Abstrakt

Nadmierne i często nieuzasadnione używanie antybiotyków stawia ludzkość w obliczu problemu rosnącej liczby lekoopornych szczepów bakteryjnych. Stąd konieczne jest poszukiwanie nowych antybiotyków oraz badanie nowych celów dla leków przeciwbakteryjnych. Dobrymi kandydatami białek niezbędnych do wzrostu, a jednocześnie różniącymi się znacząco od eukariotycznych homologów wydają się białka zaangażowane w replikację bakteryjnego chromosomu (helikaza, polimeraza, prymaza), a także utrzymujące jego prawidłową przestrzenną strukturę (topoizomerazy). W ostatnich latach opracowano wiele wysokoprzepustowych metod poszukiwania związków hamujących aktywność białek uczestniczących w procesie replikacji chromosomów bakteryjnych. Przedmiotem artykułu jest przedstawienie niektórych z nich.

Wstęp

Odkrycie penicyliny w latach 20 ub.w. zapoczątkowało erę antybiotyków. Obecnie, ze względu na nadmierne i często nieuzasadnione ich używanie, stoimy w obliczu problemu rosnącej liczby lekoopornych szczepów bakteryjnych. Łatwość w przekazywaniu genów oporności na antybiotyki wśród bakterii oraz presja selekcyjna wywierana przez częste podawanie leków antybakteryjnych, doprowadziły do pojawienia się drobnoustrojów niewrażliwych na coraz większą liczbę antybiotyków. Wśród nich wyróżnić można szczepy oporne na określone grupy związków, np. oporny na antybiotyki β-laktamowe szczep Staphylococcus aureus (MRSA – methicilin resistant S. aureus) [12] oraz szczepy wielolekooporne, takie jak MDR (multiple drug resistant) Mycobacterium tuberculosis, który w 2010 r. spowodował około 290 000 zachorowań na gruźlicę płuc [34]. W ostatnich latach pojawiły się również szczepy o rozszerzonej oporności, tzw. XDR (extensively drug resistant), do których należy szczep Klebsiella pneumoniae wywołujący zapalenie płuc [50] oraz całkowitej oporności – PDR (pandrug resistant) np. Pseudomonas aeruginosa, będący przyczyną oportunistycznych infekcji u ludzi [20].

Mechanizmy działania stosowanych najczęściej antybiotyków polegają na zaburzeniu syntezy ściany komórkowej (m.in. penicyliny, cefalosporyny, wankomycyny), hamowaniu biosyntezy białek (m.in. tetracykliny, erytromycyna, chloramfenikolu, streptomycyny) i blokowaniu procesu replikacji (kumaryny, chinolonów). Ze względu na rosnącą oporność chorobotwórczych bakterii na znane antybiotyki, konieczne jest poszukiwanie nowych celów dla antybiotykoterapii. Najlepszymi spośród nich są białka niezbędne do wzrostu i namnażania się komórek bakteryjnych, a równocześnie takie, które nie występują w komórkach ludzkich lub znacząco się od nich różnią [53].

Rozwój technik biologii komórki stwarza nowe możliwości badania oraz wizualizacji subkomórkowych struktur bakterii. Ostatnie badania dowodzą, że chromosom bakteryjny w komórce przyjmuje strukturę wysoce zorganizowaną, zbudowaną z wielu topologicznie niezależnych, superskręconych domen DNA związanych z białkami NAP (nucleoid associated proteins) [10,18]. Domenowa organizacja pozwala na jednoczesne zaangażowanie odrębnych regionów chromosomu w różne procesy komórkowe, takie jak replikacja i segregacja nowo zreplikowanych obszarów chromosomu, a także transkrypcja i rekombinacja materiału genetycznego [64]. Chromosom ulega podwojeniu i segregacji do komórek potomnych w ściśle określonym czasie, a procesy te ze względu na swoją istotność dla przeżycia komórki są precyzyjnie kontrolowane. W ostatnich latach poznano strukturę i funkcję wielu białek zaangażowanych w powielanie bakteryjnego materiału genetycznego. Przedmiotem artykułu jest przedstawienie metod poszukiwania nowych celów dla antybiotyków wśród białek uczestniczących w procesie replikacji chromosomów bakteryjnych. Omówiono przykłady białek-celów uczestniczących bezpośrednio w syntezie DNA oraz takich, które kontrolują jego topologię w trakcie tego procesu.

Replikacja DNA u bakterii i eukariontów – tak podobna, a tak różna

Replikacja DNA jest podstawowym procesem komórkowym zachodzącym we wszystkich żywych organizmach. U organizmów prokariotycznych, w przeciwieństwie do eukariontów, synteza DNA nie zachodzi w odrębnym, odpowiadającym jądru komórkowemu, przedziale komórki. Replikacja chromosomu w optymalnych warunkach zajmuje bakteriom E. coli około 40 min, podczas gdy komórki eukariotyczne potrzebują na skopiowanie całego chromosomu 18-24 godzin [65]. U bakterii i eukariontów mechanizm replikacji chromosomów oraz niektórych plazmidów wygląda podobnie. Jest to dwukierunkowy proces, w którym polimerazy DNA przeprowadzają syntezę w kierunku 5’→3’ (na nici wiodącej i opóźnionej), poczynając od krótkich starterowych fragmentów RNA syntetyzowanych przez prymazę [65]. W przeciwieństwie do eukariontów, bakterie rozpoczynają syntezę DNA chromosomalnego w jednym, ściśle określonym miejscu zwanym oriC (origin of chromosomal replication) [47]. Proces inicjowany jest przez białko DnaA, które wiążąc się do kilku krótkich, swoistych sekwencji nukleotydowych w regionie oriC, oligomeryzuje i powoduje rozplecenie helisy DNA [35]. W skład maszynerii replikacyjnej (zwanej replisomem), przeprowadzającej syntezę DNA wchodzą: prymaza (DnaG) – syntetyzuje startery RNA, helikaza (DnaB) – rozplata nić DNA w miarę przesuwania się widełek replikacyjnych oraz polimeraza DNA III (Pol III). Ze względu na to, że synteza DNA zachodzi zawsze w kierunku 5’→3’, tylko jedna nić (wiodąca) może być syntetyzowana w sposób ciągły. Druga nić (opóźniona) powstaje przez syntezę odcinków DNA (fragmentów Okazaki), które są następnie ze sobą łączone [31,44]. U bakterii replikacja kończy się w obrębie sekwencji ter, a nowo powstałe chromosomy są rozdzielane (w procesie dekatenacji) przez topoizomerazę IV (tabela 1).

Pomimo wielu podobieństw w procesie replikacji u bakterii i eukariontów, różnice w budowie komórek oraz w wielkości i liczbie chromosomów bakteryjnych i eukariotycznych przekładają się na różnice w składzie i budowie aparatu replikacyjnego oraz zestawie białek modulujących strukturę i topologię DNA. Głównym enzymem syntetyzującym DNA u bakterii jest polimeraza DNA III, która stanowi heteromultimeryczny kompleks odpowiedzialny za syntezę obu nici DNA (wiodącej i opóźnionej) [45]. Rdzeniem enzymu są stabilizująca inne elementy podjednostka θ [68] oraz dwa białka o aktywności enzymatycznej – podjednostki α i ε, kodowane odpowiednio przez geny dnaE i dnaQ. Aktywność 5‘→3‘ polimerazy wykazuje podjednostka α, natomiast podjednostka ε ma aktywność 3‘→5‘ egzonukleazy i jest odpowiedzialna za korekcję błędnie wbudowanych nukleotydów. Za dimeryzację rdzenia polimerazy III DNA odpowiadają natomiast podjednostki τ. Elementem utrzymującym polimerazę na nici DNA podczas replikacji (procesywność) jest tzw. β-klamra zbudowana z dwóch cząsteczek białka DnaN. Dodatkowymi elementami strukturalnymi enzymu są podjednostki γ, δ, δ’, χ i ψ [7]. W komórkach eukariotycznych aktywność 5‘→3‘ polimerazy wykazują: polimeraza DNA α i polimeraza DNA δ. Polimeraza DNA α inicjuje replikację w kompleksie z prymazą, natomiast polimeraza DNA δ odpowiada za syntezę nici wiodącej. Charakteryzuje się większą procesywnością oraz przejawia dodatkowo aktywność 3‘→5‘ egzonukleazy. Ze względu na to, że bakterie inicjują replikację w jednym i ściśle zdefiniowanym miejscu, a replikacja u eukariontów rozpoczyna się w wielu miejscach, organizmy te różnią się między sobą nie tylko rodzajem polimeraz, ale również liczbą ich kopii w komórce. W komórce eukariotycznej znajduje się 20 000-60 000 cząsteczek polimerazy DNA α, podczas gdy u bakterii E. coli występuje tylko 10-20 cząsteczek polimerazy DNA III [21]. Różnice między bakteriami a eukariontami uwidaczniają się również w przypadku czynników odpowiedzialnych za inicjację replikacji. U większości bakterii homologi białka DnaA z udziałem ATP inicjują rozplatanie dwuniciowego DNA w regionie oriC [35]. Natomiast w komórkach eukariotycznych za inicjację replikacji odpowiada kompleks utworzony przez wiele białek.

Różnice między białkami tworzącymi replisom u bakterii i eukariontów są na tyle duże (tabela 2 i 3), że czynią te pierwsze atrakcyjnym celem antybiotykoterapii. Dodatkowo komponenty replisomów mogą się różnić także między poszczególnymi gatunkami bakterii, co stwarza możliwość zaprojektowania leku o wąskim spektrum działania, a nawet ukierunkowania go przeciwko konkretnym patogenom [53]. Replikacja jest jednak trudnym celem terapii antybakteryjnej. Jednym z powodów tych trudności jest współistnienie w genomie kilku kopii genów kodujących białka replikacyjne. Genomy wielu gatunków z rodzaju Bacillus zawierają dodatkową kopię genu dnaN, dnaN-2, który koduje białko DnaN-2, wykazujące 40% podobieństwa na poziomie sekwencji aminokwasowej względem białka DnaN [53]. Stąd celując w białka replikacyjne mające dodatkowe kopie, należy jednoznacznie ustalić rolę ich homologów w procesie replikacji DNA.

Przemieszczanie się widełek replikacyjnych w  czasie syntezy DNA powoduje zmiany w strukturze i topologii chromosomu. Generowane są zmiany superskręcenia chromosomu (powstają odpowiednio pozytywne superskręty przed kompleksem replikacyjnym oraz negatywne za nim) zwane stresem topologicznym. Za eliminację nagromadzonych superskręceń odpowiadają wyspecjalizowane enzymy – topoizomerazy (tabela 1). Topoizomerazy przejściowo nacinając jedną (typ I) lub obie (typ II) nici DNA, prowadzą do zmian w liczbie superskrętów DNA (liczby opleceń jednej helisy DNA wokół drugiej). Chociaż enzymy te działają przede wszystkim lokalnie w regionach, w których dochodzi do generowania nadmiernego superskręcenia DNA, to funkcje komórkowe topoizomeraz należy również rozpatrywać w aspekcie globalnej regulacji topologii bakteryjnego chromosomu. Topoizomerazy regulując poziom superskręcenia w wielu miejscach chromosomu, w sposób skoordynowany prowadzą do zmiany całej jego struktury. Pociąga to za sobą zmiany w globalnym profilu ekspresji genów, których promotory są wrażliwe na zmiany w gęstości superhelikalnej DNA, w tym również wielu genów warunkujących przystosowanie się bakterii chorobotwórczych do bytowania w organizmie gospodarza (tzw. genów wirulencji). Białka remodelujące strukturę DNA, w tym przede wszystkim topoizomerazy, ze względu na swoje zaangażowanie w organizację chromosomu podczas replikacji materiału genetycznego oraz transkrypcji genów, wydają się doskonałym celem terapii przeciwbakteryjnych.

Ostatnie lata przyniosły rozwój specyficznych metod skupiających się na poszukiwaniu nowych inhibitorów procesu replikacji. Liczba nowo odkrywanych związków stale wzrasta, jednak jak dotąd nie wprowadzono do leczenia żadnego z nich. Cząsteczki te działają na różne elementy replisomu dlatego można je podzielić na dwie grupy: blokujące aktywność białek o właściwościach enzymatycznych, takich jak polimeraza DNA, helikaza czy prymaza oraz zaburzających oddziaływania między podjednostkami replisomów – cząsteczki wiążące się do białek SSB (single strand binding proteins) i DnaN. Coraz więcej nowo opracowywanych metod wykorzystuje techniki wysokoprzepustowe, które pozwalają na przesiewowe badanie setek tysięcy cząsteczek i selekcjonowanie tych o potencjalnym zastosowaniu w leczeniu. Zastosowanie mają również metody oparte na komputerowym modelowaniu cząsteczek inhibitorów w oparciu o struktury dostępnych białek lub ich homologów, syntezie chemicznej cząsteczek analogicznych do znanych już inhibitorów czy krystalizacja wybranych białek w kompleksie z cząsteczkami inhibitora. Niżej przedstawiono kilka przykładowych metod poszukiwania inhibitorów białek replikacyjnych oraz topoizomeraz, które są niezbędne do prawidłowego przebiegu procesu replikacji DNA.

Metody poszukiwania inhibitorów białek o aktywności enzymatycznej

Pierwszym etapem replikacji jest rozplecenie podwójnej helisy DNA w miejscu oriC, a następnie przyłączenie helikazy oraz prymazy, które tworzą tzw. prymosom. Helikaza, hydrolizując ATP, powoduje rozplecenie podwójnej helisy i umożliwia przesuwanie widełek replikacyjnych, natomiast prymaza syntetyzuje krótkie odcinki RNA, które służą następnie jako startery do syntezy nowych nici DNA. Oba enzymy są niezbędne do przeżycia bakterii [26]. Helikazy, oprócz replikacji, są zaangażowane również w inne procesy komórkowe, w tym naprawę DNA. W komórkach zarówno eukariotycznych jak i bakteryjnych występuje kilka ich paralogów; bakterie E. coli mają aż 12 różnych białek o aktywności helikazowej [77].

Bakteryjne funkcjonalne homologi helikazy i prymazy różnią się od ich eukariotycznych odpowiedników i dlatego stanowią atrakcyjny cel dla nowej generacji antybiotyków. Ponieważ w komórce bakteryjnej helikaza silnie oddziałuje z prymazą, a ponadto prymaza stymuluje aktywność helikazy, trudno jest badać każde z tych białek osobno. Jedną z metod, która pozwala na ilościowe oznaczenie aktywności prymazy DnaG w obecności helikazy DnaB jest wysokoprzepustowy test, polegający na sprzężeniu aktywności prymazy z reporterowym enzymem – pirofosfatazą [6]. Difosforan powstający w wyniku działania prymazy jest substratem dla pirofosfatazy. Ta ostatnia przekształca go do dwóch reszt fosforanowych, których detekcję przeprowadza się kolorymetrycznie w płytkach wielodołkowych (ryc. 1). Metoda umożliwiła przeszukanie kolekcji wielu cząsteczek o potencjalnym hamującym działaniu na prymazę. Pozwoliła na wyselekcjonowanie trzech związków, z których dwa – doksorubicyna oraz suramina, wcześniej znane jako leki przeciwnowotworowe [37], okazały się silnymi inhibitorami prymazy. Autorzy sugerują, że działanie suraminy polega na konkurencji z trifosforanami nukleotydów o miejsce wiązania do prymazy. Podobnie jak suramina, również doksorubicyna zawiera w swojej strukturze grupy aromatyczne, które mogą się wiązać do miejsc aktywnych prymazy i w ten sposób uniemożliwiać wiązanie DNA lub trifosforanów rybonukleotydów [6].

Pierwszą helikazą o znanej strukturze trzeciorzędowej było plazmidowe białko RepA, którego homologi są kodowane na plazmidach obecnych zarówno u bakterii Gram- -ujemnych jak i Gram-dodatnich [55]. Stąd poszukiwania inhibitorów replikacji skupiły się początkowo właśnie na tym białku. Wykazano, że naturalnie występujące wśród bakterii, grzybów i roślin wyższych związki flawonowe o strukturze podobnej do naftochinonu hamują helikazę RepA [11]. Jeden z testowanych związków, myricetyna najsilniej hamował białko RepA zarówno in vitro, jak również in vivo. W późniejszych badaniach udowodniono, że myricetyna swoiście hamuje również kodowaną na chromosomie helikazę DnaB, lecz nie wpływa na aktywność bakteryjnej prymazy DnaG [26].

Zhang i wsp. opracowali wysokoprzepustowy test, umoż- liwiający badanie aktywności prymazy DnaG w obecności białka DnaB, które stymuluje aktywność prymazy [24]. W teście tym prymaza syntetyzuje startery RNA w obecności znakowanego izotopowo nukleotydu ([3 H]-CTP) na matrycy jednoniciowego DNA (ryc. 2). Poziom syntezy radioaktywnych starterów jest rejestrowany w liczniku scyntylacyjnym. Stosując opisany test poszukiwano związków o działaniu hamującym na jeden i/lub oba enzymy. Swoistość oddziaływania wyselekcjonowanych cząsteczek zweryfikowano badając aktywność helikazy DnaB za pomocą techniki FRET (fluorescence resonance energy transfer). Fluorescencja barwnika Texas Red związanego do 5‘-końca dwuniciowego, częściowo rozplecionego odcinka DNA była wyciszana przez cząsteczkę Dabcylu umiejscowionego na komplementarnej nici (ryc. 3). Po rozpleceniu nić z barwnikiem Texas Red hybrydyzowa- ła z obecną w mieszaninie reakcyjnej komplementarną nicią DNA niezwiązaną z wygaszaczem, co skutkowało przyrostem fluorescencji w próbce. Inhibitory, które hamowały syntezę starterów RNA, a nie hamowały rozplatania podwójnej helisy DNA, określano mianem swoistych względem prymazy, natomiast hamujące obie reakcje – inhibitorami mieszanymi. Metoda ta pozwoliła na wyselekcjonowanie cząsteczek z grupy triaminotriazyn, które autorzy opisują jako inhibitory helikazy DnaB. Triaminotriazyny nie wykazywały działania antybiotycznego przeciw bakteriom Gram-ujemnym, takim jak P. areuginosa czy E. coli, a hamowały wzrost bakterii Gram-dodatnich (S. aureus, Streptococcus pneumoniae), a nawet grzybów z rodzaju Candida. Jednak związki z tej grupy wykazywały dużą cytotoksyczność względem komórek eukariotycznych w testach przeprowadzonych na liniach komórkowych HeLa. Triaminotriazyny wydają się ciekawymi związkami z punktu widzenia nowoczesnej antybiotykoterapii, konieczne są jednak ich modyfikacje mające na celu zmniejszenie cytotoksyczności oraz zwiększenie efektywności przenikania do komórek bakteryjnych

Najważniejszym białkiem w całym aparacie replikacyjnym jest polimeraza DNA. U większości bakterii rolę replikatywnej polimerazy, w odróżnieniu od innych polimeraz biorących udział np. w naprawie DNA, pełni polimeraza DNA III (DnaE1). Badanie stechiometrii replisomu u bakterii E. coli wykazało, że na jedne widełki replikacyjne przypadają trzy cząsteczki białka DnaE1 [52]. Jednak niektóre Gram-dodatnie bakterie, takie jak Bacillus subtilis, mają dwie różne replikatywne polimerazy DNA, DnaE3 i PolC w widełkach replikacyjnych [53]. Polimeraza DnaE3 jest homologiem białka DnaE1, natomiast PolC zawiera dodatkową podjednostkę o aktywności 3‘→5‘ egzonukleazowej, która jest homologiem podjednostki ε oraz wykazuje inną względem DnaE1/DnaE3 aranżację przestrzenną domen funkcjonalnych. Oba białka (PolC i DnaE3) są niezbędne do przeżycia B. subtilis [16].

Jak dotąd nie zidentyfikowano inhibitorów swoistych względem polimerazy DNA DnaE1. Jedynie Shakya i wsp. opisali podstawione różnymi grupami funkcyjnymi analogi nukleozydów pirymidynowych [57,63], które hamowały wzrost bakterii z rodzaju Mycobacterium. Mechanizm działania tych związków musi jeszcze zostać wyjaśniony. Wiadomo jednak, że pochodne 5-hydroksymetylotymidyny hamowały replikację E. coli. Są tym bardziej interesujące, gdyż cechują się niewielką cytotoksycznością względem komórek eukariotycznych.

Polimeraza PolC wydaje się ciekawym obiektem w poszukiwaniu nowych antybiotyków. Wykazano, że dwie grupy związków: 6-anilinouracyle (6-AU) [14,28,36] i bischinole [28] hamowały aktywność białka PolC. Na uwagę zasługuje jeszcze trzecia grupa związków – cząsteczki hybrydowe, np. połączenie chinolonów z 6-anilinouracylem w sposób skojarzony hamowały aktywność zarówno białka PolC jak i gyrazy [11,80]. Od czasu poznania mechanizmu działania pochodnych 6-anilinouracyli (6-AU), większość badań skupiła się na syntezie związków pochodnych i badaniu ich zdolności do hamowania wzrostu mikroorganizmów. Mechanizm działania tych związków polega na współzawodnictwie z dGTP podczas syntezy DNA. Z jednej strony inhibitory te tworzą potrójne wiązanie wodorowe z cytozyną w helisie DNA, z drugiej natomiast – wiążą się w centrum aktywnym enzymu, unieczynniając go w ten sposób [14]. Tarantino i wsp. wykazali przeciwbakteryjne działanie 3-N pochodnych anilinouracyli w stosunku do S. aureus, B. subtilis, Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium [69]. W badaniach Daly’ego i wsp. porównano działanie przeciwbakteryjne 3-N pochodnych 6-AU i konwencjonalnych antybiotyków, takich jak klindamycyna, wankomycyna, penicylina G, oksofloksacyna, oksacylina, ryfampina i in., wobec szpitalnych szczepów S. aureus, E. faecium oraz E. faecalis [14]. Wyniki badań okazały się obiecujące, żaden z badanych szczepów nie wykazywał krzyżowej oporności z cząsteczkami pochodnych 6-AU. Związki te hamowały wzrost mikroorganizmów już w mikromolowym stężeniu, a w stężeniu odpowiadającym dwukrotnej wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC – minimal inhibitory concentration) wykazywały działanie bakteriobójcze przeciw klinicznym izolatom badanych ziarniaków. Jednak dużą wadą 6-AU oraz pochodnych jest ich bardzo mała rozpuszczalność w wodzie oraz biodostępność [53].

Do badania inhibitorów PolC S. aureus opracowano wysokoprzepustowy test luminescencyjny [36]. Zasada metody jest tożsama z tą, która znalazła zastosowanie w sekwencjonowaniu drugiej generacji, tzw. pirosekwencjonowaniu (ryc. 4). W dwuetapowej reakcji, najpierw z zastosowaniem sulfurylazy ATP, a następnie lucyferazy, powstający w wyniku polimeryzacji DNA pirofosforan zostaje użyty do wzbudzenia lucyferyny. Po wzbudzeniu białko to emituje strumień fotonów o określonej długości fali, który jest rejestrowany przez odpowiedni detektor. Test może być przydatny do przeszukiwania bibliotek różnych cząsteczek w celu identyfikacji nowych inhibitorów PolC.

Drugim podejściem metodycznym do pomiaru aktywności polimerazy w testach in vitro jest monitorowanie przyrostu produktów reakcji przez zastosowanie fluorescencyjnych interkalatorów. Związki te wbudowują się w podwójną helisę powstającego DNA i pozwalają na ilościowe jego oznaczenie. Guiles i wsp. przystosowali eksperyment do płytek wielodołkowych, tworząc wysokoprzepustowy fluorescencyjny test hamowania aktywności białka PolC [28]. W ten sposób przeszukali kolekcję niskocząsteczkowych związków, z których kwazolino-2-ilamino-kwanazolino-4-ole (bischinole) wykazywały działanie hamujące aktywność białka PolC.

Podstawiając w N-pozycję 6-anilinouracyli cząsteczkę fluorochinolonów, odkryto nową grupę inhibitorów, które wykorzystywały skojarzone działanie obu cząsteczek [11,80]. Jedna z takich cząsteczek hybrydowych, nazwana 21D, wykazywała szeroki zakres działania przeciwko klinicznie izolowanym szczepom bakterii Gram-dodatnich, w tym również szczepów wielolekoopornych. Związek 21D wykazywał 5-15 razy silniejsze działanie bakteriobójcze niż wyjściowa cząsteczka 6-AU. Interesujące jest również to, że związek 21D hamował wzrost bakterii Gram-dodatnich oraz w mniejszym stopniu bakterii Gram-ujemnych. Autorzy uważają, że większy skutek przeciwbakteryjny można będzie uzyskać podstawiając różne cząsteczki fluorochinolonów do cząsteczki 6-AU.

Wyżej opisane metody przesiewowego poszukiwania inhibitorów replikacji pozwalają szybko wyselekcjonować z całej puli dostępnych związków te, które potencjalnie mogą hamować aktywność białek replikacyjnych. Dodatkowo połączenie technik przesiewowych z modelowaniem komputerowym otwiera możliwości w projektowaniu nowych antybiotyków.

Metody poszukiwania inhibitorów zaburzających oddziaływania między podjednostkami replisomu

Replisomy są makrokompleksami, w których oddziaływanie między poszczególnymi elementami jest istotne do utrzymania spójności strukturalnej i funkcjonalnej całej maszynerii replikacyjnej. Cząsteczki zaburzające oddziaływania mogą być podstawą nowoczesnej antybiotykoterapii. Największe nadzieje wzbudza zaburzanie oddziaływań między partnerami białek SSB oraz DnaN.

Wysokoprzepustowy test polegający na pomiarze anizotropii fluorescencji [22] pozwolił wyselekcjonować związek nazwany RU7, który zaburzał oddziaływanie β-klamry (dimer białka DnaN) z polimerazą DNA E. coli (Pol III). W doświadczeniu wykorzystano krótki peptyd znakowany fluorescencyjnie o sekwencji identycznej z C-końcem Pol III. Wykazano, że związek RU7 zaburza oddziaływanie peptyd- β-klamra przez konkurencję o miejsce wiązania, co powoduje spadek anizotropii fluorescencji w roztworze. DnaN oddziałuje w komórkach bakterii także z polimerazami DNA II i IV. Jednak różny sposób wiązania β-klamry do wszystkich wspomnianych polimeraz przejawia się w różnej sile oddziaływania z nimi. Związek RU7 blokuje replikację zależną od Pol III 5 i 50 razy wydajniej niż syntezę DNA prowadzoną odpowiednio przez Pol III  i Pol IV.

Po rozpleceniu podwójnej helisy, DNA jest narażone na uszkodzenia oraz na ponowną lub przypadkową hybrydyzację [42]. Stanowi to poważne zagrożenie dla integralności chromosomu. Ochronę przed uszkodzeniami w miejscach rozplecenia DNA zapewniają białka SSB. Biorą udział w replikacji, rekombinacji oraz naprawie DNA, a także rekrutują do jednoniciowego DNA wiele białek o właściwościach enzymatycznych. Wykazano, że C-końcowa domena białek SSB jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania i oddziaływania z innymi partnerami białkowymi, w tym z egzonukleazą I E. coli [41]. W celu identyfikacji inhibitorów tego oddziaływania opracowano test analogiczny do poszukiwania inhibitorów β-klamry. Krótki peptyd stanowiący C-końcowy fragment białka SSB znakowano fluoresceiną i badano dysocjację kompleksu peptyd-egzonukleaza I, co można było obserwować jako zmianę polaryzacji fluorescencji. W technice tej wykorzystano to, że fluorofor wzbudzony przez spolaryzowane światło emituje w różnym stopniu (zależnym od siły wiązania i wielkości cząsteczki) również światło spolaryzowane (FP – fluorescencepolarization). Cztery z badanych związków blokowały oddziaływanie między białkiem SSB a egzonukleazą I. Związki te w różnym stopniu zaburzały również oddziaływanie białka SSB z innymi jego znanymi partnerami białkowymi: RecQ (bierze udział w rekombinacji plazmidów oraz naprawie DNA) i PriA (składnik prymosomu) z E. coli.

Gyraza jako cel dla antybiotyków

Od wielu lat głównym celem poszukiwanych leków antybakteryjnych jest gyraza, należąca do grupy topoizomeraz typu II. Jej homologi, powszechne u bakterii i niezbędne do ich przeżycia, nie są obecne u eukariontów. Enzym zbudowany z dwóch homodimerów odpowiednio białek GyrA oraz GyrB, jest odpowiedzialny za utrzymywanie odpowiedniego poziomu ujemnego superskręcenia DNA w komórce oraz za usuwanie pozytywnych superskrętów z cząsteczki DNA generowanych miejscowo podczas jej rozplatania. Istnieje dzisiaj wiele testów mających na celu określenie aktywności tego enzymu w obecności potencjalnych inhibitorów. Ze względu na to, że gyraza do swojej aktywności wymaga dostarczenia energii w postaci ATP, część testów opiera się na pomiarze zdolności gyrazy do hydrolizy ATP w sprzężeniu z oksydacją NADH, co jest wykrywane przez oznaczenia kolorymetryczne [8,27]. Przy projektowaniu inhibitorów gyrazy wykorzystuje się również zdolność tego enzymu do przekształcania zrelaksowanego DNA w formę superskręconą [48]. Klasyczna metoda badania aktywności topoizomerazowej polega na określaniu zmian w konformacji DNA spowodowanych przez topoizomerazy przez rozdzielane różniących się gęstością superhelikalną form topologicznych DNA (topoizomerów) w żelu agarozowym, barwienie żelu fluorescencyjnymi barwnikami, tj. bromek etydyny, a następnie ilościowe oznaczanie intensywności fluorescencji poszczególnych izoform DNA. Jest to jednak podejście wieloetapowe, nie daje możliwości określenia inhibitorów poszczególnych podjednostek gyrazy (GyrA, GyrB) oraz nie pozwala bezpośrednio badać domeny wiążącej ATP.

W celu wykrywania kompetycyjnych inhibitorów gyrazy, a także innych strukturalnie powiązanych topoizomeraz wprowadzono i rozwinięto technikę wykorzystującą polaryzację fluorescencji. W oparciu o krystaliczną strukturę kompleksu GyrB/nowobiocyna zaprojektowano i zsyntetyzowano nowe fluorescencyjne sondy oparte na kowalencyjnym wiązaniu fluoroforu do badanych związków [24]. Dzięki tej metodzie autorzy wyselekcjonowali znane dotąd inhibitory gyrazy przeszukując bibliotekę FDA (Food and Drug Administration), potwierdzając tym samym użyteczność tej techniki w przeszukiwaniach większych bibliotek związków chemicznych w wyniku ich koniugacji z fluoroforem i analizy widma FP.

Znanych jest wiele związków chemicznych o różnych mechanizmach wiązania, hamujących aktywność bakteryjnych gyraz, z czego wiele jest z powodzeniem wykorzystywanych w leczeniu klinicznym. Natomiast nadal nie są znane selektywne inhibitory bakteryjnej topoizomerazy I, drugiego oprócz gyrazy głównego enzymu dla utrzymania struktury chromosomu. Dzisiaj wiele nadziei wiąże się właśnie z topoizomerazą I jako celem nowych grup związków chemicznych o własnościach przeciwbakteryjnych [51,67,73].

Rozwiązanie struktury krystalicznej bakteryjnej topoizomerazy I w kompleksie z DNA [79] stworzyło szansę komputerowego modelowania i dokowania związków chemicznych potencjalnie mogących zaburzać oddziaływanie białka z DNA lub, podobnie jak znane inhibitory gyraz, stabilizować toksyczny dla komórki, kowalencyjny kompleks TopA-DNA. Metody modelowania inhibitorów w oparciu o znane struktury krystaliczne były już wcześniej z powodzeniem stosowane dla topoizomeraz typu II [61]. Modelowanie komputerowe jest jednak nadal techniką, która nie daje gwarancji na to, że wytypowany związek będzie rzeczywiście wpływał na aktywność białka, do którego się wiąże. W rzeczywistości tylko niewielki odsetek proponowanych związków chemicznych działa w testach in vitro oraz in vivo. Mimo pewnych ograniczeń modelowanie komputerowe zawęża grono potencjalnie użytecznych cząsteczek i znacznie obniża koszty ich poszukiwania, redukując potrzebę przeszukiwania ogromnych bibliotek związków chemicznych w klasycznych testach przesiewowych.

Wysokoprzepustowe techniki – nowe wyzwanie w poszukiwaniu inhibitorów bakteryjnych topoizomeraz

Prowadzenie testów przesiewowych w poszukiwaniu inhibitorów topoizomeraz wymaga przeprowadzania tysięcy mikroreakcji. Wykorzystanie klasycznych metod w testach przesiewowych jest utrudnione, gdyż odczyt wyniku wymagałby przygotowania setek żeli agarozowych w celu weryfikacji zmian w topologii DNA. Metoda jest mało wydajna, czaso- i pracochłonna, a przez to mało praktyczna do zastosowania w zautomatyzowanej wysokoprzepustowej procedurze przesiewowego poszukiwania (HTS – high-throughputscreening) dużych bibliotek, zawierających setki tysięcy związków chemicznych.

Jedna z metod oparta na zbliżeniowym teście scyntylacyjnym (SPA – scintillation proximity assay) została wprowadzona do bezpośredniej analizy domeny wiążącej ATP GyrB. W teście tym znakowany izotopem ligand (w tym przypadku [ 3 H]dihydronowobiocyna) jest dokowany w kieszeni wiążącej ATP biotynylowanej podjednostki GyrB, która jest unieruchomiona na kulkach SPA pokrytych streptawidyną. Emitowane przez ligand promieniowanie β jest rejestrowane przez detektor promieniowana jonizującego. Inhibitor wiążąc się do podjednostki gyrazy wypiera radioaktywny ligand powodując zmniejszenie wartości odczytu. Technikę tę wyróżnia selektywność w stosunku do poszukiwania inhibitorów podjednostki GyrB, a także, w przeciwieństwie do większości standardowych metod, brak konieczności rozdzielania produktów reakcji w żelu agarozowym [23].

W przypadku topoizomeraz typu I alternatywnym podejściem względem klasycznej metody z wykorzystaniem żeli agarozowych jest fluorometryczny test wykorzystujący róż- nicę w wiązaniu bromku etydyny lub innych fluorescencyjnych interkalatorów do superskręconego DNA w porównaniu z jego postacią zrelaksowaną [2]. Mimo że technika wydaje się użyteczna w badaniach przesiewowych, to jednak ma pewne ograniczenia. Stosunkowo niski poziom sygnału oraz niewielka różnica odczytu między obiema wyżej wspomnianymi postaciami DNA powodują, że uzyskanie jednoznacznego wyniku może być utrudnione.

Metoda przesiewowego poszukiwania inhibitorów topoizomeraz (zarówno typu I jak i II) zaproponowana przez Maxwella i wsp. opiera się na zdolności tworzenia kompleksu między cząsteczką plazmidowego DNA i zakotwiczonym oligonukleotydem (ryc. 5) [43]. Kompleks taki jest tworzony efektywniej, gdy plazmid znajduje się w stanie superskręconym. Takie podejście pozwala na monitorowanie topologii plazmidu bez konieczności rozdzielania jego topologicznych form i ich analizy w żelu agarozowym. Technika była do tej pory testowana w ograniczonym zakresie, jednak pozwoliła na identyfikację związków o charakterze inhibitorów bakteryjnej gyrazy i topoizomerazy VI [70], a zasada metody może być z powodzeniem stosowana do poszukiwań na większą skalę. Metoda opisana przez Shapiro i wsp. oparta jest również na tworzeniu kompleksu, w którym nić oligonukleotydu znakowana jest barwnikiem fluorescencyjnym [58]. Zmiany stosunku zrelaksowanego i superskręconego DNA są określane przez odczyt anizotropii fluorescencji. Przewagą tej metody jest uproszczenie procedury, bowiem oligonukleotyd nie jest unieruchomiony do podłoża. Wadą jest natomiast zapotrzebowanie na duże ilości plazmidu w jednorodnym topologicznie stanie, co pociąga za sobą duże koszty związane z oczyszczaniem plazmidu. Dodatkową trudnością w prawidłowej analizie wyników może być potencjalny wpływ badanych związków na anizotropię fluorescencji.

Stosunkowo prostą i szybką metodą badań przesiewowych, której celem jest identyfikacja cząsteczek skierowanych przeciwko białkom oddziałującym z DNA, w tym również topoizomerazie I jest mikromiareczkowanie wykorzystujące testy ELISA. Jedna z metod polega na wykrywaniu przeciwciał monoklonalnych swoiście wiążących ten enzym. Hamowanie aktywności analizowanych białek przez przeciwciała jest oceniane in situ w testach relaksacji DNA, przez dodanie superskręconego DNA bezpośrednio do studzienek płytki, a następnie analizę produktów reakcji w żelu agarozowym [39]. Tego typu badania przeprowadzano z sukcesem m.in. dla topoizomerazy IA pochodzącej z Mycobacterium smegmatis [38].

Ciekawą alternatywą dla metod in vitro jest poszukiwanie związków wpływających na aktywność topoizomeraz bezpośrednio w żywych komórkach. W metodzie tej wykorzystywany jest gen reporterowy kontrolowany przez promotor wrażliwy na zmiany topologii DNA [3]. Zmiana w poziomie transkrypcji genu reporterowego jest pochodną zmian w aktywności topoizomeraz. Niewątpliwie zaletą tej metody jest analiza nie tylko zdolności danego związku do hamowania aktywności topoizomeraz, ale również jego zdolność do przenikania bariery, jaką jest błona/ściana komórkowa. Ze względu na to, że enzymów wpływających na topologię DNA i mogących potencjalnie regulować ekspresję genu reporterowego jest kilka, jednoznaczna identyfikacja celu działania odkrytego związku może być utrudniona, co stanowi pewne ograniczenie metody.

Podsumowanie

Replikacja DNA jest podstawowym procesem w dzielących się komórkach, a jej prawidłowy przebieg zapewnia ciągłość przekazywania informacji genetycznej z pokolenia na pokolenie. Blokowanie tego procesu wydaje się zatem podstawowym sposobem hamowania namnażania mikroorganizmów, a w przypadku szczepów chorobotwórczych ich zwalczania. Pewne różnice w przebiegu replikacji DNA oraz budowie replisomów między bakteriami i eukariontami pozwalają na swoiste zwalczanie chorobotwórczych bakterii przy jednoczesnym minimalizowaniu niepożądanych skutków dla chorego. W dobie rosnącej lekooporności replikacja chromosomów bakteryjnych jest intensywnie badanym procesem, a poszukiwanie nowych tarcz terapeutycznych w ostatnich latach staje się priorytetem dla coraz większej liczby zespołów badawczych. Świadczy o tym opracowywanie nowych technik, za pomocą których poszukuje się związków o potencjalnych właściwościach antybiotycznych. Dokładne poznanie mechanizmów replikacji chromosomów bakteryjnych jest nadzieją na znalezienie w przyszłości nowych grup związków chemicznych hamujących ten proces. Połączenie technik wysokoprzepustowych oraz komputerowego modelowania stwarza szansę na jednoczesne przeszukiwanie ogromnej puli związków chemicznych hamujących replikację, a po ich wstępnym wyodrębnieniu, na przewidywanie modyfikacji zwiększających ich efektywność działania, rozpuszczalność oraz zdolność przenikania do komórek.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr hab. Dagmarze Jakimowicz i prof. dr hab. Jolancie Zakrzewskiej-Czerwińskiej za dyskusje i cenne uwagi w trakcie pisania manuskryptu.

Przypisy

• 1. Adachi T., Mizuuchi M., Robinson E.A., Appella E., O’Dea M.H., GellertM., Mizuuchi K.: DNA sequence of the E. coli gyrB gene: applicationof a new sequencing strategy. Nucleic Acids Res., 1987; 15: 771-784
  Google Scholar
• 2. Andrea J.E., Adachi K., Morgan A.R.: Fluorometric assays for DNAtopoisomerases and topoisomerase-targeted drugs: quantitation ofcatalytic activity and DNA cleavage. Mol. Pharmacol., 1991; 40: 495-501
  Google Scholar
• 3. Andrews B., Barth P., Mill S., Yang W.: Topoisomerase modulatorassays. 55. Patent application WO 2004/087963 A1
  Google Scholar
• 4. Bailey S., Eliason W.K., Steitz T.A.: Structure of hexameric DnaBhelicase and its complex with a domain of DnaG primase. Science,2007; 318: 459-463
  Google Scholar
• 5. Bergerat A., de Massy B., Gadelle D., Varoutas P.C., Nicolas A., ForterreP.: An atypical topoisomerase II from Archaea with implicationsfor meiotic recombination. Nature, 1997; 386: 414-417
  Google Scholar
• 6. Biswas T., Resto-Roldán E., Sawyer S.K., Artsimovitch I., TsodikovOV.: A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assayand its application to the discovery of inhibitors of Mycobacteriumtuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res., 2013; 41: e56
  Google Scholar
• 7. Blinkova A., Hervas C., Stukenberg P.T., Onrust R., O’Donnell M.E.,Walker J.R.: The Escherichia coli DNA polymerase III holoenzymecontains both products of the dnaX gene, tau and gamma, but onlytau is essential. J. Bacteriol., 1993; 175: 6018-6027
  Google Scholar
• 8. Boehm H.J., Boehringer M., Bur D., Gmuender H., Huber W., KlausW., Kostrewa D., Kuehne H., Luebbers T., Meunier-Keller N., MuellerF.: Novel inhibitors of DNA gyrase: 3D structure based biased needlescreening, hit validation by biophysical methods, and 3D guidedoptimization. A promising alternative to random screening. J. Med.Chem., 2000; 43:2664-2674
  Google Scholar
• 9. Brown P.O., Cozzarelli N.R.: Catenation and knotting of duplexDNA by type 1 topoisomerases: a mechanistic parallel with type 2topoisomerases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981; 78: 843-847
  Google Scholar
• 10. Browning D.F., Grainger D.C., Busby S.J.: Effects of nucleoidassociatedproteins on bacterial chromosome structure and geneexpression. Curr. Opin. Microbiol., 2010; 13: 773-780
  Google Scholar
• 11. Butler M.M., Lamarr W.A., Foster K.A., Barnes M.H., Skow DJ.,Lyden P.T., Kustigian L.M., Zhi Ch., Brown N.C., Wright G.E., BowlinT.L.: Antibacterial activity and mechanism of action of a novel anilinouracil-fluoroquinolonehybrid compound. Antimicrob. AgentsChemother., 2007; 51: 119-127
  Google Scholar
• 12. Calhoun J.H., Murray C.K., Manring M.M.: Multidrug-resistantorganisms in military wounds from Iraq and Afghanistan. Clin. Orthop.Relat. Res., 2008; 466: 1356-1362
  Google Scholar
• 13. Confalonieri F., Elie C., Nadal M., de La Tour C., Forterre P., DuguetM.: Reverse gyrase: a helicase-like domain and a type I topoisomerasein the same polypeptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993;90: 4753-4757
  Google Scholar
• 14. Daly J.S., Giehl T.J., Brown N.C., Zhi C., Wright G.E., Ellison R.T.:In vitro antimicrobial activities of novel anilinouracils which selectivelyinhibit DNA polymerase III of gram-positive bacteria. Antimicrob.Agents Chemother., 2000; 44: 2217-2221
  Google Scholar
• 15. D’Arpa P., Machlin P.S., Ratrie H., Rothfield N.F., Cleveland D.W.,Earnshaw W.C.: cDNA cloning of human DNA topoisomerase I: catalyticactivity of a 67.7-kDa carboxyl-terminal fragment. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 1988; 85: 2543-2547
  Google Scholar
• 16. Dervyn E., Suski C., Daniel R., Bruand C., Chapuis J., ErringtonJ., Janniere L., Ehrlich S.D.: Two essential DNA polymerases at thebacterial replication fork. Science, 2001; 294: 1716-1719
  Google Scholar
• 17. DiGate R.J., Marians K.J.: Molecular cloning and DNA sequenceanalysis of Escherichia coli topB, the gene encoding topoisomeraseIII. J. Biol. Chem., 1989; 264: 17924-17930
  Google Scholar
• 18. Dillon S.C., Dorman C.J.: Bacterial nucleoid-associated proteins,nucleoid structure and gene expression. Nat. Rev. Microbiol., 2010;8: 185-195
  Google Scholar
• 19. Durnford J.M., Champoux J.J.: The DNA untwisting enzyme fromSaccharomyces cerevisiae. Partial purification and characterization.J. Biol. Chem. 1978; 253: 1086-1089
  Google Scholar
• 20. Falagas M.E., Koletsi P.K., Bliziotis I.A.: The diversity of definitionsof multidrug-resistant (MDR) and pandrug-resistant (PDR)Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa. J. Med.Microbiol., 2006; 55: 1619-1629
  Google Scholar
• 21. Fijalkowska I.J., Schaaper R.M., Jonczyk P.: DNA replication fidelityin Escherichia coli: a multi-DNA polymerase affair. FEMS Microbiol.Rev., 2012; 36: 1105-1121
  Google Scholar
• 22. Georgescu R.E., Yurieva O., Kim S.S., Kuriyan J., Kong X.P.,O’Donnell M.: Structure of a small-molecule inhibitor of a DNA polymerasesliding clamp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008; 105: 11116-11121
  Google Scholar
• 23. Gevi M., Domenici E.: A scintillation proximity assay amenablefor screening and characterization of DNA gyrase B subunit inhibitors.Anal. Biochem., 2002; 300: 34-39
  Google Scholar
• 24. Glaser B.T., Malerich J.P., Duellman S.J., Fong J., Hutson C., FineR.M., Keblansky B., Tang M.J., Madrid P.B.: A high-throughput fluorescencepolarization assay for inhibitors of gyrase B. J. Biomol.Screen, 2011; 16: 230-238
  Google Scholar
• 25. Green M., Barner H.D., Cohen S.S.: Studies on the biosynthesisof bacterial and viral pyrimidines. V. Hydrogenation of 5-hydroxymethylpyrimidines.J. Biol. Chem., 1957; 228: 621-631
  Google Scholar
• 26. Griep M.A., Blood S., Larson M.A., Koepsell S.A., Hinrichs S.H.:Myricetin inhibits Escherichia coli DnaB helicase but not primase.Bioorg. Med. Chem., 2007; 15: 7203-7208
  Google Scholar
• 27. Gross C.H., Parsons J.D., Grossman T.H., Charifson P.S., Bellon S.,Jernee J., Dwyer M., Chambers S.P., Markland W., Botfield M., RaybuckS.A.: Active-site residues of Escherichia coli DNA gyrase requiredin coupling ATP hydrolysis to DNA supercoiling and amino acidsubstitutions leading to novobiocin resistance. Antimicrob. AgentsChemother., 2003; 47: 1037-1046
  Google Scholar
• 28. Guiles J., Sun X., Critchley I.A., Ochsner U., Tregay M., StoneK., Bertino J., Green L., Sabin R., Dean F., Dallmann H.G., McHenryC.S., Janjic N.: Quinazolin-2-ylamino-quinazolin-4-ols as novel nonnucleosideinhibitors of bacterial DNA polymerase III. Bioorg. Med.Chem. Lett., 2009; 19: 800-802
  Google Scholar
• 29. Hanai R., Caron P.R., Wang J.C.: Human TOP3: a single-copy geneencoding DNA topoisomerase III. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1996;93: 3653-3657
  Google Scholar
• 30. Hardy C.D., Cozzarelli N.R.: Alteration of Escherichia coli topoisomeraseIV to novobiocin resistance. Antimicrob. Agents Chemother.,2003; 47: 941-947
  Google Scholar
• 31. Herendeen D.R, Kelly T.J.: DNA polymerase III: running ringsaround the fork. Cell, 1996; 84: 5-8
  Google Scholar
• 32. Jenkins J.R., Ayton P., Jones T., Davies S.L., Simmons D.L., HarrisA.L., Sheer D., Hickson I.D.: Isolation of cDNA clones encoding thebeta isozyme of human DNA topoisomerase II and localisation of thegene to chromosome 3p24. Nucleic Acids Res., 1992; 20: 5587-5592
  Google Scholar
• 33. Kato J., Nishimura Y., Imamura R., Niki H., Hiraga S., Suzuki H.:New topoisomerase essential for chromosome segregation in E. coli.Cell, 1990; 63: 393-404
  Google Scholar
• 34. Khann S., Mao E.T., Rajendra Y.P., Satyanarayana S., NagarajaS.B., Kumar A.M.: Linkage of presumptive multidrug resistant tuberculosis(MDR-TB) patients to diagnostic and treatment servicesin Cambodia. PloS One, 2013; 8: e59903
  Google Scholar
• 35. Kornberg A., Baker T.A.: The DNA replication. Second edition.W.H. Freeman & Co, New York 1992
  Google Scholar
• 36. Kuhl A., Svenstrup N., Ladel C., Otteneder M., Binas A., SchifferG., Brands M., Lampe T., Ziegelbauer K., Rubsamen-Waigmann H., HaebichD., Ehlert K.: Biological characterization of novel inhibitors ofthe gram-positive DNA polymerase IIIC enzyme. Antimicrob. AgentsChemother., 2005; 49: 987-995
  Google Scholar
• 37. Laginha K.M., Verwoert S., Charrois G.J., Allen T.M.: Determinationof doxorubicin levels in whole tumor and tumor nuclei inmurine breast cancer tumors. Clin. Cancer. Res., 2005; 11: 6944-6949
  Google Scholar
• 38. Leelaram M.N., Bhat A.G., Suneetha N., Nagaraja V., ManjunathR.: Immunological cross-reactivity of mycobacterial topoisomeraseI and divergence from other bacteria. Tuberc. Edinb. Scotl.;2009; 89: 256-262
  Google Scholar
• 39. Leelaram M.N., Suneetha N., Nagaraja V., Manjunath R.: A newELISA plate based microtiter well assay for mycobacterial topoisomeraseI for the direct screening of enzyme inhibitory monoclonalantibody supernatants. J. Immunol. Methods, 2010; 357: 26-32
  Google Scholar
• 40. López de Saro F.J., O’Donnell M.: Interaction of the beta slidingclamp with MutS, ligase, and DNA polymerase I. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 2001; 98: 8376-8380
  Google Scholar
• 41. Lu D., Bernstein D.A., Satyshur K.A., Keck J.L.: Small-moleculetools for dissecting the roles of SSB/protein interactions in genomemaintenance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010; 107: 633-638
  Google Scholar
• 42. Lu D., Windsor M.A., Gellman S.H., Keck J.L.: Peptide inhibitorsidentify roles for SSB C-terminal residues in SSB/exonuclease I complexformation. Biochemistry (Mosc), 2009; 48: 6764-6771
  Google Scholar
• 43. Maxwell A., Burton N.P., O’Hagan N.: High-throughput assaysfor DNA gyrase and other topoisomerases. Nucleic Acids Res., 2006;34: e104
  Google Scholar
• 44. McGlynn P., Lloyd R.G.: Recombinational repair and restart ofdamaged replication forks. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2002; 3: 859-870
  Google Scholar
• 45. McHenry C.S.: DNA polymerase III holoenzyme of Escherichiacoli: components and function of a true replicative complex. Mol.Cell. Biochem., 1985; 66: 71-85
  Google Scholar
• 46. McKay G.A., Reddy R., Arhin F., Belley A., Lehoux D., Moeck G.,Sarmiento I., Parr T.R., Gros P., Pelletier J., Far A.R.: TriaminotriazineDNA helicase inhibitors with antibacterial activity. Bioorg. Med.Chem. Lett., 2006; 16: 1286-1290
  Google Scholar
• 47. Messer W., Meijer M, Bergmans H.E., Hansen F.G., von MeyenburgK., Beck E., Schaller H.: Origin of replication, oriC, of the Escherichiacoli K12 chromosome: nucleotide sequence. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol., 1979; 43: 139-145
  Google Scholar
• 48. Moir D.T., Ming Di., Opperman T., Schweizer H.P., Bowlin T.L.:A high-throughput, homogeneous, bioluminescent assay for Pseudomonasaeruginosa gyrase inhibitors and other DNA-damagingagents. J. Biomol. Screen, 2007; 12: 855-864
  Google Scholar
• 49. Morais Cabral J.H., Jackson A.P., Smith C.V., Shikotra N., MaxwellA., Liddington R.C.: Crystal structure of the breakage-reunion domainof DNA gyrase. Nature, 1997; 388: 903-906
  Google Scholar
• 50. Nordmann P., Cuzon G., Naas T.: The real threat of Klebsiellapneumoniae carbapenemase-producing bacteria. Lancet Infect.Dis., 2009; 9: 228-236
  Google Scholar
• 51. Pommier Y.: Drugging topoisomerases: lessons and challenges.ACS Chem. Biol., 2013; 8: 82-95
  Google Scholar
• 52. Reyes-Lamothe R., Sherratt D.J., Leake M.C.: Stoichiometry andarchitecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli.Science, 2010; 328: 498-501
  Google Scholar
• 53. Robinson A., Causer R.J., Dixon N.E.: Architecture and conservationof the bacterial DNA replication machinery, an underexploiteddrug target. Curr. Drug Targets, 2012; 13: 352-372
  Google Scholar
• 54. Rothenberg M.L.: Topoisomerase I inhibitors: review and update.Ann. Oncol., 1997; 8: 837-855
  Google Scholar
• 55. Scherzinger E., Haring V., Lurz R., Otto S.: Plasmid RSF1010 DNAreplication in vitro promoted by purified RSF1010 RepA, RepB andRepC proteins. Nucleic Acids Res., 1991; 19: 1203-1211
  Google Scholar
• 56. Seville M., West A.B., Cull M.G., McHenry C.S.: Fluorometric assayfor DNA polymerases and reverse transcriptase. BioTechniques,1996; 21: 664-672
  Google Scholar
• 57. Shakya N., Srivastav N.C., Bhavanam S., Tse C., Desroches N.,Agrawal B., Kunimoto D.Y., Kumar R.: Discovery of novel 5-(ethyl orhydroxymethyl) analogs of 2’-’up’ fluoro (or hydroxyl) pyrimidinenucleosides as a new class of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacteriumbovis and Mycobacterium avium inhibitors. Bioorg. Med.Chem., 2012; 20: 4088-4097
  Google Scholar
• 58. Shapiro A., Jahic H., Prasad S., Ehmann D., Thresher J., Gao N.,Hajec L.: A homogeneous, high-throughput fluorescence anisotropy–based DNA supercoiling assay. J. Biomol. Screen, 2010; 15: 1088-1098
  Google Scholar
• 59. Shereda R.D., Kozlov A.G., Lohman T.M., Cox M.M., Keck J.L.: SSBas an organizer/mobilizer of genome maintenance complexes. Crit.Rev. Biochem. Mol. Biol., 2008; 43: 289-318
  Google Scholar
• 60. Shuman S., Moss B.: Identification of a vaccinia virus gene encodinga type I DNA topoisomerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987;84: 7478-7482
  Google Scholar
• 61. Siwek A., Stączek P., Stefańska J.: Synthesis and structure-activityrelationship studies of 4-arylthiosemicarbazides as topoisomeraseIV inhibitors with Gram-positive antibacterial activity. Search formolecular basis of antibacterial activity of thiosemicarbazides. Eur.J. Med. Chem., 2011; 46: 5717-5726
  Google Scholar
• 62. Slesarev A.I., Lake J.A., Stetter K.O., Gellert M,. Kozyavkin S.A.:Purification and characterization of DNA topoisomerase V. An enzymefrom the hyperthermophilic prokaryote Methanopyrus kandlerithat resembles eukaryotic topoisomerase I. J. Biol. Chem., 1994;269: 3295-3303
  Google Scholar
• 63. Srivastav N.C., Shakya N., Bhavanam S., Agrawal A., Tse C., DesrochesN., Kunimoto D.Y., Kumar R.: Antimycobacterial activitiesof 5-alkyl (or halo)-3’-substituted pyrimidine nucleoside analogs.Bioorg. Med. Chem. Lett., 2012; 22: 1091-1094
  Google Scholar
• 64. Stavans J., Oppenheim A.: DNA-protein interactions and bacterialchromosome architecture. Phys. Biol., 2006: 3: 1-10
  Google Scholar
• 65. Stillman B.: Cell cycle control of DNA replication. Science, 1996;274: 1659-1664
  Google Scholar
• 66. Swanberg S.L., Wang J.C.: Cloning and sequencing of the Escherichiacoli gyrA gene coding for the A subunit of DNA gyrase. J. Mol.Biol., 1987; 197: 729-736
  Google Scholar
• 67. Szafran M., Zakrzewska-Czerwińska J., Jakimowicz D.: Bakteryjnetopoizomerazy typu I – rola biologiczna i zastosowanie jakopotencjalnych celów dla antybiotyków. Postȩpy Hig. Med. Dośw.,2013; 67: 130-142
  Google Scholar
• 68. Taft-Benz S.A., Schaaper R.M.: The theta subunit of Escherichiacoli DNA polymerase III: a role in stabilizing the epsilon proofreadingsubunit. J. Bacteriol., 2004; 186: 2774-2780
  Google Scholar
• 69. Tarantino P.M., Zhi C., Wright G.E., Brown NC.: Inhibitors of DNApolymerase III as novel antimicrobial agents against gram-positiveeubacteria. Antimicrob. Agents Chemother., 1999; 43: 1982-1987
  Google Scholar
• 70. Taylor J.A., Mitchenall L.A., Rejzek M., Field R.A., Maxwell A.:Application of a novel microtitre plate-based assay for the discoveryof new inhibitors of DNA gyrase and DNA topoisomerase VI. PloSOne, 2013; 8: e58010
  Google Scholar
• 71. Topcu Z.: DNA topoisomerases as targets for anticancer drugs.J. Clin. Pharm. Ther., 2001; 26: 405-416
  Google Scholar
• 72. Tsai-Pflugfelder M., Liu L.F., Liu A.A., Tewey K.M., Whang-PengJ., Knutsen T., Huebner K., Croce C., Wang J.C: Cloning and sequencingof cDNA encoding human DNA topoisomerase II and localizationof the gene to chromosome region 17q21-22. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 1988; 85: 7177-7181
  Google Scholar
• 73. Tse-Dinh Y.C.: Bacterial topoisomerase I as a target for discoveryof antibacterial compounds. Nucleic Acids Res., 2009; 37: 731-737
  Google Scholar
• 74. Tse-Dinh Y.C., Wang J.C.: Complete nucleotide sequence of thetopA gene encoding Escherichia coli DNA topoisomerase I. J. Mol.Biol., 1986; 191: 321-331
  Google Scholar
• 75. Waga S., Stillman B.: The DNA replication fork in eukaryoticcells. Annu. Rev. Biochem., 1998; 67: 721-751
  Google Scholar
• 76. Wallis J.W., Chrebet G., Brodsky G., Rolfe M., Rothstein R.: A hyper-recombinationmutation in S. cerevisiae identifies a novel eukaryotictopoisomerase. Cell, 1989; 58: 409-419
  Google Scholar
• 77. Xu H., Ziegelin G., Schröder W., Frank J., Ayora S., Alonso J.C.,Lanka E., Saenger W.: Flavones inhibit the hexameric replicativehelicase RepA. Nucleic Acids Res., 2001; 29: 5058-5066
  Google Scholar
• 78. Zhang Y., Yang F., Kao Y.C., Kurilla M.G., Pompliano D.L., DickerI.B.: Homogenous assays for Escherichia coli DnaB-stimulated DnaGprimase and DnaB helicase and their use in screening for chemicalinhibitors. Anal. Biochem., 2002; 304: 174-179
  Google Scholar
• 79. Zhang Z., Cheng B., Tse-Dinh Y.C.: Crystal structure of a covalentintermediate in DNA cleavage and rejoining by Escherichia coli DNAtopoisomerase I. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011; 108: 6939-6944
  Google Scholar
• 80. Zhi C., Long Z.Y., Manikowski A., Comstock J., Xu W.C., BrownN.C., Tarantino P.M., Holm K.A., Dix E.J., Wright G.E.: Hybrid antibacterials.DNA polymerase-topoisomerase inhibitors. J. Med. Chem.,2006; 49: 1455-1465
  Google Scholar

Pełna treść artykułu