Abstrakt

17β-estradiol i progesteron, steroidy płciowe omawiane zazwyczaj w związku z modulacją funkcji reprodukcyjnych, regulują wiele wewnątrzkomórkowych procesów w komórkach docelowych, wyposażonych w odpowiednie receptory. Ostatnie lata przyniosły znaczny postęp w zrozumieniu mechanizmów działania steroidów płciowych na poziomie molekularnym. Oprócz tradycyjnej drogi przekazywania sygnału hormonalnego, związanej z regulacją transkrypcji genów, opisano mechanizmy szybkiego działania steroidów zwane niegenomowymi, w których regulacja aktywności komórki odbywa się przez interakcje z białkami regulatorowymi w błonie komórkowej i cytoplazmie. 17β-estradiol i progesteron modulują aktywność ważnych szlaków sygnałowych w komórce, działając przez powszechnie występujące kaskady regulatorowe kinaz aktywowanych mitogenami (MAPK), kinazy 3-fosfatydyloinozytolu oraz kinaz tyrozynowych. Wynik ich działania w komórce jest wypadkową aktywności mechanizmów genomowego i niegenomowego oraz zależy od jej fizjologicznego i genetycznego kontekstu. Opisanie mechanizmów działania steroidów płciowych na poziomie molekularnym pozwala nie tylko zrozumieć złożoność ich oddziaływania w warunkach fizjologicznych, ale także występujących patologii. W pracy podsumowano wiadomości na temat działania 17β-estradiolu i progesteronu na poziomie molekularnym z wyjaśnieniem ich powiązania z komórkowymi szlakami sygnałowymi.

Wstęp

Hormony płciowe (zwane także steroidami płciowymi), są grupą lipofilnych cząsteczek syntetyzowanych z cholesterolu w gonadach, korze nadnerczy lub powstających przez przekształcenie z innych hormonów płciowych w komórkach wielu tkanek organizmu (np. wątrobie czy tkance tłuszczowej). Do grupy tej są zaliczane androgeny, estrogeny i progestageny. Mimo iż zwyczajowo są dzielone na „hormony żeńskie” (estrogeny i progesteron) i „hormony męskie” (androgeny), przedstawiciele tych dwóch grup występują fizjologicznie u obu płci, w różnych natomiast stężeniach i pełniąc odmienne role. Steroidy płciowe są transportowane we krwi w postaci związanej z białkami; testosteron i estradiol głównie z białkiem SHBD (sex hormone binding globulin), w niewielkim stopniu również z albuminami, natomiast progesteron wraz z transkortyną. Ze względu na swą hydrofobową naturę, przenikają przez błony komórkowe do wnętrza komórek docelowych na zasadzie dyfuzji. Po wniknięciu do komórki, hormony płciowe działają przez związanie ze swoistymi receptorami wewnątrzkomórkowymi, będącymi jednocześnie czynnikami transkrypcyjnymi. Receptory te, aktywowane po związaniu z ligandem, ujawniają działanie wzmacniające bądź wyciszające ekspresję genów docelowych. Działanie aktywnych kompleksów hormon-receptor może się odbywać także pośrednio, przez oddziaływanie z innymi czynnikami transkrypcyjnymi lub przez włączenie w wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne. Należy zatem zaznaczyć, że mechanizm działania hormonów płciowych może przebiegać w zróżnicowany sposób, pociągając za sobą wiele swoistych odpowiedzi, o charakterze których decydować będzie fizjologiczny i genetyczny kontekst komórek docelowych.

Mechanizm działania hormonów płciowych

Rozwój badań nad działaniem hormonów steroidowych przypada na początek XX w., kiedy po raz pierwszy opisano zależność między nieprawidłowościami rozwoju embrionalnego kijanek i występującymi w jego wyniku chorobami a działaniem steroidów i hormonów tarczycy [22]. Jeszcze w latach 50 ub.w. powszechnie sądzono, że działanie estradiolu w komórkach docelowych wynika z poddania go procesom utleniania i redukcji z udziałem koenzymów. Dopiero odkrycie techniki radioaktywnego znaczenia estradiolu pozwoliło nie tylko obalić istnieją- cy pogląd i zrozumieć fizjologiczną rolę tego hormonu, ale również doprowadziło w 1958 r. do przełomowego odkrycia receptora estrogenowego, stanowiąc duży postęp w rozwoju badań nad mechanizmem działania estrogenów w następnych latach [44]. Kamieniem milowym w zrozumieniu mechanizmów działania wszystkich hormonów steroidowych była praca opublikowana przez Clevera i Karlsona w 1960 r. Badacze ci, testując działanie ekdyzonu (steroidowego hormonu linienia) na larwach owadów zauważyli zmiany w strukturze chromosomów obserwowane po 2 h od iniekcji hormonu, zanikające w ciągu 24 h. W sposób naturalny wskazywało to, że działanie tego steroidu miało swoje odzwierciedlenie na poziomie aktywności genów. Kilka lat później opracowano dwustopniowy model obrazujący wiązanie się wewnątrz komórek hormonu z receptorem o dużej swoistości oraz następującą w wyniku aktywacji powstałego kompleksu hormon-receptor indukcję ekspresji genów [45]. Był to pierwszy odkryty mechanizm działania steroidów w komórkach docelowych, który jeszcze przez wiele lat był uważany za jedyny.

Receptorowa ścieżka działania

Według klasycznej teorii działania steroidów, 17β-estradiol (E2) i progesteron (P4) po wniknięciu do komórki regulują ekspresję określonych genów przez związanie się ze swoistymi receptorami jądrowymi, będącymi jednocześnie czynnikami transkrypcyjnymi. Proces ten ma charakter szlaku następujących po sobie zdarzeń, a pojawiająca się w jego wyniku regulacja ekspresji genów to tylko początek procesów komórkowych zaangażowanych w rozwój i odpowiedź fizjologiczną organizmu. Od czasu pierwszego sklonowania cDNA receptorów estrogenowych w latach 50 ub.w. odkryto i opisano u człowieka już ponad 60 różnych receptorów jądrowych, również takich, dla których ligandy nie istnieją lub nie są znane, zwanych receptorami sierocymi (orphan receptors), stanowiących interesujący obiekt przyszłych badań [60]. Według obowiązującej nomenklatury, receptory hormonów steroidowych znajdujące się w podrodzinie receptorów jądrowych NR3 są dzielone na trzy grupy: A – receptory estradiolu ERα i ERβ, B – receptory sieroce estradiolu ERRα i ERRβ, C – receptory pozostałych hormonów steroidowych, w której zawierają się receptory progesteronu PRA i PRB [70]. Receptory te są białkami o wyraźnej budowie modułowej, w których wyróżnić można pięć funkcjonalnych domen (ryc. 1) [30].

Domena N-końcowa, o najmniejszej homologii wśród receptorów jądrowych, zawiera sekwencję AF-1 odpowiadającą za wiązanie się kompleksów koaktywacyjnych [62]. Występujące następnie dwie domeny środkowe: domena C odpowiedzialna za wiązanie z DNA (DBD – DNA binding domain) i domena E za przyłączenie liganda (LBD – ligand binding domain), mają wysoce konserwatywną ewolucyjnie sekwencję wśród wszystkich receptorów steroidowych [5]. Domeny te są rozdzielone regionem zawiasowym, nazywanym także giętką (hinge), będącym najbardziej zmienną sekwencją receptorów o najmniej zbadanej relacji strukturalno-funkcjonalnej, podlegającej wielu potranslacyjnym modyfikacjom [91]. Znajdująca się częściowo w domenie E oraz kończąca w C-terminalnym rejonie białka sekwencja AF-2 również odpowiada za aktywację transkrypcji [77]. Receptory estrogenowe są kodowane przez dwa oddzielne geny (ESR1 dla ERα i ESR2 dla ERβ), podczas gdy receptory progesteronowe są dwoma izoformami powstałymi przez alternatywny splicing tego samego genu (PGR). Mimo dużego podobień- stwa budowy receptory progesteronowe są funkcjonalnie różnymi czynnikami transkrypcyjnymi, wykazującymi często przeciwstawne działanie. Wśród receptorów estrogenowych istnieje osiem izoform powstałych w wyniku alternatywnego splicingu dwóch genów (3 izoformy ERα i 5 izoform ER β). Ekspresja obu receptorów wystepuje powszechnie w komórkach wielu tkanek, jednak przewagę ERα wykazują komórki błony śluzowej macicy, jajnika, podwzgórza oraz przewodów wyprowadzających jądra, podczas gdy ERβ komórki nerek, mózgu, serca, kości, płuc, błony śluzowej jelit, stercza i śródbłonka naczyniowego [5]. Ekspresję PR wykazują natomiast przede wszystkim komórki macicy i jajników oraz OUN (głównie podzwgórza) [5]. Szczegółowe informacje na temat receptorów estrogenowych zawiera obszerna publikacja Ascenzi i wsp. [3], a profile ekspresji receptora ERα, ERβ oraz PR w różnych tkankach organizmu znaleźć można na stronie: Nuclear Receptor Signaling Atlas (www.nursa.org).

Początkowo sądzono, że receptory steroidów aktywność transkrypcyjną osiągają tylko przez dimeryzację i przy- łączenie liganda, a aktywny kompleks wiąże się ze swoistymi, palindromowymi sekwencjami DNA nazwanymi ogólnie HREs (hormone response elements), które w przypadku omawianych receptorów będą dwoma motywami: 5’-AGAACA-3’dla progesteronu i 5’-AGGTCA-3’ dla estradiolu [38]. Obecnie wiadomo, że część receptorów jądrowych tworzy heterodimery z receptorami retinoidu X, które przyłączają się do bezpośrednio powtórzonych sekwencji HREs, podczas gdy receptory sieroce działają niezależnie od liganda na dwa możliwe sposoby: jako homodimery przyłączając się do bezpośrednio powtórzonych HREs lub jako monomery łącząc się z niesymetrycznymi HREs, znajdującymi się tylko po jednej stronie (ryc. 2) [60]. Zatem, działanie regulujące ekspresję genów przez receptory dla hormonów płciowych odbywa się nie tylko przez związanie z sekwencją HRE znajdującą się w rejonie promotorowym genu docelowego, ale również po przyłą- czeniu się w bezpośrednim sąsiedztwie jego sekwencji lub oddziałując z innymi czynnikami transkrypcyjnymi [3]. Działanie to dla niektórych receptorów przebiega w obecności liganda, podczas gdy dla innych przy jego braku. Co więcej, regulacja ekspresji genów wymaga dostępu do aparatu transkrypcyjnego komórki, odbywa się bowiem na poziomie promotorów genów docelowych, wymagając aktywności kompleksów preinicjacyjnych w obszarze startu transkrypcji. Aktywność ta jest osiągana przez receptory steroidów w kontakcie z głównymi czynnikami transkrypcyjnymi (GTF – general transcription factors), takimi jak: TBP, TAFs, TFIIB, z czynnikami transkrypcyjnymi sekwencjoswoistymi (GATA-1, NFκB/p65, AP-1/ Fos/Jun), z czynnikami przebudowującymi chromatynę (HMG1) oraz w kontakcie z koregulatorami transkrypcji: koaktywatorami lub korepresorami, zarówno dla receptorów zależnych od liganda, jak i dla tych od niego niezależnych [5]. Obecnie znanych jest już wiele koregulatorów receptorów steroidów płciowych, z których jednym z najlepiej poznanych jest białko SRC-1 (steroid receptor Co-activator-1) [71], będące koaktywatorem transkrypcji, który wiąże się zarówno z receptorami PR, jak i ERα w domenie AF-2, wzmacniając ich hormonozależną aktywność transkrypcyjną. Receptory klasy II z grupy receptorów kwasu retinowego RAR/RXR (heterodimery z receptorem retinoidów), które działają wyciszająco na transkrypcję genów docelowych w postaci niezwiązanej z ligandem, wyciszające działanie zawdzięczają aktywności korepresorów N-CoR (nuclear receptor Co-repressor) i  SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptors) (ryc. 2). Represory te łączą się z heterodimerami receptorów RAR/RXR związanych z DNA tylko pod nieobecność hormonów [17]. Należy zatem podkreślić, że aktywność transkrypcyjna receptorów steroidów płciowych jest wypadkową ich współdziałania z wieloma białkami zaangażowanymi w procesy transkrypcji materiału genetycznego, a także różnych sygnałów docierających do jądra komórkowego. Przedstawione wyżej podstawowe informacje dotyczące receptorów steroidów płciowych pozwalają dokładniej prześledzić drogę ich genomowego działania począwszy od wniknięcia do komórki.

Klasyczne, genomowe działanie steroidów płciowych

Uważa się, że lipofilne steroidy płciowe, transportowane we krwi głównie w postaci związanej z białkami (estradiol z SHBG i albuminami, progesteron z transkortyną), a tylko w około 5% krążących w postaci niezwiązanej, przenikają przez ściany naczyń krwionośnych i wnikają do komórek docelowych na zasadzie dyfuzji. Jeszcze do niedawna za komórki docelowe hormonów płciowych uważano tylko te znajdujące się w narządach rozrodczych (jajnikach, jądrach i najądrzach, macicy, gruczole sutkowym) [114].

Analizując fenotypy wielu naturalnie występujących mutacji genu aromatazy (enzymu konwertującego testosteron do estradiolu) oraz myszy z nokautem genów receptorów steroidów płciowych, opisano występujące w ich wyniku nieprawidłowości rozwoju wielu tkanek, co pozwoliło znacznie poszerzyć listę komórek docelowych działania steroidów płciowych [40]. Znajdują się na niej komórki m.in. układu krążenia, układu nerwowego, przewodu pokarmowego, układu odpornościowego, skóry, nerek i płuc. W komórkach docelowych muszą występować swoiste receptory tych hormonów, które pod nieobecność sygnału hormonalnego są „zabezpieczone” w postaci związania z heterokompleksami bia- łek opiekuńczych Hsp90 lub Hsp70 (heat-shock proteins), immunofilin (FKBP52 lub FKBP54) oraz białka p23 [98]. Receptory ER i PR są umiejscowione w komórkach zarówno w cytoplazmie jak i w jądrze komórkowym. Należy jednak zaznaczyć, że ich umiejscowienie nie ma charakteru stałego, a jest raczej procesem dynamicznym, wypadkową translokacji z i do jądra komórkowego. Niemniej, pod nieobecność liganda większość receptorów ER i PR znajduje się w jądrze komórkowym, a nie w cytoplazmie, jak receptory innych steroidów, gdyż mają swoiste, ulegające konstytutywnej ekspresji sygnały lokalizacji jądrowej (NLS – nuclear localization signal) znajdujące się w domenie zawiasowej receptora [102]. Hormony płciowe przedostając się do cytoplazmy komórki natrafiają na nieaktywne receptory, które dzięki związaniu z kompleksem białek opiekuńczych wykazują takie sfałdowanie domeny LBD receptora, która utrzymuje konformację o najwyższym powinowactwie do hormonu [80]. Hormon wiążąc się ze swoistym receptorem w domenie LBD (blokowanej dotychczas białkiem Hsp90), powoduje zmianę jego konformacji przestrzennej i w jej wyniku, oddysocjowanie białek opiekuńczych i dimeryzację receptorów, czyniąc taki kompleks aktywnym i zdolnym do translokacji w kierunku jądra komórkowego [79,98]. Mechanizm ten zwiększa też znacząco powinowactwo receptora do DNA, nie tylko przez występujące następnie związanie koaktywatorów, lecz również przez odsłonięcie znajdujących się w rejonie DBD wtórnych sygnałów lokalizacji jądrowej NLS zależnych od liganda [35]. Działanie to jest uznawane za pierwszy element genomowej ścieżki oddziaływania hormonów płciowych [80]. Po translokacji do jądra komórkowego, kompleksy hormon-receptor stymulują ekspresję genów docelowych współdziałając z koaktywatorami i elementami kompleksu inicjacyjnego transkrypcji dla polimerazy II. Mogą działać według dwóch mechanizmów. dwóch mechanizmów. Bezpośrednio, wiążąc się do palindromowych sekwencji DNA o charakterystycznym motywie GRE 5’-GGTACA-nnn-TGTTCT3’ dla progesteronu lub ERE 5’-AGGTCA-nnn-TGA/TCCT3’ dla estradiolu (gdzie n oznacza dowolną zasadę azotową), znajdujących się w bezpośrednim sąsiedztwie genów docelowych lub pośrednio, przez związanie z innymi czynnikami transkrypcyjnymi stabilizując ich połączenie z DNA i rekrutując koaktywatory do powstałego kompleksu [49]. Należy jednak zaznaczyć, że w przypadku tego drugiego mechanizmu, receptor hormonu nie wiąże się z DNA bezpośrednio. Co więcej, większość genów regulowanych przez ER nie ma perfekcyjnych, palindromowych ERE, a mimo to nadal motywy te pozostają funkcjonalne. Przykładami genów bezpośrednio regulowanych przez ER u człowieka są geny pS2, oksytocyny, c-myc, TGF-α, laktoferyny, prolaktyny, receptora progesteronowego PRA, RARα, keratyny 19 czy angiotensyny. Szczególnymi przykładami działania ER, jest niebezpośrednia regulacja według drugiego mechanizmu, m.in. wiązanie się ERα z białkiem Sp1 i transaktywacja genów IGFBP-4, receptora EGF, c-fos, bcl-2, genu receptora LDL, VEGF, cykliny D1, współdziałanie z białkami UDF-1 i USF-2 w rejonie promotora katepsyny D oraz ERα i ERβ z AP-1 regulujące ekspresję m.in. receptora progesteronowego PRB czy IGF-1 [22]. Lista regulowanych genów oraz pełen opis sekwencji ERE i ich modyfikacji znajdują się w publikacjach [49,72].

Warto podkreślić, że jakakolwiek regulacja genów nie jest możliwa bez uprzedniego przygotowania struktury DNA na taki kontakt. Oczywistym jest, że struktura chromatyny, w którą upakowany jest materiał genetyczny, warunkuje dostęp całego aparatu transkrypcyjnego do sekwencji kodujących genomu. Co więcej, struktura ta jest zasadniczo zaangażowana w regulację ekspresji genów [4]. Na najniższym poziomie organizacji DNA tworzy struktury zwane nukleosomami, składającymi się z histonów owiniętych podwójną nicią DNA. Zasadnym jest więc pytanie, w jaki sposób receptory steroidowe odnajdują i łączą się ze swoistymi motywami w sekwencjach poprzedzających geny docelowe. Wiadomo, że hormony steroidowe mogą się wiązać do regularnie zorganizowanej chromatyny prawdopodobnie ze względu na rotacyjną orientację HRE w nukleosomach [78]. Dane doświadczalne wykazują, że acetylacja histonów ma wpływ na ich luźniejsze związanie z DNA, a biorąc pod uwagę to, że podczas inicjacji transkrypcji są aktywne acetylotransferazy histonów, ich aktywność znosi hamujący wpływ histonów na transkrypcję [100]. Co ciekawe, niektóre z koaktywatorów receptorów steroidowych wykazują aktywność acetylotransferaz histonów, np. koaktywator receptorów steroidowych SRC1 (steroid-receptor coactivator 1) i koaktywator PCAF (p300/CBP-associated factor) (ryc. 2). Nie tylko stabilizują one powstające kompleksy hormon-receptor i de facto także kompleksy preinicjacyjne, lecz wzmacniają także transkrypcję genów docelowych przez reorganizację chromatyny [100]. Podobne działanie przebudowujące chromatynę opisano dla czynnika transkrypcyjnego NF-1, z którym mogą się łączyć receptory progesteronowe [18]. Transkrypcja genów aktywowana przez steroidy płciowe odbywa się według powszechnie znanego mechanizmu z udziałem polimerazy RNA II. Do inicjacji transkrypcji jest wymagane związanie się podstawowych czynników transkrypcyjnych TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH w rejonie promotorowym genu. TFIID składa się m.in. z białka TBP (TATA box inding protein) oraz białek TAFs (TBP-associated factors), z którymi mogą oddziaływać receptory steroidowe [48]. Co więcej, zarówno receptory ERα, jak i PR współdziałają bezpośrednio z TFIIB [42]. Po związaniu do odpowiedniej sekwencji oraz rekrutacji wielu czynników transkrypcyjnych i białek regulujących transkrypcję, w odpowiedzi na działanie steroidów następuje start transkrypcji lub wzrost/spadek jej poziomu. Odpowiedź ta, będąc związaną z regulacją funkcjonowania komórki na poziomie materiału genetycznego, ma charakter długoterminowy i jest nazywana genomowym mechanizmem działania steroidów płciowych.

Mechanizm działania genomowego z wykorzystaniem receptorów błonowych

Mimo iż od dawna ugruntowany jest pogląd, że receptory steroidów występują wewnątrzkomórkowo i przemieszczają się między jądrem komórkowym a cytoplazmą (a proces ten utrzymuje je w stanie dynamicznej równowagi między tymi komórkowymi przedziałami), około 40 lat temu pojawiły się doniesienia o występowaniu puli receptorów estrogenowych związanych z błoną komórkową, odkrytej po raz pierwszy w komórkach endometrium. Później odkryto ich występowanie w komórkach innych tkanek, m.in. w plemnikach, hepatocytach i gruczole sutkowym. W błonach komórkowych zanotowano występowanie obu izoform receptora, także ERβ [15]. Od tego czasu przeprowadzono wiele badań, które miały na celu sprawdzenie, czy receptory te są identyczne w porównaniu do tych ją- drowych, różniąc się jedynie umiejscowieniem [96], czy też stanowią osobną subpopulację [105], lub czy istnieją jakieś strukturalne sygnały decydujące o ich translokacji w kierunku błony komórkowej. Najnowsze badania nad strukturą błonowych receptorów estrogenowych (mERs – membrane estrogen receptors) nadal nie rozstrzygają tej kwestii, wszystko wskazuje jednak, że są to osobne izoformy receptorów ERα (ER46) otrzymane przez alternatywny splicing [25]. Co więcej, przez substytucje aminokwasów [82] oraz modyfikacje potranslacyjne (palmitylację) [1] otrzymują sygnały determinujące ich błonową lokalizację. Wykazano również, że receptory te są umiejscowione w błonach w rejonach bogatych w kaweoliny (białka błonowe znane głównie z udziału w endocytozie), zwłaszcza w komórkach nabłonkowych [119]. Występowanie analogicznych receptorów błonowych progesteronu (mPR) również opisano [120]. Zaskakuje jednak znacznie bogatsza niż w mER liczba wariantów receptorów błonowych progesteronu. Do odkrytych początkowo podtypów receptorów błonowych mPRα, mPRβ, mPRγ, charakteryzujących się u człowieka wysoką ekspresją w narządach rozrodczych, mózgu i nerkach [120], dołączono niedawno kolejne: mPRδ i mPRε [99]. Wiadomo już, że receptor mPRα działa przez aktywację białka G nie należąc jednak do grupy receptorów białka G ze względu na inne pochodzenie ewolucyjne [104]. Niemniej jednak, działanie zarówno mERs, jak i mPRs pozostaje nadal słabo zbadane. Naukowcy skupiają się na opisywaniu szybkiego, niegenomowego działania receptorów błonowych, podczas gdy aspekt ich genomowej sygnalizacji pozostaje niezauważany. A właśnie istnienie pojedynczych doniesień, potwierdzających występowanie translokacji receptorów błonowych do cytoplazmy czy jądra komórkowego skłania do przypuszczeń, że istnieje mechanizm, przez który receptory błonowe mogą regulować ekspresję genów. W przypadku receptora mERα opisano jego translokację z błony komórkowej do jądra komórkowego, zarówno po związaniu z estradiolem, jak i bez, z tą różnicą, że translokację niezwiązaną z ligandem blokowało padanie inhibitorów MAPKs [57]. Co więcej, badania Xu i wsp. wykorzystujące błonowe receptory ER dowiodły translokacji receptorów do jądra komórkowego i aktywacji transkrypcji przez związanie z sekwencjami ERE [115]. Działanie to zaobserwowano tylko po uprzednim związaniu receptorów z estradiolem, a o jego bezpośrednim, genomowym działaniu świadczyło zarówno zahamowanie tego działania po podaniu inhibitora estradiolu, występują- ce także u dominujących negatywnych mutantów ERα, jak i brak hamującego działania po podaniu inhibitorów MAPK i Akt (wykluczających działanie niegenomowe).

Szybki, niegenomowy mechanizm działania

Mechanizm genomowego oddziaływania steroidów płciowych opisany wyżej charakteryzuje się odległym w czasie skutkiem działania. Oznacza to, że pierwsze zmiany ekspresji genów, będące następstwem działania hormonu, zaobserwować można po co najmniej kilku godzinach od ekspozycji. Jak więc należy tłumaczyć działanie steroidów, ujawniające się w ciągu kilku minut od ekspozycji? Jest zbyt szybkie, by być związanym z transkrypcją mRNA i syntezą białek. Jest więc oczywistym, że musi istnieć alternatywny mechanizm, związany z szybką odpowiedzią komórki na sygnalizację hormonami steroidowymi. Pierwsze obserwacje szybkiego działania estradiolu pojawiły się już w późnych latach sześćdziesiątych ub.w. Wskazówki dotyczące nowej drogi działania steroidów płciowych pojawiły się wraz z odkryciem subpopulacji receptorów błonowych mER i w wyniku aktywowanej przez nie produkcji cAMP [22]. Inne badania tylko potwierdziły ich udział w alternatywnym mechanizmie sygnalizacji [56], zwanym później mechanizmem niegenomowym lub niejądrowym (poprawniej natomiast byłoby nazywać go mechanizmem nietranskrypcyjnym, podkreślając w ten sposób, że wiązanie receptorów do DNA i synteza RNA nie są w tym mechanizmie wymagane do osiągnięcia skutku działania) [94]. Należy jednak zaznaczyć, że nadal nie istnieje jednorodny system klasyfikacji mechanizmów niegenomowych, a ich podłoże molekularne w wielu przypadkach pozostaje jeszcze nieznane. Mechanizmy niegenomowe grupują wszystkie opisane działania steroidów płciowych, które nie sposób połączyć z działaniem genomowym, tzn. A) te, dla których skutek działania pojawia się zbyt szybko (w ciągu sekund lub minut); B) ujawniające się w obecności inhibitorów syntezy RNA lub białka; C) występujące po związaniu się steroidu z cząsteczkami trwale związanymi z błoną komórkową; D) indukowane w komórkach o wysokim stopniu upakowania chromatyny, w których brak jest procesów syntezy RNA i białka (np. plemnikach); E) obserwowane po związaniu się steroidów ze zmutowanymi receptorami, niezdolnymi do aktywowania procesów transkrypcji.

Mechanizm tego typu oddziaływań rozpoczyna się z chwilą związania steroidu z receptorem błonowym, zapoczątkowując wewnątrzkomórkową kaskadę sygnalizacyjną, regulującą wiele komórkowych procesów. W ten sposób regulacji mogą podlegać procesy m.in. wzrostu komórek, ich przeżycia, migracji czy tworzenia nowych naczyń krwionośnych, czyli nawet te długoterminowe, których wynik jest związany z regulacją transkrypcji genów (ale pośrednio, dopiero w następstwie aktywacji receptorów błonowych i wewnątrzkomórkowej kaskady sygnalizacyjnej) [13]. Niegenomowy mechanizm działania steroidów płciowych może przebiegać bezpośrednio, kiedy hormon jest jedynym agonistą, bądź pośrednio, jeśli skutek jego działania wymaga obecności innego agonisty. Co więcej, działanie bezpośrednie może być swoiste, kiedy przebiega z udziałem receptorów (tych klasycznych steroidowych i tych nieklasycznych jak wtórne przekaźniki sygnału) lub przebiegać bez udziału receptorów, gdy jest nieswoiste. Jak dotąd jedynym przykładem działania pośredniego jest działanie nieswoiste, aczkolwiek nie wyklucza się istnienia tożsamych mechanizmów, jak w przypadku działania bezpośredniego [23]. Obecnie wiadomo, że steroidowe receptory błonowe są zaangażowane w regulację jonowych kanałów błonowych, receptorów związanych z białkiem G, kinaz tyrozynowych oraz kinaz aktywowanych mitogenami. Wykazano że aktywują wytwarzanie cyklazy adenylanowej oraz powodują aktywację fosfolipazy C.

Aktywacja receptorów związanych z białkiem G i regulacja kanałów jonowych

Jednym z najlepiej poznanych szlaków niegenomowego działania steroidów płciowych jest aktywacja receptorów związanych z białkiem G (GPCRs – G-protein-coupled receptors). Mianem białka G zwykło się określać rodzinę białek zaangażowanych w transdukcję sygnałów pochodzących ze środowiska zewnętrznego komórki, mających aktywność GTPaz. Za ich aktywację odpowiadają zakotwiczone w błonie komórkowej receptory GPCR, których zmiana konformacji przestrzennej wywołana związaniem się do ich podjednostki zewnątrzkomórkowej efektora (w postaci hormonu lub neuroprzekaźnika) powoduje modyfikację białka G. Niedawne odkrycia wskazują, że receptor białka G – GPR30, jest odrębnym receptorem błonowym estradiolu (mER) [85]. Co więcej, wszystko wskazuje na to, że działając przez receptor GPR30 estrogeny regulują szlak sygnałowy czynników wzrostu jednocześnie według dwóch przeciwstawnych mechanizmów [26]. Związanie liganda do GPR30 prowadzi do aktywacji cyklazy adenylanowej i w jej następstwie aktywacji kinazy białkowej A (PKA). Aktywna kinaza PKA hamuje szlak ERK1/2 wzbudzony sygnalizacją płynącą z EGFR. Jednak zarówno estrogeny, jak i ich antagoniści, przez związanie z receptorem GPR30, powodują transaktywację receptora EGFR. Należy zatem podejrzewać, że sygnalizacja estrogenów płynąca z GPR30 przez aktywację i inhibicję szlaku EGFR, w pewnym sensie utrzymuje funkcjonalną równowagę aktywności kinaz ERK 1/2 [26].

Aktywacja białka G wywołuje kaskadę sygnalizacji komórkowej, która może regulować transkrypcję, ruch, kurczliwość lub sekrecję komórki [69]. Udowodniono, że 17β-estradiol może działać na izofomę β fosolipazy C związanej z białkiem G w osteoblastach, powodując mobilizację jonów Ca2+ z siateczki śródplazmatycznej oraz wytwarzanie wtórnych przekaźników informacji, takich jak trifosforan inozytolu (IP3 ) czy diacyloglicerol (DAG). Powoduje to wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca2+ [55]. Badania wykazały również, że estrogeny wpływają na różnicowanie neuronów dopaminergicznych śródmózgowia u myszy zgodnie z mechanizmem niegenomowym. Podanie 17β-estradiolu zwiększało wzrost neurytów, hamowany podaniem antagonistów szlaku cAMP/PKA i Ca2+, ale nie antagonistów estrogenów [6]. Co więcej, odnotowano nagłe uwolnienie zmagazynowanych w zarodkowych neuronach dopaminergicznych jonów Ca2+ w następstwie aktywacji szlaku IP3 przez związanie estradiolu z receptorem błonowym [7]. Mechanizm związany z jonami wapnia występuje tak- że w przypadku działania estradiolu na błonę śluzową macicy. Już jedne z pierwszych badań nad działaniem estradiolu przeprowadzone w latach 70 ub.w. na kulturach komórek endometrium wykazały nagły (poniżej 10 min) napływ do komórki jonów Ca2+ w odpowiedzi na podanie 17β-estradiolu [22]. Natomiast najwcześniejsze obserwacje szybkiego działania progesteronu dotyczą procesu dojrzewania oocytów u płazów. Opisano krótkotrwały przepływ jonów Ca2+ z powierzchni oocytu żaby Rana pipens w ciągu kilku sekund od podania progesteronu, poprzedzający spadek wewnątrzkomórkowego poziomu cAMP i chwilowy wzrost cGMP. Inne badania ujawniły, że progesteron działając przez swój receptor błonowy indukuje szlaki fosfolipidowe drugorzędowych przekaźników informacji powodując wytworzenie DAG (1,2-diacyloglicerolu) i aktywację kaskady PKC (kinazy białkowej C), stanowiących sygnał inicjujący oocyty do podziałów mejotycznych [22,67]. Analogiczne szybkie działanie progesteronu opisano dla plemników. Wykazano, że progesteron jest jednym z bodźców wywołują- cych reakcję akrosomalną. Dzieje się tak, ze względu na zdolność progesteronu do wywołania szybkiego wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca2+, a wzrost jest zależny od dawki hormonu i nie jest blokowany przez podanie swoistego antagonisty wewnątrzkomórkowych receptorów progesteronowych RU-486 [22]. Progesteron reguluje także przepływ innych jonów w plemnikach, m.in. Na+ i Cl- oraz bierze udział w analogicznych jak w oocytach szlakach wtórnych przekaźników sygnałów prowadzących do wytworzenia DAG i IP3 i w konsekwencji aktywacji fosfolipazy C oraz prawdopodobnie fosfolipazy A2 w plemnikach po kapacytacji [22]. Niedawno opisano także udział zależnej od cAMP kinazy białkowej A w aktywowanej progesteronem reakcji akrosomalnej [36] oraz stymulację fosforylacji tyrozyny [61]. Szybką odpowiedź w dojrzałych ludzkich oocytach i komórkach warstwy ziarnistej w postaci napływu jonów Ca2+ odnotowano także dla estradiolu [66,103]. Nie wpływa on wprawdzie na przejście oocytu przez fazy dojrzewania mejotycznego, ale zdaje się zwiększać możliwość zapłodnienia dojrzałych oocytów [103]. W przypadku plemników 17β-estradiol powoduje wzrost ich ruchliwości, poboru tlenu, wytwarzaniu mleczanów oraz metabolizmu kilku innych substratów, zwiększając zdolność plemników do penetracji oocytu [22]. Należy jednak zaznaczyć, że wiązanie się 17β-estradiolu do receptorów błonowych ulegało osłabieniu w obecności progestagenów [22]. Powszechnie wiadomo, że steroidy płciowe wykazują działanie wazodylatacyjne, opierające się na regulacji stężenia jonów Ca2+ w komórkach śródbłonka naczyniowego i mięśni gładkich. W komórkach warstwy mięśniowej gładkiej naczyń krwionośnych estradiol hamuje działanie kanałów Ca2+ typu L bramkowanych zmianą potencjału [68], reguluje też błonowy przepływ jonów K+ przez otwieranie kanałów BK (big potassium channels, zwanych też Maxi-K+ ) zależnych od zmian potencjału błonowego i wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca2+, przez fosforylację zależną od cGMP [113] oraz bezpośrednie wiązanie się do podjednostki β kana- łu [106]. Podobny szybki mechanizm działania wykazuje progesteron w osteoblastach, powodując gromadzenie się w komórce jonów Ca2+ wywołane otwieraniem się kanałów Ca2+ typu L oraz mobilizację rezerw tych jonów z siateczki śródplazmatycznej [34]. Napływ jonów wapnia opisano także w komórkach dwunastnicy przez aktywację szlaku PLC po podaniu estradiolu [75]. Podsumowując, modulacja błonowych receptorów związanych z białkiem G oraz kanałów jonowych może tłumaczyć wiele z zaobserwowanych szybkich skutków działania steroidów płciowych na komórki, włączając kaskadę sygnalizacyjną PLC/DAG/IP3 , wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ i aktywację kinazy białkowej C (PKC) oraz aktywację szlaku cyklazy adenylanowej/kinazy białkowej A [47].

Aktywacja szlaków kinaz białkowych

Działanie steroidów płciowych, przebiegające według szybkiego, niegenomowego mechanizmu jest związane z aktywnością kilku głównych ścieżek sygnalizacyjnych w komórce, odpowiadających za integrację i przekazywanie sygnałów zewnątrzkomórkowych (ryc. 3). Do ścieżek takich należą kaskady kinaz aktywowanych mitogenami (MAPK – mitogen-activated protein kinases), kinaz tyrozynowych i lipidowych. Związane są zazwyczaj z odbiorem sygnalizacji pochodzącej od różnych czynników wzrostu, a ich aktywacja w komórce reguluje główne procesy, takie jak ekspresja genów, proliferacja i przetrwanie.

Szlak MAPK i kinaz tyrozynowych

Kinazy MAP są grupą kinaz białkowych serynowo-treoninowych, odpowiadających głównie na wiele zewnątrzkomórkowych sygnałów wzrostu i czynników o charakterze stresowym i prozapalnym [16]. Aktywację szlaków kinaz MAP przez steroidy płciowe opisano już dla kilku tkanek i zgrupować je można w trzy klasyczne kaskady sygnalizacyjne: ERK 1/2 (extracellular-signal-regulated kinases 1/2), kinaz p38 (p38 mitogen-activated protein kinases) oraz JNKs (c-Jun N-terminal kinases) [74]. Należy jednak zaznaczyć, że charakter oddziaływań między steroidami płciowymi a szlakiem MAPK jest złożony, ze względu na istnienie kilku poziomów ich wzajemnej regulacji [112]. Po pierwsze, aktywny kompleks kinaz MAP ma zdolność niezależnej od liganda aktywacji receptorów steroidowych, nie jest natomiast jeszcze wiadomo czy wszystkich rodzajów. Na pewno jednak fosforylacja receptora ER przez kinazy MAP odgrywa znaczącą rolę w jego aktywacji niezależnej od liganda [46]. Po drugie, to właśnie ekspozycja na estrogeny powoduje aktywację kinaz ERK 1/2 szlaku MAPK, opisaną w różnych typach komórek. Estradiol ma zdolność aktywacji MAPK wykazaną w komórkach nerwowych [110] (gdzie prowadzi do ekspresji genu białka c-Fos), w komórkach śródbłonka [50,90], osteoblastach [20] i adipocytach [32]. O mechanizmie aktywacji mogą świadczyć pośrednio właśnie badania na tych ostatnich. W adipocytach bowiem stwierdzono obniżenie skutku aktywacji MAPK przez estradiol po podaniu toksyny krztuśca, której działanie jest związane z blokowaniem wiązania się białka G do receptorów GPCR i hamowanie szlaku sygnałowego związanego z tymi receptorami. Podobny wynik uzyskano po podaniu fosfatazy białkowej 2 (PP2 – protein phosphatase 2, której substratami są m.in. białka Raf, MEK, Akt) oraz wortmanniny (swoistego inhibitora kinaz P13, mTOR czy MAPK) [32]. Dane te wskazują, że w mechanizmie aktywacji MAPK przez estradiol równolegle biorą udział szlaki związane z białkiemG/kinazami z rodziny Src/oraz PI3K/Akt (ryc. 3) [94]. Istnieją badania dowodzące, że estradiol aktywuje właśnie szlaki Src/Ras/ ERK [64] oraz PI3K/Akt [95]. To właśnie za pośrednictwem szlaku Src-PI3K-Akt-eNOS komórki śródbłonka w odpowiedzi na stymulację estradiolem uwalniają tlenek azotu (NO). W szlaku tym sygnał jest przekazywany od receptora błonowego mER do kinazy PI3K przez aktywację białka G i kompleks kinaz Src. W ten sposób uruchomiona kaskada kinaz aktywuje kinazę Akt (PKB), która ostatecznie aktywuje syntazę tlenku azotu eNOS i uwolnienie NO [37]. Jakie jest zatem znaczenie tych szlaków i przekazywanej za ich pośrednictwem informacji przez steroidy płciowe? Odpowiedź na to pytanie zdaje się wynikać z samej funkcji pełnionej w komórce przez kinazę tyrozynową Src. Gen SRC, kodujący to białko jest zaliczany do protoonkogenów, bierze więc udział w regulacji podstawowych dla komórki procesów: proliferacji, adhezji, poruszania się i inwazji. Nie dziwi więc, że wzrost jej aktywności spowodowany mutacjami lub sygnałami indukowanymi przez czynniki wzrostu, jest obserwowany w różnych rodzajach nowotworów [116]. Zatem sygnalizacja hormonami płciowymi, aktywująca szlak Src/Ras/ERK będzie miała charakter stymulacji proliferacji komórki (ryc. 3) [13,63]. W przypadku estradiolu, aktywacja będzie się odbywała bezpośrednio przez oddziaływanie ER z kinazą c-Src, natomiast progesteronu przebiegała przez asocjację receptora PRB do ER (czyli tzw. „cross talk”) i wzbudzenie ścieżki aktywowanej przez ER [65]. Aktywacja przez hormony płciowe szlaku PI3K/Akt (uczestniczącego w przekazywaniu komórce sygnałów mitogennych i promujących przetrwanie), odbywająca się za pośrednictwem kinazy Akt (PKB) oraz regulacji ekspresji cykliny D1, będzie miała charakter stymulacji jej wzrostu [63]. Udowodniono, że niedobór estradiolu powoduje rozwinięcie się nadwrażliwości na mitogenne działanie E2 w komórkach raka gruczołu sutkowego właśnie przez wzrost aktywności MAPK [117]. Znacznie mniej wiadomo na temat udziału steroidów płciowych w aktywacji drugiej kaskady MAPK związanej z białkiem p38.

Istnieją doniesienia, że w komórkach śródbłonka naczyniowego estradiol ochronne działanie wykazuje właśnie przez aktywację białka p38 i indukcję kinaz MAPK oraz fosforylację HSP27 (heat shock protein 27) [83]. Estradiol w warunkach stresu metabolicznego zapobiega tworzeniu się włókien stresowych (EC stress fiber formation) oraz pomaga utrzymać integrację aktyny i błon w komórkach. Estradiol zapobiega apoptozie wywołanej hipoksją, stymuluje migrację komórek śródbłonka oraz wytworzenie prymitywnych przewodów kapilarnych. Przeciwną natomiast regulację szlaku p38 wykazuje estradiol w komórkach Kupffera. Niedawne doniesienia dowodzą, że przez negatywną regulację poziomu receptorów TLR4 (Toll-like receptor 4) estradiol hamuje szlak p38 oraz NF-κB, ograniczając w ten sposób uwalnianie cytokin prozapalnych [41]. Mechanizm ograniczenia ekspresji TLR4 nie jest jednak znany. Najnowsze badania przeprowadzone na komórkach nabłonka rogówki dowodzą, że 17β-estradiol wykazuje działanie przeciwzapalne, ograniczając uwalnianie cytokin prozapalnych IL-6, IL-1 oraz TNF-α przez hamowanie szlaku p38 [109]. Wskazuje to jedynie, że molekularny mechanizm działania estradiolu przez szlaki wewnątrzkomórkowych przekaźników informacji może być swoisty tkankowo i różnić się znacznie w zależności od funkcjonalnego profilu i aktywności życiowych komórek.

Zaangażowanie estradiolu w  trzecią kaskadę ścieżki MAPK, szlak kinaz JNKs (c-Jun N-terminal kinases) zostało dowiedzione na linii mysich monocytów RAW 264.7 (wykazujących ekspresję receptorów ER). Wykazano, że estradiol obniża aktywowaną cytokinami ekspresję czynnika martwicy nowotworów TNF (tumor necrosis factor) przez hamowanie aktywności kinazy JNK [101]. W wyniku tego działania nie dochodzi do aktywacji czynników c-Jun i JunD, ich kumulacji w jądrze komórkowym i wiązania z sekwencją AP-1 promotora genu TNF-α, czyli jego transaktywacji. Mechanizm ten odgrywa główną rolę w ochronie kości przed wywołanym uwalnianym z makrofagów czynnikiem TNF-α, pobudzeniem formowania osteoklastów i w następstwie resorpcją kości. Niemniej, wpływ estradiolu na szlak kinaz JNK może mieć też negatywny kontekst, jak w przypadku hamowania wywołanej przez chemioterapię i promieniowanie UV apoptozy komórek raka gruczołu sutkowego. Wykazano, że estradiol blokował działanie kinaz JNK aktywowanych paklitakselem lub promieniowaniem UV, powodując zahamowanie fosforylacji czynników Bcl-2 i Bcl-xl, nie dopuszczając do aktywacji kaspaz i indukcji apoptozy [84].

Aktywacja ścieżki błonowej związanej z szybkim, niegenomowym mechanizmem działania steroidów płciowych może również prowadzić do regulacji transkrypcji, ale ważnym jest, że sygnalizacja pochodząca z receptorów błonowych reguluje także aktywność czynników transkrypcyjnych niezwiązanych z regulacją klasycznymi ER. Powiększa się zatem zakres genów regulowanych hormonami płciowymi, a  aktywacja cytoplazmatycznych szlaków sygnałowych stanowi, oprócz drogi szybkiego działania w komórce, alternatywny mechanizm regulacji ekspresji genów. Jak dotąd opisano już kilka czynników transkrypcyjnych aktywowanych sygnalizacją mER, z których najczęściej badanym był CREB (cAMP response element-binding). Jego aktywację wykazano w komórkach hipokampa [108], adipocytach [32], komórkach raka jelita grubego [39] oraz nerwiaka płodowego [111]. Czynnik CREB aktywuje m.in. ekspresję c-Fos, podobnie jak inne opisane dla sygnalizacji błonowej estradiolu czynniki SRF (serum response factor) czy ELK1 [39]. Oprócz regulacji czynnika AP1 (opisanej wcześniej) [10], estradiol ma zdolność regulacji kilku czynników transkrypcyjnych z rodziny STAT (signal transducers and activators of transcription), to jest: Stat1, Stat3 i Stat5 [9]. W przypadku progesteronu, analogiczną aktywację transkrypcji indukowaną szlakiem błonowym opisano dla czynnika transkrypcyjnego c-Ets-2 (promującego progresję cyklu komórkowego z fazy G1 ) regulującego ekspresję m.in. cykliny D1 [2]. Należy jednak podkreślić, że regulacja ekspresji genów indukowana aktywacją szlaków cytoplazmatycznych przez progesteron, jest w równym stopniu związana z transkrypcją swoistych genów regulowanych przez receptory progesteronowe [92], co tych z nimi niezwiązanych, aktywowanych w następstwie uruchomionych przez PR ścieżek MAPK [54]. Aktywowana przez progesteron kaskada kinaz MAPK jest ściśle związana z transaktywacją EGFR (epidermal growth factor receptor) i c-Src [21]. Wykazano również, że progesteron powoduje fosforylację i translokację czynników Stat5 [86] i Stat3 [81]. Biorąc pod uwagę, że progesteron przez aktywację szlaku Akt/c-Src oraz drogi kinaz MAPK wzmacnia i aktywuje sygnalizację związaną z EGFR (indukującą proliferację komórki), jakiekolwiek deregulacje tego szlaku są krytyczne w skutkach, przyczyniając się do niekontrolowanej proliferacji i rozwoju komórek nowotworowych [53,81].

Integracja szlaków sygnałowych różnych hormonów

Biorąc pod uwagę, że między sygnalizacją pochodzą- cą z  błony komórkowej oraz szlakami sygnałowymi 17β-estradiolu i progesteronu zgrupowanymi razem pod pojęciem mechanizmów niegenomowych, występuje duża zbieżność nie tylko dla omawianych hormonów płciowych, ale dla hormonów steroidowych ogólnie, można przypuszczać, że szlaki te są w komórce funkcjonalnie powiązane (ryc. 3). Zhang i Trudeau zebrali istniejące doniesienia na temat współdziałania szlaków sygnałowych estradiolu i innych hormonów i podzielili je według trzech typów współdziałania [118]. W pierwszym, związanym z androgenami, 5α-dihydrotestosteronem (DHT), przedstawili przypadek gdy dwa hormony regulują te same czynniki transkrypcyjne tą samą ścieżką sygnałową. Chodzi o czynniki Elk-1 (ETS-like transcription factor 1), C/ EBPβ (CCAAT enhancer binding protein-beta), CREB oraz c-Jun/c-Fos, które są aktywowane przez szlak Src/Shc/ ERK zarówno przez estradiol, jak i dihydroksytestosteron [52]. Opisano je w osteoblastach, osteocytach, fibroblastach zarodkowych i komórkach HeLa [51]. W drugim typie połączyli przypadki regulowania ścieżki działania jądrowych ER przez sygnalizację błonową wywołaną działaniem hormonów tarczycy (TH) – T3i T4. Dinda i wsp. wykazali, że hormony te działają w ten sam sposób co estrogeny w komórkach raka gruczołu sutkowego, indukując proliferację komórek przez regulację stężenia białka p53 i hiperfosforylację czynnika transkrypcyjnego pRb [19]. Działanie to jest hamowane przez inhibitory ER, co wskazuje na udział tych receptorów w wymienionym procesie. Natomiast podanie hormonów tarczycy związanych z agarozą, niezdolnych do przekroczenia błony komórkowej, nie zakłóciło fosforylacji receptora ERα, co wskazuje, że w szlaku tym uczestniczą receptory mTR (membrane tyroid receptor) związane z błoną komórkową [19]. Jak zauważają autorzy, szlak ten bardzo przypomina indukcję sygnałów wewnątrzkomórkowych przez EGF (epidermal growth factor – czynnik wzrostu nabłonka) i IGF (insulin- -like growth factor – insulinopodobny czynnik wzrostu) [12,97]. Sygnalizacja pochodząca z EGF, oprócz bezpośredniego aktywowania nER może także wywoływać je pośrednio, przez aktywację koaktywatora nER – białka AIB1 (amplified in breast 1), zwanego także NCOA3 (nuclear receptor coactivator 3) [73]. W trzecim typie opisali regulację poziomu nER pośrednią i negatywną, bo w odpowiedzi na aktywację szlaku gonadoliberyny (GnRH) w mysich komórkach LbT2 ekspresji ulega enzym Ubc4 (ubiquitin-conjugating Enzyme 4), który powoduje ubikwitynację receptorów nER i w następstwie ich degradację w proteasomach [58].

Niegenomowa sygnalizacja steroidów płciowych – znaczenie

Niegenomowy szlak sygnałowy steroidów płciowych nadal zawiera wiele niewiadomych, co zgodnie podkreślają naukowcy zajmujący się tym zagadnieniem. Nie chodzi tu tylko o zrozumienie pełnego mechanizmu, za pośrednictwem którego ta sygnalizacja się odbywa, ale także lub przede wszystkim o ustalenie czy istnieją szczególne sytuacje in vivo w stanach fizjologicznych lub patologicznych, w których odgrywa on znaczącą rolę. Należy przypuszczać, że poszczególne tkanki są wrażliwe na miejscowe lub ogólnoustrojowe oscylacje stężenia steroidów płciowych, a wrażliwość ta przejawia się w gotowości do wzbudzenia szybkiej odpowiedzi w postaci aktywacji wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, czyli mechanizmu niegenomowego. Jest bardzo prawdopodobne, że jakiekolwiek dysfunkcje złożonego systemu regulacji stężenia hormonów płciowych i związane z nimi stany patologiczne, mogą powstawać właśnie z udziałem sygnalizacji niegenomowej [94]. Nadal jednak brakuje badań, które by to jednoznacznie rozstrzygały. Dobrym modelem badawczym, wykorzystywanym w badaniach niegenomowego działania steroidów płciowych są zwierzęta mające punktowe mutacje w genie jednego z receptorów steroidowych, które uniemożliwiają wiązanie się aktywnego receptora steroidowego do DNA. Mutacje te zatem odpowiadają za utratę funkcji transkrypcyjnych receptora nie powodując jednak całkowitej utraty ich aktywności. Badania z użyciem tego modelu są szczególnie ciekawe, biorąc pod uwagę możliwość porównania fenotypów zwierząt z utratą funkcji transkrypcyjnych receptora, do tych z jego nokautem. Badania przeprowadzone przez Jakacką i wsp. na myszach z mutacją punktową receptora ERα w domenie odpowiedzialnej za wiązanie z DNA wykazały, że heterozygotyczne samice były bezpłodne z poważnymi zaburzeniami strukturalnymi i funkcjonalnymi jajników, podczas gdy badania nad myszami z nokautem ER dowodzą, że wystarczy jedna prawidłowa kopia genu ER, aby zachować niemal prawidłową aktywność funkcjonalną receptorów [43]. Należy zatem przypuszczać, że do prawidłowego wzrostu i osiągnięcia aktywności funkcjonalnej komórek zależnych od sygnalizacji steroidami płciowymi niezbędne jest współdziałanie zarówno genomowych, jak i niegenomowych szlaków. Należy również zaznaczyć, że odkrycie i zrozumienie mechanizmów niegenomowego działania steroidów płciowych stworzyło nowe możliwości farmakologicznego regulowania ich aktywności w terapii przeciwnowotworowej, a także pozwoliło wytłumaczyć wiele przypadków braku odpowiedzi na leczenie inhibitorami receptorów.

Rozważając znaczenie obu mechanizmów działania steroidów płciowych oraz ich wzajemne powiązanie uprawnionym jest założenie, że genomowa sygnalizacja pozwala na działanie długotrwałe, dotyczące programowania komórki na właściwe jej zadania i funkcje przez wysublimowaną regulację na poziomie genetycznym. Natomiast sygnalizacja niegenomowa jest mechanizmem, za pośrednictwem którego steroidy płciowe wzbudzają w komórce aktywność niezbędną w adaptacji do dynamicznie zmieniającego się środowiska [94]. Należy jednak zaznaczyć, że w przypadku działania szybkiego, steroidy uruchamiają w komórce narzędzia, które już istnieją i funkcjonują, gotowe do szybkiej odpowiedzi na sygnalizację płynącą z błony komórkowej, natomiast wynik takiej sygnalizacji może być długoterminowy, właśnie ze względu na istnienie wzajemnych funkcjonalnych powiązań między obiema drogami działania.

Oporność na działanie estrogenów i ich antagonistów w powiązaniu z sygnalizacją czynników wzrostu

17β-estradiol działa pobudzająco na proliferację komórek i prawdopodobnie aktywuje niektóre onkogeny, co może sprzyjać rozwojowi oraz progresji chorób nowotworowych, przede wszystkim raka gruczołu sutkowego, jajników oraz błony śluzowej trzonu macicy. Proliferację wywołaną działaniem estradiolu można jednak zahamować w komórkach nowotworowych wykazujących ekspresję ER, przez podawanie swoistych inhibitorów aromatazy (blokowanie powstawania estradiolu) lub inhibitorów receptora estrogenowego (np. tamoxifenu). Szacuje się jednak, że nawet 50% pacjentów z nowotworami ER-dodatnimi od początku nie reaguje lub szybko staje się oporna na działanie tych leków [24,59,87]. W wielu przypadkach opisywana oporność jest związana z nadekspresją bądź nadmierną aktywacją białek zaangażowanych w szlaki sygnałowe czynników wzrostu i estradiolu, np. HER2, IGF-1R (członków rodziny receptorów EGFR) oraz białka c-Src [33,87]. Wykazano, że nadekspresja białka Cas (wiążącego c-Src) w komórkach nowotworowych zmniejsza ich przeżywalność i oporność na tamoxifen [107]. Badania na modelu oporności na tamoxifen, ujawniającej się w postaci zwiększonej liczby receptorów ERα umiejscowionych w cytoplazmie/błonie komórkowej oraz zwiększonej sygnalizacji cytoplazmatycznej, dowodzą, że zablokowanie kinazy c-Src przywracało hamujące działanie tamoxifenu na wzrost komórek nowotworowych oraz spadek ekspresji receptorów [24]. Aktywowany EGFR przez białka Grb2 i Sos oraz kaskadę Ras/ Raf/MEK uaktywnia kinazy MAPK, a przez to fosforylację czynników transkrypcyjnych promujących proliferację, działa więc w podobny sposób jak estrogeny przez mER (ryc. 3) [24]. Podobnie jak w przypadku szlaku E2/mER może działać przez aktywację PI3K, Akt oraz aktywować czynnik STAT5 [93]. Koekspresja c-Src i EGFR powoduje nową fosforylację w domenie katalitycznej EGFR, która wprawdzie nie wpływa na aktywność katalityczną receptora, ale znacznie zwiększa proliferację, transformację oraz tworzenie zmiany nowotworowej w warunkach in vivo [8]. Można zatem przypuszczać, że podłoże oporności na inhibitory ER jest związane ze zwiększoną aktywnością układu GFR-c-Src oraz ER-c-Src. Można również zakładać, że proliferacyjne szlaki sygnałowe mER i EGFR mają wspólne ogniwa, które nie ograniczają się tylko do ścieżek MAPK i Akt oraz czynników transkrypcyjnych z rodziny STAT [29]. Należy przyjąć, że proliferacyjne działanie estradiolu na komórki raka gruczołu sutkowego nie ogranicza się do sygnalizacji związanej z jego receptorami, ale występuje w związku z aktywnością wielu białek adaptorowych i czynników wzrostu. Aktywność i poziom tych cząsteczek często determinuje losy komórki i jej wrażliwość na leczenie przeciwnowotworowe. Zatem zrozumienie i odkrycie nowych mechanizmów wiążących sygnalizację estrogenów z innymi szlakami sygnałowymi w komórce może mieć przełomową rolę w ustalaniu skuteczniejszego leczenia nowotworów hormonozależnych.

Działanie steroidów płciowych niezależne od receptorów

Oprócz klasycznego działania steroidów płciowych za po- średnictwem swoistych receptorów, indukcja sygnałów pochodzących od steroidów płciowych może się odbywać niejako pośrednio, gdy nośnikiem tej informacji nie jest swoisty receptor hormonu. Taki mechanizm opisano dla 17β-estradiolu (oraz androgenów), transportowanych we krwi wraz z cząsteczkami globuliny wiążącej hormony płciowe (SHBG). SHBG jest glikoproteiną osoczową, mają- cą duże powinowactwo do steroidów płciowych, regulującą ich biodostępność oraz wychwyt przez komórki docelowe. Jej wytwarzanie w wątrobie jest regulowane przez steroidy płciowe (estradiol pobudza, a testosteron je hamuje), wzrastając podczas przyjmowania antykoncepcji doustnej oraz osiągając niemal dziesięciokrotny wzrost w przebiegu ciąży [88]. Jednak szczególnie ważnym działaniem w omawianych mechanizmach działania steroidów płciowych jest jej zdolność do przekazywania komórce sygnału hormonalnego oraz modulacji szlaków sygnałowych estrogenu. W błonach komórkowych znajduje się swoisty receptor dla SHBG – RSHBG, będący częścią szlaku transdukcji sygnału związanego z kaskadą cyklazy adenylanowej i cAMP. SHBG może się wiązać ze swoim receptorem w błonie komórkowej tylko w postaci niezwiązanej z hormonem. Po związaniu z receptorem ma nadal równie duże powinowactwo do hormonu jak w postaci wolnej w osoczu [48]. W odróżnieniu od innych błonowych receptorów białek, RSHBG do aktywacji i inicjacji sygnału wymaga nie tylko związania z SHBG, lecz również rekrutacji hormonu steroidowego do powstałego kompleksu SHBG-RSHBG [89]. Związanie się estradiolu do kompleksu SHBG-RSHBG uaktywnia cyklazę adenylanową i wytwarzanie cAMP. Badania przeprowadzone na modelach nowotworowych udowodniły, że aktywacja receptora RSHBG hamowała proliferacyjne [27] i antyapoptotyczne [14] działanie estradiolu na komórki raka gruczołu sutkowego linii MCF-7. [27] Skutek ten, zapoczątkowany wzrostem wewnątrzkomórkowego stężenia cAMP i aktywacją kinazy białkowej A (PKA), osiągany był prawdopodobnie przez hamowanie szlaku MAPK zamiast kinazy MAP [28]. Jak przytacza autor, istnieją badania wskazujące, że aktywacja szlaku SHBG przeciwdziała wywołanej estradiolem aktywacji kinazy ERK (jednej z dróg szlaku MAPK kontrolującej proliferację komórki) [14] oraz że aktywacja kinazy ERK jest hamowana zarówno przez cAMP, jak i PKA [45], prowadząc do spadku ekspresji ERα [46]. Trzeba jednak pamiętać, że mechanizm ten opisano dla modelu nowotworowego, a więc na tej podstawie trudno ocenić, czy i w jaki sposób występuje on w warunkach fizjologicznych.

Podsumowanie

Steroidy płciowe są zaangażowane w regulację wielu podstawowych dla życia procesów w organizmie. Począwszy od poczęcia, rozwoju płodowego, przez pokwitanie i okres dojrzałości płciowej, a kończąc na starzeniu organizmu, są jednymi z głównych czynników regulujących podstawowe fizjologiczne aktywności zarówno na poziomie tkanek, jak i pojedynczych komórek. To właśnie poznanie mechanizmów działania steroidów płciowych na poziomie molekularnym ujawniło istnienie sieci ich wielopłaszczyznowych odziaływań w komórce, za pośrednictwem których wywierają one właściwe działanie fizjologiczne. Przyjmując, że działanie 17β-estradiolu i progesteronu jest swoiste tkankowo, skutki ich działania będą zależeć w równej mierze od genetycznego ukierunkowania komórki, jak i stanu czynnościowego, w którym ona się znajduje. Zawsze jednak będzie to również wypadkowa sygnalizacji płynącej z otaczającej tkanki i całego ustroju. Zrozumienie złożoności tego zagadnienia, może stworzyć szansę na opracowanie skuteczniejszej terapii przeciwnowotworowej. Odkrycie i opisanie działania niegenomowego steroidów pozwoliło zrozumieć wiele mechanizmów oporności na leczenie oraz stworzyło szansę na farmaceutyczną ingerencję w wiele nowych, komórkowych szlaków. Jest oczywistym, że jeszcze wiele aspektów działania steroidów płciowych pozostaje nieznanych i wymaga dalszych badań. Opisanie interakcji między poszczególnymi szlakami sygnałowymi steroidów oraz ich powiązania z sygnalizacją indukowaną przez czynniki wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe uzmysławia, jak wiele aspektów działania steroidów płciowych wymaga jeszcze dokładnego zbadania.

Przypisy

• 1. Acconcia F., Ascenzi P., Bocedi A., Spisni E., Tomasi V., TrentalanceA., Visca P., Marino M.: Palmitoylation-dependent estrogen receptorα membrane localization: regulation by 17β-estradiol. Mol. Biol.Cell., 2005; 16: 231-237
  Google Scholar
• 2. Albanese C., Johnson J., Watanabe G., Eklund N., Vu D., Arnold A.,Pestell R.G.: Transforming p21ras mutants and c-Ets-2 activate thecyclin D1 promoter through distinguishable regions. J. Biol. Chem.,1995; 270: 23589-23597
  Google Scholar
• 3. Ascenzi P., Bocedi A., Marino M.: Structure-function relationshipof estrogen receptor α and β: impact on human health. Mol. AspectsMed., 2006; 27: 299-402
  Google Scholar
• 4. Beato M., Eisfeld K.: Transcription factor access to chromatin.Nucleic Acids Res., 1997; 25: 3559-3563
  Google Scholar
• 5. Beato M., Klug J.: Steroid hormone receptors: an update. Hum.Reprod. Update, 2000; 6: 225-236
  Google Scholar
• 6. Beyer C., Karolczak M.: Estrogenic stimulation of neurite growthin midbrain dopaminergic neurons depends on cAMP/protein kinaseA signalling. J. Neurosci. Res., 2000; 59: 107-116
  Google Scholar
• 7. Beyer C., Raab H.: Nongenomic effects of oestrogen: Embryonicmouse midbrain neurones respond with a rapid release of calciumfrom intracellular stores. Eur. J. Neurosci., 1998; 10: 255-262
  Google Scholar
• 8. Biscardi J.S., Maa M.C., Tice D.A., Cox M.E., Leu T.H., Parsons S.J.:c-Src-mediated phosphorylation of the epidermal growth factorreceptor on Tyr845 and Tyr1101 is associated with modulation ofreceptor function. J. Biol. Chem., 1999; 274: 8335-8343
  Google Scholar
• 9. Bjornstrom L., Sjoberg M.: Signal transducers and activators oftranscription as downstream targets of nongenomic estrogen receptoractions. Mol. Endocrinol., 2002; 16: 2202-2214
  Google Scholar
• 10. Bjornstrom L., Sjoberg M.: Estrogen receptor-dependent activationof AP-1 via non-genomic signalling. Nucl. Recept., 2004; 2: 3
  Google Scholar
• 11. Brosens J.J., Tullet J., Varshochi R., Lam E.W.: Steroid receptoraction. Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol., 2004; 18: 265-283
  Google Scholar
• 12. Bunone G., Briand P.A., Miksicek R.J., Picard D.: Activation ofthe unliganded estrogen receptor by EGF involves the MAP kinasepathway and direct phosphorylation. EMBO J., 1996; 15: 2174-2183
  Google Scholar
• 13. Castoria G., Barone M. V., Di Domenico M., Bilancio A., AmetranoD., Migliaccio A., Auricchio F.: Non-transcriptional actionof estrogen and progestin triggers DNA synthesis. EMBO J., 1999;18: 2500-2510
  Google Scholar
• 14. Catalano M.G., Frairia R., Boccuzzi G., Fortunati N.: Sex hormonebindingglobulin antagonizes the antiapoptotic effect of estradiol inbreast cancer cells. Mol. Cell. Endocrinol., 2005; 230: 31-37
  Google Scholar
• 15. Chambliss K.L., Yuhanna I.S., Anderson R.G., Mendelsohn M.E.,Shaul P.W.: ERβ has non-genomic action in caveolae. Mol. Endocrinol.,2002; 16: 938-946
  Google Scholar
• 16. Chang L., Karin M.: Mammalian MAP kinase signalling cascades.Nature, 2001; 410: 37-40
  Google Scholar
• 17. Chen J.D., Evans R.M.: A transcriptional co-repressor that interactswith nuclear hormone receptors. Nature, 1995; 377: 454-457
  Google Scholar
• 18. Di Croce L., Koop R., Venditti P., Westphal H.M., Nightingale K.P.,Corona D.F., Becker P.B., Beato M.: Two-step synergism between theprogesterone receptor and the DNA-binding domain of nuclear factor 1 on MMTV minichromosomes. Mol. Cell, 1999; 4: 45-54
  Google Scholar
• 19. Dinda S., Sanchez A., Moudgil V.: Estrogen-like effects of thyroidhormone on the regulation of tumor suppressor proteins, p53 andretinoblastoma, in breast cancer cells. Oncogene, 2002; 21: 761-768
  Google Scholar
• 20. Endoh H., Sasaki H., Maruyama K., Takeyama K., Waga I., ShimizuT., Kato S., Kawashima H.: Rapid activation of MAP kinase by estrogenin the bone cell line. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997;235: 99-102
  Google Scholar
• 21. Faivre E.J., Lange C.A.: Progesterone receptors upregulate Wnt- 1 to induce epidermal growth factor receptor transactivation andc-Src-dependent sustained activation of Erk1/2 mitogen-activatedprotein kinase in breast cancer cells. Mol. Cell. Biol., 2007; 27: 466-480
  Google Scholar
• 22. Falkenstein E., Norman A.W., Wehling M.: Mannheim classificationof nongenomically initiated (rapid) steroid action(s). J. Clin.Endocrinol. Metab., 2000; 85: 2072-2075
  Google Scholar
• 23. Falkenstein E., Tillmann H.C., Christ M., Feuring M., Wehling M.:Multiple actions of steroid hormones-a focus on rapid, nongenomiceffects. Pharmacol. Rev., 2000: 52; 513-556
  Google Scholar
• 24. Fan P., Wang J., Santen R.J., Yue W.: Long-term treatment withtamoxifen facilitates translocation of estrogen receptor alpha out ofthe nucleus and enhances its interaction with EGFR in MCF-7 breastcancer cells. Cancer Res., 2007; 67: 1352-1360
  Google Scholar
• 25. Figtree G.A., McDonald D., Watkins H., Channon K.M.: Truncatedestrogen receptor α 46-kDa isoform in human endothelial cells: relationshipto acute activation of nitric oxide synthase. Circulation,2003; 107: 120-126
  Google Scholar
• 26. Filardo E.J., Quinn J.A., Frackelton A.R.Jr., Bland K.I.: Estrogenaction via the G protein coupled receptor, GPR30: stimulation ofadenylyl cyclase and cAMP-mediated attenuation of the epidermalgrowth factor receptor-to-MAPK signaling axis. Mol. Endocrinol.,2002; 16: 70-84
  Google Scholar
• 27. Fortunati N., Catalano M.G., Boccuzzi G., Frairia R.: Sex hormonebindingglobulin (SHBG), estradiol and breast cancer. Mol. Cell. Endocrinol.,2010; 316: 86-92
  Google Scholar
• 28. Fortunati N., Fissore F., Fazzari A., Becchis M., Comba A., CatalanoM.G., Berta L., Frairia R.: Sex steroid binding protein exertsa negative control on estradiol action in MCF-7 cells (human breastcancer) through cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate and proteinkinase A. Endocrinology, 1996; 137: 686-692
  Google Scholar
• 29. Fox E.M., Andrade J., Shupnik M.A.: Novel actions of estrogento promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclearpathways. Steroids, 2009; 74: 622-627
  Google Scholar
• 30. Fuller P.J.: The steroid receptor superfamily: mechanisms ofdiversity. FASEB J., 1991; 5: 3092-3099
  Google Scholar
• 31. Furukawa T., Kurokawa J.: Regulation of cardiac ion channelsvia non-genomic action of sex steroid hormones: implication forthe gender difference in cardiac arrhythmias. Pharmacol. Ther.,2007; 115: 106-115
  Google Scholar
• 32. Garcia Dos Santos E., Dieudonne M.N., Pecquery R., Le MoalV., Giudicelli Y., Lacasa D.: Rapid nongenomic E2 effects on p42/p44 MAPK, activator protein-1, and cAMP response element bindingprotein in rat white adipocytes. Endocrinol., 2002; 143: 930-940
  Google Scholar
• 33. Gee J.M., Robertson J.F., Gutteridge E., Ellis I.O., Pinder S.E., RubiniM., Nicholson R.I.: Epidermal growth factor receptor/HER2/insulin-like growth factor receptor signaling and oestrogen receptoractivity in clinical breast cancer. Endocr. Relat. Cancer, 2005;12: S99-S111
  Google Scholar
• 34. Grosse B., Kachkache M., Le Mellay V., Lieberherr M.: Membranesignalling and progesterone in female and male osteoblasts. Involvementof intracellular Ca2+, inositol trisphosphate, and diacylglycerol,but not cAMP. J. Cell. Biochem., 2000; 79: 334-345
  Google Scholar
• 35. Guiochon-Mantel A., Lescop P., Christin-Maitre S., Loosfelt H.,Perrot-Applanat M., Milgrom E.: Nucleocytoplasmic shuttling of theprogesterone receptor. EMBO J., 1991; 10: 3851-3859
  Google Scholar
• 36. Harrison D.A., Carr D.W., Meizel S.: Involvement of protein kinaseA and A kinase anchoring protein in the progesterone-initiatedhuman sperm acrosome reaction. Biol. Reprod., 2000; 62: 811-820
  Google Scholar
• 37. Haynes M.P., Li L., Sinha D., Russell K.S., Hisamoto K., Baron R.,Collinge M., Sessa W.C., Bender J.R.: Src kinase mediates phosphatidylinositol3-kinase/Akt-dependent rapid endothelial nitric-oxidesynthase activation by estrogen. J. Biol. Chem., 2003; 278: 2118-2123
  Google Scholar
• 38. Helsen C., Kerkhofs S., Clinckemalie L., Spans L., Laurent M.,Boonen S., Vanderschueren D., Claessens F.: Structural basis for nuclearhormone receptor DNA binding. Mol. Cell. Endocrinol., 2012;348: 411-417
  Google Scholar
• 39. Hennessy B.A., Harvey B.J., Healy V.: 17β-Estradiol rapidly stimulatesc-fos expression via the MAPK pathway in T84 cells. Mol. Cell.Endocrinol., 2005; 229: 39-47
  Google Scholar
• 40. Hewitt S.C., Korach K.S.: Oestrogen receptor knockout mice:roles for oestrogen receptors alpha and beta in reproductive tissues.Reproduction, 2003; 125: 143-149
  Google Scholar
• 41. Hsieh Y.C., Frink M., Thobe B.M., Hsu J.T., Choudhry M.A.,Schwacha M.G., Bland K.I., Chaudry I.H.:17β-estradiol downregulatesKupffer cell TLR4-dependent p38 MAPK pathway and normalizesinflammatory cytokine production following trauma-hemorrhage.Mol. Immunol., 2007; 44: 2165-2172
  Google Scholar
• 42. Ing N.H., Beekman J.M., Tsai S.Y., Tsai M.J., O’Malley B.W.: Membersof the steroid hormone receptor superfamily interact with TFIIB(S300-II). J. Biol. Chem., 1992; 267: 17617-17623
  Google Scholar
• 43. Jakacka M., Ito M., Martinson F., Ishikawa T., Lee E.J., Jameson J.L.:An estrogen receptor (ER)α deoxyribonucleic acid-binding domainknock-in mutation provides evidence for nonclassical ER pathwaysignaling in vivo. Mol. Endocrinol., 2002; 16: 2188-2201
  Google Scholar
• 44. Jensen E.V., Jacobson H.I., Walf A.A., Frye C.A.: Estrogen action:a historic perspective on the implications of considering alternativeapproaches. Physiol Behav., 2010; 99: 151-162
  Google Scholar
• 45. Jensen E.V., Suzuki T., Kawashima T., Stumpf W.E., Jungblut P.W.,DeSombre E.R.: A two-step mechanism for the interaction of estradiolwith rat uterus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1968; 59: 632-638
  Google Scholar
• 46. Kato S., Endoh H., Masuhiro Y., Kitamoto T., Uchiyama S., SasakiH.,Masushige S., Gotoh Y., Nishida E., Kawashima H., Metzger D., ChambonP.: Activation of the estrogen receptor through phosphorylationby mitogen-activated protein kinase. Science, 1995; 270: 1491-1494
  Google Scholar
• 47. Kelly M.J., Lagrange A.H., Wagner E.J., Ronnekleiv O.K.: Rapideffects of estrogen to modulate G protein-coupled receptors viaactivation of protein kinase A and protein kinase C pathways. Steroids,1999; 64: 64-75
  Google Scholar
• 48. Klein–Hitpass L., Schwerk C., Kahmann S., Vassen L.: Targetsof activated steroid hormone receptors: basal transcription factorsand receptor interacting proteins. J. Mol. Med., 1998; 76: 490-496
  Google Scholar
• 49. Klinge C.M.: Estrogen receptor interaction with estrogen responseelements.: Nucleic Acids Res., 2001; 29: 2905-2919
  Google Scholar
• 50. Klinge C.M., Blankenship K.A., Risinger K.E., Bhatnagar S., NoisinE.L., Sumanasekera W.K., Zhao L., Brey D.M., Keynton R.S.: Resveratroland estradiol rapidly activate MAPK signaling through estrogenreceptor α and β in endothelial cells. J. Biol. Chem., 2005;280: 7460-7468
  Google Scholar
• 51. Kousteni S., Bellido T., Plotkin L.I., O’Brien C.A., Bodenner D.L.,Han L., Han K., DiGregorio G.B., Katzenellenbogen J.A., KatzenellenbogenB.S., Roberson P.K., Weinstein R.S., Jilka R.L., Manolagas S.C.:Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen orandrogen receptors, dissociation from transcriptional activity. Cell,2001; 104: 719-730
  Google Scholar
• 52. Kousteni S., Han L., Chen J.R., Almeida M., Plotkin L.I., Bellido T.,Manolagas S.C.: Kinase-mediated regulation of common transcriptionfactors accounts for the bone-protective effects of sex steroids.J. Clin. Invest., 2003; 111: 1651-1664
  Google Scholar
• 53. Lange C.A.: Integration of progesterone receptor action withrapid signaling events in breast cancer models. J. Steroid Biochem.Mol. Biol., 2008; 108: 203-212
  Google Scholar
• 54. Lange C.A.: Making sense of cross-talk between steroid hormonereceptors and intracellular signaling pathways: who will have thelast word? Mol. Endocrinol., 2004; 18: 269-278
  Google Scholar
• 55. Le Mellay V., Grosse B., Lieberherr M.: Phospholipase C beta andmembrane action of calcitriol and estradiol. J. Biol. Chem., 1997;272: 11902-11907
  Google Scholar
• 56. Levin E.R.: Cellular functions of the plasma membrane estrogenreceptor. Trends Endocrinol. Metab., 1999; 10: 374-377
  Google Scholar
• 57. Lu Q., Ebling H., Mittler J., Baur W.E., Karas R.H.: MAP kinasemediates growth factor-induced nuclear translocation of estrogenreceptor alpha. FEBS Lett., 2002; 516: 1-8
  Google Scholar
• 58. Luo M., Koh M., Feng J., Wu Q., Melamed P.: Cross talk in hormonallyregulated gene transcription through induction of estrogenreceptor ubiquitylation. Mol. Cell. Biol., 2005; 25: 7386-7398
  Google Scholar
• 59. Macedo L.F., Sabnis G., Brodie A.: Preclinical modeling of endocrineresponse and resistance: focus on aromatase inhibitors.Cancer, 2008; 112: 679-688
  Google Scholar
• 60. Mangelsdorf D.J., Thummel C., Beato M., Herrlich P., Schütz G.,Umesono K., Blumberg B., Kastner P., Mark M., Chambon P., EvansR.M.: The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell,1995; 83: 835-839
  Google Scholar
• 61. Martinez F., Tesarik J., Martin C.M., Soler A., Mendoza C.: Stimulationof tyrosine phosphorylation by progesterone and its 11-OHderivatives: Dissection of a Ca2+-dependent and a Ca2+-independentmechanism. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999; 255: 23-27
  Google Scholar
• 62. McKenna N.J., O’Malley B.W.: Combinatorial control of geneexpression by nuclear receptors and coregulators. Cell, 2002; 108:465-474
  Google Scholar
• 63. Migliaccio A., Castoria G., Auricchio F.: Src-dependent signallingpathway regulation by sex-steroid hormones: therapeutic implications.Int. J. Biochem. Cell Biol., 2007; 39: 1343-1348
  Google Scholar
• 64. Migliaccio A., Di Domenico M., Castoria G., de Falco A., BontempoP., Nola E., Auricchio F.: Tyrosine kinase/p21ras/MAPkinasepathway activation by estradiol-receptor complex in MCF-7 cells.EMBO J., 1996; 15: 1292-1300
  Google Scholar
• 65. Migliaccio A., Piccolo D., Castoria G., Di Domenico M., BilancioA., Lombardi M., Gong W., Beato M., Auricchio F.: Activation of theSrc/p21ras/Erk pathway by progesterone receptor via cross-talkwith estrogen receptor. EMBO J., 1998; 17: 2008-2018
  Google Scholar
• 66. Morley P., Whitfield J.F., Vanderhyden B.C, Tsang B.K., SchwartzJ.L.: A new, nongenomic estrogen action: the rapid release of intracellularcalcium. Endocrinology, 1992; 131: 1305-1312
  Google Scholar
• 67. Morrill G.A., Kostellow A.B.: Progesterone induces meiotic divisionin the amphibian oocyte by releasing lipid second messengersfrom the plasma membrane. Steroids, 1999; 64: 157-167
  Google Scholar
• 68. Nakajima T., Kitazawa T., Hamada E., Hazama H., Omata M.,Kurachi Y.: 17beta-Estradiol inhibits the voltage-dependent L-typeCa2+ currents in aortic smooth muscle cells. Eur. J. Pharmacol., 1995;294: 625-635
  Google Scholar
• 69. Neves S.R., Ram P.T., Iyengar R.: “G protein pathways”. Science,2002; 296: 1636-1639
  Google Scholar
• 70. Nuclear Receptors Nomenclature Committee: A unified nomenclaturesystem for the nuclear receptor superfamily. Cell, 1999;97: 161-163
  Google Scholar
• 71. Oñate S.A., Tsai S.Y., Tsai M.J., O’Malley B.W.: Sequence andcharacterization of a coactivator for the steroid hormone receptorsuperfamily. Science, 1995; 270: 1354-1357
  Google Scholar
• 72. O’Lone R., Frith M.C., Karlsson E.K., Hansen U.: Genomic targetsof nuclear estrogen receptors. Mol. Endocrinol., 2004; 18: 1859-1875
  Google Scholar
• 73. Osborne C.K., Schiff R.: Growth factor receptor cross-talk withestrogen receptor as a mechanism for tamoxifen resistance in breastcancer. Breast, 2003; 12: 362-367
  Google Scholar
• 74. Pearson G., Robinson F., Beers Gibson T., Xu B.E., KarandikarM., Berman K., Cobb M.H.: Mitogen-activated protein (MAP) kinasepathways: regulation and physiological functions. Endocr. Rev., 2001;22: 153-183
  Google Scholar
• 75. Picotto G., Vazquez G., Boland R.: 17β-estradiol increases intracellularCa2+ concentration in rat enterocytes. Potential role ofphospholipase C-dependent store-operated Ca2+ influx. Biochem.J., 1999; 339: 71-77
  Google Scholar
• 76. Pietras R.J., Szego C.M.: Partial purification and characterizationof oestrogen receptors in subfractions of hepatocyte plasmamembranes. Biochem. J., 1980; 191: 743-760
  Google Scholar
• 77. Pike A.C., Brzozowski A.M., Hubbard R.E., Bonn T., Thorsell A.G.,Engstrom O., Ljunggren J., Gustafsson J.A., Carlquist M.: Structure ofthe ligand-binding domain of oestrogen receptor beta in the presenceof a partial agonist and a full antagonist. EMBO J., 1999; 18:4608-4618
  Google Scholar
• 78. Piña B., Brüggemeier U., Beato M.: Nucleosome positioningmodulates accessibility of regulatory proteins to the mouse mammarytumor virus promoter. Cell, 1990; 60: 719-731
  Google Scholar
• 79. Powell E., Wang Y., Shapiro D.J., Xu W.: Differential requirementsof Hsp90 and DNA for the formation of estrogen receptor homodimersand heterodimers. J. Biol. Chem., 2010; 285: 16125-16134
  Google Scholar
• 80. Pratt W.B., Toft D.O.: Steroid receptor interactions with heatshock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev., 1997;18: 306-360
  Google Scholar
• 81. Proietti C., Salatino M., Rosemblit C., Carnevale R., Pecci A.,Kornblihtt A.R., Molinolo A.A., Frahm I., Charreau E.H., Schillaci R.,Elizalde P.V.: Progestins induce transcriptional activation of signaltransducer and activator of transcription 3 (Stat3) via a Jak- andSrc-dependent mechanism in breast cancer cells. Mol. Cell. Biol.,2005; 25: 4826-4840
  Google Scholar
• 82. Razandi M., Alton G., Pedram A., Ghonshani S., Webb P., LevinE.R.: Identification of a structural determinant necessary for thelocalization and function of estrogen receptor alpha at the plasmamembrane. Mol. Cell. Biol., 2003; 23: 1633-1646
  Google Scholar
• 83. Razandi M., Pedram A., Levin E.R.: Estrogen signals to the preservationof endothelial cell form and function. J. Biol. Chem., 2000;275: 38540-38546
  Google Scholar
• 84. Razandi M., Pedram A., Levin E.R.: Plasma membrane estrogenreceptors signal to antiapoptosis in breast cancer. Mol Endocrinol.,2000; 14: 1434-1447
  Google Scholar
• 85. Revankar C.M., Cimino D.F., Sklar L.A., Arterburn J.B., ProssnitzE.R.: A transmembrane intracellular estrogen receptor mediatesrapid cell signaling. Science, 2005; 307: 1625-1630
  Google Scholar
• 86. Richer J.K., Lange C.A., Manning N.G., Owen G., Powell R., HorwitzK.B.: Convergence of progesterone with growth factor and cytokinesignaling in breast cancer. Progesterone receptors regulate signaltransducers and activators of transcription expression and activity.J. Biol. Chem., 1998; 273: 31317-31326
  Google Scholar
• 87. Riggins R.B., Thomas K.S., Ta H.Q., Wen J., Davis R.J., Schuh N.R.,Donelan S.S., Owen K.A., Gibson M.A., Shupnik M.A., Silva C.M., ParsonsS.J., Clarke R., Bouton A.H.: Physical and functional interactionsbetween Cas and c-Src induce tamoxifen resistance of breast cancercells through pathways involving epidermal growth factor receptorand signal transducer and activator of transcription 5b. CancerRes., 2006; 66: 7007-7015
  Google Scholar
• 88. Rosner W.: The functions of corticosteroid-binding globulinand sex hormonebinding globulin: recent advances. Endocr. Rev.,1990; 11: 80-91
  Google Scholar
• 89. Rosner W., Hryb D.J., Khan M.S., Nakhla A.M., Romas N.A.: Sexhormone-binding globulin mediates steroid hormone signal transductionat the plasma membrane. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol.,1999; 69: 481-485
  Google Scholar
• 90. Russell K.S., Haynes M.P., Sinha D., Clerisme E., Bender J.R.: Humanvascular endothelial cells contain membrane binding sites forestradiol, which mediate rapid intracellular signaling. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 2000; 97: 5930-5935
  Google Scholar
• 91. Sentis S., Le Romancer M., Bianchin C., Rostan M.C., Corbo L.:Sumoylation of the estrogen receptor α hinge region regulates itstranscriptional activity. Mol. Endocrinol., 2005; 19: 2671-2684
  Google Scholar
• 92. Shen T., Horwitz K.B., Lange C.A.: Transcriptional hyperactivityof human progesterone receptors is coupled to their liganddependentdown-regulation by mitogenactivated protein kinasedependentphosphorylation of serine 294. Mol. Cell. Biol., 2001; 21:6122-6131
  Google Scholar
• 93. Silva C.M., Shupnik M.A.: Integration of steroid and growth factorpathways in breast cancer: focus on signal transducers and activatorsof transcription and their potential role in resistance. Mol.Endocrinol., 2007; 21: 1499-1512
  Google Scholar
• 94. Simoncini T., Genazzani A.R.: Non-genomic actions of sex steroidhormones. Eur. J. Endocrinol., 2003; 148: 281-292
  Google Scholar
• 95. Simoncini T., Hafezi-Moghadam A., Brazil D. P., Ley K., Chin W.W.,Liao J. K.: Interaction of ER with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OHkinase. Nature, 2000; 407: 538-541
  Google Scholar
• 96. Singh S., Shaul P.W., Gupta P.D.: Conventional estrogen receptorsare found in the plasma membrane of vaginal epithelial cellsof the rat. Steroids, 2002; 67: 757-764
  Google Scholar
• 97. Smith C.L.: Cross-talk between peptide growth factor and estrogenreceptor signaling pathways. Biol. Reprod., 1998; 58: 627-632
  Google Scholar
• 98. Smith D.F., Toft D.O.: Steroid receptors and their associated proteins.Mol. Endocrinol., 1993; 7: 4-11
  Google Scholar
• 99. Smith J.L., Kupchak B.R., Garitaonandia I., Hoang L.K., MainaA.S., Regalla L.M., Lyons T.J.: Heterologous expression of humanmPRα, mPRβ and mPRγ in yeast confirms their ability to functionas membrane progesterone receptors. Steroids, 2008; 73: 1160-1173
  Google Scholar
• 100. Spencer T.E., Jenster G., Burcin M.M., Allis C.D., Zhou J., MizzenC.A., McKenna N.J., Onate S.A., Tsai S.Y., Tsai M.J., O›Malley B.W.:Steroid receptor coactivator-1 is a histone acetyltransferase. Nature,1997; 389: 194-198
  Google Scholar
• 101. Srivastava S., Weitzmann M.N., Cenci S., Ross F.P., Adler S.,Pacifici R.: Estrogen decreases TNF gene expression by blockingJNK activity and the resulting production of c-Jun and JunD. J. Clin.Invest., 1999; 104: 503-513
  Google Scholar
• 102. Stenoien D.L., Mancini M.G., Patel K., Allegretto E.A., SmithC.L., Mancini M.A.: Subnuclear trafficking of estrogen receptor-α andsteroid receptor coactivator-1. Mol. Endocrinol., 2000; 14: 518-534
  Google Scholar
• 103. Tesarik J., Mendoza C.: Nongenomic effects of 17 β-estradiolon maturing human oocytes: Relationship to oocyte developmentalpotential. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1995; 80: 1438-1443
  Google Scholar
• 104. Thomas P., Pang Y., Dong J., Groenen P., Kelder J., De Vlieg J.,Zhu Y., Tubbs C.: Steroid and G protein binding characteristics of theseatrout and human progestin membrane receptor-alpha subtypesand their evolutionary origins. Endocrinology, 2007; 148: 705-718
  Google Scholar
• 105. Toran-Allerand C.D., Guan X., MacLusky N.J., Horvath T.L., DianoS., Singh M., Connolly E.S.Jr, Nethrapalli I.S., Tinnikov A.A.: ER-X:a novel, plasma membrane-associated, putative estrogen receptorthat is regulated during development and after ischemic brain injury.J. Neurosci., 2002; 22: 8391-8401
  Google Scholar
• 106. Valverde M.A., Rojas P., Amigo J., Cosmelli D., Orio P., BahamondeM.I., Mann G.E., Vergara C., Latorre R.: Acute activation ofMaxi-K channels (hSlo) by estradiol binding to the β subunit. Science,1999; 285: 1929-1931
  Google Scholar
• 107. van der Flier S., Brinkman A., Look M.P., Kok E.M., Meijer-vanGelder M.E., Klijn J.G., Dorssers L.C., Foekens J.A.: Bcar1/p130Cas proteinand primary breast cancer: prognosis and response to tamoxifentreatment. J. Natl. Cancer Inst., 2000; 92: 120-127
  Google Scholar
• 108. Wade C.B., Dorsa D.M.: Estrogen activation of cyclic adenosine5′- monophosphate response element-mediated transcriptionrequires the extracellularly regulated kinase/mitogen-activatedprotein kinase pathway. Endocrinology, 2003; 144: 832-838
  Google Scholar
• 109. Wang C., Shi X., Chen X., Wu H., Zhang H., Xie J., Yang X., GouZ., Ye J.: 17-β-estradiol inhibits hyperosmolarity-induced proinflammatorycytokine elevation via the p38 MAPK pathway in humancorneal epithelial cells. Mol. Vis., 2012; 18: 1115-1122
  Google Scholar
• 110. Watters J.J., Campbell J.S., Cunningham M.J., Krebs E.G., DorsaD.M.: Rapid membrane effects of steroids in neuroblastoma cells:effects of estrogen on mitogen activated protein kinase signallingcascade and c-fos immediate early gene transcription. Endocrinology,1997; 138: 4030-4033
  Google Scholar
• 111. Watters J.J., Dorsa D.M.: Transcriptional effects of estrogen onneuronal neurotensin gene expression involve cAMP/protein kinaseA-dependent signaling mechanisms. J. Neurosci., 1998; 18: 6672-6680
  Google Scholar
• 112. Weigel N.L., Zhang Y.: Ligand-independent activation of steroidhormone receptors. J. Mol. Med., 1998; 76: 469-479
  Google Scholar
• 113. White R.E., Darkow D.J., Lang J.L.: Estrogen relaxes coronary arteriesby opening BKCa channels through a cGMP-dependent mechanism.Circ. Res., 1995; 77: 936-942
  Google Scholar
• 114. Wierman M.E.: Sex steroid effects at target tissues: mechanismsof action. Adv. Physiol. Educ., 2007; 31: 26-33
  Google Scholar
• 115. Xu Y., Traystman R.J., Hurn P.D., Wang M.M.: Membrane restraintof estrogen receptor alpha enhances estrogen-dependentnuclear localization and genomic function. Mol. Endocrinol., 2004;18: 86-96
  Google Scholar
• 116. Yeatman T.: A renaissance for Src. Nat. Rev., 2004; 4: 470-480
  Google Scholar
• 117. Yue W., Wang J.P., Conaway M., Masamura S., Li Y., Santen R.J.:Activation of the MAPK pathway enhances sensitivity of MCF-7breast cancer cells to the mitogenic effect of estradiol. Endocrinol.,2002; 143: 3221-3229
  Google Scholar
• 118. Zhang D., Trudeau V.L.: Integration of membrane and nuclearestrogen receptor signaling. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr.Physiol., 2006; 144: 306-315
  Google Scholar
• 119. Zhu W., Smart E.J.: Caveolae, estrogen and nitric oxide. TrendsEndocrinol. Metab., 2003; 14: 114-117
  Google Scholar
• 120. Zhu Y., Bond J., Thomas P.: Identification, classification andpartial characterization of genes in humans and other vertebrateshomologous to a fish membrane progestin receptor. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 2003; 100: 2237-2242
  Google Scholar

Pełna treść artykułu