). Arch. Roum. Pathol. Exp. Microbiol., 1984; 43: 251-278
[PubMed]  

[84] Mel D.M., Arsic B.L., Nikolic B.D., Radovanic M.L.: Studies on vaccination against bacillary dysentery. 4. Oral immunization with live monotypic and combined vaccines. Bull. World Health Organ., 1968; 39: 375-380
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[85] Mukhopadhaya A., Mahalanabis D., Khanam J., Chakrabarti M.K.: Protective efficacy of oral immunization with heat-killed Shigella flexneri 2a in animal model: study of cross protection, immune response and antigenic recognition. Vaccine, 2003; 21: 3043-3050
[PubMed]  

[86] Mulczyk M., Adamus G., Witkowska D., Romanowska E.: Studies on virulence of Shigella flexneri. Protective effect of outer membrane proteins. Arch. Immunol. Ther. Exp., 1981; 29: 85-90
[PubMed]  

[87] Munday C.J., Whitehead G.M., Todd N.J., Campbell M., Hawkey P.M.: Predominance and genetic diversity of community- and hospital-acquired CTX-M extended-spectrum beta-lactamases in York, UK. J. Antimicrob. Chemother., 2004; 54: 628-633
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[88] Nataro J.P., Mai V., Johnson J., Blackwelder W.C., Heimer R., Tirrell S., Edberg S.C., Braden C.R., Glenn Morris J.Jr, Hirshon J.M.: Diarrheagenic Escherichia coli infection in Baltimore, Maryland, New Haven, Connecticut. Clin. Infect. Dis., 2006; 43: 402-407
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[89] Nato F, Phalipon A, Nguyen TL, Diep TT, Sansonetti P, Germani Y.: Dipstick for rapid diagnosis of Shigella flexneri 2a in stool. PLoS One, 2007; 2: e361
[PubMed]  

[90] Nikaido H.: Bacterial resistance to antibiotics as a function of outer membrane permeability. J. Antimicrob. Chemother., 1988; 22, Suppl. A: 17-22
[PubMed]  

[91] Noriega F.R., Liao F.M., Maneval D.R., Ren S., Formal S.B., Levine M.M.: Strategy for cross-protection among Shigella flexneri serotypes. Infect. Immun., 1999; 67: 782-788
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[92] Noriega F.R., Losonsky G., Wang J.Y., Formal S.B., Levine M.M.: Further characterization of delta aroA delta virG Shigella flexneri 2a strain CVD 1203 as a mucosal Shigella vaccine and as a live-vector vaccine for delivering antigens of enterotoxigenic Escherichia coli. Infect. Immun., 1996; 64: 23-27
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[93] Noriega F.R., Wang J.Y., Losonsky G., Maneval D.L., Hone D.M., Levine M.M.: Construction and characterization of attenuated delta aroA delta virG Shigella flexneri 2a strain CVD 1203, a prototype live oral vaccine. Infect. Immun., 1994; 62: 5168-5172
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[94] Oberhelman R.A., Kopecko D.J., Salazar-Lindo E., Gotuzzo E., Buysse J.M., Venkatesan M.M., Fernandez-Prada C., Guzman M., Leon-Barua R., Sack R.B.: Prospective study of systemic and mucosal immune responses in dysenteric patients to specific Shigella invasion plasmid antigens and lipopolysaccharides. Infect. Immun., 1991; 59: 2341-2350
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[95] O’Hara C.M.: Manual and automated instrumentation for identification of Enterobacteriaceae and other aerobic Gram-negative bacilli. Clin. Microbiol. Rev., 2005; 18: 147-162
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[96] Passwell J.H., Harlev E., Ashkenazi S., Chu C., Miron D., Ramon R., Farzan N., Shiloach J., Bryla D.A., Majadly F., Roberson R., Robbins J.B., Schneerson R.: Safety and immunogenicity of improved Shigella O-specific polysaccharide-protein conjugate vaccines in adults in Israel. Infect. Immun., 2001; 69: 1351-1357
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[97] Paterson D.L.: Resistance in gram-negative bacteria: Enterobacteriaceae. Am. J. Med., 2006; 119: S20-S28
[PubMed]  

[98] Paterson D.L., Hujer K.M., Hujer A.M., Yeiser B., Bonomo M.D., Rice L.B., Bonomo R.A.; International Klebsiella Study Group.: Extended-spectrum β-lactamases in Klebsiella pneumoniae bloodstream isolates from seven countries: dominance and widespread prevalence of SHV- and CTX-M-type β-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother., 2003; 47: 3554-3560
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[99] Paterson D.L., Ko W.C., Von Gottberg A., Mohapatra S., Casellas J.M., Goossens H., Mulazimoglu L., Trenholme G., Klugman K.P., Bonomo R.A., Rice L.B., Wagener M.M., McCormack J.G., Yu V.L.: International prospective study of Klebsiella pneumonia bacteremia: implications of extended-spectrum beta-lactamase production in nosocomial infections. Ann. Intern. Med., 2004; 140: 26-32
[PubMed]  

[100] Pendaries C., Tronchere H., Arbibe L., Mounier J., Gozani O., Cantley L., Fry M.J., Gaits- Iacovoni F., Sansonetti P.J., Payrastre B.: PtdIns(5)P activates the host cell PI3-kinase/akt pathway during Shigella flexneri infection. EMBO J., 2006; 25: 1024-1034
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[101] Petroni A., Corso A., Melano R., Cacace M.L., Bru A.M., Rossi A., Galas M.: Plasmidic extended-spectrum beta-lactamases in Vibrio cholerae O1 El Tor isolates in Argentina. Antimicrob. Agents Chemother., 2002; 46: 1462-1468
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[102] Phalipon A., Cardona A., Kraehenbuhl J.P., Edelman L., Sansonetti P.J., Corthesy B.: Secretory component: a new role in secretory IgA-mediated immune exclusion in vivo. Immunity, 2002; 17: 107-115
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[103] Poole K.: Mechanisms of bacterial biocide and antibiotic resistance. J. Appl. Microbiol., 2002; 92: 55S-64S
[PubMed]  

[104] Ram P.K., Crump J.A., Gupta S.K., Miller M.A., Mintz E.D.: Part II. Analysis of data gaps pertaining to Shigella infections in low and medium human development index countries, 1984-2005. Epidemiol. Infect., 2008; 136: 577-603
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[105] Ramarao N., Le Clainche C., Izard T., Bourdet-Sicard R., Ageron E., Sansonetti P.J., Carlier M., Van Nhieu G.T.: Capping host actin filaments by vinculin activated by the Shigella IpaA carboxyl-terminal domain. FEBS Lett., 2007, 581: 853-857
[PubMed]  

[106] Raqib R., Lindberg A.A., Wretlind B., Bardhan P.K., Andersson U., Andersson J.: Persistence of local cytokine production in shigellosis in acute and convalescent stages. Infect. Immun., 1995; 63: 289-296
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[107] Reier-Nilsen T., Farstad T., Nakstad B., Lauvrak V., Steinbakk M.: Comparison of broad range 16S rDNA PCR and conventional blood culture for diagnosis of sepsis in the newborn: a case control study. BMC Pediatr., 2009; 9: 5
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[108] Reis R.S., Horn F.: Enteropathogenic Escherichia coli, Samonella, Shigella and Yersinia: cellular aspects of host-bacteria interactions in enteric diseases. Gut Pathog., 2010; 2: 8
[PubMed]  

[109] Robin G., Keisari Y., Slepon R., Ashkenazi S., Cohen D.: Quantitative analysis of IgG class and subclass and IgA serum response to Shigella sonnei and Shigella flexneri 2a polysaccharides following vaccination with Shigella conjugate vaccines. Vaccine, 1999; 17: 3109-3115
[PubMed]  

[110] Rohde J.R., Breitkreutz A., Chenal A., Sansonetti P.J., Parsot C.: Type III secretion effectors of the IpaH family are E3 ubiquitin ligases. Cell Host Microbe., 2007; 1: 77-83
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[111] Roy S., Das A.B., Ghosh A.N., Biswas T.: Purification, pore-forming ability, and antigenic relatedness of the major outer membrane protein of Shigella dysenteriae type 1. Infect. Immun., 1994; 62: 4333-4338
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[112] Rui X., Xu Y., Wan H., Su G., Huang C.: Construction of a stable and non-resistant bivalent vaccine candidate strain against Shigella flexneri 2a and Shigella sonnei. Chin. J. Biotechnol., 1996; 12: 89-97
[PubMed]  

[113] Ruiz J.: Mechanisms of resistance to quinolones: target alterations, decreased accumulation and DNA gyrase protection. J. Antimicrob. Chemother., 2003; 51: 1109-1117
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[114] Ruiz N., Kahne D., Silhavy T.J.: Advances in understanding bacterial outer-membrane biogenesis. Nat. Rev. Microbiol., 2006; 4: 57-66
[PubMed]  

[115] Salminen S., Isolauri E., Onnela T.: Gut flora in normal and disordered states. Chemotherapy. 1995; 41 Suppl 1: 5-15
[PubMed]  

[116] Sansonetti P.J., Arondel J., Huerre M., Harada A., Matsushima K.: Interleukin-8 controls bacterial transepithelial translocation at the cost of epithelial destruction in experimental shigellosis. Infect. Immun., 1999; 67: 1471-1480
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[117] Sansonetti P., Phalipon A.: Shigellosis: from molecular pathogenesis of infection to protective immunity and vaccine development. Res. Immunol., 1996; 147: 595-602
[PubMed]  

[118] Schroeder G.N., Hilbi H.: Molecular pathogenesis of Shigella spp.: controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin. Microbiol. Rev., 2008; 21: 134-156
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[119] Silva J.: Mechanisms of antibiotic resistance. Curr. Ther. Res., 1996; 57: 30-35

[120] Singer M., Sansonetti P.J.: IL-8 is a key chemokine regulating neutrophil recruitment in a new mouse model of Shigella-induced colitis. J. Immun., 2004, 173: 4197-4206
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[121] Skoudy A., Nhieu G.T., Mantis N., Arpin M., Mounier J., Gounon P., Sansonetti P.J.: A functional role for ezrin during Shigella flexneri entry into epithelial cells. J. Cell. Sci., 1999; 112: 2059-2068
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[122] Staniszewska M., Witkowska D., Gamian A.: Fimbrie jako czynnik patogenności bakterii i nośnik w szczepionkach koniugatowych. Postępy Hig. Med. Dośw., 2000; 54: 727-747
[PubMed]  

[123] Suzuki T., Franchi L., Toma C., Ashida H., Ogawa M., Yoshikawa Y., Mimuro H., Inohara N., Sasakawa C., Nunez G.: Differential regulation of caspase-1 activation, pyroptosis, and autophagy via Ipaf and ASC in Shigella infected macrophages. PLoS Pathog., 2007; 3: e111
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[124] Taylor D.N., Trofa A.C., Sadoff J., Chu C., Bryla D., Shiloach J., Cohen D., Ashkenazi S., Lerman Y., Egan W., Schneerson R., Robbins J.B.: Synthesis, characterization, and clinical evaluation of conjugate vaccines composed of the O-specific polysaccharides of Shigella dysenteriae type 1, Shigella flexneri type 2a, and Shigella sonnei (Plesiomonas shigelloides) bound to bacterial toxoids. Infect. Immun., 1993; 61: 3678-3687
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[125] Tommassen J.: Assembly of outer-membrane proteins in bacteria and mitochondria. Microbiology, 2010; 156: 2587-2596
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[126] Tran Van Nhieu G., Caron E., Hall A., Sansonetti P.J.: IpaC induces actin polymerization and filopodia formation during Shigella entry into epithelial cells. EMBO J., 1999; 18: 3249-3262
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[127] Tribble D., Kaminski R., Cantrell J., Nelson M., Porter C., Baqar S., Williams C., Arora R., Saunders J., Ananthakrishnan M., Sanders J., Zaucha G., Turbyfill R., Oaks E.: Safety and immunogenicity of a Shigella flexneri 2a Invaplex 50 intranasal vaccine in adult volunteers. Vaccine, 2010; 28: 6076-6085
[PubMed]  

[128] Turbyfill K.R., Hartman A.B., Oaks E.V.: Isolation and characterization of a Shigella flexneri invasin complex subunit vaccine. Infect. Immun., 2000; 68: 6624-6632
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[129] Turbyfill K.R., Kaminski R.W., Oaks E.V.: Immunogenicity and efficacy of highly purified invasin complex vaccine from Shigella flexneri 2a. Vaccine, 2008; 26: 1353-1364
[PubMed]  

[130] Van Baar B.L.: Characterisation of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionisation and electrospray mass spectrometry. FEMS Microbiol. Rev., 2000; 24: 193-219
[PubMed]  

[131] Van De Verg L.L., Bendiuk N.O., Kotloff K., Marsh M.M., Ruckert J.L., Puryear J.L., Taylor D.N., Hartman A.B.: Cross-reactivity of Shigella flexneri serotype 2a O antigen antibodies following immunization or infection. Vaccine, 1996; 14: 1062-1068
[PubMed]  

[132] Van De Verg L.L., Mallett C.P., Collins H.H., Larsen T., Hammack C., Hale T.L.: Antibody and cytokine responses in a mouse pulmonary model of Shigella flexneri serotype 2a infection. Infect. Immun., 1995; 63: 1947-1954
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[133] Vecino W.H., Morin P.M., Agha R., Jacobs W.R. Jr, Fennelly G.J.: Mucosal DNA vaccination with highly attenuated Shigella is superior to attenuated Salmonella and comparable to intramuscular DNA vaccination for T cells against HIV. Immunol. Lett., 2002; 82: 197-204
[PubMed]  

[134] Vecino W.H., Quanquin N.M., Martinez-Sobrido L., Fernandez-Sesma A., García-Sastre A., Jacobs W.R. Jr, Fennelly G.J.: Mucosal immunization with attenuated Shigella flexneri harboring an influenza hemagglutinin DNA vaccine protects mice against a lethal influenza challenge. Virology, 2004; 325: 192-199
[PubMed]  

[135] Von Seidlein L., Kim D.R., Ali M., Lee H., Wang X., Thiem V.D., Canh do G., Chaicumpa W., Agtini M.D., Hossain A., Bhutta Z.A., Mason C., Sethabutr O., Talukder K., Nair G.B., Deen J.L., Kotloff K., Clemens J.: A multicentre study of Shigella diarrhoea in six Asian countries: disease burden, clinical manifestations, and microbiology. PLoS Med., 2006; 3: e353
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[136] Watanabe T.: Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria. Bacteriol. Rev., 1963; 27: 87-115
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[137] Way S.S., Borczuk A.C., Dominitz R., Goldberg M.B.: An essential role for gamma interferon in innate resistance to Shigella flexneri infection. Infect. Immun., 1998; 66: 1342-1348
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[138] Way S.S., Borczuk A.C., Goldberg M.B.: Adaptive immune response to Shigella flexneri 2a cydC in immunocompetent mice and mice lacking immunoglobulin A. Infect. Immun., 1999; 67: 2001-2004
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[139] Way S.S., Borczuk A.C., Goldberg M.B.: Thymic independance of adaptive immunity to the intracellular patogen Shigella flexneri serotype 2a. Infect. Immun., 1999; 67: 3970-3979
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[140] Weinrauch Y., Drujan D., Shapiro S.D., Weiss J., Zychlinsky A.: Neutrophil elastase targets virulence factors of enterobacteria. Nature, 2002; 417: 91-94
[PubMed]  

[141] Wiegand I., Geiss H.K., Mack D., Stürenburg E., Seifert H.: Detection of extended-spectrum beta-lactamases among Enterobacteriaceae by use of semiautomated microbiology systems and manual detection procedures. J. Clin. Microbiol., 2007; 45: 1167-1174
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[142] Williamson R.: Resistance of Clostridium perfringens to beta-lactam antibiotics mediated by a decreased affinity of a single essential penicillin-binding protein. J. Gen. Microbiol., 1983; 129: 2339-2342
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[143] Witkowska D., Adamus G., Mulczyk M., Romanowska E.: Outer membrane protein composition of Shigella flexneri. FEMS Microbiol. Lett., 1982; 13: 109-111

[144] Witkowska D., Bartyś A., Gamian A.: Białka osłony komórkowej pałeczek jelitowych i ich udział w patogenności oraz odporności przeciwbakteryjnej. Postępy Hig. Med. Dośw. 2009; 63: 176-199
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[145] Witkowska D., Czarny A., Mulczyk M.: Humoral response in mice immunized with outer membrane proteins of Shigella flexneri. Arch. Immunol. Ther. Exp., 1986; 34: 499-504
[PubMed]  

[146] Witkowska D., Masłowska E., Staniszewska M., Szostko B., Jankowski A., Gamian A.: Enterobacterial 38-kDa outer membrane protein is an age-dependent molecular marker of innate immunity and immunoglobulin deficiency as results from its reactivity with IgG and IgA antibody. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2006; 48: 205-214
[PubMed]  

[147] Witkowska D., Mieszała M., Gamian A., Staniszewska M., Czarny A., Przondo-Mordarska A., Jaquinod M., Forest E.: Major structural proteins of type 1 and type 3 Klebsiella fimbriae are effective protein carriers and immunogens in conjugates as revealed from their immunochemical characterization. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2005; 45: 221-230
[PubMed]  

[148] Witkowska D., Mleczko J., Mulczyk M.: Transfer of immunity by means of spleen cells from mice immunized with outer membrane proteins of Shigella flexneri. Arch. Immunol. Ther. Exp., 1985; 33: 629-635
[PubMed]  

[149] Wu F., Della-Latta P.: Pulsed-field gel electrophoresis. W: Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology, t. 1, red.: Tang Y.W., Stratton C. W. Springer, Nashville 2006, 143-157

[150] Xiang Y., Han W.: Bacterial identification based on 16S ribosomal RNA gene sequence analysis. W: Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology, t. 1, red.: Tang Y.W., Stratton C. W. Springer, Nashville 2006, 323-332

[151] Yokochi T, Inoue Y, Kato Y, Sugiyama T, Jiang GZ, Kawai M, Fukada M, Takahashi K.: Strong adjuvant action of Klebsiella O3 lipopolysaccharide and its inhibition of systemic anaphylaxis. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1995; 10: 181-184
[PubMed]  

[152] Yoshida S., Handa Y., Suzuki T., Ogawa M., Suzuki M., Tamai A., Abe A., Katayama E., Sasakawa C.: Microtubule-severing activity of Shigella is pivotal for intercellular spreading. Science, 2006, 314: 985-989
[PubMed]  

[153] Zwillich S.H., Duby A.D., Lipsky, P.E.: T-lymphocyte clones responsive to Shigella flexneri. J. Clin. Microbiol., 1989; 27: 417-421
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[154] Zychlinsky A., Prevost M.C., Sansonetti P.J.: Shigella flexneri induces apoptosis in infected macrophages. Nature, 1992; 358: 167-169
[PubMed]  

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu