Abstrakt

The Fanconi anemia (FA) pathway is one of the DNA repair systems involved in removal of DNA crosslinks. Proteins which belong to this pathway are crucial to the protection of genetic information, whereas disturbances in their function have serious implications for the whole organism. Biallelic mutations in FA genes are the cause of Fanconi anemia – a genetic disease which manifests itself through numerous congenital abnormalities, chromosomal instability and increased predisposition to cancer. The FA pathway is composed of fifteen proteins. Eight of them, in the presence of DNA interstrand crosslinks (ICLs), form a nuclear core complex responsible for monoubiquitination of FANCD2 and FANCI, which is a key step of ICL repair. FA proteins which are not involved in the monoubiquitination step participate in repair of DNA double strand breaks via homologous recombination. Some of the FA proteins, besides having a direct role in the repair of DNA damage, are engaged in replication, cell cycle control and mitosis. The unperturbed course of those processes determines the maintenance of genome stability.

Wprowadzenie

Materiał genetyczny jest nieustannie narażony na działanie czynników endo- i egzogennych mogących prowadzić do jego uszkodzeń. Dlatego też komórki wykształciły wiele mechanizmów związanych z  ochroną integralności informacji genetycznej. Uszkodzenie DNA jednocześnie uruchamia kilka typów odpowiedzi komórki, do których należą aktywacja punktów kontrolnych cyklu komórkowego i systemów naprawy DNA, zmiana profilu transkrypcji oraz apoptoza. Białka uczestniczące w tych procesach ściśle ze sobą współpracują, a  zaburzenia ich funkcji prowadzą do niestabilności genomu. Sygnał o uszkodzeniu DNA jest przekazywany od białek sensorowych, a następnie przez białka mediatorowe i przekaźnikowe do białek efektorowych, które powodują m.in. zahamowanie cyklu komórkowego i zapoczątkowanie procesów naprawy DNA. Umożliwia to reperację materiału genetycznego i zapobiega przekazywaniu uszkodzonych lub nie w pełni zreplikowanych chromosomów do komórek potomnych. Gdy uszkodzeń w DNA jest zbyt wiele, komórka może zostać skierowana na drogę programowanej śmierci – apoptozy [74].

Do jednych z najgroźniejszych dla komórki uszkodzeń DNA należą międzyniciowe wiązania krzyżowe (ICLs – DNA interstrand crosslinks). Ich usuwanie jest procesem niezmierne skomplikowanym i  angażuje białka należące do szlaku naprawy przez wycięcie nukleotydu (NER – nucleotide excision repair), syntezy DNA z ominię- ciem miejsca uszkodzenia (TLS – translesion synthesis), naprawy błędnie sparowanych zasad (MMR – mismatch repair), rekombinacji homologicznej (HR – homologous recombination) oraz szlaku białek niedokrwistości Fanconiego (FA – Fanconi anemia), czyli niemal wszystkich znanych systemów reperacji genomu [15]. Szlak białek FA, jako jedyny uczestniczy w większości etapów usuwania wiązań krzyżowych, a także współdziała z pozostałymi systemami naprawczymi zaangażowanymi w ten proces. Mutacje genów kodujących białka szlaku FA powodują rozwój niedokrwistości Fanconiego. Choroba ta, podobnie jak ataksja-teleangiektazja, zespół Blooma, Xeroderma pigmentosum czy zespół Nijmegen, jest jednym z dziedzicznych zespołów chorobowych, których cechą charakterystyczną na poziomie komórkowym jest niestabilność chromosomalna, skutkująca u  chorych zwiększoną predyspozycją do karcynogenezy.

Obraz kliniczny niedokrwistości Fanconiego

Niedokrwistość Fanconiego jest rzadką chorobą genetyczną opisaną po raz pierwszy przez szwajcarskiego pediatrę Guido Fanconiego w 1927 r. Dotychczas zidentyfikowano 15 genów zaangażowanych w rozwój tej choroby (FANCA, FANCB, FANCC, BRCA2, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, BRIP1, FANCL, FANCM, PALB2, RAD51C i SLX4), które kodują białka tworzące tzw. szlak białek niedokrwistości Fanconiego (alternatywne nazwy genów FA wymieniane w piśmiennictwie przedstawiono w tabeli 1). Niedokrwistość Fanconiego jest najczęściej uwarunkowana mutacjami w  genach FANCA, FANCC oraz FANCG i dziedziczona w sposób autosomalny recesywny, a w przypadku mutacji genu FANCB w sposób recesywny sprzężony z chromosomem X [32,35]. Charakterystyczną cechą pacjentów cierpiących na to schorzenie są zaburzenia układu krwiotwórczego objawiające się anemią aplastyczną wynikającą z postępujących zaburzeń funkcji szpiku kostnego. Dodatkowo u chorych często występuje opóźnienie umysłowe oraz liczne wady wrodzone, do których należą mikrocefalia, hiperpigmentacja skóry, nieprawidłowości w budowie organów wewnętrznych, np. serca i nerek, a także liczne wady szkieletowe [35,82].

Choroba ta wiąże się również ze zwiększonym ryzykiem zachorowań na nowotwory, takie jak ostra białaczka szpikowa oraz nowotwory wątroby, głowy i szyi, przewodu pokarmowego, skóry, układu moczowego i piersi [11]. U 20% pacjentów rozwijają się one w bardzo wczesnym wieku. Najcięższy przebieg FA zaobserwowano u pacjentów posiadających mutacje w genie BRCA2 (breast cancer 2, early onset). W tej grupie chorych ryzyko wystąpienia chorób nowotworowych wynosi 60-80%. Rozwijają się w dzieciństwie między 4 a 10 rokiem życia [2]. Zaburzeń hematologicznych nie zaobserwowano jedynie w przypadku biallelicznych mutacji w genie RAD51C (RAD51 (S. cerevisiae) homolog C), dlatego choroba wywołana mutacją w tym genie jest często nazywana zespołem podobnym do niedokrwistości Fanconiego [88,100].

Na poziomie komórkowym niedokrwistość Fanconiego objawia się podwyższoną liczbą spontanicznych i indukowanych związkami sieciującymi DNA złamań chromosomów [11]. Często prowadzą one do powstania tzw. figur radialnych tworzących się w wyniku fuzji chromosomów [64]. Komórki pacjentów cechuje ponadto zwiększona apoptoza, częstsze mutacje oraz zaburzenia cyklu komórkowego przejawiające się wydłużoną fazą G2 [11]. Charakterystyczna dla niedokrwistości Fanconiego jest również nadwrażliwość komórek pacjentów na związki wprowadzające wiązania krzyżowe do DNA, która jest cechą wykorzystywaną w diagnostyce tego schorzenia. Fenotyp chorych uwarunkowany uszkodzeniami genów FA sugeruje, iż kodowane przez nie białka są zaangażowane w wiele ważnych procesów komórkowych.

Białka szlaku niedokrwistości Fanconiego

Większość białek należących do szlaku FA poznano w ostatniej dekadzie. Do końca lat dziewięćdziesiątych XX w. dzięki analizie komplementacyjnej, polegającej na hybrydyzacji komórek pochodzących od różnych pacjentów (ryc. 1), wśród chorych na niedokrwistość Fanconiego zidentyfikowano osiem grup komplementacyjnych [93]. Grupy te oznaczono literami A-H, a każda z nich reprezentowała pacjentów z mutacjami różnych genów. Do 2000 r. sklonowano część genów FA (FANCA, FANCC, FANCE, FANCF i FANCG) [3,12,13,14,93] oraz wycofano z klasyfikacji grupę H, ponieważ ponowna analiza komplementacyjna dowiodła, że pacjent z  tej grupy posiadał mutację w tym samym genie co chorzy z grupy A [31]. W następnym roku wykazano niejednorodność grupy D i ustalono, że chorzy przyporządkowani do tej grupy komplementacyjnej posiadają mutacje w dwóch różnych genach – FANCD1 i FANCD2 [99]. W naastępnych latach dynamiczny rozwój technik biologii molekularnej umożliwił odkrycie i poznanie sekwencji aż dziewięciu pozostałych genów szlaku FA (FANCB, BRCA2/FANCD1, FANCI, BRIP1, FANCL, FANCM, PALB2, RAD51C oraz SLX4) [17,28,44,56,57,58,72,91,100].

Spośród znanych obecnie piętnastu białek szlaku niedokrwistości Fanconiego, osiem tworzy tzw. kompleks jądrowy (FANCA, FANCB, FANCC, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL oraz FANCM). Kompleks ten powstaje przypuszczalnie w kilku etapach z połączenia mniejszych kompleksów białkowych, jednak dokładny proces jego tworzenia nadal nie został w pełni poznany. Najprawdopodobniej subkompleksy FANCL-FANCB oraz FANCA-FANCG są transportowane z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie łączą się z białkiem FANCM. Do tego kompleksu przyłącza się kolejny subkompleks FANCC- -FANCE, a następnie białko FANCF [55].

Kompleks jądrowy przeprowadza monoubikwitynację tzw. heterodimeru ID zbudowanego z  białek FANCD2 oraz FANCI. W  kompleksie jądrowym funkcję katalityczną związaną z monoubikwitynacją tych białek pełni FANCL, mające aktywność ligazy E3 ubikwityny [56]. Do prawidłowego przebiegu procesu monoubikwitynacji wymagana jest także obecność enzymu E2 sprzęgającego ubikwitynę. Enzymem tym jest UBE2T, które przy- łącza się do domeny palca PHD (plant homeo domain) białka FANCL, co umożliwia ich współdziałanie. Udział UBE2T w usuwaniu ICLs jest również związany z ochroną komórek przed aberracjami chromosomalnymi indukowanymi związkami sieciującymi DNA [51]. Spośród pozostałych białek kompleksu jądrowego, jedynie FANCM jest aktywne enzymatycznie. Pełni ono funkcję helikazy, ATP-azy oraz translokazy, dzięki czemu może transportować kompleks jądrowy wzdłuż nici DNA [58]. W skład kompleksu jądrowego oprócz białek FA wchodzą także białka towarzyszące, tzw. FAAP (Fanconi anemia associated proteins) oraz MFH (FANCM-associated histone fold proteins). Ich funkcja nie została jeszcze dokładnie poznana. Dotychczas przeprowadzone badania wskazują, że czynnik FAAP100 stabilizuje kompleks jądrowy przez bezpośrednie oddziaływanie z  białkami FANCB oraz FANCL. Zapobiega to nukleolitycznej degradacji poszczególnych składników kompleksu jądrowego [46]. Natomiast FAAP24 oraz białka MHF1 i MHF2 stymulują aktywność tego kompleksu przez interakcje z białkiem FANCM, a  ich obecność jest niezbędna do prawidłowego przebiegu procesu monoubikwitynacji kompleksu ID. Dodatkowo FAAP24 wraz z FANCM odpowiadają za rekrutację kompleksu jądrowego do miejsca uszkodzenia DNA, a MFH1 za przyłączanie go do chromatyny [8,85].

Tabela 1. Geny szlaku niedokrwistości Fanconiego

Ryc. 1.Schemat analizy komplementacyjnej komórek pacjentów z niedokrwistością Fanconiego nadwrażliwych na mitomycynę C (MMC). Hybryda, która powstała w wyniku fuzji komórek chorych należących do tej samej grupy komplementacyjnej (FA-1 i FA-2) zachowuje nadwrażliwość na MMC. Fuzja komórek pacjentów pochodzących z dwóch różnych grup komplementacyjnych (FA-2 i FA-3), prowadzi do utworzenia komórki hybrydowej wykazującej prawidłowy fenotyp

Zidentyfikowany niedawno czynnik FAAP20, dzięki domenie UBZ (ubiquitin-binding zinc finger domain) pomaga zachować integralność kompleksu jądrowego i jest niezbędny do wiązania białka FANCA z chromatyną w odpowiedzi na uszkodzenia DNA [1]. Pozostałe białka szlaku niedokrwistości Fanconiego: BRCA2, BRIP1, PALB2, RAD51C oraz SLX4 nie są związane z monoubikwitynacją kompleksu ID i biorą udział w naprawie podwójnych pęknięć DNA (DSBs – DNA double strand breaks) przez rekombinację homologiczną.

Rola białek szlaku FA w usuwaniu wiązań krzyżowych

Główną funkcją szlaku białek FA w ochronie genomu jest usuwanie z DNA wiązań krzyżowych wprowadzanych przez czynniki sieciujące (tabela 2). Związki te, mogące mieć pochodzenie endo- i egzogenne, tworzą addukty, które kowalencyjnie łączą dwie zasady azotowe leżące w obrębie tej samej bądź dwóch przeciwstawnych nici DNA, tworząc odpowiednio wiązania krzyżowe wewnątrz- i międzyniciowe [76]. W warunkach fizjologicznych wiązania krzyżowe są wprowadzane do DNA przez produkty peroksydacji lipidów, np. aldehyd malonowy, α,β-nienasycone kwasy tłuszczowe lub też mogą powstawać samoistnie [79,92]. Wśród egzogennych czynników sieciujących dużą grupę stanowią związki stosowane w  terapii nowotworów, takie jak mitomycyna C, pochodne platyny (cisplatyna, karboplatyna), pochodne iperytu azotowego – melfalan i chlorambucyl, a  także chloroetylonitrozomoczniki i  psoraleny [15,30,49,67,71]. Związki sieciujące DNA mają silne działanie cytotoksyczne, ponieważ wprowadzane przez nie międzyniciowe wiązania krzyżowe blokują replikację i transkrypcję.

Tabela 2. Białka należące do szlaku niedokrwistości Fanconiego oraz ich funkcja w naprawie ICLs

Obecność ICLs w materiale genetycznym w czasie fazy S cyklu komórkowego powoduje zatrzymane widełek replikacyjnych, co aktywuje kinazę ATR (ataxia-teleangiectasia and RAD3-related protein), będącą jednym z białek sensorowych odpowiedzialnych za rozpoznawanie uszkodzeń DNA (ryc. 2). W aktywacji ATR uczestniczy również szlak białek FA, za pośrednictwem kompleksu FANCM-FAAP24. Rearanżuje on strukturę widełek replikacyjnych, zapewniając wydajne przekazywanie sygnału o uszkodzeniu DNA przez ATR [27]. Aktywowana kinaza ATR wraz z białkiem towarzyszącym ATRIP fosforyluje białka FANCD2 oraz FANCI, które następnie podlegają monoubikwitynacji [81,87] (ryc. 3). Monoubikwitynacja kompleksu ID jest ważnym etapem usuwania wiązań krzyżowych z DNA, ponieważ proces ten umożliwia rekrutację w miejsce uszkodzenia wielu białek, które są niezbędne w kolejnych etapach naprawy. Należą do nich PCNA (proliferating cell nuclear antigen) i białka rekombinacji homologicznej: BRCA1, BRCA2 i  RAD51 [64,97,102]. Proces deubikwitynacji kompleksu ID wyłącza natomiast szlak białek FA z naprawy ICLs. Reakcja deubikwitynacji jest przeprowadzana przez kompleks USP1-UAF1, który dodatkowo promuje dalszą naprawę DNA przez HR [62,66]. Wykazano, że zaburzenia monoubikwitynacji kompleksu ID prowadzą do zahamowania nacięcia nici w obrębie wiązania krzyżowego, co znacząco wpływa na wydajne usuwanie ICLs [38]. Nacię- cie nici DNA przeprowadzają kompleksy MUS81-EME1, ERCC1-XPF, a  także nukleaza FAN1 (FANCD2/FANCI associated nuclease 1), której rekrutacja do ICLs uzależniona jest głównie od obecności monoubikwitynowanej postaci FANCD2 [25,39,86].

Przypuszczalnie kompleks MUS81-EME1 jako pierwszy nacina nić po stronie 3’ wiązania krzyżowego, co skutkuje powstaniem podwójnego pęknięcia nici DNA [25]. W kolejnym etapie naprawy następuje drugie nacięcie w obrębie ICLs, umożliwiające odsunięcie uszkodzonego fragmentu DNA i prowadzące do utworzenia przerwy w naciętej nici. Przez wiele lat uważano, że należący do szlaku NER kompleks ERCC1-XPF nacina DNA po stronie 5’ wiązania krzyżowego. Odkrycie nukleazy FAN1 sugeruje jednak, że proces nacinania nici DNA podczas usuwania ICLs może przebiegać inaczej. FAN1 preferencyjnie nacina nici po stronie 5’, w przeciwieństwie do ERCC1-XPF i MUS81-EME1 preferujących stronę 3’ [86]. Badania ostatnich lat wskazują, że na funkcjonowanie nukleaz wpływa także SLX4. Białko to jest niezbędne do tworzenia skupisk białkowych (foci) ERCC1-XPF, ale również może oddziaływać z kompleksem MUS81-EME1 [94]. Najprawdopodobniej funkcja SLX4 w usuwaniu wiązań krzyżowych w znacznym stopniu wiąże się jednak z transportem ERCC1-XPF w miejsce uszkodzenia [91]. Etap ten ma duże znaczenie, ponieważ obecność kompleksu ERCC1-XPF jest niezbędna do wydajnego przyłączania FANCD2 do chromatyny i naprawy podwójnego pęknięcia DNA przez białka HR [6,54].

Dalsza naprawa ICLs obejmuje przywrócenie integralności materiału genetycznego przez wypełnienie przerwy w DNA powstałej w wyniku działania nukleaz. Proces ten wymaga udziału polimeraz należących do szlaku TLS (polimerazy Rev1, N, ζ, η oraz κ), które umożliwiają syntezę DNA, mimo obecnego w nici matrycowej uszkodzenia [60,61,75,84,114]. W procesie usuwania ICLs jest to addukt związku sieciującego połączonego z wcześniej naciętym przez nukleazy fragmentem DNA. Polimerazy szlaku TLS wykazują mniejszą wierność niż replikacyjna polimeraza δ, dlatego naprawa z udziałem tego szlaku często prowadzi do powstawania mutacji [42,64]. W czasie usuwania wiązań krzyżowych szlak TLS współ- działa z PCNA, stanowiącym rodzaj platformy służącej do przełączania polimeraz, a także z białkami szlaku niedokrwistości Fanconiego, takimi jak FANCC i kompleks ID [61,65,113]. Ostatnie badania wykazały, że aktywność Rev1 jest regulowana przez FAAP20, nowo zidentyfikowane białko wchodzące w skład kompleksu jądrowego. Może to wskazywać, że szlak białek FA stymuluje usuwanie wiązań krzyżowych poprzez promowanie TLS, a tym samym zapobiega powstaniu dużych insercji bądź delecji [36].

W kolejnym etapie naprawy następuje reperacja podwójnego pęknięcia, za pośrednictwem rekombinacji homologicznej (naprawę podwójnych pęknięć DNA przez HR opisano w dalszej części artykułu), a fragment DNA zawierający ICLs zostaje usunięty, najprawdopodobniej przez NER lub spontaniczną hydrolizę [64]. Ostatnim krokiem naprawy jest przywrócenie prawidłowej struktury widełek replikacyjnych. Najprawdopodobniej odbywa się to z udziałem helikazy Blooma (BLM) oraz topoizomerazy IIIα. Współdziałają one bezpośrednio z białkami szlaku FA, a także mają aktywność resolwazy struktury Hollidaya, która może powstawać podczas naprawy DSBs przez HR [56,64]. Białka te wraz z RPA (replication protein A) oraz wchodzącymi w skład kompleksu jądrowego białkami FANCA, FANCC, FANCE, FANCF i FANCG tworzą także tzw. kompleks BRAFT uczestniczący w rozwijaniu nici DNA [59]. W odpowiedzi na ICLs rolę łącznika między helikazą BLM, a wchodzącymi w skład kompleksu BRAFT białkami FA pełni FANCM [16].

Ryc. 2. Aktywacja szlaku FA (opis w tekście)

W usuwaniu wiązań krzyżowych biorą również udział niektóre białka systemu naprawy MMR, które oddziałują z białkami szlaku niedokrwistości Fanconiego. Ich rola w usuwaniu ICLs jest jednak słabo poznana [69,112]. Najwięcej wiadomo na temat oddziaływań między BRIP1 a MutLα, będącym kompleksem białek PMS2 oraz MLH1. BRIP1 łączy się poprzez domenę helikazową z MLH1, a oddziaływanie między obydwoma białkami jest istotne w prawidłowej odpowiedzi BRIP1 w naprawie wiązań krzyżowych. Mimo że PMS2 nie łączy się bezpośrednio z BRIP1, to obecność tego białka stabilizuje kompleks BRIP1 z  MLH1 [69]. MutLα tworzy również kompleks z nukleazą FAN1. Dlatego też można przypuszczać, że kompleks ID rekrutuje w miejsce uszkodzenia nie tylko FAN1, ale także kompleks MutLα-FAN1, który potencjalnie może wpływać na włączanie do procesu naprawy kolejnych białek, takich jak BRIP1 [86]. Potwierdzałoby to wcześniejsze przypuszczenia, że BRIP1 dzięki funkcji helikazowej pośredniczy w nacinaniu nici DNA od strony 5’ wiązania krzyżowego przez rozwijanie nici DNA i tworzenie odpowiedniego substratu dla nukleaz [98].

Współdziałanie białek szlaku FA z rekombinacją homologiczną w naprawie podwójnych pęknięć D

Rola białek szlaku niedokrwistości Fanconiego w naprawie uszkodzeń DNA nie ogranicza się jedynie do usuwania wiązań krzyżowych. Znaczna część białek tego szlaku jest zaangażowana także w  reperację podwójnych pęknięć DNA przez rekombinację homologiczną. HR jest oprócz naprawy przez łączenie niehomologicznych końców (NHEJ – nonhomologous end joining) jednym z dwóch procesów odpowiedzialnych za naprawę DSBs w komórkach ssaków. Uszkodzenia te, podobnie jak wiązania krzyżowe, są silnymi induktorami aberracji chromosomalnych. Rekombinacja homologiczna w czasie późnej fazy S oraz G2 cyklu komórkowego naprawia podwójne pęknięcia powstałe na skutek działania czynników zewnętrznych np. promieniowania jonizującego lub podczas fizjologicznych procesów np. mejozy. W HR jako matryca do reperacji DNA jest wykorzystywana chromatyda siostrzana, co zapewnia bezbłędną naprawę uszkodzenia [45,90]. Ogromne znaczenie dla zrozumienia współdziałania HR z  białkami szlaku FA miało odkrycie z 2002 r., kiedy wykazano, że do rozwoju niedokrwistości Fanconiego w grupie komplementacyjnej D1 prowadzą bialleliczne mutacje genu kodującego BRCA2 [28]. Białko to było wcześniej przyporządkowane wyłącznie do systemu rekombinacji homologicznej. Od tamtego czasu zidentyfikowano osiem kolejnych genów kodujących białka FA, z których połowa, tj. BRIP1, PALB2, RAD51C i SLX4 działa poniżej etapu monoubikwitynacji kompleksu ID i uczestniczy bezpośrednio lub pośrednio w naprawie podwójnych pęknięć przez HR.

Ryc. 3. Schemat usuwania wiązań krzyżowych z DNA (opis w tekście)

DSBs naprawiane przez rekombinację homologiczną są rozpoznawane przez kompleks MRN, który tworzą białka MRE11, RAD50 i NBS1. Kompleks ten bierze udział w naprawie DNA zarówno w procesie HR jak i NHEJ [37]. W obecności podwójnego pęknięcia DNA kompleks MRN aktywuje kinazę ATM (ataxia-teleangiectasia mutated), występującą w stanie nieaktywnym w postaci homodimeru. Aktywacja ATM prowadzi do monomeryzacji kompleksu i autofosforylacji białek [9,41]. Aktywowana kinaza ATM fosforyluje następnie liczne białka zaangażowane w kontrolę cyklu komórkowego, np. BRCA1, MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint 1), CHK2 (checkpoint kinase 2), a  także histon H2AX [9,18]. W następstwie aktywności ATM zostaje zatrzymany cykl komórkowy i są uruchamiane procesy reperacji DNA. Pierwszym etapem naprawy podwójnego pęknięcia jest resekcja DNA dokonywana przez białko MRE11, prowadząca do powstania jednoniciowych 3’ końców, zakończonych grupą hydroksylową [68]. Resekcja nici jest również promowana przez białko CtIP (CtBP interacting protein), które uczestniczy w rekrutacji RPA opłaszczającego powstające wolne końce DNA, co przeciwdziała ich degradacji [9]. W ochronie jednoniciowych fragmentów DNA (ssDNA – single stranded DNA) bierze udział także białko RAD52. Jego obecność zapobiega atakom nukleaz i ułatwia parowanie nici DNA w dalszych etapach naprawy [23].

W rekombinacji homologicznych 3’ końców DNA ważną rolę odgrywa rekombinaza RAD51, która buduje tzw. nukleofilament, złożony z  wielu monomerów tego białka [5]. W proces powstawania nukleofilamentu zaangażowane jest białko BRCA2 łączące się bezpośrednio z RAD51. Białka te oddziałują ze sobą przez powtórzenia BRC zlokalizowane w środkowej części BRCA2 oraz przez C-końcowy region tego białka wiążący RAD51. Obecność BRCA2 promuje przyłączanie RAD51 do ssDNA, a proces ten jest stymulowany dodatkowo przez białko DSS1 [24,26,48]. Prawidłowe działanie BRCA2 uzależnione jest od obecności białek PALB2 (partner and localizer of BRCA2) oraz BRCA1. PALB2 jest partnerem jądrowym BRCA2 i uczestniczy w jego umiejscawianiu w miejscach uszkodzeń DNA [106]. Dodatkowo PALB2 stanowi rusztowanie dla kompleksu między białkami BRCA2 i BRCA1 [95]. W reperację podwójnych pęknięć DNA pośrednio jest zaangażowana także helikaza BRIP1 (BRCA1 interacting protein C-terminal helicase 1), która współdziała z BRCA1. Połączenie tych białek następuje przez obecne w BRCA1 domeny BRCT, a oddziaływanie to ma wpływ na wybór odpowiedniej ścieżki naprawy DNA i sprzyja reperacji przez homologiczną rekombinację [47,111]. Nieprawidłowe wiązanie BRIP1 do BRCA1 skutkuje naprawą z udziałem polimerazy η należącej do szlaku TLS. Włączenie TLS do naprawy podwójnych pęknięć następuje jednak jedynie w wyniku bezpośredniego związania BRIP1 z MLH1 [107]. Kompleks BRCA1 i BRIP1 pełni również dodatkowe funkcje w ochronie genomu w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Jest on niezbędny do uruchomienia punktu kontrolnego cyklu komórkowego w czasie przejścia z fazy G2 do M [111].

Powstały nukleofilament RAD51 odpowiada za odnajdywanie homologicznej nici DNA, a  także stymuluje inwazję nici. W procesie tym biorą udział także dodatkowe białka takie jak RAD54 oraz paralogi RAD51 (RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 i  XRCC3) [70,96]. Paralogi te formują jeden duży kompleks BCDX2 i dwa mniejsze kompleksy RAD51C-XRCC3 oraz RAD51D-XRCC2. Wykazują one powinowactwo do tzw. rozgałęzionych struktur DNA, katalizują łączenie jednoniciowych fragmentów DNA, a także pełnią funkcję mediatora w  procesie wymian homologicznych nici DNA z udziałem RAD51 [40,52,53,83,110]. Inwazja nici stymulowana przez RAD51 powoduje powstanie tzw. pętli D (displacement loop), a wolne 3’ końce są substratem dla polimeraz, które wydłużają nici DNA na matrycy, którą jest chromatyda siostrzana. Pętla D jest strukturą wyjściową dla kilku ścieżek HR. W podtypie SDSA (synthesis-dependent strand annealing), czyli łączeniu nici zależnym od syntezy DNA, dokonujący inwazji jednoniciowy fragment DNA ulega wydłużeniu, a następnie jest uwalniany z udziałem helikaz i łączony z drugim końcem 5’. Podczas naprawy może również dojść do utraty jednego z 3’ końców. Wówczas w wyniku replikacji indukowanej pęknięciem (BIR – break induced replication) pozostały jednoniciowy fragment DNA dokonuje inwazji nici promując jednocześnie syntezę DNA do końca chromosomu. W przypadku głównego szlaku naprawy podwójnych pęknięć DNA – DSBR (double strand break repair) wydłużaniu ulega zarówno dokonująca inwazji nić DNA, jak również drugi 3’ koniec DNA, który zostaje uchwycony i związany z chromatydą siostrzaną [4]. Prowadzi to do utworzenia tzw. struktury Hollidaya (HJ – Holliday junction). Aktywność nukleazową niezbędną do jej rozplecenia mają m.in. kompleksy MUS81-EME1, ERCC1-XPF oraz nukleaza Yen1/GEN1. Badania ostatnich lat wskazują, że kompleks między SLX1 a należącym do białek szlaku niedokrwistości Fanconiego SLX4 również ma aktywność resolwazy struktury HJ. SLX4 jest także platformą, do której mogą się przy- łączać kompleksy MUS81-EME1 oraz ERCC1-XPF, co przypuszczalnie mogłoby umożliwić współdziałanie tych nukleaz w rozplataniu struktury HJ (ryc. 4) [94].

Ryc. 4. Schemat naprawy podwójnych pęknięć DNA przez rekombinację homologiczną. DSBR – naprawa podwójnych pęknięć DNA, SDSA – naprawa przez łączenie nici zależne od syntezy DNA, BIR – naprawa w wyniku replikacji indukowanej pęknięciem (opis w tekście)

Mechanizm naprawy DSB powstającego podczas wycinania wiązania krzyżowego z DNA nie jest dokładnie poznany. Po ekspozycji komórek z mutacjami w genach kodujących BRCA2, PALB2 oraz paralogi RAD51 na czynniki sieciujące DNA, tworzenie nukleofilamentu RAD51 jest zaburzone. Wskazuje to nie tylko na udział HR w naprawie ICLs, ale także, że etap inwazji nici, poprzedzający reperacyjną syntezę DNA z wykorzystaniem chromatydy siostrzanej jako matrycy, zachodzi również podczas usuwania ICLs [7,19,20,105]. Kolejnym potwierdzeniem ścisłego współdziałania HR oraz białek szlaku FA jest opisanie pacjenta należącego do nowej grupy komplementacyjnej FA, posiadającego mutację w genie XRCC2, którą zidentyfikowano przez sekwencjonowanie całego eksonu tego chorego [80]. Grupie tej nie przypisano jeszcze nowej nazwy, jest to już jednak drugi paralog RAD51, poza RAD51C, zaangażowany w patogenezę niedokrwistości Fanconiego.

Rola białek FA w stabilizacji genomu

Wiele dotychczas przeprowadzonych badań wskazuje, że szlak białek FA odgrywa ogromną rolę w zachowaniu stabilności genomu nie tylko przez udział w naprawie uszkodzeń DNA, ale także przez uczestnictwo w innych ważnych procesach komórkowych, których prawidłowy przebieg warunkuje utrzymanie integralności materiału genetycznego. Białka FA są aktywne w  fazie S cyklu komórkowego, dlatego też mogą współpracować zarówno z maszynerią replikacyjną, jak również z białkami zaangażowanymi w kontrolę cyklu komórkowego w tej fazie.

Spośród białek szlaku niedokrwistości Fanconiego najważniejszą rolę w trakcie replikacji pełnią BRCA2 oraz FANCM. Mutacje genu kodującego BRCA2 opóźniają postęp widełek replikacyjnych, co wskazuje na udział tego białka w prawidłowym przebiegu replikacji DNA [10]. Dodatkowo BRCA2 odgrywa także rolę w ochronie widełek replikacyjnych przed rozpadem. C-końcowy fragment tego białka stabilizujący nukleofilament RAD51 blokuje degradację nowo zsyntetyzowanych fragmentów DNA przez nukleazę MRE11, co zapobiega powstawaniu aberracji chromosomalnych. Funkcja ta jest niezależna od roli BRCA2 w naprawie podwójnych pęknięć DNA, dlatego jest możliwe, że głównym zadaniem tego białka w utrzymaniu stabilności genomu i supresji nowotworów może być przeciwdziałanie powstawaniu uszkodzeń DNA [77]. Rolą FANCM jest natomiast rearanżacja struktury widełek replikacyjnych i kontrola wydłużania łańcucha DNA w sposób zależny od ATP [50] i promowanie wznowienia postępu widełek replikacyjnych po ich zatrzymaniu w obecności uszkodzeń DNA [78]. Wciąż jeszcze niewiele wiadomo na temat funkcji pozostałych białek szlaku FA w replikacji. Białka te są związane z  chromatyną podczas prawidłowego przebiegu tego procesu, dlatego przypuszcza się, że ich funkcja najprawdopodobniej polega na stabilizacji widełek replikacyjnych [101].

Niezakłócony przebieg replikacji ma ogromne znaczenie dla zachowania ciągłości informacji genetycznej zawartej w DNA. Obecność uszkodzeń w materiale genetycznym może prowadzić do zatrzymania widełek replikacyjnych. Dalsza replikacja DNA następuje po naprawie uszkodzeń DNA, poprzedzonej aktywacją punktów kontrolnych i  zatrzymaniem cyklu komórkowego. W ich uruchomieniu biorą także udział białka szlaku FA – FANCM oraz BRIP1. Białka te są związane z aktywacją punktu kontrolnego fazy S cyklu komórkowego zależnego od kinazy ATR. Białko to należy do rodziny kinaz związanych z kinazami 3-fosfatydyloinozytolu i uczestniczy we wczesnych etapach aktywacji punktów kontrolnych. Pełni ono rolę białka sensorowego rozpoznającego zatrzymane widełki replikacyjne oraz produkty przejściowe naprawy DNA. Przekazywanie sygnału w punkcie kontrolnym fazy S zależnym od ATR zapoczątkowuje przyłączenie kompleksu ATR z partnerskim białkiem ATRIP do jednoniciowych fragmentów DNA, które zostały wcześniej opłaszczone przez RPA. Aktywowana kinaza ATR fosforyluje kolejne białka zaangażowane w kontrolę cyklu komórkowego, a jej funkcja kinazowa jest stymulowana przez białko TOPBP1 [108]. W odpowiedzi na działanie związków sieciujących punkt kontrolny zależny od ATR jest aktywowany również przez FANCM, które jest niezbędne do rekrutacji białka RPA w miejsce uszkodzenia DNA [29]. FANCM i FAAP24 dodatkowo asocjują z ATR oraz z białkiem je stabilizują- cym – HCLK2 [27,34]. Kompleks FANCM-FAAP24 wpływa także na działanie ATR przez utrzymywanie białka TOPBP1 w obrębie chromatyny [78]. W regulację aktywności ATR jest zaangażowane także BRIP1, współdziałające z TOPBP1. Zaburzenia w funkcjonowaniu kompleksu tych białek zmniejszają wydajność przyłączania RPA do chromatyny, a to wpływa na fosforylację białek za pośrednictwem ATR w  odpowiedzi na stres replikacyjny [21,43]. Ponadto białka BRIP1 i TOPBP1 oddziałują z BRCA1 i wraz z nim biorą udział w kontroli fazy S cyklu komórkowego w odpowiedzi na uszkodzenia DNA, przypuszczalnie przez wpływ na wznowienie replikacji [22]. Punkt kontrolny fazy S jest także regulowany przez białko RAD51C, jednak nadal niewiele wiadomo na temat jego funkcji w kontroli cyklu komórkowego. Najprawdopodobniej pośredniczy ono w przekazywaniu sygnału o obecności wiązań krzyżowych i podwójnych pęknięć DNA oraz reguluje aktywność białka przekaźnikowego jakim jest kinaza CHK2 [89].

W przypadku gdy mechanizmy kontrolne cyklu komórkowego zawiodą, uszkodzenia DNA mogą się utrzymywać aż do mitozy, co może spowodować niestabilność chromosomalną. Szlak białek niedokrwistości Fanconiego uczestniczy w dodatkowym mechanizmie ochraniają- cym stabilność genomu, polegającym na znakowaniu uszkodzeń DNA w czasie tej fazy cyklu komórkowego. W komórkach eksponowanych na działanie afidikoliny (związku o właściwościach antymitotycznych) obserwuje się zwiększoną liczbę foci FANCD2 w łamliwych miejscach chromosomów mitotycznych [34]. Foci te zazwyczaj występują podwójnie, po jednym skupisku białkowym na chromatydę, dlatego nazywa się je siostrzanymi [109]. Miejsca wiązania FANCD2 oraz FANCI na chromosomie pokrywają się często z obecnością tzw. ultracienkich mostów chromatydowych (UFB – ultrafine DNA bridges). Mosty te, złożone z fragmentów nici DNA łączących dwie chromatydy, powstają po fuzji telomerów bądź chromatyd siostrzanych, czego skutkiem jest wadliwa segregacja chromosomów do komórek potomnych. Do UFB wiąże się również helikaza BLM. Może to sugerować, że białka te znakują uszkodzenia DNA w komórkach mitotycznych, które ominęły punkty kontrolne cyklu komórkowego. Wiązanie i obecność kompleksu ID na chromosomie umożliwia aktywację szlaków naprawy DNA i reperację materiału genetycznego, co zapobiega mutacjom i aberracjom chromosomalnym, które mogą spowodować niestabilność genomu [34]. Dodatkowo w komórkach z mutacjami w genach FANCA, FANCC i FANCD2 zaobserwowano zmniejszoną rekrutację helikazy BLM do UFB w niecentromerowych regionach chromosomów. Wskazuje to, że białka szlaku FA współdziałają wraz z BLM w usuwaniu nieprawidłowych struktur DNA, które powstają w wyniku niezakończonej replikacji fragmentów chromosomów [63,104].

Podsumowanie

Rola białek szlaku FA w ochronie stabilności genomu jest niezwykle złożona. Z pewnością największe znaczenie dla zachowania integralności materiału genetycznego ma ich udział w usuwaniu ICLs i podwójnych pęknięć DNA, mogących prowadzić do powstania aberracji chromosomalnych, a nawet śmierci komórki. Coraz więcej danych wskazuje na równie istotny wkład białek tworzących szlak niedokrwistości Fanconiego w kontrolę cyklu komórkowego, replikację i znakowanie uszkodzeń DNA. Funkcja białek szlaku FA może być jednak bardziej złożona, ponieważ wchodzą one także w liczne interakcje z proteinami zaangażowanymi w apoptozę i transkrypcję, a także odpowiedź komórki na stres oksydacyjny [33]. Rola białek FA w wymienionych procesach wymaga jednak dalszych badań, które pozwolą lepiej zrozumieć funkcje szlaku niedokrwistości Fanconiego na poziomie komórkowym oraz jego znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania całego organizmu. Mimo że wiedza dotycząca udziału białek należących do tego szlaku oraz ich roli znacząco się rozszerzyła, to nadal nie wszystkie geny FA zostały zidentyfikowane. U prawie 5% chorych podłoże genetyczne niedokrwistości Fanconiego nadal pozostaje nieznane (dane Fanconi Anemia Research Fund, Inc. z 14 listopada 2013 r.), co wskazuje na obecność dodatkowych białek zaangażowanych w szlak FA. Wszystkie zidentyfikowane w ostatnich latach nowe białka FA działające poniżej etapu monoubikwitynacji kompleksu ID są powiązane z rekombinacją homologiczną lub bezpośrednio biorą udział w tym procesie. Ścisłe i coraz lepiej udokumentowane współdziałanie tych systemów naprawy DNA może sugerować, że obszar poszukiwań kolejnych białek FA powinien być ukierunkowany na szlak HR.

Na ogromną rolę białek szlaku niedokrwistości Fanconiego w kontroli stabilności genomu wskazuje także zwiększona predyspozycja do rozwoju nowotworów obserwowana u  pacjentów z  heterozygotycznymi mutacjami genów – BRCA2, PALB2, BRIP1 oraz RAD51C. Mimo że uszkodzenia pojedynczego allela tych genów (należących jednocześnie do szlaku FA i HR) nie prowadzą do rozwoju niedokrwistości Fanconiego, wiążą się jednak ze zwiększonym ryzykiem zachorowań na raka piersi i/lub jajnika [73,88,103]. Poznanie wszystkich białek FA pozwoli z  pewnością na pełne zrozumienie ich funkcji w procesach odpowiedzialnych za stabilizację genomu, co może się przyczynić do zaprojektowania nowych strategii leczniczych dla pacjentów z niedokrwistością Fanconiego oraz skuteczniejszych terapii przeciwnowotworowych.v

Pełna treść artykułu