Streszczenie

W pracy opisano badania skoncentrowane wokół aspektów fizjologicznych i strukturalnych kompleksów metali z GnRH, które otrzymał prof. Henryk Kozłowski z Uniwersytetu Wrocław­skiego. Stwierdzono, że kompleksy miedzi, niklu, cynku i kobaltu stymulowały uwalnianie LH i FSH w warunkach in vivo i in vitro. Najbardziej trwały i obiecujący okazał się kompleks miedzi z GnRH (Cu-GnRH), miał większe powinowactwo do swoistego receptora niż natywny GnRH, większą siłę uwalniającą oraz stymulował odmienną ścieżkę sygnalizacji wewnątrzkomórko­wej. Ocenia się, że jest on bardzo obiecującym analogonem GnRH i powinien być wykorzysty­wanym w dalszych badaniach.

Słowa kluczowe:GnRH · receptor GnRH · analogon GnRH · Cu-GnRH · Ni-GnRH · Co-GnRH · sygnalizacja wewnątrzkomórkowa

Summary

Our research was concentrated about physiological and structural aspects of metal comple­xes with GnRH, which were synthetized by Professor Henryk Kozłowski from the Uniwersity of Wrocław. We found that copper, nickel, zinc and cobalt complexes with GnRH stimulated the release of LH and FSH both in vivo and in vitro. The most stable and active was Cu-GnRH. It also exhibited the higher affinity to specific receptor than GnRH, had higher releasing power for LH and FSH and stimulated differently the intracellular signaling. We suggest, that this complex in highly promissive as a new analog of GnRH with possible application to further research.

Key words:GnRH · receptor GnRH · GnRH analogs · Cu-GnRH · Ni-GnRH · Co-GnRH · intracellular signaling

Wykaz skrótów:

cAMP – cykliczny adenozynomonofosforan; DSMO – nazwa roztworu używanego do badań; GnRH – gonadoliberyna; ¹HNMR – odmiana NMR; MR – jądrowy rezonans magnetyczny; mRNA – infor­macyjny mRNA; TOCS4, ROES4, DYANA, MALDI-TOFMAS – metody badań struktury peptydów.

Wprowadzenie

GnRH (gonadoliberina; hormon uwalniający gonadotropi­ny; mGnRH; GnRH I; pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg­-Pro-Gly-NH₂) został wyizolowany najpierw z podwzgórz owczych, bydlęcych i świńskich jest w wielu laboratoriach, wśród nich i w naszym [25,26,28], lecz w połowie lat 60 ubie­głego wieku tylko dwa laboratoria mogły skutecznie praco­wać nad strukturą GnRH. Jego struktura pierwszorzędowa została ustalona przez te dwie niezależne grupy badawcze kierowane przez profesorów Andrew V. Schally’ego i Rogera Guillemina [6,36], którzy zostali uhonorowani za te badania Nagrodą Nobla w roku 1977. Uważano wtedy, że istnieje tylko jedna struktura GnRH u wszystkich zwierząt i u ludzi speł­niając jedną rolę fizjologiczną w regulacji uwalniania i bio­syntezy LH i FSH z przedniego płata przysadki mózgowej.

Podstawowe wiadomości o GnRH i jego receptorze

GnRH jest głównym peptydem podwzgórzowym przekazu­jącym dyspozycję nerwową do zapoczątkowania całej skom­plikowanej kaskady reakcji wewnątrzkomórkowych po jego związaniu się ze swoistym receptorem na powierzchni ko­mórki przedniej części przysadki. Jest on syntetyzowany jako duża cząsteczka prohormonu w neuronach okolicy przedwzrokowej podwzgórza, a następnie poddany prze­kształceniom w neuronach z tego dużego prohormonu do aktywnego dekapeptydu przez odpowiednie enzymy do po­staci aktywnej, a następnie przechowywany w granulach sekrecyjnych, skąd jest transportowany do zewnętrznej wyniosłości pośrodkowej [34,40]. Peptyd ten jest uwalnia­ny w sposób pulsacyjny, w pulsach zsynchronizowanych, z zakończeń nerwowych, z których przez krążenie wrotne co 30-120 min dostaje się do przedniej części przysadki. Tam stymuluje uwalniane i biosyntezę hormonu luteinizującego (LH) i hormonu dopechęrzykowego (FSH) z gonadotropów po uprzednim związaniu się z receptorem GnRH typu I na błonie komórkowej. Każdy puls GnRH stymuluje sekrecję i biosyntezę LH i FSH [8,40], lecz pulsy FSH są mniej wy­raźne. LH jest zgromadzony w przedniej przysadce i zależ­ny od związania się GnRH z receptorem na błonie komórki przysadkowej, z której jest uwalniany. Częstotliwość pulsów jest największa podczas wyrzutu owulacyjnego, a najniższa w czasie fazy lutealnej cyklu płciowego. Zsynchronizowa­ny układ wyrzutu LH i FSH wynika ze zmian pulsów GnRH, modulującego wpływu steroidów gonadowych i hormonów peptydowych na działanie stymulacyjne GnRH oraz różnice w okresie półtrwania tych hormonów [34,40].

W czasie intensywnych badań w latach następnych upewnio­no się, że istnieje wiele odmian tego peptydu u kręgowców; obecnie zidentyfikowano i określono strukturę 30 różnych struktur GnRH. Spośród nich 15 zostało zidentyfikowanych u kręgowców [40,48], 9 form GnRH zidentyfikowano u przed­strunowców, które są przodkami kręgowców [1,18], a także zidentyfikowano ciekawy homolog GnRH mający 12 reszt aminokwasowych u ośmiornicy oraz 5 GnRH u innych bez­kręgowców (ryc. 1) [1,22,48]. Cząsteczki GnRH są obecne w wielu różnych tkankach u kręgowców, pełniąc w nich różne funkcje, łącznie z funkcją neuroendokrynną. Działają w spo­sób parakrynny w łożysku i gonadach, w sposób autokrynny w neuronach GnRH, komórkach immunogennych oraz peł­nią rolę neuroprzekaźników i neuromodulatorów w ośrod­kowym i obwodowym układzie nerwowym, np. w zwojach sympatycznych i w śródmózgowiu [40]. Żadna z tych funkcji jednak nie zachodzi przez dostarczenie GnRH do komórki docelowej przez krążenie ogólne. Jedyna postać GnRH była­by w stanie spełniać wszystkie te funkcje, ale przynajmniej dwie, a nawet trzy różne formy GnRH są obecne u większo­ści kręgowców. GnRH II, wyizolowany początkowo z mózgu kurcząt, jest obecny u zdecydowanej większości gatunków zwierząt. Struktura GnRH II jest zachowana w sposób dosko­nały w czasie ewolucji i jest obecna u wszystkich gatunków, od ryb kostnoszkieletowych do człowieka. Jest najwcześniej wyewoluowaną postacią, nazwana później GnRH II, podczas gdy GnRH podwzgórzowy został nazwany GnRH I [40].

Ryc. 1. Sekwencja reszt aminokwasowych (w kodzie trzyliterowym) naturalnie występujących GnRH, które pojawiły się w ciągu 600 mln lat ewolucji zwierząt. Pogrubione litery skrótów aminokwasów (lewa i prawa strona) pokazują zachowawcze końcowe reszty NH2- i COOH, które pełnią istotną rolę funkcyjną. Pozostałe reszty są albo niezbyt istotne, albo są ważne tylko dla poszczególnego receptora GnRH. GnRH są nazwane tak jak nazwy gatunkowe zwierząt, u których były odkryte po raz pierwszy, chociaż występują nie tylko u jednego gatunku, np. ssaczy GnRH I jest powszechnie obecny u płazów i prymitywnych ryb ościstych; kurczęcy GnRH II (chicken II) jest obecny u większości kręgowców, łącznie z człowiekiem; łososiowy GnRH (GnRH III) jest prawdopodobnie obecny u wszystkich ryb kostnoszkieletowych (wg [40,48] – zmodyfikowano). 1) Ryżanka japońska – ryba, której długość nie przekracza 4 cm, charakteryzuje się krótkim okresem rozrodu; w 1994 roku 2 samice i 2 samce tej ryby odbyły 15-dniową podróż w kosmosie, przystąpiły do tarła; złożyły i zapłodniły ikrę. Wszystkie osobniki i narybek wróciły żywe na ziemię. 2) Ryba z rodziny Sparidae (Ameryka Płn.). Whitefish: angielska nazwa ryby z rodziny Coregonidae. Numery GnRH: 1-15: kręgowce; 16-24: bezkręgowce, przedstrunowce (Chelyosoma i Ciona); 25-30: bezkręgowce: ośmiornica – głowonóg (Octopus vulgaris); jeż morski-szkarłupień (Strongylocentrotus purpuratus); zając morski – mięczak (Aplysia californica); skałoczep – mięczak (Lottia gigantea); robak morski – pierścienica (Capitella teleta), pijawka – pierścienica (Helobdella robusta)

U większości kręgowców zidentyfikowano również trzecią postać GnRH, bardzo zachowawczą (łososiowy GnRH), a zlo­kalizowano ją w zakończeniach nerwowych w przednim mó­zgowiu u ryb kostnoszkieletowych; nazwano ją GnRH III. GnRH III zachował pełną konserwację sekwencji, lecz jest obecny tylko u ryb kostnoszkieletowych, co oznacza, że jego gen został utworzony po ewolucyjnym zróżnicowaniu ryb kostnoszkieletowych i odłączeniu ich od ścieżki ewolucyjnej kręgowców. Należy odnotować interesujący fakt, że w geno­mie ryby łososiowatej nerki istnieją dwa geny kodujące ten sam GnRH (GnRH III) [40].

Gen receptora GnRH typu I u człowieka jest pojedynczą kopią zlokalizowaną na chromosome 4q21.2 [2,24,33], przeciwnie do większości białek receptorów związanych z białkiem G (GPCR), które są bez intronów, składa się z trzech eksonów oddzielonych od siebie dwoma intronami i zajmuje więcej niż 15 kb wzdłuż chromosomu [8,15] (ryc. 2). Ekson l zawie­ra region niepodlegający translacji 5′-UTR oraz pierwsze 522 nukleotydy otwartej ramki odczytu, koduje również pierwsze trzy domeny transmembranowe (TM) oraz część czwartej domeny TM. Ekson 2 jest odpowiedzialny za ko­dowanie następnych 220 nukleotydców w ramce odczytu, zawiera resztę czwartej domeny TM, piątą domenę TM oraz część trzeciego zwoju wewnątrzkomórkowego (IC). Ekson 3 ma resztę sekwencji kodującej oraz 3-UTR. Granice między eksonami i intronami w ludzkim genie receptora GnRH są dobrze zachowane [8]. Pięć miejsc sygnalnych poliadenyla­cji jest w okolicy 800 – bp i stanowią wiązkę ulokowaną w 3′- UTR genu ludzkiego receptora GnRH [15]. 3′-UTR zawiera wiele motywów w sekwencji nukleotydów (ATTTA), które są odpowiedzialne za niestabilność mRNA; wykryto je rów­nież w wielu innych RNA, które podlegają szybkiej degrada­cji [17,49]. Wielkość mRNA receptora GnRH wnioskowana z długości sekwencji od 5′ do 3′-UTR jest około 5,5 kb, co się doskonale zgadza z opisanym dużym transkryptem (4,7-5 kb), który jest tworzony w wyniku ekspresji genu w ludzkiej przedniej przysadce mózgowej [8].

Ryc. 2. Struktury cDNA oraz genu ludzkiego receptora GnRH typu I, który jest zlokalizowany na chromosomie 4.21.2 i składa się 3 eksonów przedzielonych dwoma intronami. Ekson 1 zawiera 5′-UTR (region niepodlegający translacji) oraz koduje pierwsze 3 domeny TM (transmembranowe) oraz część czwartej domeny TM. Ekson 2 składa się z 220 par zasad (bp) i koduje pozostałą część czwartej domeny TM, piątą domenę TM oraz część trzeciego wewnątrzkomórkowego zwoju IC. Ekson 3 koduje pozostałe części otwartej ramki odczytu oraz zawiera 3′-UTR oraz część trzeciego wewnątrzkomórkowego zwoju IC. Ekson 3 koduje pozostałe części otwartej ramki odczytu oraz zawiera 3′-UTR (wg [8] – zmodyfikowano

Związanie się liganda (GnRH) do odpowiadającego mu swo­istego receptora, należącego do nadrodziny białek związa­nych z białkiem G – GPCR, takiego jak receptor GnRH, zawiera­jącego siedem domen transmembranowych (TM), wywołuje modyfikację konformacyjną tego receptora po powstaniu kompleksu, a to z kolei pozwala receptorowi na interakcję z białkiem G i na indukcję wymiany nukleotydu guanylowego na podjednostce α białka G i w konsekwencji na uwolnienie podjednostki α oraz βg od kompleksu receptora z białkiem G. Białko G inicjuje aktywację klasycznych efektorów sygnali­zacji wewnątrzkomórkowej, takich jak fosfolipaza C, cyklaza adenylanowa, kanały wapniowe oraz reguluje poziom we­wnątrzkomórkowy fosforanów inozytolu, wapnia, cyklicz­nego AMP oraz wiele innych przenośników sygnałów [34,40].

Siłą napędową badań nad strukturą receptora GnRH i jego interakcji z GnRH jest przekonanie, że taka informacja może dać racjonalną podstawę do stworzenia nowych analogonów GnRH o pożądanych własnościach. Aby zrozumieć własności i zależności struktura-funkcja receptora z cząsteczką GnRH oraz zmiany konformacyjne w rodzinie białek G po związaniu się różnych analogonów GnRH, należało również dokładnie zrozumieć i określić „kieszeń wiążącą” GnRH w receptorze. Aktywacja receptora wpływa na rotacje helis wewnątrz­membranowych (TM) i ruchy części struktur helis TM 2, 3, 6 i 7. Helisy są mocno upakowane w stanie nieaktywnym, a podlegają rozluźnieniu w czasie aktywacji receptora [40].

Rola miedzi w rozrodzie

O potencjalnym znaczeniu jonów miedzi w biochemii pep­tydów mózgu można wnioskować z faktu, że stężenie tego metalu w zakończeniach aksonów podwzgórzowych jest 1-2 albo więcej razy większe aniżeli w plazmie krwi [37]. Pepty­dy zawierające resztę histydyny są zwykle bardzo dobrymi ligandami dla jonów metali, a zwłaszcza dla Cu²⁺ [35].

W 1936 r. Fevold i wsp. [16] wykryli jako pierwsi, że owulacja może być indukowana przez dożylne wstrzyknięcie soli mie­dzi. Od tego czasu wielu innych badaczy wykryło, że podanie soli miedzi królikom [14,21,50,51,52] oraz owcom prowadzi do owulacji przez jej działanie na poziomie podwzgórza. Jony miedzi stymulowały uwalniane LH, zarówno podsta­wowe jak i stymulowane przez GnRH z komórek przysadki niedojrzałych samic szczura in vitro [19]. Miedź jest również bardzo dobrym czynnikiem uwalniającym GnRH z izolowa­nych granul podwzgórzowych, co potwierdza hipotezę, że miedź wpływa na neurony GnRH, a nie tylko na granule.

Barnea i wsp. w serii interesujących badań wykazali zna­czenie miedzi w utrzymaniu stabilności podwzgórzowych granul zawierających GnRH i sugerują mechanizm uwalnia­nia GnRH zarówno z wyizolowanych granul oraz z granul w ekplantach podwzgórzowych [3,9]. Inkubacja wyizolowa­nych granul z Cu-ATP oraz z Mg-ATP oznaczała, że Cu-ATP stymuluje nie tylko uwalnianie GnRH niezależnie od KCl, ale była o wiele bardziej skuteczna od Mg-ATP. Wydaje się więc, że Cu-ATP oraz Mg-ATP mogą działać przez oddzielne mechanizmy w uwalnianiu GnRH [3], a granule sekrecyjne mogą być miejscem działania miedzi [3,4].

Amidacja GnRH

Monooksygenaza α-amidująca peptydyloglicyny (PAM) kata­lizuje reakcję α-amidacji na karboksylowym końcu łańcucha peptydylo-glicyny. W wyniku tej reakcji hormony peptydo­we i białkowe, nieaktywne biologicznie, są przekształcane do ich właściwych postaci aktywnych w podwzgórzu i przy­sadce [44,45]. PAM jest umiejscowiona w komórce głównie w kompleksie Golgiego, jest także białkiem błonowym zwią­zanym z granulami zawierającymi peptydy. Reakcja amidacji zachodzi w reakcji dwuetapowej, a katalizacja zachodzi za pośrednictwem jej dwóch enzymów składowych: PHM – mo­nooksydazy peptydylo-α-hydroksyglicyny oraz PAL – liazy α-amidującej peptydyloglicylo-α-hydroksyglicyny, które razem noszą nazwę PAM [39].

Pierwszy stopień amidacji zachodzi z udziałem PHM, a drugi stopień jest katalizowany przez PAL. PHM zawiera dwa jony miedzi, które są między Cu²⁺ i Cu⁺ stanem utlenienia. Taka struktura sugeruje, że reakcja z udziałem PHM poprzedza aktywację substratu przez tlen związany z miedzią. Enzym PAM zawiera również atom cynku, który jest związany z PAL. Aktywność jego może być ograniczona przez takie czynni­ki chelatujące jak srebro (Ag) czy EDTA i rekonstytuowana przez dodanie molarnego nadmiaru metali dwuwartościo­wych (ryc. 3). Aktywność PAM zależy od tlenu cząsteczkowe­go, askorbinianu i miedzi. Małe stężenia PAM i askorbinianu mogą uczynić reakcję α-amidacji czynnikiem ograniczają­cym w syntezie biologicznie aktywnego peptydu. Miedź odgrywa istotną rolę w amidacji GnRH i nie może być za­stąpiona przez żaden inny metal dwuwartościowy [29,46].

Ryc. 3. Amidacja prohormonu GnRH – bardzo ważna dla uzyskania aktywnej cząsteczki GnRH. PHM: monooksydaza peptydyloglycylo-α-hydroksyglicyny; PAL: liaza α-amidująca peptydyloglicylo-a-hydroksyglicyny (wg [39] zmodifikowano)

Kompleksy metali z GnRH jako analogony GnRH – osiągnięcia polskiej myśli naukowej

Znając rezultaty wielu badań dotyczących roli miedzi w re­produkcji oraz badań nad połączeniem miedzi z amino­kwasami, dwoje wybitnych polskich uczonych chemików – prof. Barbara Rzeszotarska zajmująca się syntezą chemicz­ną GnRH (Uniwersytet Opolski) i prof. Henryk Kozłowski – specjalista od kompleksów miedzi z aminokwasami i pep­tydami (Uniwersytet Wrocławski) powzięli myśl o syntezie kompleksów GnRH z miedzią, niklem i cynkiem. Pierwsze badania strukturalne i biologiczne wypadły bardzo obiecu­jąco [18,31]. Kompleksy w badaniach in vivo indukowały owu­lację [18]. Te wyniki oznaczały, że w polskim laboratorium narodził się nowy interesujący analogon GnRH – Cu-GnRH. Wyżej wymienieni uczeni zwrócili się do mnie o dalsze kie­rowanie tymi badaniami.

Dalszym eksperymentem dotyczącym aktywności biologicz­nej i mocy uwalniającej gonadotropiny przysadkowej była infuzja kompleksów bezpośrednio do przysadki szczurzy­cy, odpowiednio przygotowanej według metody Ramireza i McCanna, służącej pierwotnie do testowania frakcji przy oczyszczaniu naturalnego GnRH (LHRF).

Infuzja doprzysadkowa była opracowana w Instytucie w Ja­błonnie przez profesora E. Domańskiego; za pomocą aparatu stereotaktycznego wprowadzono na stałe kaniule do przysad­ki i po zaleczeniu rany pooperacyjnej użyto do eksperymentu. Rezultaty badań wykazały pełną aktywność uwalniającą LH przez kompleksy metali z GnRH, a zwłaszcza Cu-GnRH, któ­rego siła uwalniania LH była większa od natywnego GnRH.

W następnym doświadczeniu, samicom owariektomizowa­nym i potraktowanym uprzednio estradiolem i progeste­ronem, aby zahamować uwalnianie endogennego GnRH, wstrzykiwano GnRH, Cu-GnRH, Ni-GnRH albo Zn-GnRH, aby po 15 minutach od dożylnego wstrzyknięcia pobrać krew i w niej oznaczyć, już nową metodą radioimmunologiczną, LH i FSH (ryc. 4 i 5). Wyniki tych badań wskazują, że uwal­nianie LH i FSH przez Cu-GnRH było znacznie wyższe aniżeli przez natywny GnRH; Ni-GnRH wykazuje również moc uwal­niającą chociaż znacznie niższą od Cu-GnRH [30].

Ryc. 4. Uwalnianie LH z przysadki do krwi u kastrowanych, potraktowanych uprzednio estradiolem i progesteronem samic szczura in vivo, 15 minut po dożylnym wstrzyknięciu GnRH albo kompleksów metali GnRH. 1- sól fizjjologiczna (NaCl); 2 – GnRH (0,1 mg); 3 – GnRH (1 mg); 4 – Cu-GnRH (1 mg); 5 – Cu-GnRH (5 mg); 6 – Ni-GnRH (1 mg); 7 – Ni-GnRH (5 mg); 8 – Zn-GnRH (1 mg); 9 – Zn-GnRH (10 mg); 4-9 vs 1-3 różnica statystycznie istotna

Ryc. 5. Uwalnianie FSH z przysadki do krwi u kastrowanych samic szczura, potraktowanych uprzednio estradiolem i progesteronem in vivo, 15 minut po dożylnym wstrzyknięciu GnRH albo kompleksów metali z GnRH. . 1- sól fizjologiczna (NaCl); 2 – GnRH (0,1 mg); 3 – GnRH (1 mg); 4 – Cu-GnRH (1 mg); 5 – Cu-GnRH (5mg); 6 – Ni – GnRH (1 mg); 7 – Ni-GnRH (5 mg); 8- Zn – GnRH (1mg); 9- Zn – GnRH (10 mg); 4-9 VS 1-3 różnica statystycznie istotna

Eksperymenty przeprowadzone na dużych grupach zwierząt i przy precyzyjnym oznaczeniu RIA hormonów ostatecznie potwierdziły dużą aktywność uwalniającą gonadotropiny przez kompleksy, a zwłaszcza dużą moc uwalniającą LH przez Cu-GnRH. W serii badań nad uwalnianiem LH z komórek przysadkowych stwierdzono aktywność uwalniającą kom­pleksów metali, a zwłaszcza aktywność Cu-GnRH (ryc. 6). W dalszych naszych badaniach nad wiązaniem się komplek­sów metali z receptorem wykazaliśmy, że kompleks Cu-GnRH wiązał się do receptora z większym powinowactwem w po­równaniu z naturalnym dekapeptydem GnRH, natomiast kompleks Ni-GnRH wiązał się z receptorami przysadkowymi z mniejszym powinowactwem [29].

Ryc. 6. Uwalnianie LH z komórek przedniej części przysadki przez GnRH, Cu- GnRH oraz Ni-GnRH w stosunku do czasu inkubacji. Dane przedstawiają średnią ±SEM; *P<0,05; **P<0,01

Dalsze badania wiązania się badanych kompleksów do recep­tora przysadki owcy wykazały, że agonista GnRH buserelina (D-Ser-(tBu)⁶-Pro⁹-NHEt)-GnRH współzawodniczy z GnRH o swoiste miejsca wiążące receptora. Gdy porównywano kompleksy meta1-GnRH z wolnym GnRH stwierdzono, że wolny hormon i kompleks nikiel(II) oraz kobalt(II) wykazują mniejsze powinowactwo do receptora aniżeli Cu-GnRH [11]. Wyniki tych badań uzasadniają i poszerzają wcześniejsze wyniki, wykonane w badaniach z użyciem receptora przy­sadki szczura, owcy i świni [11,29,42] i ostatecznie dowodzą, że jony metali pełnią istotną rolę w modulacji aktywności biologicznej hormonu GnRH.

W dalszych badaniach stwierdziliśmy, że kompleksy metali wykazywały inny profil sygnalizacji wewnątrzkomórkowej aniżeli natywny GnRH (ryc. 7 i 8). GnRH generował głównie syntezę fosforanu inozytolu w komórkach przysadki, nato­miast wewnątrzkomórkowa synteza cAMP była znacznie pod­wyższona po stymulacji komórek przysadkowych przez kom­pleksy metali z GnRH, a szczególnie przez Cu-GnRH [5,27].

Ryc. 7. Wewnątrzkomórkowa synteza fosforanu inozytolu (IP) w komórkach przysadki po 30 min inkubacji z GnRH, Cu-GnRH oraz Ni-GnRH. Stężenia wszystkich peptydów wynosiły 10-7 M. Dane przedstawiają średnią ±SEM; *P<0,05

Ryc. 8. Akumulacja wewnątrzkomórkowa cAMP w komórkach przysadki po inkubacji z GnRH, Cu-GnRH oraz Ni-GnRH. Wszystkie peptydy w stężeniu 10-7 M. Forskolina (10 mM użyta jako pozytywna kontrola). Dane przedstawiają średnią ±SEM; *P<0,05; ***P<0,001

Stwierdziliśmy także, że kompleksy GnRH nie generowa­ły desensytyzacji receptora po dłuższym czasie działania. Cu-GnRH odznacza się także znacznie większą stabilnością i mniejszą podatnością na degradację enzymatyczną [20].

Badania strukturalne kompleksów miedzi i niklu z GnRH

Podjęto wnikliwe badania strukturalne kompleksów Cu­-GnRH oraz Ni-GnRH [42,43]. Badania z zastosowaniem ją­drowego rezonansu magnetycznego (MR) oraz nowoczesnej metodyki pamięci molekularnej (MM), wykonane w ramach międzyrządowego porozumienia naukowego polsko-japoń­skiego; pozwoliły ujawnić obecność dwóch domen struktu­ralnych w cząsteczce natywnego GnRH, których orientacja przestrzenna jest modulowana przez dużą mobilność glicyny w pozycji 6 sekwencji.

Utworzenie się kompleksów metali z GnRH zostało po­twierdzone przez pomiar spektrum metodą MALDI-TOF­MAS. Z tych pomiarów wynika, że kompleks 1:1 Cu(II)-GnRH (m/z = 1245) jest najbardziej stabilny ze wszystkich trzech możliwych kompleksów metalu z GnRH, wnioskując z in­tensywności występujących szczytów. Utworzenie stabilnej formacji kompleksu 1:1 Cu(II) – GnRH zostało również po­twierdzone przez badania spektrum masowego FAB (m/z = 1244). Metastabilne sygnały odpowiadające [GnRH)n-Cu] ^m+(n, m # 1) nie były obserwowane, co sugeruje, że stosunek wiązania GnRH z miedzią (II) jest 1:1.

Wiązanie się GnRH z jonami metalu było również moni­torowane przez spektroskopię ¹HNMR. Sygnały protonów z GnRH znacznie się rozszerzały ze zwiększającym się stęże­niem jonów Cu(II), aż do stosunku 1:1 GnRH i Cu(II), podczas gdy rozszerzenie się sygnału nie zwiększa się już, gdy stosu­nek sięga już 1:1. To oznacza, że stosunek wiązania metalu do GnRH jest 1:1, co jest zgodne z rezultatami otrzymanymi z zastosowaniem metody MALDI-TOFMAS. Aby określić sto­sunek wiązania GnRH i jonu miedzi (II), zastosowano metodę ciągłych zmian, którą dostosowano do pomiarów systemu metal-peptyd. Wynik maksimum około X = 0,5 oznacza, że stosunek wiązania jest 1:1. Ten wynik jest zgodny z pomia­rami metodami MALDI-TOFMAS i ¹HNMR.

Reszta imidazolowa His jest głównym miejscem wiązania jonu Cu(II), więc struktura kompleksu między PyroGlu­-His-Trp-NHCH₃ i jonem metalu została określona przez obliczenia metodą pamięci cząsteczkowej 3(MM3), chociaż nie została doprowadzona idealnie do warunków optymal­nych. Możliwe są trzy miejsca koordynacji: azot imidozolu (N- w pozycji 1) reszty histydyny, deprotonowanej azot ami­dowy (N^–) reszty histydyny oraz deprotonowany azot (N^–) amidowy pierścienia kwasu pyroglutaminowego. Czwar­tym miejscem koordynacji może być tlen (O) cząsteczki wody. Jak wiadomo, dla kompleksów Cu(II) konfiguracja kwadratowa płaska jest faworyzowana. W istocie, kom­pleks pokazany na ryc. 9 ma taką konfigurację kwadrato­wą płaską [42,43].

Ryc. 9. Struktura kompleksu PyroGlu-His-Trp-NHCH₃ i miedzi Cu(II) obliczona metodą pamięci cząsteczkowej – MM3

Badania strukturalne kompleksu Ni-GnRH wykonano mie­rząc spektra ¹H-NMR dla GnRH w DM|S|O przez ekspery­menty TOCS4 i ROES4 [11] i są zgodne z danymi dotychczas opublikowanymi [7]. Zaobserwowane metodą ROES4, za­chodzące na siebie piki były użyte jako wyznaczniki w ob­liczeniach dynamiki molekularnej wykonanej za pomocą programu DYANA [11].

Obliczone struktury pokazano na ryc. 10 i 11. Nałożenie szkieletów z 30 najlepszych wyników struktur otrzymanych metodą DYANA pokazuje ogólną tendencję konformacyjną, ale jest względnie słabe, jak to wykazano przez duże warto­ści średniej RMSD (0,188 ± 0,74 nm dla szkieletu oraz 0,206 ± 0,101 nm dla atomów ciężkich).

Ryc. 10. Struktura Ni-GnRH o najniższej energii. Obliczone struktury z N-końca łańcucha, 4N obliczone w sferze koordynacyjnej jonów Ni w Ni-GnRH

Ryc. 11. Trzydzieści nakładających się na siebie struktur N-końca łańcucha (A) i C-końca łańcucha (B) części kompleksu peptydu Ni-GnRH

Otrzymano dokładny wgląd w strukturę przez wzajemne nakładanie obwodów końców łańcucha peptydu. Peptyd jest ułożony strukturalnie prawidłowo na obu końcach, a nieuporządkowanie pochodzi od glicyny w pozycji 6. Mię­dzycząsteczkowe zachodzenie na siebie pików ROES4 wy­kryto wcześniej dla obu końców [7] oraz wokół Gly-6, co może spowodować utratę struktury wymuszonej; stwier­dzono dużą mobilność Gly-6, a Cα stwierdzoną poprzed­nio [12] w sytuacji małej mobilności węgli szkieletu Cα reszt aromatycznych [13]. Wzajemna orientacja części struktur może być modulowana przez mobilność szkiele­tu przy Gly-6. Taka mobilność wydaje się istotna w konfor­macyjnym dostosowaniu się do peptydu w miejscu wiąza­nia się z receptorem, jak to sugeruje dramatyczna zmiana aktywności po zastąpieniu Gly-6 przez inny aminokwas [10,23,32,41,47]. Wyraźnie określona wzajemna orientacja pierścieni wewnątrz N- końca łańcucha w tych badaniach nie może być przesadnie korzystnie interpretowana z na­stępujących powodów:
1. Wszystkie możliwe zachodzące na siebie piki wewnątrz­cząsteczkowe zostały przekształcone w wymuszone odle­głości; wśród nich niektóre, takie jak HN- H_α albo H_α – H_β, dają bardzo wyraźne odległości i są po prostu odbiciem średniej konformacji.
2. Te same przymusowe ograniczenia nie są w sprzeczno­ści z innymi, ponieważ odnoszą się one do peryferyjnych części peptydu, które samoistnie mają wyższy stopień swobody poruszania się [11].

Uporządkowanie w łańcuchach bocznych stosunkowo ma­łego peptydu, należy interpretować jako strukturę śred­nią, gdzie mobilność moduluje względne orientacje pier­ścieni do siebie. Średnia struktura jest jednak całkowicie wystarczająca, aby wytłumaczyć szeroki szczyt wykryty dla H₄ histydyny. Takie rozszerzenie szczytu może być wyjaśnione tylko przez wymianę konformacyjną, w skali czasu milisekundy, dając rozkład wielkości przestrzennej zbliżony do wielkości rzeczywistej T₂. Obecność wymia­ny w tej skali, pokazuje ukształtowanie interakcji we­wnątrzcząsteczkowej, która z kolei wyjaśnia znaczenie His-2 dla aktywności biologicznej cząsteczki Ni-GnRH [10,12,23,32,41,47].

Podsumowanie

Metale skompleksowane z GnRH [Cu(II)], [Ni(II)], [Co(II)] i [Zn(II)] wywierają istotny modulujący wpływ na wiąza­nie GnRH z jego receptorem. Kompleks z miedzią działa na receptor jako rozbudowany agonista, natomiast wpływ [Ni(II)], [Co(II)] i [Zn(II)] w kompleksie działają mniej zdecydowanie jako agoniści. Zmieniają one rów­nież ścieżki sygnalizacji wewnątrzkomórkowej przez receptor i z tego względu mogą być uważane jako ważne analogony GnRH, zarówno w badaniach nad zróżnico­wanym działaniem receptora na sygnalizację w komórce i końcowy efekt fizjologiczny oraz oczekują na zastoso­wanie ich w klinice po podjęciu badań testowych i kli­nicznych w tym zakresie.

Współpraca w realizacji badań

• Instytut Fizjologii i Żywienia Zwierząt im. Jana Kielanow­skiego Polskiej Akademii Nauk, Jabłonna: Prof. dr hab. Ka­zimierz Kochman, Dr hab. Alina Gajewska, prof. nadzw., Dr Anna Michaluk, Mgr Helena Kochman
• Uniwersytet Wrocławski, Wydział Chemii: Prof. dr hab. Henryk Kozłowski, Dr Kinga Kulon
• Wyższa Szkoła Pedagogiczna w Opolu, Katedra Chemii (obecnie Uniwersytet Opolski): Prof. dr hab. Barbara Rze­szotarska, Dr Elżbieta Masiukiewicz
• Uniwersytet Warmińsko-Mazurski, Katedra Fizjologii: Prof. dr hab. Jadwiga Przała, Dr Iwona Bogacka, Dr Gabriela Siaw­rys
• Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności PAN w Olsz­tynie: Prof. dr hab. Adam Zięcik, Prof. dr hab. Agnieszka Blitek, Dr Monika Kaczmarek
• Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu: Prof. Lech Zwierzchowski, Dr Dagmara Robakowska-Hy­żorek, Dr Paweł Lisowski
• Physiologie de l’axe gonadotrope, Unité de Biologie Fonc­tionnelle et Adaptative, Université Paris, France: Prof. Ray­mond Counis
• Institute for Biological Resources and Functions, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Japan: Prof. Hiroaki Okuno, Dr Masato Kodaka, Dr Kazuhiko Nakamura

Podziękowanie

Składam serdeczne podziękowania Prof. Henrykowi Kozłow­skiemu z Uniwersytetu Wrocławskiego za krytyczne prze­czytanie manuskryptu i cenne uwagi.

PIŚMIENNICTWO

[1] Adams B.A., Tello J.A., Erchegyi J., Warby C., Hong D.J., Akinsanya K.O., Mackie G.O., Vale W., Rivier J.E., Sherwood N.M.: Six novel gonadotropin-releasing hormones are encoded as triplets on each of two genes in the protochordate, Ciona intestinalis. Endocrinology, 2003; 144: 1907-1919
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[2] Albarracin C.T., Kaiser U.B., Chin W.W.: Isolation and characterization of the 5′-flanking region of the mouse gonadotropin-releasing hormone receptor gene. Endocrinology, 1994; 135: 2300-2306
[PubMed]  

[3] Barnea A., Cho G.: Evidence that copper-amino acid complexes are potent stimulators of the release of luteinizing hormone-releasing hormone from isolated hypothalamic granules. Endocrinology, 1984; 115: 936-943
[PubMed]  

[4] Barnea A., Colombani-Vidal M.: A ligand-specific action of chelated copper on hypothalamic neurons: Stimulation of the release of luteinizing hormone-releasing hormone from median eminence explants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984; 81: 7656-7660
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[5] Blitek A., Zięcik A., Gajewska A., Kodaka M., Counis R., Kochman K.: Cobalt complex with GnRH stimulates the LH release and PKA signaling pathway in pig anterior pituitary cells in vitro. Brain Res. Bull., 2005; 65: 391-396
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[6] Burgus R., Butcher M., Amoss M., Ling N., Monahan M., Rivier J., Fellows R., Blackwell R., Vale W., Guillemin R.: Primary structure of the ovine hypothalamic luteinizing hormone-releasing factor (LRF) (LH-hypothalamus-LRF-gas chromatography-mass spectrometry-decapeptide-Edman degradation). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1972; 69: 278-282
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[7] Calzolai L., Gaggelli E., Valensin G., Maccotta A.: NMR studies of the luteinizing hormone-releasing hormone (LH-RH) decapeptide in DMSO solution. Magn. Reson. Chem., 1994; 32: 540-546
[Abstract]  

[8] Cheng C.K., Leung P.C.: Molecular biology of gonadotropin-releasing hormone (GnRH)-I, GnRH-II, and their receptors in humans. Endocr. Rev., 2005; 26: 283-306
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[9] Colombani-Vidal M., Barnea A.: Copper stimulation of LHRH release from median eminence explants. I. A divalent metal specific process that does not require extracellular calcium. Neuroendocrinology, 1986; 43: 664-669
[PubMed]  

[10] Coy D.H., Labrie F., Savary M., Coy E.J., Schally A.V.: LH-releasing activity of potent LH-RH analogs in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975; 67: 576-582
[PubMed]  

[11] D’Amelio N., Gaggelli E., Gajewska A., Kochman H., Kochman K., Kozłowski H., Latajka Z., Młynarz P., Panek J., Valensin G.: Structural analysis and sheep pituitary receptor binding of GnRH and its complexes with metal ions. J. Inorg. Biochem., 2003; 94: 28-35
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[12] Deslauriers R., Levy G.C., McGregor W.H., Sarantakis K., Smith I.C.: Conformational flexibility of luteinizing hormone-releasing hormone in aqueous solution. A carbon-13 spin-lattice relaxation time study. Biochemistry, 1975; 14: 4335-4343
[PubMed]  

[13] Deslauriers R., Somorjai R.L.: Internal rotations of side chains and backbone in luteinizing hormone-releasing hormone (LH-RH). Analysis of carbon-13 spin-lattice relaxation times. J. Am. Chem. Soc., 1976; 98: 1931-1939
[PubMed]  

[14] Donley S.A., Ilagan B.J., Rim H., Linder M.C.: Copper transport to mammary gland and milk during lactation in rats. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 2002; 283: E667-E675
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[15] Fan N.C., Peng C., Krisinger J., Leung P.C.: The human gonadotropin-releasing hormone receptor gene: complete structure including multiple promoters, transcription initiation sites, and polyadenylation signals. Mol. Cell. Endocrinol., 1995; 107: R1-R8
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[16] Fevold H.L., Hisaw F.L., Greep R.: Augmentation of the gonad-stimulating action of pituitary extracts by inorganic substances, particularly copper salts. Am. J. Physiol., 1936; 117: 68-74
[Full Text PDF]  

[17] Gay E., Babajko S.: AUUUA sequences compromise human insulin-like growth factor binding protein-1 mRNA stability. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000; 267: 509-515
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[18] Gerega K., Kozlowski H., Masiukiewicz E., Pettit L.D., Pyburn S., Rzeszotarska B.: Metal complexes of luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH). Potentiometric and spectroscopic studies. J. Inorg. Biochem., 1988; 33: 11-18
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[19] Hazum E.: Copper and thiol regulation of gonadotropin releasing hormone binding and luteinizing hormone release. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1983; 112: 306-312
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[20] Herman A., Kozłowski H., Czauderna M., Kochman K., Kulon K., Gajewska A.: Gonadoliberin (GnRH) and its copper complex (Cu-GnRH) enzymatic degradation in hypothalamic and pituitary tissue in vitro. J. Physiol. Pharmacol., 2012; 63: 69-75
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[21] Hiroi M., Sugita S., Suzuki M.: Ovulation induced by implantation of cupric sulfate into the brain of the rabbit. Endocrinology, 1965; 77: 963-967
[PubMed]  

[22] Iwakoshi E., Takuwa-Kuroda K., Fujisawa Y., Hisada M., Ukena K., Tsutsui K., Minakata H.: Isolation and characterization of a GnRH-like peptide from Octopus vulgaris. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002; 291: 1187-1193
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[23] Janecka A., Janecki T., Bowers C.Y., Folkers K.: New, highly active antagonists of LHRH with acylated lysine and p-aminophenylalanine in positions 5 and 6. Int. J. Pept. Protein Res., 1994; 44: 19-23
[PubMed]  

[24] Kakar S.S.: Molecular structure of the human gonadotropin-releasing hormone receptor gene. Eur. J. Endocrinol., 1997; 137: 183-192
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[25] Kochman K.: Some biochemical properties of LH-releasing factor from ovine hypothalamus. Third International FEBS Meeting, Warsaw 4-7 April, 1966. Book of Abstracts, Abstract F 302, p. 333

[26] Kochman K.: Purification and properties of LH and FSH releasing factor from ovine hypothalamus. PhD. Thesis. Institute of Applied Biology, Polish Academy of Sciences (Cracow), 1969

[27] Kochman K., Blitek A., Kaczmarek M., Gajewska A., Siawrys G., Counis R., Zięcik A.J.: Different signaling in pig anterior pituitary cells by GnRH and its complexes with copper and nickel. Neuro Endocrinol. Lett., 2005; 26: 377-382
[PubMed]  

[28] Kochman K., Domanski E.: Studies on purification of the hypothalamic substances responsible for the release of gonadotropins from the pituitary gland. Acta Physiol. Pol., 1969; 20: 441-453
[Abstract]  

[29] Kochman K., Gajewska A., Kochman H., Kozłowski H., Masiukiewicz E., Rzeszotarska B.: Binding of Cu²⁺, Zn²⁺, and Ni²⁺-GnRH complexes with the rat pituitary receptor. J. Inorg. Biochem., 1997; 65: 277-279
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[30] Kochman K., Gajewska A., Kozłowski H., Masiukiewicz E., Rzeszotarska B.: Increased LH and FSH release from the anterior pituitary of ovariectomized rat, in vivo, by copper-, nickel-, and zinc-LHRH complexes. J. Inorg. Biochem., 1992; 48: 41-46
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[31] Kozłowski H., Masiukiewicz E., Rzeszotarska B., Potargowicz E., Walczewska-Sumorok A.: Ovulation-inducing activity of luliberin (LHRH) complexed by copper(II), nickel(II), and zinc(II) ions. J. Inorg. Biochem., 1990; 40: 121-125
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[32] Kutscher B., Bernd M., Beckers T., Polymeropoulos E.E., Engel J.: Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997; 36: 2148-2161
[Abstract]  [Full Text PDF]  

[33] Leung P.C., Squire J., Peng C., Fan N., Hayden M.R., Olofsson J.I.: Mapping of the gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor gene to human chromosome 4q21.2 by fluorescence in situ hybridization. Mamm. Genome, 1995; 6: 309-310
[PubMed]  

[34] Liu F., Usui I., Evans L.G., Austin D.A., Mellon P.L., Olefsky J.M., Webster N.J.: Involvement of both G_q/11 and G_s proteins in gonadotropin-releasing hormone receptor-mediated signaling in LβT2 cells. J. Biol. Chem., 2002; 277: 32099-32108
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[35] Livera C.E., Pettit L.D., Bataille M., Perly B., Kozłowski H., Radomska B.: J. Chem. Soc. Dalton Trans., 1987; 16: 661-666
[Abstract]  [Full Text PDF]  

[36] Matsuo H., Baba Y., Nair R.M., Arimura A., Schally A.V.: Structure of the porcine LH- and FSH-releasing hormone. I. The proposed amino acid sequence. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971; 43: 1334-1339
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[37] Merriam G.R., Nunnelley L.L., Trish J.W., Naftolin F.: Sex-related and cyclic variation of trace elements in rat hypothalamus and pituitary. Brain Res., 1979; 171: 503-510
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[38] Michaluk A., Blitek A., Gajewska A., Kaczmarek M.M., Gromadzka-Hliwa K., Kochman H., Ziecik A.J., Kochman K.: LH release by Cu and Ni salts and metal-GnRH complexes, in vitro. Neuro Endocrinol. Lett., 2006; 27: 483-486
[PubMed]  

[39] Michaluk A., Kochman K.: Involvement of copper in female reproduction. Reprod. Biol., 2007; 7: 193-205
[PubMed]  

[40] Millar R.P., Lu Z.L., Pawson A.J., Flanagan C.A., Morgan K., Maudsley S.R.: Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr. Rev., 2004; 25: 235-275
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[41] Monahan M.W., Amoss M.S., Anderson H.A, Vale W.: Synthetic analogs of the hypothalamic luteinizing hormone releasing factor with increased agonist or antagonist properties. Biochemistry, 1973; 12: 4616-4620
[PubMed]  

[42] Nakamura K., El-Mehasseb I.M., Kodaka M., Okuno H., Kozłowski H., Gajewska A., Kochman H., Kochman K.: Structural and receptor binding analysis of Cu-GnRH, Ni-GnRH and Co-GnRH complexes. Central European Conference of Neurobiology, Cracow, August 11-15, 2001, Abstract 14, p. 58

[43] Nakamura K., Kodaka M., El-Mehasseb I.M., Gajewska A., Okuno H., Ochwanowska E., Witek B., Kozłowski H., Kochman K.: Further structural analysis of GnRH complexes with metal ions. Neuro Endocrinol. Lett., 2005; 26: 247-252
[PubMed]  

[44] O’Donnel P.J., Driscoll W.J., Bäck N., Muth E., Mueller G.P.: Peptidylglycine-α-amidating monooxygenase and pro-atrial natriuretic peptide constitute the major membrane-associated proteins of rat atrial secretory granules. J. Mol. Cell. Cardiol., 2003; 35: 915-922
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[45] Prigge S.T., Kolhekar A.S., Eipper B.A., Mains R.E., Amzel L.M.: Amidation of bioactive peptides: the structure of peptidylglycine α-hydroxylating monooxygenase. Science, 1997; 278: 1300-1305
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[46] Prigge S.T., Mains R.E., Eipper B.A., Amzel L.M.: New insights into copper monooxygenases and peptide amidation: structure, mechanism and function. Cel. Mol. Life Sci., 2000; 57: 1236-1259
[PubMed]  

[47] Rivier J., Vale W., Burgus R., Ling N., Amoss M., Blackwell R., Guillemin J.: Synthetic luteinizing hormone releasing factor analogs. Series of short-chain amide LRF homologs converging to the amino terminus. J. Med. Chem., 1973; 16: 545-549
[PubMed]  

[48] Roch G.J., Busby E.R., Sherwood N.M.: Evolution of GnRH: diving deeper. Gen. Comp. Endocrinol., 2011; 171: 1-16
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[49] Ross J.: Control of messenger RNA stability in higher eukaryotes. Trends Genet., 1996; 12: 171-175
[PubMed]  [Full Text HTML]  

[50] Suzuki M., Tnemoto Y., Takahashi K.: The effect of copper salts on ovulation, especially on hypothalamic ovulatory hormone releasing factor. Tohoku J. Exp. Med., 1972; 108: 9-18
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[51] Suzuki M., Watanabe S., Hoshii M.: Effect of estrogen on copper-induced ovulation in the rabbit. Endocrinology, 1965; 76: 1205-1207
[PubMed]  

[52] Tsou R.C., Dailey R.A., McLanahan C.S., Parent A.D., Tindall G.T., Neill J.D.: Luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) levels in pituitary stalk plasma during the preovulatory gonadotropin surge of rabbits. Endocrinology, 1977; 101: 534-539
[PubMed]  

Autor deklaruje brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu