Streszczenie

Neutrofile są jednymi z pierwszych komórek układu odpornościowego pojawiającymi się w miej­scu wystąpienia infekcji, reprezentując jeden z najskuteczniejszych i najszybszych sposobów wal­ki organizmu z patogenami. Niedawno opisano nowy mechanizm stosowany przez neutrofile wo­bec patogenów – komórki te, po aktywacji, uwalniają DNA z jądra komórkowego oraz zawartość ziarnistości znajdujących się w cytoplazmie, tworząc NET – zewnątrzkomórkową sieć neutrofi­lów. Ta zewnątrzkomórkowa struktura, zawierająca również histony oraz białka ziarnistości ko­mórek PMN, jest zdolna uwięzić i zniszczyć wiele patogenów, w tym bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne, grzyby, pierwotniaki i wirusy. Niektóre z patogenów, które po uwięzieniu na­rażone zostają na wysokie stężenie substancji bójczych, wykształciły mechanizmy obronne wo­bec wiązania przez sieć NET, takie jak modyfikacja powierzchni komórek i/lub niszczenie DNA wchodzącego w skład sieci NET z użyciem DNaz. Sugeruje się, że sieci NET wytwarzane są w procesie aktywnej śmierci komórki, nazwanej w ostatnim czasie NETosis. Nowe dane wska­zują, że ten rodzaj śmierci komórkowej wymaga współdziałania trzech procesów: produkcji re­aktywnych form tlenu, cytrulinacji histonów w komórkach PMN oraz zdolności tych komórek do przeprowadzenia autofagii, oraz znacznie różni się od znanych dotąd typów śmierci, takich jak apoptoza czy nekroza. Co więcej, uwalnianie podobnych sieci zaobserwowano także w przy­padku innych komórek – mastocytów (komórek tucznych) i eozynofilów. Komórki tuczne, ana­logicznie jak neutrofile, w określonych warunkach uwalniają chromatynę jądrową i mogą wejść w podobny program aktywnej śmierci komórkowej, natomiast sieć wytwarzana przez eozynofi­le zawiera wyłącznie chromatynę pochodzenia mitochondrialnego, a jej uwolnienie nie prowa­dzi do obumierania tych komórek.

Słowa kluczowe:neutrofile • sieć NET • NETosis • śmierć komórki

Summary

Neutrophils are one of the first cells of the immune system recruited to the site of infection, re­presenting the host’s most effective and numerous front-line defenders. Recently, a novel anti­microbial mechanism of neutrophils has been described: upon activation, they release DNA and a subset of their granule content, forming neutrophil extracellular traps (NETs). These extracel­lular, chromatin structures, which contain histones and neutrophil granule proteins, can trap and kill a broad spectrum of microbes, including Gram-positive and Gram-negative bacteria, fungi, protozoa and viruses. Some of the pathogens, which are trapped and exposed to high local con­centrations of antimicrobial compounds, employ strategies against NET binding, including surface modification and/or degradation of NET by DNases. It has been suggested that NETs are formed during active cell death, recently named NETosis. New data indicate that this novel mechanism of cell death requires interaction between three processes – reactive oxygen species generation, histone citrullination and autophagy – and significantly differs from previously known types of cell death, including apoptosis and necrosis. Moreover, the release of nuclear chromatin was also described for other types of cells – mast cells and eosinophils. Mast cells, like neutrophils, un­der certain conditions release nuclear chromatin and may undergo a similar active cell death pro­gram, while eosinophils release only mitochondrial chromatin, and its release does not lead to the death of these cells.

Key words:neutrophils • NET • NETosis • cell death

Wprowadzenie

Jeszcze do niedawna uważano, że niszczenie i likwida­cja patogennych zarazków przez neutrofile (granulocyty obojętnochłonne – komórki polimorfonuklearne – komór­ki PMN) odbywa się m.in. głównie poprzez proces fago­cytozy [11]. W 2004 r. Brinkmann i Zychlinsky [7] opi­sali po raz pierwszy nowy mechanizm, odpowiedzialny za niszczenie mikroorganizmów – sieć NET (neutrophil extracellular trap), powstałą przez uwolnienie z neutrofi­lów do przestrzeni pozakomórkowej zawartości jądra ko­mórkowego wraz ze składnikami ich ziarnistości. Autorzy tej pionierskiej publikacji udowodnili, że sieć ta nie jest wynikiem wycieku chromatyny związanego z dezinte­gracją komórki [7], a ponadto, że ze względu na szybkość formowania się sieci NET, trwająca często zaledwie kil­ka minut od chwili aktywacji neutrofilów, proces ten nie ma związku z apoptozą. NET jest skuteczną bronią za­równo wobec bakterii Gram-ujemnych, Gram-dodatnich, kwasoopornych [3,7,8,40], grzybów [5,47,48], pierwotnia­ków [15,18] jak i wirusa grypy [34]. W tym ostatnim przy­padku, formowanie sieci NET opisano w neutrofilach po­chodzących z płuc zainfekowanych wirusem grypy oraz w hodowli epitelialnych komórek pęcherzykowych [34]. Stwierdzono, że uwięzione w chromatynowej sieci NET, mikroorganizmy wystawione są na działanie wysokich stę­żeń czynników bójczych, do których należą m.in. mielo­peroksydaza (MPO), kationowe proteazy serynowe (pro­teinaza 3, katepsyna G, elastaza neutrofilowa), białko BPI (bactericidal/permeability-increasing protein) – o właści­wościach bakteriobójczych zwiększające przepuszczalność, laktoferryna, żelatynaza B, katelicydyna (LL-37), trypta­za oraz białka histonowe (histony rdzeniowe i łącznikowe histony H1) [38]. W przypadku niektórych mikroorgani­zmów aktywność sieci NET ogranicza się wyłącznie do ich „związania”, bez niszczenia przez bójcze składniki NET, co dotyczy m.in. Streptococcus pneumoniae [3], strepto­koków z grupy A (GAS – Group A Streptococcus) [8] czy Mycobacterium tuberculosis [40]. Dowiedziono, że nie tyl­ko kontakt z patogenami stymuluje formowanie się sieci NET, jako że jej uwalnianie zaobserwowano również po stymulacji takimi czynnikami, jak LPS (lipopolisacharyd), IL-8 (interleukina 8), TNF (tumor necrosis factor – czynnik martwicy nowotworów) czy też mitogenem PMA (mirysty­nian octanu forbolu) [7]. Wytworzenie zewnątrzkomórko­wych sieci neutrofilowych zaobserwowano także u pacjen­tów cierpiących na posocznicę, podczas której dochodzi do wzmożonej aktywacji trombocytów przez LPS, z udziałem receptora TLR4 [10,27]. Aktywowane w ten sposób płytki krwi przyłączają się do związanych ze śródbłonkiem na­czyniowym, unieruchomionych neutrofilów i w ten spo­sób, w zaledwie 5-10 min, pobudzają je do wytwarzania sieci NET [10,27].

Opisując zjawisko uwalniania NET zauważono, że uwalnia­nie przez granulocyty obojętnochłonne chromatyny jądrowej to nowy, unikalny rodzaj śmierci tych komórek, nazwany NETozą (NETosis) [46] – zupełnie inny, niż powszechnie znane np. nekroza czy apoptoza [14]. Warto dodać, że ten nowo odkryty program śmierci komórki – NEToza, został uwzględniony w aktualnej klasyfikacji typowych i niety­powych postaci śmierci komórki [16], do których zalicza się pięć podstawowych typów śmierci komórki (apopto­za zewnętrzna, apoptoza wewnętrzna zależna i niezależ­na od kaspaz, regulowana nekroza, autofagia, katastrofa mitotyczna) oraz sześć nietypowych: anoikis, entozę, par­thanatos, pyroptozę, kornifikację i NETosis.

Charakterystyka sieci NET

Najprościej schemat uwalniania sieci NET przez gra­nulocyty obojętnochłonne, zaproponowany przez Brninkmanna i Zychlinsky’ego [7] w 2004 r. ex vivo, można przedstawić następująco: w neutrofilach aktywowa­nych substancjami takimi jak PMA, LPS czy IL-8, docho­dzi do rozpuszczenia błony jądrowej i błon ich ziarnistości oraz dekondensacji chromatyny i połączenia jej z białkami ziarnistości, co w momencie przerwania ciągłości błony komórkowej prowadzi do uwolnienia tak powstałej struk­tury do przestrzeni pozakomórkowej. W zależności od czynnika, który aktywował wytworzenie i uwolnienie sie­ci NET, jej formowanie może zająć od kilku minut do kil­ku godzin [14]. Powstająca sieć NET zawiera m.in. część substancji bójczych, magazynowanych w ziarnistościach pierwszorzędowych komórek PMN, w tym m.in. elastazę neutrofilową, katepsynę G czy mieloperoksydazę, niektó­re białka ziarnistości drugorzędowych (m.in laktoferrynę, pentraksynę 3 – PTX3, żelatynazę) oraz trzeciorzędowych (np. metaloproteinazę macierzy 9 – MMP9), a także dzia­łające bakteriobójczo histony oraz niektóre białka cytopla­zmatyczne, które w postaci związanej z NET mają mniej­szą możliwość przenikania do innych komórek czy tkanek gospodarza [7,28]. Sieć NET nie zawiera białek cytopla­zmatycznych neutrofilów, takich jak aktyna czy tubulina [7,28]. Wykazano, że skupienie wyżej wymienionych sub­stancji w jednym miejscu zwiększa bójcze działanie wo­bec patogenów uwięzionych w sieci NET, które wspoma­gane jest dodatkowo bakteriobójczymi właściwościami histonów [39]. Ponadto wytworzona sieć NET, pozostając związana z uwalniającą ją komórką, utrzymuje się i działa nawet wtedy, gdy neutrofile tracą już zdolność do przepro­wadzania procesu fagocytozy lub utraciły ją po zabloko­waniu farmakologicznym, np. w wyniku zastosowania in­hibitora mikrofilamentów aktynowych – cytochalazyny D [7]. Dodatkowo, wytwarzane sieci NET są także swoistego rodzaju barierą fizyczną, zapobiegającą rozprzestrzenianiu się patogenów i umożliwiającą złapanie, unieszkodliwie­nie i/lub zniszczenie dużej liczby mikroorganizmów jed­nocześnie. Mimo tych danych, nadal trwają badania nad wpływem uwalniania sieci NET na funkcjonowanie obron­ności gospodarza, jak też mechanizmem usuwania przez niego wytworzonych sieci [1]. Obecnie wiadomo, że proces uwalniania zewnątrzkomórkowych sieci (ET – extracellu­lar traps) wykryto nie tylko w przypadku komórek PMN, ale także w komórkach tucznych (mastocytach) [49], pod wpływem takich czynników, jak PMA, LL-37 czy zakażeń bakteryjnych np.: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa i Streptococcus pyogenes. W mastocytach, po­dobnie jak w przypadku neutrofilów, dochodzi do rozpusz­czenia otoczki jądrowej i uwolnienia zdekondensowanej chromatyny wraz z histonami, połączonej z zawartością ziarnistości tych komórek [49,50]. W badaniach przepro­wadzonych z użyciem Streptococcus pyogenes [49], wo­bec których proces fagocytozy jest nieskuteczny, stwier­dzono, że drobnoustroje te nie tylko stymulują powstanie zewnątrzkomórkowej sieci mastocytów (MCET – mast cells extracellular traps), ale także zostają w niej „uwięzione” i zniszczone. Udowodniono, że analogicznie jak w przy­padku neutrofilów, proces uwalniania MCET zależny jest także od obecności reaktywnych form tlenu i po zakończe­niu tego procesu komórka obumiera. Innymi komórkami układu odpornościowego, u których obserwuje się „wy­rzucenie” chromatynowej sieci (EET – eosinophils extra­cellular traps), są granulocyty kwasochłonne (eozynofile). Dowiedziono, że stymulacja tych komórek LPS, składni­kiem dopełniacza 5a (C5a) lub eotaksyną po wcześniej­szym kontakcie z IFN-γ lub interleukiną 5 (IL-5), prowa­dzi do wyrzucenia do przestrzeni pozakomórkowej DNA mitochondrialnego [56], wymieszanego z magazynowany­mi w eozynofilach białkami, takimi jak kationowe białko eozynofilów (ECP – eosinophil cationic protein) oraz głów­ne białko zasadowe (MBP – major basic protein). Trzeba dodać, że EET wytwarzane przez eozynofile różnią się od sieci NET i MCET tym, że uwalniana przez nie chromaty­na pochodzi z mitochondriów, zatem nie zawiera w swo­jej strukturze histonów. Ponadto stwierdzono, że otoczka jądrowa eozynofilów pozostaje nienaruszona, stąd proces tworzenia EET nie wiąże się bezpośrednio z ich śmiercią.

Zjawisko uwalniania przez eozynofile zewnątrzkomór­kowych sieci in vivo, zaobserwowano w przebiegu cho­roby Crohna oraz przy niektórych chorobach skóry [45]. Należy dodać, iż w przypadku neutrofilów stymulacja ich składnikiem C5a, po uprzednim ich kontakcie z IFN-γ, IFN-α lub GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-sti­mulating factor – czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów) również wiąże się z wytwo­rzeniem i bardzo szybkim uwolnieniem sieci zewnątrz­komórkowych, zbudowanych z DNA mitochondrialnego, jednak ich funkcja w zakażeniach nie została do końca poznana [57]. Dowiedziono jedynie [13,56,57], że uwol­nienie chromatyny mitochondrialnej zarówno granulocy­tów obojętnochłonnych, jak i kwasochłonnych, nie prowa­dzi do śmierci tych komórek, a uwalnianie jej następuje znacznie szybciej niż w przypadku uwalniania sieci po­chodzenia jądrowego, jednak podobnie jak przy uwolnie­niu zawartości jądra komórkowego podczas tworzenia sie­ci NET, w obu przypadkach zależne jest od reaktywnych form tlenu. W ostatnim czasie do grupy komórek uwalnia­jących chromatynowe sieci zewnątrzkomórkowe dołączyły makrofagi i monocyty. W 2010 r. Chow i wsp. [9] opisa­li u myszy subpopulację makrofagów – RAW 264.7, które po stymulacji PMA zdolne były do wytworzenia zewnątrz­komórkowych sieci, nazwanych przez autorów MET (ma­crophage extracellular traps), których uwolnienie, podob­nie jak w przypadku neutrofilów i mastocytów, prowadzi do śmierci tych komórek. Kolejne badania [2] potwierdzi­ły te obserwacje, jako że stwierdzono to zjawisko w ma­krofagach pęcherzykowych u bydła w odpowiedzi na za­każenie Mannheimia haemolytica i wytwarzaną przez nie leukotoksynę oraz w makrofagach ludzkich linii THP-1, w odpowiedzi na hemolizynę E. coli. W przypadku mo­nocytów – komórek żyjących krótko i bardzo podatnych na konstytutywną, kaspazozależną apoptozę, stwierdzo­no, że zjawisko uwalniania zewnątrzkomórkowych sie­ci chromatynowych wraz z histonami zachodzi w reakcji na zakażenie bakteriami Escherichia coli oraz Klebsiella pneumoniae w sposób zależny od kaspazy 1 i wiąże się z liczbą komórek bakteryjnych we krwi [53].

Zjawisko NETozy

W pierwszej publikacji [7], dotyczącej uwalniania sieci NET przez neutrofile stwierdzono, że ta bogata w histony struktura uwalniana jest wyłącznie ze zdrowych, nieuszko­dzonych komórek. W kolejnych latach ta sama grupa ba­daczy [14], na podstawie analizy pojedynczych komórek, zaobserwowała uwalnianie NET z neutrofilów wchodzą­cych w nowo odkryty program śmierci komórkowej, na­zwanej później NETozą [46]. NEToza jest procesem pobu­dzanym nie tylko przez patogeny i ich elementy, ale także przez IL-8, TNF-α, PMA, aktywowane trombocyty oraz przeciwciała przeciwneutrofilowe wyizolowane od pacjen­tów z zapaleniem małych naczyń [20,46]. Wykazano, że te ostatnie przeciwciała są także wytwarzane w przebie­gu takich chorób, jak toczeń rumieniowaty układowy czy malaria, co sugeruje, że w czasie przebiegów tych stanów chorobowych, może również dochodzić do stymulacji pro­cesu NETozy [24,42]. Ta postać śmierci różni się od nekro­zy czy apoptozy, ponieważ w chwili rozpoczęcia procesu NETozy zmienia się w neutrofilach struktura cytoplazmy, w której dochodzi do wymieszania się chromatyny jądro­wej i uwolnionych z ziarnistości tych komórek substancji bójczych [14]. Nie obserwuje się w czasie tego zjawiska typowych dla apoptozy zmian morfologicznych, takich jak pofałdowanie błony komórkowej, kondensacja chromaty­ny jądrowej, eksternalizacja fosfatydyloseryny (PS) przed fragmentacją błony plazmatycznej czy internukleosomalne cięcia DNA [14]. Ponadto aktywność kaspaz, charaktery­styczna dla apoptozy, nie jest notowana podczas indukowa­nej PMA NETozy [14]. Co więcej, kinetyka indukowanej PMA NETozy nie zmienia się po potraktowaniu inhibito­rem kaspaz, jakim jest Z-VAD [41]. Także dodanie nekro­statyny 1, hamującej aktywność kinazy treoninowo-se­rynowej RIP1 (receptor-interacting protein-1 – RIPK1), prowadzącej do śmierci komórek w wyniku nekrozy, nie wpływa na NETozę [41]. Natomiast morfologiczne podo­bieństwo NET i fibryny (włókniste białko naturalnie wy­stępujące we krwi i biorące udział w krzepnięciu) bardzo utrudnia rozróżnienie tych struktur in vivo w obrazie uzy­skanym metodą skaningowej mikroskopii elektronowej [22]. Wynika to z tego, że w chwili infekcji, poprzedzo­nej uszkodzeniem śródbłonka, neutrofile wraz z czynnika­mi krzepnięcia krwi kumulują się w miejscu uszkodzenia, a dodatkowo mogą przylegać do fibryny [23]. Wykazano, że obie struktury – tak NET, jak i fibryna – podatne są na niszczenie przez DNAzę 1 [22], dlatego też nawet po pod­daniu ich działaniu tego enzymu, rozróżnienie NET i po­wstałych grudek pociętej fibryny jest niemożliwe. Stąd przyjmuje się, że stosowanie in vivo mikroskopii fluore­scencyjnej oraz analizy immunohistochemicznej z uży­ciem transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest niemal niezbędne do ich rozróżnienia. Trzeba dodać, że mimo iż wiele mechanizmów towarzyszących NETozie pozosta­je niewyjaśnionych, coraz więcej wskazuje na to, że roz­pad otoczki jądrowej oraz dekondensacja chromatyny za­leży od współdziałania trzech procesów, to jest cytrulinacji (deiminacji) histonów, uwolnienia reaktywnych form tle­nu oraz autofagii [7,14,35,36,41,51].

Cytrulinacja (deiminacja) histonówa NEToza

Wykazano, że upakowanie chromatyny jądrowej związa­ne z obecnością histonów oraz jej dekondensacja jest po części zależna od odpowiedniej modyfikacji tych białek. Dowiedziono, że histony podlegają wielu modyfikacjom potranslacyjnym, z których istotną dla NETozy jest de­iminacja (cytrulinacja) reszt guanidynowych arginin w hi­stonach H2A, H3 oraz H4 [36], która prowadzi do prze­kształcenia argininy (Arg) w niestandardowy aminokwas cytrulinę (Cit). Proces ten polega na konwersji dodatnio naładowanych bocznych łańcuchów argininowych w po­larne i pozbawione ładunku reszty cytrulinowe. Znanych jest 5 izoform deiminazy peptydyloargininy (PAD), które zdolne są do przeprowadzenia takiej deiminacji, z których PAD4 jest postacią najczęściej opisywaną [42]. Wszystkie deiminazy peptydyloargininowe są zależne od Ca2+, jed­nak tylko PAD4 zawierają sygnał lokalizacji jądrowej (NLS – nuclear localization signal), który umożliwia transloka­cję tego enzymu do jądra. Modyfikacje histonów podle­gające PAD4 regulują przede wszystkim strukturę chro­matyny i ekspresję genów w wielu komórkach [36], choć enzym ten nie odgrywa roli w reakcji neutrofilów i eozy­nofilów na infekcję. W komórkach tych PAD4 znajduje się w dużych ilościach w ziarnistościach [36], a jego ak­tywacja prowadzi do rozległej deiminacji histonów. Po raz pierwszy zaobserwowano to podczas badań na komórkach HL-60, zdolnych do spontanicznego lub stymulowanego różnicowania się w inne komórki, które pod wpływem di­metylosulfotlenku (DMSO) lub kwasu retinowego (ATRA – all-trans retionic acid) różnicowały się w dojrzałe neu­trofile [36,51]. Przeprowadzone na nich badania wyka­zały, że czynniki prozapalne, takie jak LPS, IL-8, fMLP (N-formylo-metionylo-leucyno-fenyloalanina) czy bak­terie Shigella flexneri, powodują znaczny wzrost cytru­linacji histonu H3 [36, 51]. Neeli i wsp. [36] oraz Wang i wsp.[51], prowadzący badania nad wpływem deiminacji na wytwarzanie NET przez przeróżnicowane w neutro­file komórki HL-60, wysunęli wnioski, iż zahamowanie aktywności PAD4 blokuje uwalnianie NET przez te ko­mórki, indukowane jonoforem wapniowym lub Shigella flexneri. Badania te wykazały również, że ilość NET wy­twarzana in vitro przez neutrofile powstałe z linii komórek HL-60, była niewielka w porównaniu do ilości uwalnia­nej in vivo przez dojrzałe, aktywowane neutrofile, mimo iż w obu przypadkach zaobserwowano cytrulinację histonu H3. Wskazuje to, że cytrulinacja jest ważnym, ale niewy­starczającym elementem regulującym NETozę i koniecz­ne jest uruchomienie dodatkowych mechanizmów, dzięki którym możliwe jest formowanie się sieci NET.

Reaktywne formy tlenu a NEToza

Do niedawna przyjmowano, że do uwolnienia chromaty­ny do przestrzeni komórkowej niezbędne jest wytworzenie reaktywnych form tlenu (ROS) [14]. Obecnie, dzięki lep­szemu poznaniu molekularnych podstaw wytwarzania sie­ci NET zaobserwowano, że możliwe jest wytworzenie NET także bez udziału ROS [20], choć w większości przypad­ków ROS są konieczne do jej powstania, chociażby w in­dukcji tego zjawiska przez PMA [7,14]. Wykazano, że wła­ściwie pobudzone neutrofile aktywują kompleks enzymatyczny – oksydazę NADPH, wskutek czego po­wstają ogromne ilości nadtlenków, zaś zahamowanie oksy­dazy NADPH oraz zakłócenie równowagi procesów utle­niania i redukcji za pomocą środków farmakologicznych, np. jodonianu dwufenylowego (DPI – diphenyleneiodo­nium), blokuje zupełnie uwolnienie sieci NET indukowa­nej PMA [14]. Dowiedziono także, że wytwarzanie NET indukowane PMA jest niemożliwe u osób chorych na prze­wlekłą chorobę ziarniniakową (CGD – chronic granuloma­tous disease), u których mutacja któregokolwiek z czterech genów kodujących podjednostki oksydazy NADPH unie­możliwia zarówno wytwarzanie sieci NET, jak i niszcze­nie bakterii w fagolizosomach podczas procesu fagocyto­zy [42,46]. Neutrofile u tych osób odzyskują jednak możliwość wytwarzania NET po inkubacji z oksydazą glu­kozową, generującą powstawanie nadtlenku wodoru. Trzeba jednak zaznaczyć, że oksydaza glukozowa wykorzystana do indukcji NETozy w opisanym doświadczeniu [14], po­chodziła z grzybów Aspergillus sp., których obecność wy­wołuje NETozę bezpośrednio, stąd nie można wykluczyć, że wzorce molekularne związane z tymi patogenami (PAMP – pathogen associated molecular patterns) – potencjalnie zanieczyszczające enzym, nie wpłynęły stymulująco na ten proces [4,5,14,43]. Uwalnianie zewnątrzkomórkowych sie­ci neutrofilowych w przytoczonych badaniach dotyczących granulocytów obojętnochłonnych odgrywa bardzo ważną rolę, gdyż sam proces fagocytozy tych komórek jest nie­skuteczny w przypadku większych cząsteczek, jakimi są np. grzyby [5,47,48]. Wiadomo, że osoby chore na CGD często cierpią z powodu zakażeń oportunistycznych wy­wołanych właśnie grzybami – o wiele większymi np. od bakterii i mimo to, że proces bójczy jest u nich raczej wzmo­żony niż obniżony, niszczenie większych drobnoustrojów (grzybów) w wyniku fagocytozy jest niemożliwe. Stwierdzono, że skuteczność przeciwgrzybiczna neutrofi­lów oparta jest w tym przypadku na zdolności do wytwa­rzania sieci NET oraz na działaniu kalprotektyny, co pro­wadzi do niszczenia grzybów z rodzaju Aspergillus sp., które u chorych na CGD wywołują zapalenie płuc i są jed­nym z głównych powodów ich śmierci [5]. Analogiczny stan można osiągnąć u ludzi w wyniku terapii genowej, przywracając aktywność oksydazy NADPH w neutrofilach [5]. Podobny mechanizm, jak przy niszczeniu Aspergillus sp., tj. poprzez wytwarzanie sieci NET i działanie kalpro­tektyny, opisano w przypadku zakażenia ludzi Candida albicans [47,48]. NEToza, jak wspomniano wcześniej, wy­daje się śmiercią komórki niezależną od kaspaz, a reak­tywne formy tlenu, wytworzone z udziałem oksydazy NADPH, zdają się hamować ich aktywność [12,54]. W ba­daniach prowadzonych przez Fadeela i wsp. [12], dotyczą­cych wpływu reaktywnych form tlenu na aktywność ka­spaz i konstytutywną apoptozę neutrofilów oraz apoptozę związaną z Fas/APO-1, zastosowanie DPI (nieswoistego inhibitora oksydazy NADPH) spowodowało znaczny wzrost poziomu kaspaz w wyizolowanych z krwi granulocytach obojętnochłonnych, a także zwiększenie ekspresji fosfaty­dyloseryny na powierzchni tych komórek – charaktery­stycznego elementu ich śmierci w procesie apoptozy. Z ko­lei aktywacja neutrofilów poprzez PMA, prowadząca do wybuchu tlenowego i wytworzenia dużej ilości ROS, do­prowadziła do zahamowania aktywności kapsaz w tych ko­mórkach, a dodatkowo odnotowano zmiany morfologicz­ne neutrofilów w postaci zwiększenia ich rozmiarów i silnej wakuolizacji cytoplazmy, a więc zmiany inne niż podczas apoptozy konstytutywnej lub stymulowanej Fas/APO-1 [12]. Zahamowanie kaskady aktywacji kaspaz zaobserwo­wano także wskutek wybuchu tlenowego, wywołanego pro­cesem fagocytozy S. aureus [54]. Można zatem przyjąć, że reaktywne formy tlenu mogą potencjalnie stymulować NETozę przez blokowanie apoptozy zależnej od kaspaz [12,54], choć hamowanie apoptozy może się też odbywać pośrednio poprzez aktywację czynnika transkrypcyjnego NF-κB [33]. Warto dodać, iż stymulatory prozapalne, ta­kie jak LPS czy IL-8, znane z pobudzania NETozy, nie zwiększają aktywność oksydazy NADPH w neutrofilach, a jedynie uwrażliwiają te komórki na wybuch oksydacyj­ny w tzw. primingu, czyli wstępnym pobudzeniu komórki, przygotowującego ją do danej reakcji lub modyfikującego dalszy jej przebieg [6,17,42]. Może to tłumaczyć dlaczego tylko w niektórych przypadkach po stymulacji LPS czy IL-8, zaobserwowano formowanie się NET, a w innych je­dynie spowolnienie apoptozy, bez wytworzenia NET. Aktywność oksydazy NADPH w granulocytach obojętno­chłonnych może być także modyfikowana zjawiskiem pri­mingu wywołanym przez inne, poza LPS i IL-8, czynniki prozapalne, takie jak GM-CSF czy TNF-α, co skutkuje uwrażliwieniem neutrofilów na wtórne czynniki inicjują­ce w tej sytuacji silniejszy wybuch tlenowy, takie jak fMLP czy PMA [17]. Aktywacja oksydazy NADPH przez różne czynniki, w tym PMA czy fMLP, stymuluje fosforylację jej cytoplazmatycznych podjednostek – p47^phox, p67^phox, p40^phox oraz ich translokację do błony plazmatycznej ko­mórki, gdzie oddziałują ze znajdującym się tam flawocytochromem b₅₅₈, składającym się z dwóch podjednostek: gp91^phox – określanej obecnie jako Nox2, oraz p22^phox. Dodatkowo, wchodzące w skład kompleksu oksydazy NADPH białko Rac2, należące do rodziny bia­łek Rho, odłącza się od swojego inhibitora – RhoGDI (RhoGDP dyssociation inhibitor) i oddziałuje z flawocy­tochromem b₅₅₈, tworząc miejsce wiązania dla podjedno­stek cytoplazmatycznych oksydazy NADPH, a której kom­pletne „złożenie”, warunkuje jej prawidłowe funkcjonowanie i wytwarzanie reaktywnych form tlenu i związane z tym uwalnianie sieci NET [17]. Potwierdzają to m.in. badania, przeprowadzone w ostatnim czasie przez Lima i wsp. [25], które wykazały, że zahamowanie białka Rac2, uniemożli­wia wytworzenie sieci zewnątrzkomórkowych, przy czym komórki te odzyskiwały tę zdolność dzięki zewnątrzpo­chodnym źródłom reaktywnych form tlenu. Hamowanie Rac2 spowodowało także obniżenie wytwarzania tlenku azotu (NO – nitric oxide), który również wydaje się ko­nieczny do powstania sieci NET, jako że zastosowanie in­hibitora syntazy tlenku azotu – L-NAME (NG-nitro-L-arginine methyl ester), także wiązało się z zahamowaniem wytwarzania tych sieci [25]. Zarejestrowano, że ROS ak­tywują także proteazy serynowe podczas procesu fagocy­tozy, a te również wchodzą w skład NET, stąd przypusz­czalnie mają działanie przeciwbakteryjne lub modulujące właściwości bójcze innych składników NET [42]. Wykazano również, że uwalniane z ziarnistości azurofilnych komórek PMN elastaza neutrofilowa (NE – neutrophil elastase) oraz mieloperoksydaza (MPO), sprzyjają dekondensacji chro­matyny [31,37]. NE cechuje zdolność do degradacji histo­nów, z czego najskuteczniej niszczona jest struktura histo­nu H4, jednak jej zbyt wysokie stężenie może hamować proces dekondensacji [37]. MPO, która jest niezbędna do wytworzenia sieci NET, do swojej aktywności rozluźnia­jącej chromatynę jądrową wymaga obecności NE, ale nie wpływa na jej zdolność do degradacji histonów [31,37]. Zauważono także, że stopień dekondensacji chromatyny w obecności MPO jest wprost proporcjonalny do jej stęże­nia i zachodzi bez udziału H₂O₂, co sugeruje nieenzyma­tyczny charakter tej reakcji [37]. Według Marcosa i wsp. [29], proces formowania się sieci NET, nie jest uzależnio­ny wyłącznie od ROS. Na podstawie badań przeprowadzo­nych na próbkach z dróg oddechowych ludzi chorych na mukowiscydozę udowodniono udział w procesie formowa­nia się sieci NET sprzężonych z białkiem G receptorów CXCR2 [29]. Nie stwierdzono natomiast udziału w tym procesie ROS [29]. Wydaje się więc, że reaktywne formy tlenu, podobnie jak cytrulinacja histonów, to bardzo waż­ny, ale nie jedyny element NETozy. Hipotezę tę potwier­dzono także w innych badaniach [41], gdzie inkubacja neu­trofilów z niewielkimi, milimolarnymi stężeniami nadtlenku wodoru, prowadziła tylko do indukcji apoptozy, ale nie NETozy. Także stymulacja neutrofilów fMLP – potencjal­nym induktorem aktywności oksydazy NADPH, nie po­budza NETozy [41,47]. Dodatkowo wykazano, że neutro­file izolowane z krwi obwodowej noworodków, w przeciwieństwie do neutrofilów osób dorosłych, nie wy­twarzają NET, mimo iż ROS są wytwarzane w taki sam sposób w obu przypadkach [55]. Warto też dodać, iż we wspomnianych wcześniej, przeróżnicowanych komórkach HL-60, dochodzi zarówno do cytrulinacji histonów, jak i wytwarzania ROS, jednak znikoma ilość wytworzonej przez nie sieci NET sugeruje, że może to mieć związek z zaburzeniem procesu autofagii tych komórek.

Autofagia a NEToza

Od czasu odkrycia i opisania sieci NET, główną dla tego procesu rolę przypisywano deiminacji (cytrulinacji) hi­stonów oraz wytwarzaniu ROS. Tymczasem w 2010 r. Remijsen i wsp. [41], na podstawie badań z użyciem nie­swoistego inhibitora autofagii – wortmaniny (wortmannin) dowiedli, iż zajście NETozy w neutrofilach indukowanych PMA wymaga nie tylko prawidłowego przebiegu aktywa­cji oksydazy NADPH, ale także zdolności neutrofilów do przeprowadzania procesu autofagii. Udział tego ostatnie­go procesu zaobserwowali także Fuchs i wsp. [14], którzy wykazali silną wakuolizację cytoplazmy w początkowych stadiach formowania się sieci NET, wynikającą z powsta­nia w komórkach PMN licznych autofagosomów. Obraz związany z wakuolizacją cytoplazmy zaobserwowano tak­że w neutrofilach stymulowanych PMA u osób chorych na CGD, a które nie były zdolne do wytwarzania ROS [41]. Badania te potwierdziły, że farmakologiczne zahamowa­nie procesu autofagii nie koliduje z zajściem wybuchu tlenowego zależnego od oksydazy NADPH, chociaż stan ten zaburza proces wewnątrzkomórkowej dekondensacji chromatyny, co prowadzi do śmierci komórki z objawami apoptozy. Wykazano także [41], że zahamowanie oksy­dazy NADPH nie wpływa na proces autofagii, jednak za­burzenia w przebiegu któregokolwiek z tych dwóch me­chanizmów blokują dekondensację chromatyny jądrowej, a tym samym NETozę. [41]. Badając wpływ interleukiny 1β (IL-1β) oraz procesu autofagii na wytwarzanie sieci NET u osób chorych na dnę moczanową, wykazano silną zależność między hamowaniem 3-kinazy fosfatydyloino­zytolu (PI3K – phosphatidylinositol 3-kinase) i zakwasze­niem środowiska pęcherzyków endosomalnych a zahamowa­niem tworzenia i uwalniania sieci NET [32]. W badaniach tych zastosowanie 3-metyloadeniny (3-MA – 3-methylade­nine) i LY 294002 (swoistych inhibitorów PI3K – kinazy kluczowej dla rozpoczęcia procesu autofagii) oraz bafilo­mycyny A (blokującej zakwaszenie pęcherzyków endoso­malnych w jej końcowym etapie), skutkowało brakiem wy­twarzania NET, które wydaje się stymulowane obecnością kryształów moczanu jednosodowego (MSU – monosodium urate), dodatkowo regulujących przekształcenie prointer­leukiny 1β (pro-IL1β) w postać dojrzałą – IL-1β, na dro­dze niezależnej od kaspazy 1 [58].

Mechanizmy obrony patogenów wobec sieci NET

Skuteczność sieci NET potwierdzono wobec wielu mi­kroorganizmów i pasożytów, jednak wykazano, że niektó­re z nich potrafią skutecznie bronić się przed złapaniem i/lub, jak już wspomniano, zniszczeniem ich przez tę sieć. Jednym z takich mechanizmów jest modyfikacja budowy ściany komórkowej, wskutek czego zmniejsza się jej po­winowactwo do NET, innym zaś zmiana ładunku ich po­wierzchni [3,8,52]. Dotychczas nie badano determinantów warunkujących wiązanie drobnoustrojów przez NET, jed­nak dowiedziono, że jest to zależne od składników znajdu­jących się na powierzchni komórek bakteryjnych [30,52]. Na przykład paciorkowce mają przynajmniej dwie stra­tegie, dzięki którym unikają związania przez sieć NET i obie oparte są na modyfikacji powierzchni komórki bak­teryjnej. Jedna z nich bazuje na zmniejszeniu powinowac­twa NET do powierzchni komórki, co związane jest z po­lisacharydową otoczką tych bakterii, gdyż wykazano, że w przypadku S. pneumoniae, jakakolwiek zmiana w eks­presji genów warunkujących określoną strukturę otocz­ki znacząco zmniejsza wiązanie tych bakterii przez sieć NET [3]. Dodatkowo, aktywacja operonu dlt (d-alanyl-li­poteichoic acid) występującego w genomie tych bakterii, powoduje włączenie reszt D-alaniny do kwasów lipotej­chojowych, zmieniając w ten sposób ładunek ich ściany komórkowej z ujemnego na dodatni, co zmniejsza powi­nowactwo kationowych, bakteriobójczych białek, wcho­dzących w skład NET, do tych komórek [52]. Trzeba do­dać, że inaktywacja dltA (jeden z genów, obok dltB, dltC i dltD, wchodzących w skład operonu dlt) nie ma znaczą­cego wpływu na wiązanie bakterii przez sieć NET do cza­su, gdy mikroorganizmy chroni polisacharydowa otoczka, jednakże jej brak powoduje znaczący wzrost podatności drobnoustrojów na działanie tych sieci [52]. Innym, bar­dzo powszechnym i lepiej poznanym mechanizmem obron­nym mikroorganizmów przed siecią NET, jest wytwarza­nie DNaz – enzymów niszczących DNA, to jest głównego elementu strukturalnego sieci NET. Zjawisko to obserwuje się u bakterii Streptococcus grupy A (GAS) oraz u wspo­mnianego wcześniej S. pneumoniae [3,8]. W przypadku tych ostatnich bakterii, po związaniu ich przez sieć NET następuje ekspresja genu endA – kodującego endonukleazę A (EndA), która wywołuje degradację uwolnionego z ko­mórki DNA. Dodatkowo, obecność EndA stymuluje uwal­nianie przez granulocyty obojętnochłonne elastazy, co do­wodzi, że endonukleaza nie tylko niszczy strukturę NET, ale także zaburza integralność całej komórki granulocytu [3]. Prowadzone przez Beitera i wsp. [3] badania wykaza­ły, że uwolnienie endonukleazy A w odpowiedzi na NET jest także pewnego rodzaju czynnikiem wirulencji, prze­ciwdziałającym uwięzieniu przez sieć NET i wzmacniają­cym dodatkowo rozprzestrzenianie się S. pneumoniae do płuc i dalej do układu krążenia. W przypadku GAS, NET niszczona jest przez DNazę Sda1 (DNaza wytwarzana przez patogeny GAS), kodowaną przez gen sda1, co zwięk­sza przeżywalność i „zjadliwość” patogenów, zarówno in vitro, jak i in vivo [8]. Przeprowadzone przez Buchanana i wsp. [8] badania sugerują, że zastosowanie inhibitorów DNaz, takich jak aktyna G, przywraca granulocytom obo­jętnochłonnym zdolność do skutecznego „wyłapywania” i unieszkodliwienia niektórych patogenów, w tym także GAS, za pomocą NET. Przyjmuje się, że w przyszłości stosowanie takich inhibitorów może, w przypadku niektó­rych chorób, stanowić alternatywę dla kuracji antybioty­kami czy nawet zabiegów chirurgicznych [8].

Negatywne skutki działania NET

Rola zjawiska uwalniania NET przez komórki PMN oraz sieci zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez inne ko­mórki jest bardzo ważna np. w reakcjach odporności wro­dzonej, gdyż wiadomo, że zaburzenie zdolności ich wytwa­rzania przyczynia się do wzrostu podatności gospodarza na infekcje oraz rozwoju wielu chorób. Trzeba jednak zazna­czyć, że duże ilości NET uwalniane w stanach patologicz­nych, które nie mogą być efektywnie usuwane przez DNazy, a także ich akumulacja w narządach i naczyniach, których degradacja z udziałem DNaz prowadzi do uwolnienia zwią­zanych z nią białek, mogą doprowadzić do stanu zapalne­go lub go nasilić, zaburzyć mikrokrążenie i powodować uszkodzenie tkanek. Uwolnienie dużych ilości DNA, hi­stonów oraz białek magazynowanych w komórkach może się także przyczynić do rozwoju chorób autoimmunizacyj­nych. Przykładem takiego schorzenia jest toczeń rumie­niowaty układowy (SLE – systemic lupus erythematosus), podczas którego gospodarz wytwarza przeciwciała przeciw własnemu DNA oraz jego kompleksom z bakteriobójczymi peptydami [24]. Obecność tych przeciwciał, wraz z charak­terystyczną dla tej choroby nadekspresją katelicydyny, sty­muluje neutrofile do uwalniania NET, zawierającego DNA, co dodatkowo nasila stan zapalny [24,26]. Udział zewnątrz­komórkowych sieci neutrofilowych zaobserwowano także w przebiegu zapalenia małych naczyń (SVV – small vessels vasculitis), podczas którego pobudzenie wytwarzania NET związane jest z obecnością we krwi przeciwciał przeciw­neutrofilowych (ANCA – antineutrophil cytoplasm autoanti­bodies) [21], a powstające sieci, odkładające się w nerkach, oraz krążące we krwi kompleksy DNA-MPO, sprzyjają nasilaniu się stanu zapalnego naczyń oraz reakcji autoim­munologicznej wobec elementów neutrofilów. Wykazano także [20], że aktywowane podczas stanów zapalnych ko­mórki śródbłonka (EC – endothelial cells), uczestniczące w transmigracji komórek PMN, mogą w pewnym stopniu stymulować tworzenie zewnątrzkomórkowych sieci neutro­filowych poprzez wydzielanie IL-8, które z kolei powodują uszkodzenie śródbłonka prawdopodobnie zależnie od cy­totoksycznych właściwości histonów i innych białek wcho­dzących w ich skład, zwrotnie nasilając stan zapalny [44]. Zaobserwowano także, że przypadku osób chorych na raka, cukrzycę, po przeszczepach, a także w stanie przedrzucaw­kowym czy po przebytym udarze, zaobserwowano we krwi tych chorych krążenie wolnego DNA (cf-DNA – circula­ting-free DNA) [26]. Do niedawna uważano, że pochodzi ono głównie z obumarłych, nekrotycznych tkanek, jednak odkrycie sieci NET, których podstawowym elementem strukturalnym jest właśnie DNA, przyczyniło się do pod­jęcia dodatkowych badań. Obserwacje z tego zakresu m.in. u ciężarnych kobiet w stanie przedrzucawkowym wykaza­ły nie tylko wysokie ciśnienie tętnicze oraz obecność biał­ka w moczu, ale także wzmożoną aktywację neutrofilów krwi obwodowej oraz wzrost stężenia wolnego, matczyne­go DNA we krwi [19]. U kobiet dotkniętych tym schorze­niem wykazano także obecność sieci NET w przestrzeniach międzykosmkowych [19], co sugeruje, że zjawisko uwal­niania NET przez neutrofile może leżeć u podstaw etiolo­gii tego schorzenia. Szkodliwe działanie związane z wy­tworzonymi NET obserwuje się także w przypadku chorób infekcyjnych oraz genetycznych, m.in. wielu chorób ukła­du oddechowego. Zauważono, że u chorych na ostre uszko­dzenie płuc, będące powikłaniem wirusowego zapalenia płuc, zewnątrzkomórkowe sieci neutrofilowe gromadzą się w okolicach pęcherzyków płucnych i prawdopodobnie są jednym z powodów uszkodzeń pęcherzykowo-naczynio­wych, wynikających m.in. ze wspomnianych właściwości cytotoksycznych niektórych z białkowych składników tych sieci [34,44]. W przypadku pacjentów cierpiących na mu­kowiscydozę wykazano, że zawarta w ich plwocinie elasta­za oraz DNA zdają się również pochodzić z NET, co suge­ruje, że w tym przypadku odkładanie się sieci NET może nasilać objawy choroby zarówno przez zahamowanie ru­chów rzęskowych i tym samym mechanicznego oczysz­czania dróg oddechowych, ale także przez okluzję naczyń włosowatych płuc [26,52].

Podsumowanie

Powszechnie występujące we krwi neutrofile pełnią bardzo ważną rolę w mechanizmach wrodzonej odporności u krę­gowców, będąc w chwili infekcji pierwszą linią obrony orga­nizmu, opartą na procesie fagocytozy, ale i/lub cytotoksycz­ności, cytolizy i pinocytozy. Obecnie odkryto inną, bardzo ważną cechę tych komórek, to jest zdolność do uwalniania chromatynowej sieci NET, utworzonej m.in. z DNA jądro­wego, która pozwala „schwytać” i „uwięzić” patogeny, wy­stawiając je na działanie stężonych i silnie bójczych białek pochodzących z ziarnistości neutrofilów. Ponadto przerwanie ciągłości otoczki jądrowej, a następnie błon ziarnistości i bło­ny cytoplazmatycznej, wiąże się z wejściem tych komórek w program śmierci nazwanej NETozą. Dodatkowo zdolność innych komórek układu odpornościowego, w tym mastocy­tów i makrofagów/monocytów, do uwalniania zewnątrzko­mórkowych sieci chromatynowych pochodzenia jądrowego, a także neutrofilów i eozynofilów do wyrzucania sieci po­wstałych z chromatyny mitochondrialnej, wydaje się prze­łomem w badaniach nad mechanizmami odporności wro­dzonej. Mimo iż skład sieci NET, a także ET uwalnianych przez inne komórki oraz sposób ich uwalniania zostały opi­sane, molekularne mechanizmy towarzyszące ich wyrzuce­niu nadal nie są do końca poznane i wciąż są przedmiotem badań, co być może w przyszłości przyczyni się do bliższe­go poznania dalszych, swoistych dla tych procesów faktów, stanowiących ważne elementy odporności u kręgowców.

PIŚMIENNICTWO

[1] Amulic B., Hayes G.: Neutrophil extracellular traps. Curr. Biol., 2011; 21: R297-R298
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[2] Aulik N.A., Hellenbrand K.M., Czuprynski C.J.: Mannheimia haemolytica and its leukotoxin causes macrophage extracellular trap formation by bovine macrophages. Infect. Immun., 2012; 80: 1923-1933
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Beiter K., Wartha F., Albiger B., Normark S., Zychlinsky A., Henriques-Normark B.: An endonuclease allows Streptococcus pneumoniae to escape from neutrophil extracellular traps. Curr. Biol., 2006; 16: 401-407
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[4] Bianchi M., Hakkim A., Brinkmann V., Siler U., Seger R.A., Zychlinsky A., Reichenbach J.: Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood, 2009; 114: 2619-2622
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[5] Bianchi M., Niemiec M.J., Siler U., Urban C.F., Reichenbach J.: Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. J. Allergy Clin. Immunol., 2011; 127: 1243-1252.e7
[PubMed]  

[6] Bréchard S., Bueb J.L., Tschirhart E.J.: Interleukin-8 primes oxidative burst in neutrophil-like HL-60 through changes in cytosolic calcium. Cell Calcium, 2005; 37: 531-540
[PubMed]  

[7] Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C., Fauler B., Uhlemann Y., Weiss D.S., Weinrauch Y., Zychlinsky A.: Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science, 2004; 303: 1532-1535
[PubMed]  

[8] Buchanan J.T., Simpson A.J., Aziz R.K., Liu G.Y., Kristian S.A., Kotb M., Feramisco J., Nizet V.: DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps. Curr. Biol., 2006; 16: 396-340
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[9] Chow O.A., von Köckritz-Blickwede M., Bright A.T., Hensler M.E., Zinkernagel A.S., Cogen A.L., Gallo R.L., Monestier M., Wang Y., Glass C.K., Nizet V.: Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe, 2010; 8: 445-454
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[10] Clark S.R., Ma A.C., Tavener S.A., McDonald B., Goodarzi Z., Kelly M.M., Patel K.D., Chakrabarti S., McAvoy E., Sinclair G.D., Keys E.M., Allen-Vercoe E., Devinney R., Doig C.J., Green F.H., Kubes P.: Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nat. Med., 2007; 13: 463-469
[PubMed]  

[11] Deptuła W., Tokarz-Deptuła B., Stosik M.: Immunologia dla biologów. Wyd. US, Szczecin 2008

[12] Fadeel B., Ahlin A., Henter J.I., Orrenius S., Hampton M.B.: Involvement of caspases in neutrophil apoptosis: regulation by reactive oxygen species. Blood, 1998; 92: 4808-4818
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[13] Fossati G., Moulding D.A., Spiller D.G., Moots R.J., White M.R., Edwards S.W.: The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. J. Immunol., 2003; 170: 1964-1972
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[14] Fuchs T.A., Abed U., Goosmann C., Hurwitz R., Schulze I., Wahn V., Weinrauch Y., Brinkmann V., Zychlinsky A.: Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol., 2007; 176: 231-241
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[15] Gabriel C., McMaster W.R., Girard D., Descoteaux A.: Leishmania donovani promastigotes evade the antimicrobial activity of neutrophil extracellular traps. J. Immunol., 2010; 185: 4319-4327
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[16] Galluzzi L., Vitale I., Abrams J.M., Alnemri E.S., Baehrecke E.H., Blagosklonny M.V., Dawson T.M., Dawson V.L., El-Deiry W.S., Fulda S., Gottlieb E., Green D.R., Hengartner M.O., Kepp O., Knight R.A., Kumar S., Lipton S.A., Lu X., Madeo F., Malorni W., Mehlen P., Nunez G., Peter M.E., Piacentini M., Rubinsztein D.C., Shi Y., Simon H.U., Vandenabeele P., White E., Yuan J., Zhivotovsky B., Melino G., Kroemer G.: Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ., 2012; 19: 107-120
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[17] Guichard C., Pedruzzi E., Dewas C., Fay M., Pouzet C., Bens M., Vandewalle A., Ogier-Denis E., Gougerot-Pocidalo M.A., Elbim C.: Interleukin-8-induced priming of neutrophil oxidative burst requires sequential recruitment of NADPH oxidase components into lipid rafts. J. Biol. Chem., 2005; 280: 37021-37032
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[18] Guimaraes-Costa A.B., Nascimento M.T., Froment G.S., Soares R.P., Morgado F.N., Conceiçao-Silva F., Saraiva E.M.: Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009; 106: 6748-6753
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[19] Gupta A., Hasler P., Gebhardt S., Holzgreve W., Hahn S: Occurrence of neutrophil extracellular DNA traps (NETs) in pre-eclampsia: a link with elevated levels of cell-free DNA? Ann. N.Y. Acad. Sci., 2006; 1075: 118-122
[PubMed]  

[20] Gupta A.K., Joshi M.B., Philippova M., Erne P., Hasler P., Hahn S., Resink T.J.: Activated endothelial cells induce neutrophil extracellular traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death. FEBS Lett., 2010; 584: 3193-3197
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[21] Kessenbrock K., Krumbholz M., Schönermarck U., Back W., Gross W.L., Werb Z., Gröne H.J., Brinkmann V., Jenne D.E.: Netting neutrophils in autoimmune small-vessels vasculitis. Nat. Med., 2009; 15: 623-625
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[22] Krautgartner W.D., Klappacher M., Hannig M., Obermayer A., Hartl D., Marcos V., Vitkov L.: Fibrin mimics neutrophil extracellular traps in SEM. Ultrastruct. Pathol., 2010; 34: 226-231
[PubMed]  

[23] Kuijper P.H., Gallardo Torres H.I., van der Linden J.A., Lammers J.W., Sixma J.J., Zwaginga J.J., Koenderman L.: Neutrophil adhesion to fibrinogen and fibrin under flow conditions is diminished by activation and L-selectin shedding. Blood, 1997; 89: 2131-2138
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[24] Lande R., Ganguly D., Facchinetti V., Frasca L., Conrad C., Gregorio J., Meller S., Chamilos G., Sebasigari R., Riccieri V., Bassett R., Amuro H., Fukuhara S., Ito T., Liu Y.J., Gilliet M.: Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med., 2011; 3: 73ra19
[PubMed]  

[25] Lim M.B., Kuiper J.W., Katchky A., Goldberg H., Glogauer M.: Rac2 is required for the formation of neutrophil extracellular traps. J. Leukoc. Biol., 2011; 90: 771-776
[PubMed]  

[26] Lögters T., Margraf S., Altrichter J., Cinatl J., Mitzner S., Windolf J., Scholz M.: The clinical value of neutrophil extracellular traps. Med. Microbiol. Immunol., 2009; 198: 211-219
[PubMed]  

[27] Ma A.C., Kubes P.: Platelets, neutrophils, and neutrophil extracellular traps (NETs) in sepsis. J. Thromb. Haemost., 2008; 6: 415-420
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[28] Mantovani A., Cassatella M.A., Costantini C., Jaillon S.: Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol., 2011; 11: 519-531
[PubMed]  

[29] Marcos V., Zhou Z., Yildirim A.O., Bohla A., Hector A., Vitkov L., Wiedenbauer E.M., Krautgartner W.D., Stoiber W., Belohradsky B.H., Rieber N., Kormann M., Koller B., Roscher A., Roos D., Griese M., Eickelberg O., Döring G., Mall M.A., Hartl D.: CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation. Nat. Med., 2010; 16: 1018-1023
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[30] Medina E.: Neutrophil extracellular traps: a strategic tactic to defeat pathogens with potential consequences for the host. J. Innate Immun., 2009; 1: 176-180
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[31] Metzler K.D., Fuchs T.A., Nauseef W.M., Reumaux D., Roesler J., Schulze I., Wahn V., Papayannopoulos V., Zychlinsky A.: Myeloperoxidase is required for neutrophil extracellular trap formation: implications for innate immunity. Blood, 2011; 117: 953-959
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[32] Mitroulis I., Kambas K., Chrysanthopoulou A., Skendros P., Apostolidou E., Kourtzelis I., Drosos G.I., Boumpas D.T., Ritis K.: Neutrophil extracellular trap formation is associated with IL-1β and autophagy-related signaling in gout. PLoS One, 2011; 6: e29318
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[33] Morgan M.J., Liu Z.G.: Crosstalk of reactive oxygen species and NF-κB signaling. Cell Res., 2011; 21: 103-115
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[34] Narasaraju T., Yang E., Samy R.P., Ng H.H., Poh W.P., Liew A.A., Phoon M.C., van Rooijen N., Chow V.T.: Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol., 2011; 179: 199-210
[PubMed]  

[35] Neeli I., Dwivedi N., Khan S., Radic M.: Regulation of extracellular chromatin release from neutrophils. J. Innate Immun., 2009; 1: 194-201
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[36] Neeli I., Khan S.N., Radic M.: Histone deimination as a response to inflammatory stimuli in neutrophils. J. Immunol., 2008; 180: 1895-1902
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[37] Papayannopoulos V., Metzler K.D., Hakkim A., Zychlinsky A.: Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol., 2010; 191: 677-691
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[38] Papayannopoulos V., Zychlinsky A.: NETs: a new strategy for using old weapons. Trends Immunol., 2009; 30: 513-521
[PubMed]  

[39] Parseghian M.H., Luhrs K.A.: Beyond the walls of the nucleus: the role of histones in cellular signaling and innate immunity. Biochem. Cell Biol., 2006; 84: 589-604
[PubMed]  

[40] Ramos-Kichik V., Mondragón-Flores R., Mondragón-Castelán M., Gonzales-Pozos S., Muniz-Hernandez S., Rojas-Espinosa O., Chacón-Salinas R., Estrada-Parra S., Estrada-Garcia I.: Neutrophil extracellular traps are induced by Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis, 2009; 89: 29-37
[PubMed]  

[41] Remijsen Q., Berghe T.W., Wirawan E., Asselbergh B., Parthoens E., de Rycke R., Noppen S., Delforge M., Willems J., Vandenabeele P.: Neutrophil extracellular trap cell death requires both autophagy and superoxide generation. Cell Research, 2011; 21: 290-304
[Abstract]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[42] Remijsen Q., Kuijpers T.W., Wirawan E., Lippens S., Vandenabeele P., Vanden Berghe T.: Dying for a cause: NETosis, mechanisms behind an antimicrobial cell death modality. Cell Death Differ., 2011; 18: 581-588
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[43] Remijsen Q., Vandenabeele P., Willems J., Kuijpers T.W.: Reconstitution of protection against Aspergillus infection in chronic granulomatous disease (CGD). Blood, 2009; 114: 3497
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[44] Saffarzadeh M., Juenemann C., Queisser M.A., Lochnit G., Barreto G., Galuska S.P., Lohmeyer J., Preissner K.T.: Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones. PLoS One, 2012; 7: e32366
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[45] Simon D., Hoesli S., Roth N., Staedler S., Yousefi S., Simon H.U.: Eosinophil extracellular traps in skin diseases. J. Allergy Clin. Immunol., 2011; 127: 194-199
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[46] Steinberg B.E., Grinstein S.: Unconventional roles of the NADPH oxidase: signaling, ion homeostasis, and cell death. Sci. STKE, 2007; 2007: pe11
[PubMed]  

[47] Urban C.F., Ermert D., Schmid M., Abu-Abed U., Goosmann C., Nacken W., Brinkmann V., Jungblut P.R., Zychlinsky A.: Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathog., 2009; 5: e1000639
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[48] Urban C.F., Reichard U., Brinkmann V., Zychlinsky A.: Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms. Cell. Microbiol., 2006; 8: 668-676
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[49] von Köckritz-Blickwede M., Goldmann O., Thulin P., Heinemann K., Norrby-Teglund A., Rohde M., Medina E.: Phagocytosis-independent antimicrobial activity of mast cells by means of extracellular trap formation. Blood, 2008; 111: 3070-3080
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[50] von Köckritz-Blickwede M., Nizet V.: Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J. Mol. Med., 2009; 87: 775-783
[PubMed]  

[51] Wang Y., Li M., Stadler S., Correl S., Li P., Wang D., Hayama R., Leonelli L., Han H., Grigoryev S.A., Allis C.D., Coonrod S.A.: Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell Biol., 2009; 184: 205-213
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[52] Wartha F., Beiter K., Albiger B., Fernebro J., Zychlinsky A., Normark S., Henriques-Normark B.: Capsule and D-alanylated lipoteichoic acids protect Streptococcus pneumoniae against neutrophil extracellular traps. Cell. Microbiol., 2007; 9: 1162-1171
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[53] Webster S.J., Daigneault M., Bewley M.A., Preston J.A., Marriott H.M., Walmsley S.R., Read R.C., Whyte M.K., Dockrell D.H.: Distinct cell death programs in monocytes regulate innate responses following challenge with common causes of invasive bacterial disease. J. Immunol., 2010; 185: 2968-2979
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[54] Wilkie R.P., Vissers M.C., Dragunow M., Hampton M.B.: A functional NADPH oxidase prevents caspase involvement in the clearance of phagocytic neutrophils. Infect. Immun., 2007; 75: 3256-3263
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[55] Yost C.C., Cody M.J., Harris E.S., Thornton N.L., McInturff A.M., Martinez M.L., Chandler N.B., Rodesch C.K., Albertine K.H., Petti C.A., Weyrich A.S., Zimmerman G.A.: Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates. Blood, 2009; 113: 6419-6427
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[56] Yousefi S., Gold J.A., Andina N., Lee J.J., Kelly A.M., Kozlowski E., Schmid I., Straumann A., Reichenbach J., Gleich G.J., Simon H.U.: Catapult-like release of mitochondrial DNA by eosinophils contributes to antibacterial defense. Nat. Med., 2008; 14: 949-953
[PubMed]  

[57] Yousefi S., Mihalache C., Kozlowski E., Schmid I., Simon H.U.: Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps. Cell Death Differ., 2009; 16: 1438-1444
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[58] Zhang H., Sun C., Glogauer M., Bokoch G.M.: Human neutrophils coordinate chemotaxis by differential activation of Rac1 and Rac2. J. Immunol., 2009; 183: 2718-2728
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu