Metformina kluczem do alternatywnej aktywacji mikrogleju?
Krzysztof Łabuzek 1 , Bożena Gabryel 2 , Bogusław Okopień 1Abstrakt
Wyniki ostatnich badań wskazują, że metformina (niezależnie od działania antyhiperglikemicznego) może hamować procesy neurozapalne i bezpośrednio wpływać na ośrodkowy układ nerwowy. Mechanizmy molekularne, przez które metformina działa przeciwzapalnie w mózgu są stosunkowo mało poznane. Obecnie przyjmuje się, że mechanizm działania metforminy polega głównie na aktywacji kinazy białkowej aktywowanej przez AMP (AMPK). Udowodniono jednak, że pewne ośrodkowe działania biologiczne metforminy (np. uwalnianie cytokin, ekspresja arginazy I lub PGC-1α) nie zależą od aktywacji AMPK, ale zachodzą poprzez mechanizmy AMPK-niezależne. W artykule omówiono aktualne dane wskazujące, iż korzystny wpływ metforminy obserwowany w eksperymentalnych modelach chorób neurodegeneracyjnych może być skutkiem promowania w mózgu tzw. alternatywnej aktywacji mikrogleju.
Wstęp
Metformina (N1,N1-dimetylobiguanid) jest pochodną guanidyny o dwóch metylowych podstawnikach bocznych. Wartości stałej dysocjacji (pKa) wynoszą 2,8 i 11,5, co powoduje, iż w warunkach fizjologicznych metformina występuje głównie w postaci kationowej (>99,9%) o dużej hydrofilności [47]. Postać niezjonizowaną metforminy (<0,01%), ze względu na obecność grup metylowych, charakteryzuje bardzo mała rozpuszczalność w tłuszczach o czym świadczy wartość współczynnika podziału n-oktanol/woda wynoszący -1,43. Dlatego też jej transport bierny przez błony komórkowe jest ograniczony [47]. Całkowita biodostępność po podaniu doustnym mieści się w zakresie 50-60%. Metformina nie wiąże się z białkami osocza, a jej objętość dystrybucji (Vd) wynosi około 4 L/kg [100]. W organizmie człowieka (w przeciwieństwie do szczura) metformina właściwie nie podlega biotransformacji i jest wydalana głównie z moczem [3,4]. Czas połowiczej eliminacji leku wynosi około 4-5 godzin [100].
Metformina weszła w skład leków przeciwcukrzycowych w latach 50 ub.w. i do dzisiaj, w USA i w większości krajów europejskich, jest jedyną pochodną biguanidu stosowaną w lecznictwie. W oparciu o wyniki badania United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS) opublikowanego w 1998 r. oraz zgodnie z aktualnymi wytycznymi polskich i światowych towarzystw diabetologicznych metformina jako jedyna, wraz z odpowiednią dietą, powinna być lekiem pierwszego rzutu w cukrzycy typu 2 [38]. Badanie UKPDS wykazało m.in., że metformina obniża ryzyko wystąpienia incydentów sercowo-naczyniowych niezależnie od działania antyhiperglikemicznego [66]. Obserwacje te skłoniły badaczy do określenia bezpośredniego wpływu metforminy na różne typy komórek, zwłaszcza budujące ściany naczyń krwiono- śnych. Przeprowadzone doświadczenia udowodniły, że metformina hamuje odpowiedź zapalną w komórkach śródbłonka naczyniowego [46], monocytach/makrofagach [66] oraz proliferację mięśni gładkich w ścianie naczyniowej [61]. Odkryte właściwości przeciwzapalne i antyproliferacyjne były podstawą do określenia często- ści występowania chorób nowotworowych u pacjentów z cukrzycą typu 2 leczonych metforminą. Wyniki badań obserwacyjnych wykazały, że stosowanie leku w tej grupie chorych istotnie redukuje ryzyko rozwoju nowotworów, niezależnie od jej działania antyhiperglikemicznego [14,31,63]. Antymitotyczne i przeciwnowotworowe właściwości metforminy potwierdzono w licznych eksperymentach zarówno na zwierzętach doświadczalnych, jak i na liniach ludzkich komórek nowotworowych [1,2,3,7,39,45,50,90,111]. Sugeruje się zatem, że metformina w przyszłości może być lekiem stosowanym w terapii adiuwantowej (uzupełniającej) nowotworów. Tym bardziej że działanie przeciwnowotworowe leku obserwowano w stężeniach terapeutycznych osiąganych u pacjentów z cukrzycą typu 2 po podaniu standardowych dawek i wobec komórek nowotworowych pochodzących z różnych narządów (mózgu, płuc, nerek, jelita i prostaty) [69]. Wyniki prób klinicznych w bliskiej perspektywie powinny ostatecznie zweryfikować hipotezę o istotnej antyneoplastycznej aktywności metforminy.
Badania przeprowadzone w ostatnich latach na zwierzęcych modelach chorób neurozapalnych i neurodegeneracyjnych dowodzą, że metformina również wyraźnie korzystnie wpływa na naturalny ich przebieg. Podawanie metforminy istotnie poprawia funkcje motoryczne u myszy R6/2, stanowiących transgeniczny model choroby Huntingtona, oceniane testami behawioralnymi [64] i powoduje wydłużenie czasu przeżycia szczurów w modelu anoreksji wywołanej chorobą nowotworową [85]. Lek wykazuje działanie neuroprotekcyjne hamując apoptozę neuronów korowych szczura w modelu stresu oksydacyjnego związanego z cukrzycą [22,29] oraz apoptozę w hodowli pierwotnej szczurzych neuronów hipokampa w warunkach jednoczesnej deprywacji tlenu i glukozy (oxygen and glucose deprivation, OGD) [70]. Metformina poprawia też naturalny przebieg eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu u myszy [73]. Ponadto skutecznie przeciwdziała nadmiernej aktywacji szlaku sygnałowego mTOR (mammalian target of rapamycin) zaangażowanego w regulację licznych procesów komórkowych zarówno w rozwijającym się, jak i dojrzałym mózgu [102]. Ponieważ nasilona aktywacja ścieżki sygnałowej mTOR może prowadzić do zaburzeń neuroplastyczności, zatem działanie hamujące metforminy może mieć znaczenie terapeutyczne w chorobach neurologicznych (np.w padaczce) lub łagodzeniu bólu przewlekłego, w przebiegu których dochodzi do utrwalenia nieprawidłowych połączeń neuronalnych [79]. Antymitotyczny, przeciwzapalny i neuroprotekcyjny wpływ metforminy został ostatecznie potwierdzony w hodowli ludzkich neuronów i komórek neuroblastoma [18].
Czy metformina przenika barierę krew-mózg?
Badania farmakokinetyczne wskazują, że metformina kumuluje się w ścianie jelita cienkiego oraz wątrobie, osią- gając tam stężenia ponad dziesięć razy wyższe niż w surowicy krwi obwodowej [104]. Do kumulacji metforminy dochodzi również w niektórych strukturach wewnątrzkomórkowych. Udowodniono np., że jej poziom w mitochondriach może przekraczać stężenie osoczowe nawet tysiąckrotnie [105]. Dla oceny wpływu metforminy na procesy zachodzące w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) istotne jest czy przechodzi ona – oraz w jakim stopniu – przez barierę krew-mózg (blood brain barrier, BBB). Według nielicznych badań metformina z łatwością przenika przez nieuszkodzoną BBB, zarówno po jednorazowym, jak i przewlekłym podawaniu [18,104]. Co więcej, wielokrotne podawanie leku powoduje jego kumulację w przysadce mózgowej i płynie mózgowo-rdzeniowym [56].
Dodatkowo, indukcja ostrego uogólnionego stanu zapalnego u szczurów za pomocą lipopolisacharydu (LPS) znamiennie zwiększa stężenie metforminy nie tylko w surowicy krwi tętniczej, ale również w podwzgórzu i przysadce mózgowej. Na podstawie wyników uzyskanych przez Cho i wsp. [19] nie należy tego tłumaczyć bezpośrednim uszkodzeniem BBB pod wpływem stosunkowo wysokiej dawki LPS (125 mg/kg/dzień). Nie można natomiast wykluczyć niekorzystnego wpływu na BBB dużych stężeń cytokin prozapalnych, obecnych we krwi obwodowej zwierząt traktowanych LPS [19].
Nieco inną dystrybucję w mózgu wykazuje metformina podczas jej długotrwałego stosowania z jednoczesną indukcją (przez wielokrotne, dootrzewnowe podawanie niskich dawek LPS) przewlekłego, uogólnionego stanu zapalnego o niewielkim nasileniu. Stan taki można traktować z pewnym przybliżeniem jako surogat chorób neurodegeneracyjnych. Wskazują na to wyniki badań, w których u zwierząt doświadczalnych chronicznie traktowanych LPS stwierdzono m.in. znaczne upośledzenie funkcji kognitywnych, aktywację apoptozy i autofagii neuronów oraz znaczną utratę komórek nerwowych w śródmózgowiu (zwłaszcza istocie czarnej), korze mózgu, móżdżku, prążkowiu i hipokampie [24]. Wykazano także zmiany elektrofizjologiczne, metaboliczne i morfologiczne neuronów wraz ze znacznym zmniejszeniem ich liczby w korze i hipokampie szczurów, którym wielokrotnie podawano dootrzewnowo LPS [91]. W takim modelu doświadczalnym metformina kumuluje się w szczurzej przysadce mózgowej, opuszce węchowej, podwzgórzu oraz prążkowiu [56]. Strukturą mózgu, która obfituje w największą liczbę komórek mikroglejowych jest właśnie prążkowie [51]. Wiadomo też, iż degeneracja neuronów dopaminergicznych tego regionu mózgu, powodująca przewagę układu hamującego nad pobudzającym, jest główną przyczyną choroby Parkinsona [43]. Przysadka mózgowa odgrywa natomiast fundamentalną rolę w regulacji osi podwzgórzowo-przysadkowo-jajnikowej, której dysfunkcja występuje m.in. w zespole policystycznych jajników (polycystic ovary syndrome, PCOS). Według doniesień wielu autorów właśnie metformina okazuje się pomocna w zwalczaniu tej patologii [9,34,59,98].
Podsumowując tę niewielką liczbę danych dotyczących dystrybucji metforminy w mózgu należy zachować ostrożność, ponieważ w jej ocenie nie uwzględnia się roli błonowych transporterów kationów organicznych (organic cation transporters, OCT), dla których metformina pozostaje substratem, a ekspresja może różnić się osobniczo [20].
Czy metformina i AMPK zawsze stanowią duet?
Obecnie przyjmuje się, że plejotropowe (wielokierunkowe) działanie metforminy jest głównie skutkiem aktywacji kinazy białkowej aktywowanej przez AMP (AMP-activated protein kinases, AMPK, EC 2.7.11.31). AMPK jest konserwowaną ewolucyjnie heterotrimeryczną kinazą serynowo-treoninową zbudowaną z katalitycznej podjednostki α występującej w dwóch izoformach (α1, α2) oraz dwóch podjednostek regulatorowych β (β1, β2) i γ (γ1, γ2, γ3) [32]. Poziom ekspresji genów kodujących poszczególne izoformy wykazuje istotną swoistość tkankową i jest odmienny w hepatocytach, komórkach mięśnia sercowego, mięśniach poprzecznie prążkowanych, adypocytach, enterocytach, makrofagach czy mikrogleju, a także zależ- ny od umiejscowienia w konkretnych kompartmentach wewnątrzkomórkowych [32].
AMPK odgrywa ważną rolę w regulacji szlaków metabolicznych i optymalizacji wewnątrzkomórkowych procesów energetycznych przez włączanie procesów wytwarzających energię, a wyłączanie procesów ją zużywających [99]. AMPK spełnia zatem rolę swoistego „czujnika” statusu energetycznego komórki uruchamianego w przypadku deficytu energetycznego i dlatego jej wzmożoną aktywność obserwuje się w komórkach narażonych na szeroko rozumiany stres metaboliczny, objawiający się m.in. zwiększoną ekspresją licznych cytokin, tlenku azotu (NO), reaktywnych form tlenu (RFT) oraz podwyższonym stężeniem w cytosolu wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia ([Ca2+] i ) [99]. Udowodniono, iż wymienione czynniki bezpośrednio odpowiadają za aktywację kinaz nadrzędnych do AMPK, co doprowadza do jej fosforylacji i spowolnienia procesów energochłonnych.
Na obecnym etapie wiedzy przyjmuje się, że aktywność AMPK podlega trójstopniowej regulacji pozwalającej na szybką reakcję komórki w odpowiedzi na niewielkie nawet zmiany statusu energetycznego, którego wskaźnikiem jest stosunek AMP/ATP [27]. Pierwszy z nich polega na odwracalnym związaniu dwóch cząsteczek AMP do swoistej domeny podjednostki γ (zwanej motywem CBS), wywołując jej zmiany konformacyjne i prowadzi do allosterycznej aktywacji. W obrębie podjednostki γ znajdują się bowiem trzy miejsca wiązania AMP. W stanie nieaktywnym przyłączona jest do niej na stałe jedna cząsteczka tego nukleotydu [27]. Połączenie dwóch dodatkowych cząsteczek AMP do podjednostki γ skutkuje 5-krotnym wzrostem aktywności enzymu. Następnie możliwa staje się fosforylacja treoniny (Thr172), umiejscowionej w podjednostce α, przez kinazy nadrzędne wobec AMPK i w efekcie dochodzi nawet do stukrotnego wzrostu jej aktywności enzymatycznej [27]. Obecnie znane są trzy kinazy regulujące poprzez fosforylację aktywność AMPK: serynowo/treoninowa kinaza 11 (liver kinase B1/serine threonine kinase 11, LKB1) (zaangażowana w mechanizm działania metforminy, patrz niżej), kinaza 1 aktywowana transformującym czynnikiem wzrostu β (TGF-β-activated kinase-1, TAK1) oraz serynowo-treoninowa kinaza kinazy β zależnej od Ca2+/ kalmoduliny (Ca2+/calmodulin-dependent kinase kinase β, CaMKK) [108,113]. Ponadto, w trzecim mechanizmie regulacyjnym, związanie AMP przez podjednostkę γ uniemożliwia defosforylację, a tym samym inhibicję AMPK przez fosfatazy [82].
Aktywna AMPK reguluje natomiast aktywność różnorodnych podległych jej substratów. Wśród nich jednym z najbardziej istotnych jest enzym karboksylaza acetylo- -CoA (acety-CoA carboxylase, ACC), biorący udział zarówno w syntezie, jak i utlenianiu kwasów tłuszczowych [27]. ACC katalizuje reakcję karboksylacji acetylo-CoA do malonylo-CoA [41]. Fosforylacja ACC w pozycji seryny 79 przez AMPK powoduje jej inaktywacją. To zmniejsza ilość wytwarzanego malonylo-CoA, aktywację acylotransferazy karnitynowej 1 (carnitine palmitynotransferase 1, CPT1) oraz zwiększa transport kwasów tłuszczowych do mitochondriów, gdzie ulegają utlenieniu [27]. Jednocześnie aktywacja AMPK nasila biogenezę mitochondrialną na skutek aktywacji PGC-1α i syntezę ATP. AMPK reguluje również aktywność reduktazy 3-hydroksy-3-metylo-glutarylokoenzymu A (HMG-CoA), hamuje syntezę cholesterolu, lipolizę i lipogenezę w adypocytach, stymuluje wydzielanie insuliny przez trzustkę oraz zwiększa ekspresję heksokinazy i transportera glukozy GLUT4 w mięśniach poprzecznie prążkowanych, co z kolei nasila wychwyt glukozy i obniża glikemię [41,112]. Doniesienia ostatnich lat świadczą o tym, że wzrost ekspresji i aktywności AMPK w warunkach niedoborów energetycznych ma także związek z jej regulacyjnym wpływem na ścieżki sygnałowe wyzwalające proces kataboliczny jakim jest autofagia [71]. Wyniki wielu doświadczeń wskazują na związek między aktywacją AMPK, a działaniem antymitotycznym i przeciwnowotworowym jej aktywatorów, w tym metforminy [44,71,83].
Rola aktywacji AMPK w mózgu jest obecnie poddawana szczególnie dogłębnej analizie. W mózgu wykryto ekspresję mRNA i białek zarówno izoform podjednostki katalitycznej α (α1, α2), jak i podjednostek regulatorowych β i γ [95]. Ekspresję AMPK stwierdzono w neuronach, astrocytach, oligodendrocytach i mikrogleju [36,53,95]. Szczególnie wysoki jej poziom występuje w neuronach móżdżku i podwzgórza [77]. AMPK pełni ważną rolę już w czasie rozwoju mózgu ssaków, integrując, poprzez fosforylację białka retinoblastoma (Rb), sygnały pochodzące od czynników wzrostu i kontrolując cykl komórkowy. U myszy z delecją genu kodującego podjednostkę regulatorową β stwierdzono atrofię móżdżku oraz znaczną utratę neuronów i oligodendrocytów [25].
Na podstawie badań prowadzonych zarówno in vitro, jak i in vivo zaburzenia w ekspresji i aktywności AMPK łączy się obecnie także z etiologią i przebiegiem chorób neurozapalnych i neurodegeneracyjnych. Według ostatnich doniesień aktywacja AMPK obniża pozakomórkową akumulację β-amyloidu przez wpływ na autofagię i degradację tego białka w korze mózgowej szczura. Vingtdeux i wsp. sugerują, iż aktywacja AMPK w OUN może stanowić w przyszłości ważny cel w terapii choroby Alzheimera [103]. Culmsee i wsp. wskazują z kolei na udział AMPK w mechanizmach cytoprotekcyjnych, ponieważ farmakologiczny jej aktywator, AICAR (5-aminoimidazol- 4-karboksyamid-1-beta-D-rybofuranosyd), chroni neurony hipokampa przed apoptozą wywołaną in vitro przez OGD, glutaminian i β-amyloid [23].
W badaniach in vitro wykazano także, że aktywacja AMPK zapobiega wejściu astrocytów na ścieżkę apoptozy wywołaną deprywacją glukozy lub obecnością w medium hodowlanym 2-deoksyglukozy [23], kwasami tłuszczowymi oraz wysokim stężeniem tlenku azotu [12]. Ponadto, AICAR działa przeciwzapalnie poprzez hamowanie wydzielania prozapalnych cytokin w hodowli pierwotnej astrocytów eksponowanych na glikosfingolipid psychozynę lub LPS [32].
Jednak w dostępnym piśmiennictwie można również znaleźć liczne dane sugerujące, iż nadmierna aktywacja AMPK w mózgu może być szkodliwa [35]. Wykazano bowiem, że nasilona aktywacja AMPK i związane z nią zaburzenia angiogenezy, polegające na nasileniu proliferacji komórek śródbłonka i wytwarzaniu czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (vascular endothelial growth factor, VEGF), mogą być przyczyną dysfunkcji krążenia mózgowego w chorobie Alzheimera [6]. Wzrost aktywności AMPKα1 w jądrach komórek neuronalnych prążkowia przyspiesza neurodegenerację zarówno w mysim modelu choroby Huntingtona, jak i u ludzi z tym schorzeniem [6]. Nasiloną aktywność enzymatyczną AMPK w mózgu stwierdza się także w następstwie stresu ischemicznego, hipoksji i/lub niedoborów glukozy. Wzrost fosforylacji AMPKα obserwowano w modelach in vitro, w tym m.in. w hodowli neuronów szczurzych narażonych na hipoksję [23] oraz in vivo u szczurów z całkowitą okluzją tętnicy środkowej mózgu (middle cerebral artery occlusion, MCAO) [62]. Molekularny mechanizm aktywacji AMPK w niedokrwieniu jest skutkiem znacznego ograniczenia dokomórkowej podaży tlenu i glukozy, co prowadzi do zatrzymania aktywności enzymów łańcucha oddechowego, wyczerpania zasobów ATP i załamania homeostazy energetycznej w komórce [67]. Wzrost współczynnika AMP/ATP indukuje zmiany konformacyjne AMPK, zwiększające jej podatność na fosforylację przez LKB1. Uzupełnianie niedoborów ATP za pośrednictwem glikolizy beztlenowej skutkuje gromadzeniem się kwasu mlekowego w przestrzeni wewnątrz- i międzykomórkowej i kwasicą. W takich warunkach mitochondria tracą zdolność do prawidłowej sekwestracji jonów Ca2+ [67]. Dodatkowo, pulę [Ca2+] i zwiększają jony Ca2+ napływające z zewnątrz oraz uwalniane z zasobów komórki. Aktywacji ulega kolejna kinaza nadrzędna wobec AMPK – CaMKK, co w konsekwencji nasila aktywność AMPK [62]. Mimo, iż aktywacja AMPK w niedokrwieniu mózgu ma na celu przywrócenie równowagi energetycznej, to jednak ostateczne jej konsekwencje pozostają niewyjaśnione. Biorąc pod rozwagę przytoczone wyżej dane należy zatem stwierdzić, iż wyniki dotychczasowych badań dotyczących udziału AMPK w neuropatologii są niejednoznaczne, a nawet sprzeczne i wzajemnie wykluczające się. Niektórzy bowiem badacze wskazują na istotny udział AMPK w mechanizmach cytoprotekcyjnych, a inni postulują jej zaangażowanie w cytotoksyczność i procesy prowadzące do neurodegeneracji [82].
Dokładny mechanizm działania metforminy nie został jak dotąd w pełni określony. Do niedawna uważano, iż metformina może aktywować AMPK przez dwa równolegle zachodzące procesy: (i) zahamowanie kompleksu I łańcucha oddechowego (reduktaza dinukleotydu nikotynoadeninowego – koenzym Q) i związany z nim wzrost stosunku AMP/ATP oraz (ii) bezpośrednią aktywację LKB1 [5,26,113]. W niektórych badaniach metformina aktywowała jednak AMPK przy prawidłowym stosunku AMP/ATP w komórce, a więc przy niezmienionym wewnętrznym stanie energetycznym [42]. Próba wyjaśnienia przyczyny tego zjawiska doprowadziła do odkrycia roli nadtlenoazotynu (ONOO−) w mechanizmie zależnej od LKB1 aktywacji AMPK przez metforminę [8,42]. Zahamowanie aktywności kompleksu I łańcucha oddechowego przez lek prowadzi do nasilenia generowania anionorodnika ponadtlenkowego (O2 – ·) [42]. Powstały O2 – · reaguje z tlenkiem azotu (NO), dając jako produkt ONOO −. W wysokich stężeniach (100 µm) nadtlenoazotyn działa niekorzystnie przez rozprzę- ganie endotelialnej syntazy tlenku azotu (eNOS) i inaktywację syntazy prostacykliny [109]. Wykazano natomiast, że niższe stężenia nadtlenoazotynu (1-10 µm) mogą aktywować AMPK [109], a usunięcie niezbędnych do jego syntezy substratów, przez wyciszenie ekspresji genu eNOS lub nadekspresję SOD, doprowadza do zahamowania aktywacji AMPK po metforminie [42]. Nadtlenoazotyn indukuje kaskadę kinaz, obejmującą kolejno: kinazę c-Src, PI3K, PDK1 i PKCζ. Ta ostatnia fosforyluje LKB1 i nasila jej wiązanie z pseudokinazą STRAD i białkiem MO25 [16,113]. Odmiennie od większości innych kinaz, aktywność LKB1 nie jest regulowana przez fosforylację, lecz w mechanizmie allosterycznym, warunkowanym utworzeniem kompleksu LKB1-STRAD-MO25. Białka STRAD i MO25 regulują stabilność i subkomórkowe rozmieszczenie LKB1 oraz są niezbędne do jej pełnej aktywności biologicznej, w tym aktywacji AMPK [16].
Od niedawna wiadomo, że skutki działania metforminy wynikają również z jej wpływu na inne niż kontrolowane przez AMPK, wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe. Udowodniono, że metformina zwiększa aktywność kinazy białkowej p38 aktywowanej przez mitogeny (p38 mitogen-activated protein kinases, p38 MAPK) oraz kinazy białkowej C (protein kinase C, PKC) w linii komórkowej mięśnia sercowego szczura H9C2 [88]. Aktywna postać p38 MAPK jednocześnie stabilizuje mRNA dla TNF-α, przez co nasila jego syntezę i zwiększa ekspresję koaktywatora-1α receptora gamma aktywowanego proliferatorami peroksysomów (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α, PGC-1α), który stymuluje biogenezę mitochondriów w mikrogleju i jest wskaźnikiem alternatywnej aktywacji tych komórek (patrz niżej) [58,80,88]. Metformina wpływa również na szlak mTOR hamując aktywność kinazy p70S6K, głównego regulatora syntezy białek, w linii komórkowej ludzkiego raka piersi HER2 [102]. Jej właściwości antyoksydacyjne są skutkiem nasilenia ekspresji manganowej dysmutazy ponadtlenkowej (Mn-SOD) i zmniejszenia wytwarzania RFT w mitochondriach [15,52]. Metformina dezaktywuje również reaktywne dwuwęglowe produkty pośrednie glikolizy, zapobiegając powstawaniu końcowych produktów zaawansowanej glikacji (advanced glycation endproducts, AGEs) [87] oraz hamuje ekspresję lektynopodobnych receptorów oksydowanych cząsteczek LDL-1 (lectin-like oxidized receptor-1, LOX-1) [74].
Mikroglej, AMPK i metformina – przyszłość neurofarmakologii?
Mikroglej stanowi 10-20% wszystkich komórek mózgu, a jego rola w utrzymywaniu prawidłowej funkcji neuronów jest niepodważalna [68,86]. Komórki mikrogleju wykazują zdolność do migracji, proliferacji oraz fagocytozy, biorą udział w prezentacji antygenów, wytwarzają cytokiny, prostaglandyny, leukotrieny, wydzielają NO, RFT, składniki dopełniacza, lizozym i aktywator plazminogenu [40]. Wiadomo również, że zmieniona reaktywność mikrogleju oraz zaburzenia komunikacji międzykomórkowej odpowiadają po części za patogenezę chorób neurologicznych, takich jak: choroba Alzheimera, Parkinsona, pląsawica Huntingtona, stwardnienie rozsiane, otępienie związane z infekcją wirusem HIV, choroby prionowe, uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne mózgu i encefalopatie metaboliczne [10,13,72,93]. Podobnie jak w przypadku makrofagów tkanek obwodowych, rodzaj pełnionej przez mikroglej aktywności podlega cyklicznym zmianom, którym towarzyszy nie tylko zmiana funkcji, ale również biochemicznej charakterystyki, co przekłada się na zmienność fenotypu [21,40]. Na podstawie analizy profilu ekspresji genów mikrogleju w pośmiertnych badaniach mózgów chorych na chorobę Alzheimera oraz mysich modelach neurodegeneracji, oprócz klasycznie aktywowanego mikrogleju ustalono istnienie mikrogleju aktywowanego alternatywnie lub hybrydy obu tych fenotypów. Patrząc na mikroglej przez pryzmat możliwości płynnego przekształcania się jednego fenotypu w drugi, warto zauważyć, że zaburzenia w regulacji cyklu wzajemnych przemian oraz w równowadze między komórkami reprezentującymi różne fenotypy mogą być przyczyną chorób neurodegeneracyjnych [21,37,40].
Z punktu widzenia farmakologii szczególnie interesują- ce są wzajemne relacje skrajnie odmiennych fenotypów tych komórek ze względu na to, że dodanie metforminy do pierwotnych hodowli mikrogleju promuje fenotyp alternatywny i przeciwzapalny. Udowodniono, że metformina w hodowli mikrogleju zmniejsza ekspresję indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS) i wydzielanie NO, zwiększa ekspresję cytokin przeciwzapalnych (IL-10 i TGF-β), a co najbardziej zaskakujące, nasila również wydzielanie cytokin pozapalnych (IL-1β, IL-6, TNF-α). Nie wszystkim wymienionym działaniom towarzyszy wzrost aktywności AMPK lub translokacja do jądra komórkowego czynnika transkrypcyjnego NF-κB. To sugeruje, że metformina może wywierać niektóre działania poprzez wpływ na cytokiny na poziomie potranskrypcyjnym lub może nasilać ich wydzielanie również w mechanizmie niezależnym od AMPK [55]. Pobudzający wpływ metforminy na wydzielanie cytokin prozapalnych stwierdzono w badaniach własnych [55]. Istotny w tym kontekście jest również pojawianie się coraz większej liczby publikacji donoszących o neuroprotekcyjnych właściwościach cytokin prozapalnych, tj. IL-1, IL-6 i TNF-α [17,60,89,92,96,97]. Ponadto, Xie i wsp. [110] oraz Li i wsp. [61] udowodnili, że w mikrośrodowisku mózgu nadtlenoazotyn (ONOO- ) wraz z cytokinami przeciwzapalnymi wpływają na efekt końcowy cytokin prozapalnych, które (w określonych warunkach) mogą działać właśnie neuroprotekcyjnie. Stres nitrozylacyjny, w którym powstają RFA (w tym ONOO- ) jest ściśle związany ze stresem oksydacyjnym, czyli zaburzeniem równowagi między ciągłym wytwarzaniem RFT, a ich likwidacją w enzymatycznych i nieenzymatycznych reakcjach neutralizacji. Spośród RFT szkodliwe są zwłaszcza anion ponadtlenkowy (O2 – ·), nadtlenek wodoru (H2 O2 ) oraz rodnik hydroksylowy (OH·) [81]. W komórkach stymulowanych LPS źródłem RFT są reakcje katalizowane przez oksydazę NADPH, ksantynową, cyklooksygenazy, lipooksygenazy oraz mitochondrialny i mikrosomalny łańcuch transportu elektronów [6,94,106].
Badania z użyciem bromku 3-(4,5-dimetylotiazol- -2-yl)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) wskazują, że stymulacja mikrogleju samym lipopolisacharydem powoduje wzrost aktywności mitochondrialnej dehydrogenazy bursztynianowej, natomiast łączne zastosowanie metforminy i LPS tego nie wywołuje. W innych modelach doświadczalnych obserwowano wyraźny hamujący wpływ metforminy na aktywność NADPH oksydazy [8,75,78]. Metformina istotnie zwiększa natomiast ekspresję mitochondrialnej MnSOD i hamuje wydzielanie RFT i RFA [52,55]. Działanie antyoksydacyjne leku potwierdzono również w badaniach własnych na pierwotnych hodowlach mikrogleju stymulowanych za pomocą LPS [55].
Metformina jest uznanym inhibitorem kompleksu I łańcucha oddechowego [76]. Co więcej, kumuluje się w znacznych ilościach w mitochondriach [105], których znaczną ilość i aktywność stwierdza się w komórkach mikroglejowych [4]. Według niektórych autorów metformina nie działa w komórkach ubogich w mitochondria lub ich pozbawionych. To sugeruje, że działanie leku jest wręcz zależne od obecności tych organelli [26,30,49]. Wydaje się, że zmniejszenie wydzielania RFT przez metforminę wynikać może z hamującego wpływu na enzymy mitochondrialne [55]. Jednak metformina wyraźnie nasila biogenezę mitochondrialną w mikrogleju [101]. Wyniki uzyskane przez zespół Vatsa i wsp. [101] wskazują, że zwiększenie ekspresji PGC-1β indukuje ekspresję arginazy I. W związku z tym, iż PGC-1α i PGC-1β pełnią w komórce podobne funkcje, przypuszcza się, że również PGC-1α pobudza ekspresję arginazy I [57]. Można zatem przyjąć, że metformina poprzez PGC-1α nasila biogenezę mitochondrialną, w mechanizmie niezależnym od AMPK.
Wspomniane wyżej PGC-1α i arginaza I stanowią uznane markery tzw. alternatywnej drogi pobudzenia mikrogleju [28]. Mikroglej aktywowany alternatywnie, w badaniach in vitro za pomocą IL-4 lub IL-13, cechuje się podwyższonym wytwarzaniem cytokin przeciwzapalnych (tj. IL-10, TGF-β), podwyższoną ekspresją arginazy I oraz receptorów mannozy (CD11β). Cechą alternatywnie pobudzonego mikrogleju jest również zwiększona biogeneza mitochondrialna, której wskaźnikami są PGC-1α i PGC-1β [28,101]. PGC-1β, poprzez nasilenie ekspresji jądrowych czynników transkrypcyjnych, takich jak NRF-1 i NRF-2 (nuclear respiratory factors 1 and 2), TFAM (mitochondrial transcription factor A) aktywuje transkrypcję genów mitochondrialnych [11,107]. Jej skutkiem jest nasilenie replikacji mitochondrialnego DNA (mtDNA), wzrost liczby i masy mitochondriów, nasilenie aktywności enzymów łańcucha oddechowego i intensywny metabolizm tlenowy [21,28,33,84,101]. Promowanie przez metforminę alternatywnej, przeciwzapalnej drogi aktywacji mikrogleju jest szczególnie istotne, bo właśnie taka jego „przeciwzapalna” postać odgrywa korzystną rolę. Potwierdziły to eksperymenty na mysich komórkach mikrogleju BV2, mysim modelu choroby Alzheimera oraz mózgach ludzi dotkniętych chorobą Alzheimera [21]. Udowodniono, że nasilenie objawów neurodegeneracji u myszy transgenicznych PS1M146L/APP751SL jest odwrotnie proporcjonalne do liczby alternatywnie aktywowanych komórek mikrogleju [48]. W hodowli mikrogleju po podaniu metforminy obserwuje się, zależne od aktywności AMPK, wyraźne cechy alternatywnego fenotypu tych komórek [54]. Zmiany te zachodzą równolegle do wzrostu ich aktywności fagocytarnej, stanowiącej kolejny wskaźnik funkcji alternatywnej. W badaniach in vitro wykazano bowiem, że metformina wyraźnie intensyfikuje fagocytozę mikrosfer opłaszczonych β-amyloidem [56]. Ponieważ metformina po przewlekłym podawaniu kumuluje się w OUN, być może jej stosowanie może polepszać właściwości fagocytarne mikrogleju również in vivo. Enzymatyczny rozkład pochłanianego β-amyloidu przez komórki mikrogleju zachodzi znacznie intensywniej w niższym pH lizosomów i endosomów. Jest to związane z większą aktywnością proteaz lizosomalnych, takich jak: dipeptydylopeptydaza I, tripeptydylopeptydaza I, katepsyna B i katepsyna D [65]. W badaniach in vitro oceniających zdolności fagocytarne mikrogleju zaobserwowano, że odpowiednio obniżone pH lizosomów istotnie zwiększa degradację pochłoniętego β-amyloidu, w porównaniu do hodowli kontrolnych, w których β-amyloid nie był rozkładany tylko wydalany na zewnątrz komórek [65]. W badaniach własnych prowadzonych na komórkach mikrogleju również obserwowano, że metformina nasila właściwości fagocytarne przy jednoczesnym obniżeniu pH przedziału endosomalno/ lizosomalnego [54]. Warto podkreślić, iż fagocytoza i wewnątrzkomórkowa degradacja peptydów β-amyloidu stanowi główny mechanizm ograniczający ich akumulację i neurotoksyczność w mózgu, a metformina poprzez obniżenie pH układu endosomalno/lizosomalnego może go dodatkowo wzmagać [65].
Ryc. 1. Wpływ metforminy na alternatywną aktywację mikrogleju
Podsumowanie
Przedstawione wyżej naukowe fakty wskazują na nowe właściwości metforminy oraz nieznane dotąd, niezależne od AMPK, mechanizmy jej działania. Co interesujące, metformina nasila wydzielanie cytokin prozapalnych przez mikroglej i jednocześnie promuje jego alternatywny fenotyp, zaangażowany niewątpliwie w endogenne mechanizmy neuroprotekcyjne. Należy jednak pamiętać, że skutki aktywacji AMPK przez metforminę w komórkach mikrogleju, są jak dotąd słabo poznane. Niemniej jednak przedstawiona zależność: metformina-AMPK-mikroglej (ryc. 1) staje się coraz bardziej obiecującym celem badań nad mechanizmami chorób neurodegeneracyjnych i neurozapalnych oraz możliwościami farmakologicznego ich leczenia.
Przypisy
- 1. Alimova I.N., Liu B., Fan Z., Edgerton S.M., Dillon T., Lind S.E., ThorA.D.: Metformin inhibits breast cancer cell growth, colony formationand induces cell cycle arrest in vitro. Cell Cycle, 2009; 8: 909-915
Google Scholar - 2. Anisimov V.N., Berstein L.M., Egormin P.A., Piskunova T.S., PopovichI.G., Zabezhinski M.A., Kovalenko I.G., Poroshina T.E., SemenchenkoA.V., Provinciali M., Re F., Franceschi C.: Effect of metforminon life span and on the development of spontaneous mammary tumorsin HER-2/neu transgenic mice. Exp. Gerontol., 2005; 40: 685-693
Google Scholar - 3. Bailey C.J.: Biguanides and NIDDM. Diabetes Care, 1992; 15: 755-772
Google Scholar - 4. Batandier C., Guigas B., Detaille D., El-Mir M.Y., Fontaine E., RigouletM., Leverve X.M.: The ROS production induced by a reverse–electron flux at respiratory-chain complex 1 is hampered by metformin.J. Bioenerg. Biomembr., 2006; 38: 33-42
Google Scholar - 5. Beal M.F.: Energetics in the pathogenesis of neurodegenerativediseases. Trends Neurosci., 2000; 23: 298-304
Google Scholar - 6. Beckner M.E., Gobbel G.T., Abounader R., Burovic F., Agostino N.R.,Laterra J., Pollack I.F.: Glycolytic glioma cells with active glycogensynthase are sensitive to PTEN and inhibitors of PI3K and gluconeogenesis.Lab. Invest., 2005; 85: 1457-1470
Google Scholar - 7. Bellin C., de Wiza D.H., Wiernsperger N.F., Rösen P.: Generationof reactive oxygen species by endothelial and smooth muscle cells:influence of hyperglycemia and metformin. Horm. Metab. Res., 2006;38: 732-739
Google Scholar - 8. Ben Ayed B., Dammak dit Mlik S., Ben Arab H., Trabelssi H., ChahtourH., Mathlouthi N., Dhuib M., Kassis M., Saiidane D., Trabelssi K.,Guermazi M.: Metformin effects on clomifene-induced ovulation inthe polycystic ovary syndrome. Tunis. Med., 2009; 87: 43-49
Google Scholar - 9. Benveniste E.N.: Role of macrophages/microglia in multiple sclerosisand experimental allergic encephalomyelitis. J. Mol. Med.,1997; 75: 165-173
Google Scholar - 10. Bergeron R., Ren J.M., Cadman K.S., Moore I.K., Perret P., PypaertM., Young L.H., Semenkovich C.F., Shulman G.I.: Chronic activationof AMP kinase results in NRF-1 activation and mitochondrial biogenesis.Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 2001; 281: E1340-E1346
Google Scholar - 11. Blázquez C., Geelen M. J., Velasco G., Guzmán M.: The AMP-activatedprotein kinase prevents ceramide synthesis de novo andapoptosis in astrocytes. FEBS Lett., 2001; 489: 149-153
Google Scholar - 12. Block M.L., Hong J.S.: Chronic microglial activation and progressivedopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans., 2007;35: 1127-1132
Google Scholar - 13. Bonnefont-Rousselot D., Raji B., Walrand S., Gardès-Albert M.,Jore D., Legrand A., Peynet J., Vasson M.P.: An intracellular modulationof free radical production could contribute to the beneficialeffects of metformin towards oxidative stress. Metabolism, 2003;52: 586-589
Google Scholar - 14. Boudeau J., Scott J.W., Resta N., Deak M., Kieloch A., KomanderD., Hardie D.G., Prescott A.R., van Aalten D.M., Alessi D.R.: Analysisof the LKB1-STRAD-MO25 complex. J. Cell Sci., 2004; 117: 6365-6375
Google Scholar - 15. Bowker S.L., Majumdar S.R., Veugelers P., Johnson J.A.: Increasedcancer-related mortality for patients with type 2 diabetes who usesulfonylureas or insulin. Diabetes Care, 2006; 29: 254-258
Google Scholar - 16. Carlson N.G., Wieggel W.A., Chen J., Bacchi A., Rogers S.W., GahringL.C.: Inflammatory cytokines IL-1α, IL-1β, IL-6, and TNF-α impartneuroprotection to an excitotoxin through distinct pathways.J. Immunol., 1999; 163: 3963-3968
Google Scholar - 17. Chen Y., Zhou K., Wang R., Liu Y., Kwak Y.D., Ma T., ThompsonR.C., Zhao Y., Smith L., Gasparini L., Luo Z., Xu H., Liao F.F.: Antidiabeticdrug metformin (GlucophageR) increases biogenesis of Alzheimer’samyloid peptides via up-regulating BACE1 transcription. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 2009; 106: 3907-3912
Google Scholar - 18. Cho Y.K., Choi Y.H., Kim S.H., Lee M.G.: Effects of Escherichia colilipopolysaccharide on the metformin pharmacokinetics in rats. Xenobiotica,2009; 39: 946-954
Google Scholar - 19. Choi M.K., Song I.S.: Organic cation transporters and their pharmacokineticand pharmacodynamic consequences. Drug Metab.Pharmacokinet., 2008; 23: 243-253
Google Scholar - 20. Colton C.A., Mott R.T., Sharpe H., Xu Q., Van Nostrand W.E., VitekM.P.: Expression profiles for macrophage alternative activationgenes in AD and in mouse models of AD. J. Neuroinflammation,2006; 3: 27
Google Scholar - 21. Correia S., Carvalho C., Santos M.S., Proença T., Nunes E., DuarteA.I., Monteiro P., Seiça R., Oliveira C.R., Moreira P.I.: Metformin protectsthe brain against the oxidative imbalance promoted by type 2diabetes. Med. Chem., 2008; 4: 358-364
Google Scholar - 22. Culmsee C., Monnig J., Kemp B.E., Mattson M.P.: AMP-activatedprotein kinase is highly expressed in neurons in the developing ratbrain and promotes neuronal survival following glucose deprivation.J. Mol. Neurosci., 2001; 17: 45-58
Google Scholar - 23. Czapski G.A., Gajkowska B., Strosznajder J.B.: Systemic administrationof lipopolysaccharide induces molecular and morphologicalalterations in the hippocampus. Brain Res., 2010; 1356: 85-94
Google Scholar - 24. Dasgupta B., Milbrandt J.: AMP-activated protein kinase phosphorylatesretinoblastoma protein to control mammalian braindevelopment. Dev. Cell, 2009; 16: 256-270
Google Scholar - 25. Detaille D., Guigas B., Leverve X., Wiernsperger N., Devos P.:Obligatory role of membrane events in the regulatory effect of metforminon the respiratory chain function. Biochem. Pharmacol.,2002; 63: 1259-1272
Google Scholar - 26. Dziewulska A., Dobrzyń P., Dobrzyń A.: Rola kinazy białkowejaktywowanej przez AMP (AMPK) w regulacji metabolizmu mięśniszkieletowych. Postępy Hig. Med. Dośw., 2010; 64: 513-521
Google Scholar - 27. Edwards J.P., Zhang X., Frauwirth K.A., Mosser D.M.: Biochemicaland functional characterization of three activated macrophagepopulations. J. Leukoc. Biol., 2006; 80: 1298-1307
Google Scholar - 28. El-Mir M.Y., Detaille D., R-Villanueva G., Delgado-Esteban M.,Guigas B., Attia S., Fontaine E., Almeida A., Leverve X.: Neuroprotectiverole of antidiabetic drug metformin against apoptotic celldeath in primary cortical neurons. J. Mol. Neurosci., 2008; 34: 77-87
Google Scholar - 29. El-Mir M.Y., Nogueira V., Fontaine E., Avéret N., Rigoulet M., LeverveX.: Dimethylbiguanide inhibits cell respiration via an indirecteffect targeted on the respiratory chain complex I. J. Biol. Chem.,2000; 275: 223-228
Google Scholar - 30. Evans J.M., Donnelly L.A., Emslie-Smith A.M., Alessi D.R., MorrisA.D.: Metformin and reduced risk of cancer in diabetic patients.BMJ, 2005; 330: 1304-1305
Google Scholar - 31. Fijałkowski F., Jarzyna R.: Rola podwzgórzowej kinazy białkowejaktywowanej przez AMP w kontroli pobierania pokarmu. PostępyHig. Med. Dośw., 2010; 64: 231-243
Google Scholar - 32. Fu X., Wan S., Lyu Y.L., Liu L.F., Qi H.: Etoposide induces ATM–dependent mitochondrial biogenesis through AMPK activation.PLoS One, 2008; 23: 3: e2009
Google Scholar - 33. Gambineri A., Semple R.K., Forlani G., Genghini S., Grassi I., HydenC.S., Pagotto U., O’Rahilly S., Pasquali R.: Monogenic polycysticovary syndrome due to a mutation in the lamin A/C gene is sensitiveto thiazolidinediones but not to metformin. Eur. J. Endocrinol.,2008; 159: 347-353
Google Scholar - 34. Garcia-Gil M., Pesi R., Perna S., Allegrini S., Giannecchini M.,Camici M., Tozzi M.G.: 5’-aminoimidazole-4-carboxamide ribosideinduces apoptosis in human neuroblastoma cells. Neuroscience,2003; 117: 811-820
Google Scholar - 35. Giri S., Nath N., Smith B., Viollet B., Singh A.K., Singh I.:5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-4-ribofuranoside inhibitsproinflammatory response in glial cells: a possible role of AMP-activatedprotein kinase. J. Neurosci., 2004; 24: 479-487
Google Scholar - 36. Giulian D., Baker T.J.: Characterization of ameboid microglia isolatedfrom developing mammalian brain. J. Neurosci., 1986; 6: 2163-2178
Google Scholar - 37. Guastamacchia E., Resta F., Triggiani V., Liso A., Licchelli B., GhiyasaldinS., Sabbà C., Tafaro E.: Evidence for a putative relationship betweentype 2 diabetes and neoplasia with particular reference to breastcancer: role of hormones, growth factors and specific receptors.Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord., 2004; 4: 59-66
Google Scholar - 38. Hanisch U.K., Kettenmann H.: Microglia: active sensor and versatileeffectors cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci.,2007; 10: 1387-1394
Google Scholar - 39. Hardie D.G.: Regulation of fatty acid and cholesterol metabolismby the AMP-activated protein kinase. Biochim. Biophys. Acta,1992; 1123: 231-238
Google Scholar - 40. Hawley S.A., Gadalla A.E., Olsen G.S., Hardie D.G.: The antidiabeticdrug metformin activates the AMP-activated protein kinasecascade via an adenine nucleotide-independent mechanism. Diabetes,2002; 51: 2420-2425
Google Scholar - 41. Herrero M.T., Barcia C., Navarro J.M.: Functional anatomy ofthalamus and basal ganglia. Childs Nerv. Syst., 2002; 18: 386-404
Google Scholar - 42. Imamura K., Ogura T., Kishimoto A., Kaminishi M., Esumi H.:Cell cycle regulation via p53 phosphorylation by a 5’-AMP activatedprotein kinase activator, 5-aminoimidazole- 4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside, in a human hepatocellular carcinoma cell line.Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001; 287: 562-567
Google Scholar - 43. Isakovic A., Harhaji L., Stevanovic D., Markovic Z., Sumarac–Dumanovic M., Starcevic V., Micic D., Trajkovic V.: Dual antigliomaaction of metformin: cell cycle arrest and mitochondria-dependentapoptosis. Cell. Mol. Life Sci., 2007; 64: 1290-1302
Google Scholar - 44. Isoda K., Young J.L., Zirlik A., MacFarlane L.A., Tsuboi N., GerdesN., Schönbeck U., Libby P.: Metformin inhibits proinflammatoryresponses and nuclear factor-κB in human vascular wall cells. Arterioscler.Thromb. Vasc. Biol., 2006; 26: 611-617
Google Scholar - 45. Jack D.B.: Handbook of clinical pharmacokinetic data. Macmillian,Basingstoke 1992
Google Scholar - 46. Jimenez S., Baglietto-Vargas D., Caballero C., Moreno-Gonzalez I.,Torres M., Sanchez-Varo R., Ruano D., Vizuete M., Gutierrez A., VitoricaJ.: Inflammatory response in the hippocampus of PS1M146L/APP751SLmouse model of Alzheimer’s disease: age-dependent switchin the microglial phenotype from alternative to classic. J. Neurosci.,2008; 28: 11650-11661
Google Scholar - 47. Kaminski M., Kiessling M., Süss D., Krammer P.H., Gülow K.: Novelrole for mitochondria: protein kinase Cθ-dependent oxidativesignaling organelles in activation-induced T-cell death. Mol. Cell.Biol., 2007; 27: 3625-3639
Google Scholar - 48. Kefas B.A., Cai Y., Kerckhofs K., Ling Z., Martens G., HeimbergH., Pipeleers D., Van de Casteele M.: Metformin-induced stimulationof AMP-activated protein kinase in beta-cells impairs their glucoseresponsiveness and can lead to apoptosis. Biochem. Pharmacol.,2004; 68: 409-416
Google Scholar - 49. Kim W.G., Mohney R.P., Wilson B., Jeohn G.H., Liu B., Hong J.S.:Regional difference in susceptibility to lipopolysaccharide-inducedneurotoxicity in the rat brain: role of microglia. J. Neurosci., 2000;20: 6309-6316
Google Scholar - 50. Kukidome D., Nishikawa T., Sonoda K., Imoto K., Fujisawa K.,Yano M., Motoshima H., Taguchi T., Matsumura T., Araki E.: Activationof AMP-activated protein kinase reduces hyperglycemia-inducedmitochondrial reactive oxygen species production and promotesmitochondrial biogenesis in human umbilical vein endothelial cells.Diabetes, 2006; 55: 120-127
Google Scholar - 51. Kuo C.L., Ho F.M., Chang M.Y., Prakash E., Lin W.W.: Inhibitionof lipopolysaccharide-induced inducible nitric oxide synthase andcyclooxygenase-2 gene expression by 5-aminoimidazole-4-carboxamideriboside is independent of AMP-activated protein kinase. J.Cell. Biochem., 2008; 103: 931-940
Google Scholar - 52. Labuzek K., Liber S., Gabryel B., Adamczyk J., Okopień B.:Metformin increases phagocytosis and acidifies lysosomal/endosomalcompartments in AMPK-dependent manner in rat primarymicroglia. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 2010;381: 171-186
Google Scholar - 53. Łabuzek K., Liber S., Gabryel B., Okopień B.: Metformin has adenosine-monophosphateactivated protein kinase (AMPK)-independenteffects on LPS-stimulated rat primary microglial cultures. Pharmacol.Rep., 2010; 62: 827-848
Google Scholar - 54. Łabuzek K., Suchy D., Gabryel B., Bielecka A., Liber S., Okopień B.:Quantification of metformin by the HPLC method in brain regions,cerebrospinal fluid and plasma of rats treated with lipopolysaccharide.Pharmacol. Rep., 2010; 62: 956-965
Google Scholar - 55. Lai L., Leone T.C., Zechner C., Schaeffer P.J., Kelly S.M., FlanaganD.P., Medeiros D.M., Kovacs A., Kelly D.P.: Transcriptional coactivatorsPGC-1α and PGC-lβ control overlapping programs required forperinatal maturation of the heart. Genes Dev., 2008; 22: 1948-1961
Google Scholar - 56. Lee Y.B., Schrader J.W., Kim S.U.: p38 map kinase regulates TNF-αproduction in human astrocytes and microglia by multiple mechanisms.Cytokine, 2000; 12: 874-880
Google Scholar - 57. Legro R.S., Myers E.R., Barnhart H.X., Carson S.A., Diamond M.P.,Carr B.R., Schlaff W.D., Coutifaris C., McGovern P.G., Cataldo N.A.,Steinkampf M.P., Nestler J.E., Gosman G., Guidice L.C., Leppert P.C.,Reproductive Medicine Network: The pregnancy in polycystic ovarysyndrome study: baseline characteristics of the randomized cohortincluding racial effects. Fertil. Steril., 2006; 86: 914-933
Google Scholar - 58. Lemere C.A.: A beneficial role for IL-1β in Alzheimer disease? J.Clin. Invest., 2007: 117: 1483-1485
Google Scholar - 59. Li J., Baud O., Vartanian T., Volpe J.J., Rosenberg P.A.: Peroxynitritegenerated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidasemediates microglial toxicity to oligodendrocytes. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 2005; 102: 9936-9941
Google Scholar - 60. Li J., Zeng Z., Viollet B., Ronnett G.V., McCullough L.D.: Neuroprotectiveeffects of adenosine monophosphate-activated protein kinaseinhibition and gene deletion in stroke. Stroke, 2007; 38: 2992-2999
Google Scholar - 61. Libby G., Donnelly L.A., Donnan P.T., Alessi D.R., Morris A.D.,Evans J.M.: New users of metformin are at low risk of incident cancer:a cohort study among people with type 2 diabetes. DiabetesCare, 2009; 32: 1620-1625
Google Scholar - 62. Ma T.C., Buescher J.L., Oatis B., Funk J.A., Nash A.J., Carrier R.L.,Hoyt K.R.: Metformin therapy in a transgenic mouse model of Huntington’sdisease. Neurosci. Lett., 2007; 411: 98-103
Google Scholar - 63. Majumdar A., Cruz D., Asamoah N., Buxbaum A., Sohar I., LobelP., Maxfield F.R.: Activation of microglia acidifies lysosomes andleads to degradation of Alzheimer amyloid fibrils. Mol. Biol. Cell,2007; 18: 1490-1496
Google Scholar - 64. Mamputu J.C., Wiernsperger N.F., Renier G.: Antiatherogenicproperties of metformin: the experimental evidence. Diabetes Metab.,2003; 29: 6S71-6S76
Google Scholar - 65. McCullough L.D., Zeng Z., Li H., Landree L.E., McFadden J., RonnettG.V.: Pharmacological inhibition of AMP-activated protein kinase providesneuroprotection in stroke. J. Biol. Chem., 2005; 280: 20493-20502
Google Scholar - 66. McGeer P.L., Kawamata T., Walker D.G., Akiyama H., Tooyama I.,McGeer E.G.: Microglia in degenerative neurological disease. Glia,1993; 7: 84-92
Google Scholar - 67. Micic D., Cvijovic G., Trajkovic V., Duntas L.H., Polovina S.: Metformin:its emerging role in oncology. Hormones, 2011; 10: 5-15
Google Scholar - 68. Mielke J.G., Taghibiglou C., Wang Y.T.: Endogenous insulin signalingprotects cultured neurons from oxygen-glucose deprivation–induced cell death. Neuroscience, 2006; 143: 165-173
Google Scholar - 69. Motoshima H., Goldstein B.J., Igata M., Araki E.: AMPK and cellproliferation – AMPK as a therapeutic target for atherosclerosis andcancer. J. Physiol., 2006; 574: 63-71
Google Scholar - 70. Müller N., Ackenheil M.: Psychoneuroimmunology and the cytokineaction in the CNS: implications for psychiatric disorders. Prog.Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry, 1998; 22: 1-33
Google Scholar - 71. Nath N., Khan M., Paintlia M.K., Singh I., Hoda M.N., Giri S.:Metformin attenuated the autoimmune disease of the central nervoussystem in animal models of multiple sclerosis. J. Immunol.,2009; 182: 8005-8014
Google Scholar - 72. Ouslimani N., Mahrouf M., Peynet J., Bonnefont-Rousselot D.,Cosson C., Legrand A., Beaudeux J.L.: Metformin reduces endothelialcell expression of both the receptor for advanced glycation endproducts and lectin-like oxidized receptor 1. Metabolism, 2007; 56:308-313
Google Scholar - 73. Ouslimani N., Peynet J., Bonnefont-Rousselot D., Thérond P.,Legrand A., Beaudeux J.L.: Metformin decreases intracellular productionof reactive oxygen species in aortic endothelial cells. Metabolism,2005; 54: 829-834
Google Scholar - 74. Owen M.R., Doran E., Halestrap A.P.: Evidence that metforminexerts its anti-diabetic effects through inhibition of complex 1 ofthe mitochondrial respiratory chain. Biochem. J., 2000; 348: 607-614
Google Scholar - 75. Pertsch M., Duncan G.E., Stumpf W.E., Pilgrim C.: A histochemicalstudy of the regional distribution in the rat brain of enzymaticactivity hydrolyzing glucose- and 2-deoxyglucose-6-phosphate. Histochemistry,1988; 88: 257-262
Google Scholar - 76. Piwkowska A., Rogacka D., Jankowski M., Dominiczak M.H., StepińskiJ.K., Angielski S.: Metformin induces suppression of NAD(P)H oxidase activity in podocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun.,2010; 393: 268-273
Google Scholar - 77. Potter W.B., O’Riordan K.J., Barnett D., Osting S.M., Wagoner M.,Burger C., Roopra A.: Metabolic regulation of neuronal plasticityby the energy sensor AMPK. PLoS One, 2010; 5: e8996
Google Scholar - 78. Puigserver P., Rhee J., Lin J., Wu Z., Yoon J.C., Zhang C.Y., KraussS., Mootha V.K., Lowell B.B., Spiegelman B.M.: Cytokine stimulationof energy expenditure through p38 MAP kinase activation of PPAR-γcoactivator-1. Mol. Cell, 2001; 8: 971-982
Google Scholar - 79. Puzanowska-Tarasiewicz H., Kuźmicka L., Tarasiewicz M.: Reaktywneformy azotu i tlenu. Pol. Merkur. Lekarski, 2009; 27: 338-340
Google Scholar - 80. Ramamurthy S., Ronnett G.: AMP-activated protein kinase(AMPK) and energy-sensing in the brain. Exp. Neurobiol., 2012; 21:52-60
Google Scholar - 81. Rattan R., Giri S., Singh A.K., Singh I.: 5-Aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside inhibits cancer cell proliferationin vitro and in vivo via AMP-activated protein kinase. J. Biol.Chem., 2005; 280: 39582-39593
Google Scholar - 82. Reznick R.M., Shulman G.I.: The role of AMP-activated proteinkinase in mitochondrial biogenesis. J. Physiol., 2006; 574: 33-39
Google Scholar - 83. Ropelle E.R., Pauli J.R., Zecchin K.G., Ueno M., de Souza C.T.,Morari J., Faria M.C., Velloso L.A., Saad M.J., Carvalheira J.B.: A centralrole for neuronal adenosine 5’-monophosphate-activated proteinkinase in cancer-induced anorexia. Endocrinology, 2007; 148:5220-5229
Google Scholar - 84. Rozemuller J.M., van der Valk P., Eikelenboom P.: Activated microgliaand cerebral amyloid deposits in Alzheimer’s disease. Res.Immunol., 1992; 143: 646-649
Google Scholar - 85. Ruggiero-Lopez D., Lecomte M., Moinet G., Patereau G., LagardeM., Wiernsperger N.: Reaction of metformin with dicarbonyl compounds.Possible implication in the inhibition of advanced glycationend product formation. Biochem. Pharmacol., 1999; 58: 1765-1773
Google Scholar - 86. Saeedi R., Parsons H.L., Wambolt R.B., Paulson K., Sharma V.,Dyck J.R., Brownsey R.W., Allard M.F.: Metabolic actions of metforminin the heart can occur by AMPK-independent mechanisms. Am. J.Physiol. Heart Circ. Physiol., 2008; 294: H2497-H2506
Google Scholar - 87. Sawada H., Hishida R., Hirata Y., Ono K., Suzuki H., MuramatsuS., Nakano I., Nagatsu T., Sawada M.: Activated microglia affect thenigro-striatal dopamine neurons differently in neonatal and agedmice treated with 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. J.Neurosci. Res., 2007; 85: 1752-1761
Google Scholar - 88. Schneider M.B., Matsuzaki H., Haorah J., Ulrich A., Standop J.,Ding X.Z., Adrian T.E., Pour PM.: Prevention of pancreatic cancerinduction in hamsters by metformin. Gastroenterology, 2001; 120:1263-1270
Google Scholar - 89. Semmler A., Hermann S., Mormann F., Weberpals M., PaxianS.A., Okulla T., Schäfers M., Kummer M.P., Klockgether T., HenekaM.T.: Sepsis causes neuroinflammation and concomitant decreaseof cerebral metabolism. J. Neuroinflammation, 2008; 5: 38
Google Scholar - 90. Shaftel S.S., Kyrkanides S., Olschowka J.A., Miller J.N., JohnsonR.E., O’Banion M.K.: Sustained hippocampal IL-1β overexpressionmediates chronic neuroinflammation and ameliorates Alzheimerplaque pathology. J. Clin. Invest., 2007; 117: 1595-1604
Google Scholar - 91. Skup M.: Komórka glejowa w normie i patologii. W: Mózg a zachowanie.T. Górska, A. Grabowska, J. Zagrodzka. PWN Warszawa.2000, 4: 68-90
Google Scholar - 92. Sonoda J., Laganière J., Mehl I.R., Barish G.D., Chong L.W., Li X.,Scheffler I.E., Mock D.C., Bataille A.R., Robert F., Lee C.H., Giguère V.,Evans R.M.: Nuclear receptor ERRα and coactivator PGC-1β are effectorsof IFN-γ-induced host defense. Genes Dev., 2007; 21: 1909-1920
Google Scholar - 93. Steinberg G.R., Kemp B.E.: AMPK in health and disease. Physiol.Rev., 2009; 89: 1025-1078
Google Scholar - 94. Tachida Y., Nakagawa K., Saito T., Saido T.C., Honda T., Saito Y.,Murayama S., Endo T., Sakaguchi G., Kato A., Kitazume S., HashimotoY.: Interleukin-1β up-regulates TACE to enhance α-cleavage of APPin neurons: resulting decrease in Aβ production. J. Neurochem.,2008; 104: 1387-1393
Google Scholar - 95. Takei Y., Laskey R.: Tumor necrosis factor α regulates responsesto nerve growth factor, promoting neural cell survival but suppressingdifferentiation of neuroblastoma cells. Mol. Biol. Cell, 2008;19: 855-864
Google Scholar - 96. Tien J.C., Tan T.Y.: Non-surgical interventions for threatenedand recurrent miscarriages. Singapore Med. J., 2007; 48: 1074-1090
Google Scholar - 97. Towler M.C., Hardie D.G.: AMP-activated protein kinase in metaboliccontrol and insulin signaling. Circ. Res., 2007; 100: 328-341
Google Scholar - 98. Tucker G.T., Casey C., Phillips P.J., Connor H., Ward J.D., WoodsH.F.: Metformin kinetics in healthy subjects and in patients withdiabetes mellitus. Br. J. Clin. Pharmacol., 1981; 12: 235-246
Google Scholar - 99. Vats D., Mukundan L., Odegaard J.I., Zhang L., Smith K.L., MorelC.R., Wagner R.A., Greaves D.R., Murray P.J., Chawla A.: Oxidativemetabolism and PGC-1β attenuate macrophage-mediated inflammation.Cell. Metab., 2006; 4: 13-24
Google Scholar - 100. Vazquez-Martin A., Oliveras-Ferraros C., Menendez J.A.: Theantidiabetic drug metformin suppresses HER2 (erbB-2) oncoproteinoverexpression via inhibition of the mTOR effector p70S6K1 in humanbreast carcinoma cells. Cell Cycle, 2009; 8: 88-96
Google Scholar - 101. Vingtdeux V., Giliberto L., Zhao H., Chandakkar P., Wu Q., SimonJ.E., Janle E.M., Lobo J., Ferruzzi M.G., Davies P., MarambaudP.: AMP-activated protein kinase signaling activation by resveratrolmodulates amyloid-β peptide metabolism. J. Biol. Chem., 2010;285: 9100-9113
Google Scholar - 102. Wilcock C., Bailey C.J.: Accumulation of metformin by tissuesof the normal and diabetic mouse. Xenobiotica, 1994; 24: 49-57
Google Scholar - 103. Wilcock C., Wyre N.D., Bailey C.J.: Subcellular distribution ofmetformin in rat liver. J. Pharm. Pharmacol., 1991; 43: 442-444
Google Scholar - 104. Wilkinson B.L., Landreth G.E.: The microglial NADPH oxidasecomplex as a source of oxidative stress in Alzheimer’s disease. J.Neuroinflammation, 2006; 3: 30
Google Scholar - 105. Wu Z., Puigserver P., Andersson U., Zhang C., Adelmant G., MoothaV., Troy A., Cinti S., Lowell B., Scarpulla R.C., Spiegelman B.M.:Mechanisms controlling mitochondrial biogenesis and respirationthrough the thermogenic coactivator PGC-1. Cell, 1999; 98: 115-124
Google Scholar - 106. Xie M., Zhang D., Dyck J.R., Li Y., Zhang H., Morishima M., MannD.L., Taffet G.E., Baldini A., Khoury D.S., Schneider M.D.: A pivotalrole for endogenous TGF-β-activated kinase-1 in the LKB1/AMP–activated protein kinase energy-sensor pathway. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 2006; 103: 17378-17383
Google Scholar - 107. Xie Z., Dong Y., Zhang M., Cui M.Z., Cohen R.A., Riek U., NeumannD., Schlattner U., Zou M.H.: Activation of protein kinase Cζby peroxynitrite regulates LKB1-dependent AMP-activated proteinkinase in cultured endothelial cells. J. Biol. Chem., 2006; 281: 6366-6375
Google Scholar - 108. Xie Z., Wei M., Morgan T.E., Fabrizio P., Han D., Finch C.E., LongoV.D.: Peroxynitrite mediates neurotoxicity of amyloid β-peptide1-42-and lipopolysaccharide-activated microglia. J. Neurosci., 2002; 22:3484-3492
Google Scholar - 109. Zakikhani M., Dowling R., Fantus I.G., Sonenberg N., Pollak M.:Metformin is an AMP kinase-dependent growth inhibitor for breastcancer cells. Cancer Res., 2006; 66: 10269-10273
Google Scholar - 110. Zhou G., Myers R., Li Y., Chen Y., Shen X., Fenyk-Melody J., WuM., Ventre J., Doebber T., Fujii N., Musi N., Hirshman M.F., GoodyearL.J., Moller D.E.: Role of AMP-activated protein kinase in mechanismof metformin action. J. Clin. Invest., 2001; 108: 1167-1174
Google Scholar - 111. Zou M.H., Kirkpatrick S.S., Davis B.J., Nelson J.S., Wiles W.G.4th,Schlattner U., Neumann D., Brownlee M., Freeman M.B., GoldmanM.H.: Activation of the AMP-activated protein kinase by the anti–diabetic drug metformin in vivo. Role of mitochondrial reactivenitrogen species. J. Biol. Chem., 2004; 279: 43940-43951
Google Scholar