Abstrakt

Kwasy mikolowe stanowią jeden z podstawowych elementów strukturalnych ściany komórkowej bakterii z podrzędu Corynebacterineae. Związki te są długołańcuchowymi α-hydroksy ß-alkilo kwasami tłuszczowymi, a w ich obrębie wyróżnia się dwa łańcuchy węglowodorowe: dłuższy łańcuch meromikolowy oraz krótszy łańcuch α-węglowodorowy. Prątki rodzaju Mycobacterium cechują się obecnością kwasów mikolowych o długości 60-90 atomów węgla zawierając jednocześnie w pełni nasycony łańcuch α-alkilowy o ściśle zdefiniowanej długości 22, 24 lub 26 atomów węgla. Obecnie prowadzone badania wskazują, że nie tylko obecność kwasów mikolowych w ścianie komórkowej mikobakterii jest istotna dla wirulencji mikobakterii. Udowodniono, że wzajemny stosunek poszczególnych typów kwasów mikolowych, ich długość oraz stopień cyklopropanizacji może ulegać zmianie w zależności od etapu infekcji czy warunków hodowli prątków. Jednocześnie wykazano, że niektóre typy mikolanów są podstawowe w procesie powstawania biofilmu, oporności na leki przeciwprątkowe czy oddziaływań z układem odpornościowym. Najnowsze badania wskazują na zastosowanie analizy profili kwasów mikolowych jako alternatywy dla klasycznych metod diagnostyki chorób, takich jak gruźlica, trąd czy mikobakteriozy.

Budowa oraz struktura chemiczna

Kwasy mikolowe są długołańcuchowymi α-hydroksy-β- alkilo kwasami tłuszczowymi. Po raz pierwszy zostały wyizolowane z prątków gruźlicya już w 1929 r. przez Andersona, jednak dopiero w 1950 r. Asselineau oraz Lederer opisali ich dokładną budowę chemiczną [3,4]. Pod względem strukturalnym, w ich obrębie wyróżnia się dwa łańcuchy węglowodorowe: dłuższy łańcuch meromikolowy (R1 ) oraz krótszy łańcuch α-węglowodorowy (R2 ) (ryc. 1). Długość łańcuchów węglowodorowych, stopień ich nasycenia oraz występowanie grup funkcyjnych jest zależne bezpośrednio od rodzaju drobnoustrojów, w których ścianie komórkowej występują kwasy mikolowe. Łańcuch meromikolowy (R1 ) cechuje dużo większe zróżnicowanie zarówno pod względem długości łańcucha jak i obecności grup funkcyjnych. W pozycji proksymalnej łańcucha meromikolowego występuje zazwyczaj pierścień cyklopropanowy, podczas gdy w pozycji dystalnej możemy zaobserwować zarówno występowanie kolejnego pierścienia cyklopropanowego, jak i hydrofilowych grup funkcyjnych: metoksylowej oraz ketonowej [25].

Ryc. 1. Ogólny wzór strukturalny kwasu mikolowego

W oparciu o zróżnicowanie podstawników w pozycji dystalnej łańcucha meromikolowego wyróżniamy trzy klasy kwasów mikolowych, odpowiednio: α-, metoksyoraz ketomikolany (ryc. 2). Oprócz różnic w  budowie chemicznej między poszczególnymi typami związków występują znaczące różnice w konformacji i strukturze przestrzennej. Dowiedziono, że ketooraz metoksymikolany mogą występować w  dwóch konformacjach – cis lub trans (ryc. 2). Jednocześnie struktura kwasu mikolowego naturalnie wymusza silne oddziaływania między łańcuchem α-alkilowym a meromikolowym prowadząc bezpośrednio do fałdowania dłuższego łańcucha meromikolowego i powstania struktury „spinki”. Udowodniono, że powstawanie złożonych układów konformacyjnych kwasów mikolowych jest o wiele częstsze w przypadku keto- oraz metoksymikolanów [7,27]. To właśnie struktura przestrzenna jaką przybierają te związki w układach emulsyjnych będąca konsekwencją wzajemnego stosunku różnych typów kwasów mikolowych względem siebie, wydaje się obecnie najistotniejsza dla zrozumienia wpływu poszczególnych typów kwasów mikolowych na przepuszczalność ściany komórkowej, oddziaływania z układem odpornościowym czy przeżywalność drobnoustrojów in vivo.

Kwasy mikolowe rodzaju Mycobacterium

Kwasy mikolowe stanowią jeden z podstawowych elementów strukturalnych ścian komórkowych bakterii z podrzędu Corynebacterineae, do których poza prątkami Mycobacterium należą m.in. drobnoustroje, takie jak Corynebacterium, Nocardia czy Rhodococcus [32]. Pod względem organizacji zrąb struktury ściany komórkowej prątków to warstwa peptydoglikanu połączonego wiązaniami fosfodiestrowymi z położonym wyżej arabinogalaktanem. Pentaarabinozowe podjednostki arabinogalaktanu wiążą jednocześnie kwasy mikolowe eksponując ich łańcuchy węglowodorowe na zewnątrz komórki. Tak ścisłe ułożenie łańcuchów estryfikowanych kwasów mikolowych nadaje ścianie komórkowej dużą hydrofobowość, której stopień zależy od długości łańcuchów meromikolowych, ich stopnia nasycenia i występowania hydrofilowych grup funkcyjnych [10,51]. Na powierzchni hydrofobowej warstwy kwasów mikolowych tworzy się ponadto niekowalencyjnie z nią związana warstwa tzw. „wolnych lipidów”. Cechuje ją wysokim stopniem heterogenności zarówno pod względem składu jakościowego, jak i ilościowego w zależności od gatunku drobnoustroju oraz warunków hodowli. Wśród związków najpowszechniej występujących w warstwie wolnych lipidów wymienia się: glikolipidy, sulfolipidy, glikopeptydolipidy, lipooligosacharydy, glikolipidy fenolowe, lipoarabinomannan, glikofosfolipidy, związki zawierające w swojej budowie kwasy mikolowe: dimikolany trehalozy, woski kwasów mikolowych [35,58]. O ogromnej różnorodności składu ściany komórkowej świadczy obecność u Mycobacterium ponad 250 genów biorących udział w syntezie związków o charakterze lipidowym w porównaniu do około 50 genów u Escherichia coli [16].

Podrząd Corynebacterineae charakteryzuje się wielką różnorodnością pod względem profili kwasów mikolowych zawartych w  ścianach komórkowych, a  ich wielkość oraz struktura jest jednym z  wykładników ich pokrewieństwa rodzajowego. Tylko pod względem wielkości cząsteczek mikolanów w całym podrzędzie wykrywa się związki o wielkości 22-110 atomów węgla [33]. Kwasy mikolowe charakterystyczne dla rodzaju Mycobacterium składają się z  60-90 atomów węgla zawierając jednocześnie w  pełni nasycony łańcuch α-alkilowy o ściśle zdefiniowanej długości 22, 24 lub 26 atomów węgla [35]. Dokładne analizy strukturalne dowiodły, że prątki Mycobacterium tuberculosis oraz Mycobacterium bovis cechują się zdecydowaną dominacją kwasów mikolowych o  długości łańcucha α-alkilowego równego 26 atomom węgla bez względu na ich typ [54,57]. W przeciwieństwie do prątków gruźlicy, prątki atypowe charakteryzują się przewagą mikolanów o krótszych łańcuchach alfa [54]. Obserwacje te wskazują na potencjalną możliwość odróżnienia prątków wywołujących gruźlicę od tych będących czynnikiem etiologicznym mikobakterioz lub trądu tylko na podstawie zawartości kwasów mikolowych o specyficznej długości łańcucha α-alkilowego. Zróżnicowanie ściany komórkowej prątków pod względem udziału poszczególnych typów mikolanów jest zagadnieniem bardziej złożonym. Ocenia się, że w  profilu kwasów mikolowych charakterystycznym dla M. tuberculosis zdecydowanie dominują α-mikolany, których zawartość szacuje się na ponad 70%, podczas gdy typy keto- oraz metoksy- stanowią odpowiednio po 10-15% wszystkich kwasów mikolowych [25]. Jednocześnie przyjmuje się, że prątki atypowe cechują się zdecydowanie większą zawartością form keto- oraz metoksy- [23]. Warto zauważyć, że liczne dane uzyskiwane w  oparciu o  wykorzystanie nowoczesnych technik badawczych, począwszy od chromatografii cienkowarstwowej po spektrometrię mas, wskazują na zróżnicowanie zawartości poszczególnych typów kwasów mikolowych w ścianie komórkowej tych samych prątków w zależności od warunków wzrostu, metabolizmu komórki czy etapu infekcji.

Wzrost w układach in vitro i in vivo a profil kwasów mikolowych

W 2002 r. po raz pierwszy uzyskano mutanty M. tuberculosis H37Rv pozbawione genu mmaA4 kodującego metylotransferazę biorącą udział w syntezie metoksyi ketomikolanów. Szczep ten charakteryzował się osłabieniem płynności ściany komórkowej, co obniżało jej przepuszczalność dla związków zarówno o charakterze hydrofobowym, jak i hydrofilowym, ale jednocześnie zachował zdolność do infekcji oraz namnażania w układach in vitro [21]. W przeciwieństwie do niego mutanty M. tuberculosis z nadekspresją genu kodującego enzym MMAS-1 cechujące się dominacją kwasów metoksymikolowych i  marginalnym udziałem form keto- oraz alfa- charakteryzowały się zwiększoną przepuszczalnością ściany komórkowej dla związków o charakterze hydrofilowym, w tym dla takich leków jak ampicylina czy rifamycyna [68]. Nie miały one jednak zdolności do infekcji oraz namnażania w układach in vitro, co zasugerowało negatywny wpływ dużej zawartości metoksymikolanów na aktywność biologiczną prątków. W układach in vivo udowodniono jednocześnie, że zmniejszony poziom ketomikolanów w ścianie komórkowej koreluje z obniżeniem stopnia wirulencji mikobakterii [21]. Jednocześnie u M. tuberculosis wyizolowanych od ludzi z  aktywną postacią gruźlicy płuc wykryto nadekspresję genu mmaA4, co wspiera tezę o głównej roli podwyższonego wytwarzania ketomikolanów w rozwoju zakażeń mikobakteryjnych [46]. Poza aktywnością genu mmaA4 istotny wpływ na atenuację prątków gruźlicy mają mutacje w  obrębie genów kodujących enzymy odpowiadające za prawidłową syntezę pierścieni cyklopropanowych łańcucha meromikolowego – pcaA oraz cmaA2. Unieczynnienie tych genów w połączeniu z brakiem aktywności genu mmaA4 powoduje znaczny spadek wirulencji mikobakterii z  powodu występowania w strukturze ściany komórkowej jedynie pozbawionych pierścieni cyklopropanowych α-mikolanów. Jednocześnie pozbawienie prątków jedynie genów pcaA oraz cmaA2 skutkujące obecnością wszystkich typów kwasów mikolowych, lecz pozbawionych pierścieni cyklopropanowych, prowadzi do jedynie nieznacznego osłabienia wirulencji prątków. Dodatkowo wykazano, że mikobakterie z nokautem genów pcaA oraz cmaA2 indukują intensywną odpowiedź immunologiczną ujawniającą się nasilonym wytwarzaniam TNF- α, IFN-γ oraz IL-12p35 [5]. Dowiedziono, że aktywność genu mmaA4 wydaje się niezbędna zarówno do zahamowania wytwarzania IL-12p40, głównej cytokiny w odpowiedzi odpornościowej względem wewnątrzkomórkowych patogenów, jak i dla wzrostu prątków w postaci biofilmu [17,50].

Ryc. 2. Klasy kwasów mikolowych rodzaju Mycobacterium [25]. A. Kwas α-mikolowy. B. Kwas metoksymikolowy w konformacji cis. C. Kwas metoksymikolowy w konformacji trans. D. Kwas ketomikolowy w konformacji cis. E. Kwas ketomikolowy w konformacji trans

Tworzenie biofilmu bakteryjnego u prątków z rodzaju Mycobacterium zależne jest bezpośrednio od ekspresji białka opiekuńczego oraz oddziaływania z enzymem KasA, który jest jednym z elementów wieloenzymowego kompleksu syntazy kwasów tłuszczowych typu II (FASII) odpowiadającego za syntezę kwasów mikolowych. Początkowo oceniano, że podstawą do tworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej mikobakterii są lipopolisacharydy oraz glikopaptydolipidy oraz pochodne kwasów mikolowych (estry i diacyloglicerole), których nasilona synteza korelowała z intensywnym tworzeniem biofilmu przez te drobnoustroje [13,15,38,47,48]. Dopiero dokładna analiza składu biofilmu w układzie in vitro dowiodła obecności wolnych kwasów mikolowych jako jednego z głównych składników macierzy zewnątrzkomórkowej [39]. Obecność wolnych kwasów mikolowych jako składnika biofilmu nie jest jednak skutkiem lizy prątków, ale ich aktywnego transportu na zewnątrz komórki. W transporcie tym biorą udział konserwatywne transmembranowe transportery lipidowe MmpL3 oraz MmpL11 przenoszące poza obręb ściany komórkowej pochodne kwasów mikolowych w postaci odpowiednio mikolanów trehalozy oraz estrów kwasów mikolowych i diacylogliceroli [43]. Bezpośrednim prekursorem wolnych kwasów mikolowych w  biofilmie mikobakteryjnym jest dimikolan trehalozy (TDM) zwany też czynnikiem wiązkowym, który ulega zewnątrzkomórkowej hydrolizie przez swoistą esterazę serynową – Msmeg_1529 [41]. Uwolnione w wyniku hydrolizy kwasy mikolowe należące głównie do keto- i  metoksymikolanów są niezbędne do właściwego uformowania się biofilmu mikobakterii w  układach in vivo [50]. Dowiedziono również, że obecność wolnych kwasów mikolowych w postaci keto- lub metoksy- jako składników macierzy zewnątrzkomórkowej może odpowiadać w dużym stopniu za oporność biofilmów mikobakterii na dzia- łanie leków przeciwprątkowych [1,41,50]. Obecnie podkreśla się dużą heterogenność komórek populacji mikobakterii wzrastających w postaci planktonicznej lub biofilnie, jak i  tych znajdowanych w  czasie infekcji w ziarniniakach płucnych [49,69]. Już wczesne badania przebiegu gruźlicy u  świnek morskich wykazały powstawanie ziarniny w płucach wywołanej wziewną immunizacją dimikolanem trehalozy [26]. Późniejsze badania wykorzystujące do donosowego zakażania zwierząt preparaty alfa-, keto- oraz metoksymikolanów dowiodły powstawania ziarniniaków tylko w przypadku zastosowania postaci kwasów [56]. Niebagatelną rolę ketomikolanów na powierzchni prątków udowodniono również w przypadku rozwoju makrofagów piankowatych, jednego z etapów tworzenia ziarniniaków [45]. Wykazano jednocześnie, że poddanie makrofagów ekspozycji na działanie kwasów mikolowych może skutkować ich przekształceniem się w  makrofagi piankowate o  upośledzonych zdolnościach do późniejszej reakcji na niektóre antygeny wziewne, takie jak np. owoalbumina, co indukuje miejscową tolerancję immunologiczną [30,31].

Rola biologiczna poszczególnych typów kwasów mikolowych w  rozwoju i  wirulencji prątków jest bardzo złożona i wciąż brak jest dokładnych danych do jej pełnej charakterystyki. Jednak dotychczas przeprowadzane badania dowodzą, że wszystkie klasy mikolanów są niezbędne do pełnej wirulencji mikobakterii, lecz prawdopodobnie uczestniczą na różnych etapach rozwijającego się zakażenia. Wydaje się, że do wzrostu planktonicznego prątków gruźliczy ważna jest dominacja α-mikolanów, będąca kluczowa jednocześnie w późniejszej zdolności do wnikania do wnętrza makrofagów pęcherzykowych [68]. W kolejnych etapach infekcji, w tym tworzeniu makrofagów piankowatych oraz powstawaniu ziarniniaków gruźliczych większe znaczenie odgrywają postaci keto- i metoksy- [22,45].

Wpływ warunków hodowli na profil kwasów mikolowych

Mikobakterie cechują się zdolnością do modulowania składu poszczególnych typów mikolanów w  zależności od warunków środowiska czy etapu infekcji. Wydaje się więc istotne, że warunki hodowli bakterii mogą być istotnym czynnikiem wpływającym na wielkość oraz strukturę chemiczną kwasów mikolowych. Organizmami modelowymi do oceny wpływu zastosowanego źródła węgla na profil mikolanów są najczęściej bakterie z rodzaju Rhodococcus znajdujące obecnie szerokie zastosowanie w procesach biodegradacji. Mikroorganizmy te cechują się obecnością kwasów mikolowych o całkowitej liczbie atomów węgla w cząsteczce w zakresie 32-66 oraz dużym stopniu nasycenia łańcuchów zarówno meromikolowego jak i  α-alkilowego [32]. Dowiedziono, że zmiana źródła węgla z glukozy na fruktozę, maltozę bądź maltodekstrynę może skutkować znaczącymi zmianami jakościowymi oraz ilościowymi w profilu wytwarzanych kwasów [61]. Znacznie większy wpływ na syntezę kwasów mikolowych wydaje się mieć zastosowanie alternatywnych dla cukrów źródeł węgla. Zastosowanie monooleinianu polioksyetylenosorbitolu (Tween 80) jako jedynego źródła węgla spowodowało wyraźne przesunięcie profilu ściany komórkowej Rhodococcus w kierunku syntezy kwasów mikolowych o dłuższych i bardziej nienasyconych łańcuchach węglowodorowych [55]. Podobne zmiany zauważono w przypadku szczepów Rhodococcus erythropolis zdolnych do rozkładu fenolu, a wzrastających w obecności kwasów humusowych [29]. Udowodniono, że szczep zdolny do wzrostu w obecności fenolu wykazywał znacznie większy udział długołańcuchowych i nienasyconych kwasów mikolowych w porównaniu do szczepu zmodyfikowanego genetycznie o podwyższonej aktywności hydroksylazy fenolowej. Tego typu modyfikacja budowy ściany komórkowej powodowała wzrost hydrofobowości powierzchni komórki bakteryjnej prawie o 10% oraz wzrost jej przepuszczalności dla związków o charakterze hydrofobowym. Zmiana ta może być spowodowana przez silne zaburzenia płynności ściany komórkowej będące skutkiem jej oddziaływań z silnie hydrofobowymi związkami, takimi jak Tween 80 czy kwasy humusowe. Naturalną reakcją bakterii znajdujących się w ich środowisku jest więc modyfikacja profilu kwasów mikolowych pozwalająca na adaptację do bardziej hydrofobowego otoczenia. Podobne zmiany w profilu kwasów mikolowych będących odpowiedzią na hydrofobowe środowisko wzrostu odnotowano w rodzaju Mycobacterium [66,67]. Prątki hodowane na pożywkach zawierających antracen jako jedyne źródło węgla cechowały się nawet 70-krotnie większą hydrofobowością powierzchni komórki w  porównaniu do tych samych szczepów hodowanych na podłożu z glukozą [8,67]. Jednocześnie w hodowlach zawierających zarówno glukozę jak i antracen dowiedziono spadku stopnia hydrofobowości ściany komórkowej w miarę wzrostu zawartości glukozy w stosunku do antracenu [66]. Można więc przypuszczać, że zmiana hydrofobowości powierzchni ściany komórkowej Mycobacterium nie następuje wskutek stymulacji konkretnym związkiem chemicznym, lecz jako reakcja na ogólną hydrofobowość środowiska wzrostu. Źródło węgla nie jest jednak jedynym czynnikiem wzrostowym wpływającym na profil kwasów mikolowych. W literaturze wymienia się wiele innych związków chemicznych o istotnym wpływie na skład ściany komórkowej, w tym induktory enzymów, modulatory transportu, czy metale ciężkie [29,61].

Wśród czynników fizycznych mających potencjalny wpływ na syntezę oraz profil kwasów mikolowych wymienia się głównie temperaturę oraz zawartość dwutlenku węgla. Udowodniono, że obniżenie temperatury wzrostu niektórych szczepów Rhodococcus do 10 °C powoduje całkowite zahamowanie syntezy kwasów mikolowych. Systematyczny wzrost temperatury skutkuje jednocześnie wzrostem udziału długołańcuchowych oraz nienasyconych mikolanów [61]. Podobne zmiany obserwuje się u prątków Mycobacterium wiążąc je bezpośrednio ze spadkiem płynności ściany komórkowej w obniżonej temperaturze otoczenia [20]. Ponadto u  mikobakterii, temperatura determinuje nie tylko długość łańcuchów kwasów mikolowych, ale również ich strukturę. Udowodniono, że spadek temperatury inkubacji może wywoływać intensyfikację cyklopropoanizacji łańcuchów meromikolowych [2,6]. Niedawno przeprowadzone badania dowiodły również niebagatalnego wpływu dwutlenku węgla na formowanie biofilmu mikobakteryjnego, którego jednym z głównych składników są kwasy mikolowe [40,41]. Zaobserwowano, iż powstawanie biofilmów jest opóźnione przy obniżonych stężeniach cynku i żelaza. Pierwiastki te są kofaktorami enzymów, takich jak dehydrogenazy pirogronianowa czy izocytrynianowa, które katalizując reakcję dekarboksylacji prowadzą pośrednio do wewnątrzkomórkowego wytwarzania dwutlenku węgla. Jakkolwiek badacze zaobserwowali, iż formowanie biofilmu zachodzi w znacznie większym stopniu w szczelnie zamkniętych naczyniach w porównaniu do hodowli z dodatkiem 5% CO2 . Sugeruje to, że na tworzenie biofilmów może mieć wpływ wiele innych czynników środowiskowych dotychczas niezidentyfikowanych [40].

Przeciwciała przeciwko kwasom mikolowym

Potencjalna zdolność do generowania swoistej odpowiedzi odpornościowej bezpośrednio związana ze stopniem ekspozycji kwasów mikolowych na powierzchni ściany komórkowej Mycobacterium czyni z tej specyficznej grupy związków chemicznych doskonały antygen do wytwarzania przeciwciał. Pierwsze doniesienia dotyczące obecności swoistych przeciwciał (anty-MA) w surowicy chorych na gruźlicę płuc dowiodły immunogenności zarówno czynnika wiązkowego (dimikoloanu trehalozy), jak i samych wolnych kwasów mikolowych [44,52]. Późniejsze badania dowiodły jednocześnie dużej kompetycji antygenowej wyizolowanych przeciwciał między kwasami mikolowymi a cholesterolem w teście ELISA [7]. Obserwowana reaktywność krzyżowa jest związana najprawdopodobniej podobieństwem strukturalnym układów steroidowych do konformacji przestrzennej, jaką przyjmują kwasy mikolowe w roztworach wodnych [7,27]. Występuje bezpośrednia zależność siły wiązania przeciwciał do kwasów mikolowych a ich klasą oraz długością łańcucha meromikolowego. Najwyższy stopień antygenowości wykazują kolejno kwasy metoksy- oraz ketomikolowe. W środowisku wodnym przyjmują one charakterystyczną konformację przestrzenną w kształcie litery „W” – eksponując w jednym kierunku wszystkie grupy funkcyjne o  charakterze hydrofilowym. Zależność immunogenności od konformacji potwierdza znikoma aktywność przeciwciał anty-MA względem α-mikolanów, niemających dodatkowych hydrofilowych grup funkcyjnych o ograniczonych możliwościach do tworzenia opisanych w przypadku innych klas związków struktur przestrzennych [9,14]. Podkreślenia wymaga to, że kwasy metoksy- oraz ketomikolowe stanowią jedynie do 30% wszystkich tych związków w ścianie komórkowej M. tuberculosis, co teoretycznie znacząco ogranicza zastosowanie diagnostyczne przeciwciał anty-MA [35]. Potencjalnymi technikami pozwalającymi na zwiększenie immunogenności kwasów mikolowych jest ich immobilizacja z użyciem wysokocząsteczkowego nośnika. Wśród dotychczas wykorzystywanych nośników kwasów mikolowych wymienia się systemy detekcyjne oparte na liposomach oraz jednowarstwach N-(2-merkaptoetyl) oktadecanamidu [34,36,42,59]. Obie wymienione techniki dowiodły znacząco większej czułości i swoistości oznaczeń względem klasycznego testu ELISA.

Kwasy mikolowe jako biomakery w wykrywaniu gruźlicy oraz mikobakterioz

Już w  latach 80 dwudziestego wieku, badacze zwrócili uwagę na kwasy mikolowe jako potencjalne markery detekcji i różnicowania mikobakterii. Związki te są integralną częścią ściany komórkowej prątków stanowiąc 20-40% ich suchej masy [10]. Ponadto są związkami o dobrej chemicznej stabilności i mogą być wykrywane zarówno z materiału zawierającego żywe mikroorganizmy, jak i tylko ich osłony komórkowe lub elementy biofilmu [18,50]. Wraz z rozwojem technik chromatografii cieczowej rozwinięto referencyjną metodę klasyfikowania mikobakterii na podstawie profilu estrów bromofenacylowych kwasów mikolowych. Metoda ta oparta na detekcji UV miała charakter jedynie porównawczy znajdując przyszłe zastosowanie bardziej w  klasyfikacji szczepów wstępnie namnożonych niż właściwej diagnostyce [12]. Weryfikacja przydatności diagnostycznej późniejszych modyfikacji przedstawionej metody uwzględniających również detekcję fluorescencyjną pozwoliła na osiągnięcie wykrywalności na poziomie jedynie 41% bezpośrednio z plwocin o dodatniej bakterioskopii [11]. Zadowalającą czułość uzyskano dopiero w wyniku 10-dniowego namnażania na podłożu 7H9 osiągając odpowiednio 30 i 91% wykrywalności dla grupy ujemnej i dodatniej pod względem bakterioskopii [65]. Dowiedziono jednocześnie, że metoda ta może zostać z powodzeniem zastosowana do oceny lekowrażliwości mikobakterii przez jednoczesną inkubację na podłożu zawierającym antybiotyk, a także wolnym od niego. [64]. Obecnie rozwój zaawansowanych technik spektrometrii mas pozwala na znacznie czulszą detekcję kwasów mikolowych w porównaniu do klasycznych detektorów UV czy fluorescencyjnych. Pierwsze badania z  użyciem spektrometrii mas wykorzystujące m.in. urządzenia typu MALDI-TOF skupiały się głównie na aspektach poznawczych mając na celu głównie charakterystykę profili kwasów mikolowych zawartych w czynniku wiązkowym bądź w  samej ścianie komórkowej u  różnych szczepów mikobakterii [22,37,54,62,63]. Dopiero ostatnie lata przyniosły dokładną weryfikację przydatności analizy kwasów mikolowych z użyciem tandemowych spektrometrów mas w  diagnostyce gruźlicy [53,57]. Badania wykazały dużą czułość oraz swoistość oznaczeń kwasów mikolowych bezpośrednio z plwociny chorych sięgającą odpowiednio 94 i 93% w wykrywaniu gruźlicy płuc [53]. Jednocześnie prowadzone badania pozwoliły na wykrycie kwasów mikolowych charakterystycznych dla prątków gruźlicy w około 70% przypadków przy bezpośredniej analizie z plwociny oraz w 94% po 10-dniowej inkubacji na podłożu 7H9 [57]. Badania te wskazują jak wielki potencjał stanowią kwasy mikolowe jako biomarkery zarówno w diagnostyce gruźlicy u ludzi, jak i w wykrywaniu wielu mikobakterioz wywoływanych przez prątki atypowe.

Kwasy mikolowe jako markery „antycznych” zakażeń prątkami z rodzaju Mycobacterium

Kwasy mikolowe z powodu swojej budowy chemicznej cechują się wyjątkową trwałością oraz opornością na działanie czynników środowiskowych. Ze względu właśnie na te cechy, związki te zostały wytypowane jako biomarkery alternatywne dla antycznego DNA w  wykrywaniu chorób wywoływanych przez mikobakterie w materiałach archeologicznych [60]. O przydatności analizy kwasów mikolowych lub wręcz jej przewagi nad analizami genetycznymi świadczą wyniki badań potwierdzające obecność kwasów mikolowych w  próbach kości, zwapniałych oraz zmumifikowanych fragmentów tkanki płucnej artefaktów archeologicznych noszących znamiona kontaktu z gruźlicą [18,19,24]. Badania przeprowadzone na szkieletach z okresu neolitu również wykazały obecność mikolanów o profilu charakterystycznym dla prątków gruźlicy, co bezpośrednio popiera tezę, że gruźlica jest najstarszą chorobą znaną ludzkości [28]. Drobnoustroje z rodzaju Mycobacterium towarzyszą od tysięcy lat nie tylko człowiekowi, a ich pozostałości w postaci kwasów mikolowych wykryto również w kościach sprzed 17 tysięcy lat należące do wymarłego gatunku bizona – Bison antiquus [33]. Analiza profilu kwasów mikolowych pozwala na wykrycie nie tylko gruźlicy, ale również chorób wywoływanych przez pozostałe szczepy prątków, w tym również trądu. Badania przeprowadzone na materiale kostnym z okresu średniowiecza noszącym zmiany charakterystyczne dla trądu dowiodły obecności kwasów mikolowych o profilu charakterystycznym dla Mycobacterium leprae.

Podsumowanie

Kwasy mikolowe to wyjątkowo interesująca grupa związków chemicznych stanowiąca integralną cześć ściany komórkowej drobnoustrojów z rodzaju Mycobacterium. Obecnie prowadzone badania wskazują, że nie tylko obecność kwasów mikolowych w ścianie komórkowej mikobakterii jest istotna dla wirulencji mikobakterii. Dowiedziono, że wzajemny stosunek poszczególnych typów kwasów mikolowych, ich długość oraz stopień cyklopropanizacji może ulegać zmianie w  zależności od etapu infekcji czy warunków hodowli prątków. Jednocześnie wykazano, że niektóre mikolany mogą być podstawowe dla powstawania biofilmu, oporności na leki przeciwprątkowe czy oddziaływań z  układem odpornościowym. Najnowsze badania wskazują na zastosowanie analizy profili kwasów mikolowych jako alternatywy dla klasycznych metod diagnostyki chorób, takich jak gruźlica, trąd czy mikobakteriozy. Złożoność funkcji jakie pełnią kwasy mikolowe w  komórkach rodzaju Mycobacterium czynią z nich niezmiennie od ponad 60 lat niewyczerpane źródło wiedzy na temat metabolizmu oraz wirulencji mikobakterii.

Przypisy

• 1. Alahari A., Alibaud L., Trivelli X., Gupta R., Lamichhane G., ReynoldsR.C., Bishai W.R., Guerardel Y., Kremer L.: Mycolic acid methyltransferase,MmaA4, is necessary for thiacetazone susceptibilityin Mycobacterium tuberculosis. Mol. Microbiol., 2009; 71: 1263-1277
  Google Scholar
• 2. Alibaud L., Alahari A., Trivelli X., Ojha A.K., Hatfull G.F., GuerardelY., Kremer L.: Temperature-dependent regulation of mycolic acidcyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacteriumsmegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanationof α-mycolates. J. Biol. Chem., 2010; 285: 21698-21707
  Google Scholar
• 3. Anderson R.J.: Chemical investigation of biologically active lipoidsof tubercle bacilli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1929; 15: 628-633
  Google Scholar
• 4. Asselineau J., Lederer E.: Structure of the mycolic acids of Mycobacteria.Nature, 1950; 166: 782-783
  Google Scholar
• 5. Barkan D., Hedhli D., Yan H.G., Huygen K., Glickman M.S.: Mycobacteriumtuberculosis lacking all mycolic acid cyclopropanation isviable but highly attenuated and hyperinflammatory in mice. Infect.Immun., 2012; 80: 1958-1968
  Google Scholar
• 6. Barkan D., Liu Z., Sacchettini J.C., Glickman M.S.: Mycolic acid cyclopropanationis essential for viability, drug resistance, and cell wallintegrity of Mycobacterium tuberculosis. Chem. Biol., 2009; 16: 499-509
  Google Scholar
• 7. Benadie Y., Deysel M., Siko D.G., Roberts V.V., Van Wyngaardt S.,Thanyani S.T., Sekanka G., Ten Bokum A.M., Collett L.A., Grooten J.,Baird M.S., Verschoor J.A.: Cholesteroid nature of free mycolic acidsfrom M. tuberculosis. Chem. Phys. Lipids, 2008; 152: 95-103
  Google Scholar
• 8. Bendinger B., Rijnaarts H.H., Altendorf K., Zehnder A.J.: Physicochemicalcell surface and adhesive properties of coryneform bacteriarelated to the presence and chain length of mycolic acids. Appl.Environ. Microbiol., 1993; 59: 3973-3977
  Google Scholar
• 9. Beukes M., Lemmer Y., Deysel M., Al Dulayymi J.R., Baird M.S.,Koza G., Iglesias M.M., Rowles R.R., Theunissen C., Grooten J., ToschiG., Roberts V.V., Pilcher L., Van Wyngaardt S., Mathebula N., BalogunM., Stoltz A.C., Verschoor J.A.: Structure-function relationshipsof the antigenicity of mycolic acids in tuberculosis patients. Chem.Phys. Lipids, 2010; 163: 800-808
  Google Scholar
• 10. Brennan P.J., Crick D.C.: The cell-wall core of Mycobacterium tuberculosisin the context of drug discovery. Curr. Top. Med. Chem.,2007; 7: 475-488
  Google Scholar
• 11. Butler W.R., Guthertz L.S.: Mycolic acid analysis by high-performanceliquid chromatography for identification of Mycobacteriumspecies. Clin. Microbiol. Rev., 2001; 14: 704-726
  Google Scholar
• 12. Butler W.R., Kilburn J.O.: High-performance liquid-chromatographypatterns of mycolic acids as criteria for identification of Mycobacteriumchelonae, Mycobacterium fortuitum, and Mycobacteriumsmegmatis. J. Clin. Microbiol., 1990; 28: 2094-2098
  Google Scholar
• 13. Carter G., Wu M., Drummond D.C., Bermudez L.E.: Characterizationof biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium.J. Med. Microbiol., 2003; 52: 747-752
  Google Scholar
• 14. Chan C.E., Zhao B.Z., Cazenave-Gassiot A., Pang S.W., Bendt A.K.,Wenk M.R., MacAry P.A., Hanson B.J.: Novel phage display-derivedmycolic acid-specific antibodies with potential for tuberculosis diagnosis.J. Lipid Res., 2013; 54: 2924-2932
  Google Scholar
• 15. Chen J.M., German G.J., Alexander D.C., Ren H., Tan T., Liu J.:Roles of Lsr2 in colony morphology and biofilm formation of Mycobacteriumsmegmatis. J. Bacteriol., 2006; 188: 633-641
  Google Scholar
• 16. Cole S.T., Barrell B.G.: Analysis of the genome of Mycobacteriumtuberculosis H37Rv. Novartis Found. Symp., 1998; 217: 160-172
  Google Scholar
• 17. Dao D.N., Sweeney K., Hsu T., Gurcha S.S., Nascimento I.P., RoshevskyD., Besra G.S., Chan J., Porcelli S.A., Jacobs W.R.: Mycolic acidmodification by the mmaA4 gene of M. tuberculosis modulates IL-12production. PLoS Pathog., 2008; 4: e1000081
  Google Scholar
• 18. Donoghue H.D., Lee O.Y., Minnikin D.E., Besra G.S., Taylor J.H.,Spigelman M.: Tuberculosis in Dr Granville’s mummy: a molecular re-examinationof the earliest known Egyptian mummy to be scientificallyexamined and given a medical diagnosis. Proc. Biol. Sci., 2010; 277: 51-56
  Google Scholar
• 19. Donoghue H.D., Spigelman M., Zias J., Gernaey-Child A.M., MinnikinD.E.: Mycobacterium tuberculosis complex DNA in calcified pleurafrom remains 1400 years old. Lett. Appl. Microbiol., 1998; 27: 265-269
  Google Scholar
• 20. Draper P.: The outer parts of the mycobacterial envelope as permeabilitybarriers. Front. Biosci., 1998; 3: D1253-D1261
  Google Scholar
• 21. Dubnau E., Chan J., Raynaud C., Mohan V.P., Lanéelle M.A., YuK., Quémard A., Smith I., Daffé M.: Oxygenated mycolic acids arenecessary for virulence of Mycobacterium tuberculosis in mice. Mol.Microbiol., 2000; 36: 630-637
  Google Scholar
• 22. Fujita Y., Naka T., McNeil M.R., Yano I.: Intact molecular characterizationof cord factor (trehalose 6,6’-dimycolate) from ninespecies of mycobacteria by MALDI-TOF mass spectrometry. Microbiology,2005; 151: 3403-3416
  Google Scholar
• 23. Fujita Y., Okamoto Y., Uenishi Y., Sunagawa M., Uchiyama T.,Yano I.: Molecular and supra-molecular structure related differencesin toxicity and granulomatogenic activity of mycobacterialcord factor in mice. Microb. Pathog., 2007; 43: 10-21
  Google Scholar
• 24. Gernaey A.M., Minnikin D.E., Copley M.S., Dixon R.A., MiddletonJ.C., Roberts C.A.: Mycolic acids and ancient DNA confirm an osteologicaldiagnosis of tuberculosis. Tuberculosis, 2001; 81: 259-265
  Google Scholar
• 25. Glickman M.S., Cahill S.M., Jacobs W.R.Jr.: The Mycobacteriumtuberculosis cmaA2 gene encodes a mycolic acid trans-cyclopropanesynthetase. J. Biol. Chem., 2001; 276: 2228-2233
  Google Scholar
• 26. Hamasaki N., Isowa K., Kamada K., Terano Y., Matsumoto T., ArakawaT., Kobayashi K., Yano I.: In vivo administration of mycobacterial cordfactor (trehalose 6,6’-dimycolate) can induce lung and liver granulomasand thymic atrophy in rabbits. Infect. Immun., 2000; 68: 3704-3709
  Google Scholar
• 27. Hasegawa T., Leblanc R.M.: Aggregation properties of mycolicacid molecules in monolayer films: a comparative study of compoundsfrom various acid-fast bacterial species. Biochim. Biophys.Acta, 2003; 1617: 89-95
  Google Scholar
• 28. Hershkovitz I., Donoghue H.D., Minnikin D.E., Besra G.S., LeeO.Y., Gernaey A.M., Galili E., Eshed V., Greenblatt C.L., Lemma E.,Bar-Gal G.K., Spigelman M.: Detection and molecular characterizationof 9,000-year-old Mycobacterium tuberculosis from a neolithicsettlement in the Eastern Mediterranean. PloS One, 2008; 3: e3426
  Google Scholar
• 29. Kolouchová I., Schreiberová O., Masák J., Sigler K., Rezanka T.:Structural analysis of mycolic acids from phenol-degrading strainof Rhodococcus erythropolis by liquid chromatography-tandem massspectrometry. Folia Microbiol., 2012; 57: 473-483
  Google Scholar
• 30. Korf J.E., Pynaert G., Tournoy K., Boonefaes T., Van OosterhoutA., Ginneberge D., Haegeman A., Verschoor J.A., De Baetselier P.,Grooten J.: Macrophage reprogramming by mycolic acid promotesa tolerogenic response in experimental asthma. Am. J. Respir. Crit.Care Med., 2006; 174: 152-160
  Google Scholar
• 31. Korf J., Stoltz A., Verschoor J., De Baetselier P., Grooten J.: TheMycobacterium tuberculosis cell wall component mycolic acid elicitspathogen-associated host innate immune responses. Eur. J. Immunol.,2005; 35: 890-900
  Google Scholar
• 32. Kowalski K., Szewczyk R., Druszczynska M.: Kwasy mikolowe- potencjalne markery diagnostyki oportunistycznych zakażeń mikroorganizmamiz podrzędu Corynebacterineae. Postępy Hig. Med.Dośw., 2012; 66: 461-468
  Google Scholar
• 33. Lee O.Y., Wu H.H., Donoghue H.D., Spigelman M., Greenblatt C.L.,Bull I.D., Rothschild B.M., Martin L.D., Minnikin D.E., Besra G.S.: Mycobacteriumtuberculosis complex lipid virulence factors preservedin the 17,000-year-old skeleton of an extinct bison, Bison antiquus.PloS One, 2012; 7: e41923
  Google Scholar
• 34. Lemmer Y., Thanyani S.T., Vrey P.J., Driver C.H., Venter L., vanWyngaardt S., ten Bokum A.M., Ozoemena K.I., Pilcher L.A., Fernig D.G.,Stoltz A.C., Swai H.S., Verschoor J.A.: Detection of antimycolic acid antibodiesby liposomal biosensors. Methods Enzymol., 2009; 464: 79-104
  Google Scholar
• 35. Liu J., Barry C.E.3rd, Besra G.S., Nikaido H.: Mycolic acid structuredetermines the fluidity of the mycobacterial cell wall. J. Biol.Chem., 1996; 271: 29545-29551
  Google Scholar
• 36. Mathebula N.S., Pillay J., Toschi G., Verschoor J.A., OzoemenaK.I.: Recognition of anti-mycolic acid antibody at self-assembledmycolic acid antigens on a gold electrode: a potential impedimetricimmunosensing platform for active tuberculosis. Chem. Commun.,2009; 23: 3345-3347
  Google Scholar
• 37. Mederos L., Valdivia J.A., Valero-Guillen P.L.: Analysis of thestructure of mycolic acids of Mycobacterium simiae reveals a particularcomposition of α-mycolates in strain ‘habana’ TMC 5135, consideredas immunogenic in tuberculosis and leprosy. Microbiology,2007; 153: 4159-4165
  Google Scholar
• 38. Mukherjee R., Chatterji D.: Proteomics and mass spectrometricstudies reveal planktonic growth of Mycobacterium smegmatisin biofilm cultures in the absence of rpoZ. J. Chromatogr. B Analyt.Technol. Biomed. Life Sci., 2008; 861: 196-202
  Google Scholar
• 39. Ojha A., Anand M., Bhatt A., Kremer L., Jacobs W.R.Jr., Hatfull G.F.:GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesisduring biofilm formation in mycobacteria. Cell, 2005; 123: 861-873
  Google Scholar
• 40. Ojha A.K., Baughn A.D., Sambandan D., Hsu T., Trivelli X.,Guerardel Y., Alahari A., Kremer L., Jacobs W.R.Jr., Hatfull G.F.:Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing freemycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol.,2008; 69: 164-174
  Google Scholar
• 41. Ojha A.K., Trivelli X., Guerardel Y., Kremer L., Hatfull G.F.: Enzymatichydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolicacids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem., 2010;285: 17380-17389
  Google Scholar
• 42. Ozoemena K.I., Mathebula N.S., Pillay J., Toschi G., VerschoorJ.A.: Electron transfer dynamics across self-assembled N-(2-mercaptoethyl)octadecanamide/mycolic acid layers: impedimetric insightsinto the structural integrity and interaction with anti-mycolic acidantibodies. Phys. Chem. Chem. Phys., 2010; 12: 345-357
  Google Scholar
• 43. Pacheco S.A., Hsu F.F., Powers K.M., Purdy G.E.: MmpL11 proteintransports mycolic acid-containing lipids to the mycobacterial cellwall and contributes to biofilm formation in Mycobacterium smegmatis.J. Biol. Chem., 2013; 288: 24213-24222
  Google Scholar
• 44. Pan J., Fujiwara N., Oka S., Maekura R., Ogura T., Yano I.: Anti–cord factor (trehalose 6,6’-dimycolate) IgG antibody in tuberculosispatients recognizes mycolic acid subclasses. Microbiol. Immunol.,1999; 43: 863-869
  Google Scholar
• 45. Peyron P., Vaubourgeix J., Poquet Y., Levillain F., Botanch C.,Bardou F., Daffé M., Emile J.F., Marchou B., Cardona P.J., de ChastellierC., Altare F.: Foamy macrophages from tuberculous patients’granulomas constitute a nutrient-rich reservoir for M. tuberculosispersistence. PLoS Pathog., 2008; 4: e1000204
  Google Scholar
• 46. Rachman H., Strong M., Ulrichs T., Grode L., Schuchhardt J.,Mollenkopf H., Kosmiadi G.A., Eisenberg D., Kaufmann S.H.E.: Uniquetranscriptome signature of Mycobacterium tuberculosis in pulmonarytuberculosis. Infect. Immun., 2006; 74: 1233-1242
  Google Scholar
• 47. Recht J., Kolter R.: Glycopeptidolipid acetylation affects slidingmotility and biofilm formation in Mycobacterium smegmatis. J. Bacteriol.,2001; 183: 5718-5724
  Google Scholar
• 48. Ren H., Dover L.G., Islam S.T., Alexander D.C., Chen J.M., BesraG.S., Liu J.: Identification of the lipooligosaccharide biosyntheticgene cluster from Mycobacterium marinum. Mol. Microbiol., 2007;63: 1345-1359
  Google Scholar
• 49. Ryan G.J., Hoff D.R., Driver E.R., Voskuil M.I., Gonzalez-JuarreroM., Basaraba R.J., Crick D.C., Spencer J.S., Lenaerts A.J.: Multiple M.tuberculosis phenotypes in mouse and guinea pig lung tissue revealedby a dual-staining approach. PLoS One, 2010; 5: e11108
  Google Scholar
• 50. Sambandan D., Dao D.N., Weinrick B.C., Vilcheze C., Gurcha S.S.,Ojha A., Kremer L., Besra G.S., Hatfull G.F., Jacobs W.R.: Keto-mycolicacid-dependent pellicle formation confers tolerance to drug–sensitive Mycobacterium tuberculosis. MBio., 2013; 4: e00222-00213
  Google Scholar
• 51. Sani M., Houben E.N., Geurtsen J., Pierson J., de Punder K., vanZon M., Wever B., Piersma S.R., Jiménez C.R., Daffé M., Appelmelk B.J.,Bitter W., van der Wel N., Peters P.J.: Direct visualization by cryo-EMof the mycobacterial capsular layer: a labile structure containingESX-1-secreted proteins. PLoS Pathog., 2010; 6: e1000794
  Google Scholar
• 52. Schleicher G.K., Feldman C., Vermaak Y., Verschoor J.A.: Prevalenceof anti-mycolic acid antibodies in patients with pulmonarytuberculosis co-infected with HIV. Clin. Chem. Lab. Med., 2002;40: 882-887
  Google Scholar
• 53. Shui G., Bendt A.K., Jappar I.A., Lim H.M., Laneelle M., Hervé M.,Via L.E., Chua G.H., Bratschi M.W., Rahim S.Z., Michell, A.L., HwangS.H., Lee J.S., Eum S.Y., Kwak H.K., Daffé M., Dartois V., Michel G.,Barry C.E.3rd, Wenk M.R.: Mycolic acids as diagnostic markers fortuberculosis case detection in humans and drug efficacy in mice.EMBO Mol. Med., 2012; 4: 27-37
  Google Scholar
• 54. Song S.H., Park K.U., Lee J.H., Kim E.C., Kim J.Q., Song J.: Electrosprayionization-tandem mass spectrometry analysis of the mycolicacid profiles for the identification of common clinical isolatesof mycobacterial species. J. Microbiol. Methods, 2009; 77: 165-177
  Google Scholar
• 55. Stratton H.M., Brooks P.R., Carr E.L., Seviour R.J.: Effects of cultureconditions on the mycolic acid composition of isolates of Rhodococcusspp. from activated sludgefoams. Syst. Appl. Microbiol.,2003; 26: 165-171
  Google Scholar
• 56. Sugawara I., Udagawa T., Hua S.C., Reza-Gholizadeh M., OtomoK., Saito Y., Yamada H.: Pulmonary granulomas of guinea pigs inducedby inhalation exposure of heat-treated BCG Pasteur, purifiedtrehalose dimycolate and methyl ketomycolate. J. Med. Microbiol.,2002; 51: 131-137
  Google Scholar
• 57. Szewczyk R., Kowalski K., Janiszewska-Drobinska B., Druszczyń-ska M.: Rapid method for Mycobacterium tuberculosis identificationusing electrospray ionization tandem mass spectrometry analysisof mycolic acids. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2013; 76: 298-305
  Google Scholar
• 58. Takayama K., Wang C., Besra G.S.: Pathway to synthesis andprocessing of mycolic acids in Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol.Rev., 2005; 18: 81-101
  Google Scholar
• 59. Thanyani S.T., Roberts V., Siko D.G., Vrey P., Verschoor J.A.:A novel application of affinity biosensor technology to detect antibodiesto mycolic acid in tuberculosis patients. J. Immunol. Methods,2008; 332: 61-72
  Google Scholar
• 60. Tran T.N., Aboudharam G., Raoult D., Drancourt M.: Beyondancient microbial DNA: nonnucleotidic biomolecules for paleomicrobiology.Biotechniques, 2011; 50: 370-380
  Google Scholar
• 61. Tucker T.A., Crow S.A.Jr., Pierce G.E.: Effect of growth media oncell envelope composition and nitrile hydratase stability in Rhodococcusrhodochrous strain DAP 96253. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.,2012; 39: 1577-1585
  Google Scholar
• 62. Uenishi Y., Fujita Y., Kusunose N., Yano I., Sunagawa M.: Comprehensiveanalysis of mycolic acid subclass and molecular speciescomposition of Mycobacterium bovis BCG Tokyo 172 cell wall skeleton(SMP-105). J. Microbiol. Methods, 2008; 72: 149-156
  Google Scholar
• 63. Uenishi Y., Takii T., Yano I., Sunagawa M.: Separation and molecularcharacterization of mycolic acid from the cell wall skeleton of Mycobacteriumbovis BCG Tokyo 172 (SMP-105) and BCG substrains by normal–phase high performance liquid chromatography and liquid chromatography/massspectrometry. J. Microbiol. Methods, 2009; 77: 320-322
  Google Scholar
• 64. Viader-Salvado J.M., Garza-Gonzalez E., Valdez-Leal R., del Bosque-MoncayoM.A., Tijerina-Menchaca R., Guerrero-Olazaran M.:Mycolic acid index susceptibility method for Mycobacterium tuberculosis.J. Clin. Microbiol., 2001; 39: 2642-2645
  Google Scholar
• 65. Viader-Salvadó J.M., Molina-Torres C.A., Guerrero-Olazarán M.:Detection and identification of mycobacteria by mycolic acid analysisof sputum specimens and young cultures. J. Microbiol. Methods,2007; 70: 479-483
  Google Scholar
• 66. Wick L.Y., Pasche N., Bernasconi S.M., Pelz O., Harms H.: Characterizationof multiple-substrate utilization by anthracene-degradingMycobacterium frederiksbergense LB501T. Appl. Environ. Microbiol.,2003; 69: 6133-6142
  Google Scholar
• 67. Wick L.Y., Wattiau P., Harms H.: Influence of the growth substrateon the mycolic acid profiles of mycobacteria. Environ. Microbiol.,2002; 4: 612-616
  Google Scholar
• 68. Yuan Y., Zhu Y., Crane D.D., Barry C.E.3rd: The effect of oxygenatedmycolic acid composition on cell wall function and macrophage growthin Mycobacterium tuberculosis. Mol. Microbiol., 1998; 29: 1449-1458
  Google Scholar
• 69. Zambrano M.M., Kolter R.: Mycobacterial biofilms: a greasy wayto hold it together. Cell, 2005; 123: 762-764
  Google Scholar

Pełna treść artykułu