Abstrakt

Pałeczki z rodzaju Campylobacter jejuni i Campylobacter coli to Gram-ujemne, mikroaerofilne bakterie szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, wywołujące u człowieka odzwierzęcą chorobę nazywaną kampylobakteriozą. Zakażenia tymi drobnoustrojami spowodowane są głównie spożyciem skażonych bakteriami produktów żywnościowych pochodzenia zwierzęcego, przede wszystkim nieodpowiednio przygotowanego mięsa drobiowego. Kampylobakterioza przebiega najczęściej pod postacią zapalenia żołądka i jelit lub tylko zapalenia jelit, a do charakterystycznych objawów chorobowych należą: wodnisto-śluzowa biegunka często z obecnością krwi w kale, nudności, wymioty, ból brzucha i gorączka. Z danych epidemiologicznych wynika, że w Europie, a także w Ameryce Północnej, bakterie z rodzaju Campylobacter, w tym przede wszystkim C. jejuni i C. coli, są najczęściej izolowanymi patogenami w przebiegu zakażeń przewodu pokarmowego u ludzi. Dane epidemiologiczne wskazują, że drobnoustroje te są znacznie częściej przyczyną ostrych biegunek, głównie u małych dzieci, niż pałeczki z rodzaju Salmonella czy Yersinia. Brak swoistych objawów choroby sprawia, że do rozpoznania kampylobakteriozy konieczne jest przeprowadzenie specjalistycznych badań mikrobiologicznych. Dotychczas laboratoryjna diagnostyka kampylobakteriozy oparta jest na badaniach bakteriologicznych i testach serologicznych, takich jak odczyn wiązania dopełniacza, odczyn immunoenzymatyczny ELISA czy odczyn western-immunoblotting. Ponieważ jak dotąd, badania te wykonywane są w Polsce jedynie w nielicznych laboratoriach, przeważająca liczba zachorowań na kampylobakteriozę nie była odnotowywana w polskich statystykach epidemiologicznych. Celem pracy jest omówienie zagadnień dotyczących mikrobiologicznej diagnostyki zakażeń wywoływanych przez pałeczki C. jejuni i C. coli. Opisano również podstawowe dane epidemiologiczne, kliniczne oraz obowiązujące wytyczne dotyczące leczenia kampylobakteriozy u ludzi.

Wprowadzenie

Pałeczki z rodzaju Campylobacter to Gram-ujemne, mikroaerofilne, ruchliwe pałeczki o długości 0,5–5 µm i średnicy 0,2–0,8 µm należące do typu Proteobacteria, klasy Proteobacteria, rodziny Campylobacteraceae [14,20,41,43]. Wywołują u ludzi odzwierzęcą chorobę nazwaną kampylobakteriozą.

Bakterie Campylobacter stanowią naturalną mikroflorę przewodu pokarmowego zarówno zwierząt hodowlanych (drób, bydło, owce, świnie), jak i dziko żyjących [1,9,14,38]. Do zakażenia pałeczkami Campylobacter sp. dochodzi najczęściej w wyniku spożycia niepoddanych odpowiedniej obróbce cieplnej potraw mięsnych, zwłaszcza przygotowanych z mięsa drobiowego oraz nieprzestrzegania podstawowych zasad higieny [7,12,27,31]. Do zakażenia może także doprowadzić spożycie skażonego pałeczkami Campylobacter sp. niepasteryzowanego mleka i jego przetworów lub skażonej wody. Znane są także przypadki zakażenia ludzi w następstwie bezpośredniego kontaktu ze zwierzętami domowymi lub hodowlanymi [9,19].

Epidemiologia kampylobakteriozy

W Polsce na mocy ustawy o zapobieganiu oraz zwalczaniu zakażeń i chorób zakaźnych u ludzi z dnia 13 lipca 2012 r. każdy przypadek kampylobakteriozy podlega rejestracji [37,38,40,42]. Informacje o liczbie potwierdzonych przypadków kampylobakteriozy są publikowane w postaci „Meldunków o zachorowaniach na choroby zakaźne i zatrucia w Polsce” oraz w postaci biuletynów rocznych „Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce”. Z danych opublikowanych przez Zakład Epidemiologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie w 2010 roku wynika, że w przeciągu ostatnich 6 lat liczba potwierdzonych przypadków kampylobakteriozy wzrosła prawie 14-krotnie; z 24 odnotowanych w 2004 r. do 352 odnotowanych w 2011 r., co daje zapadalność na poziomie 0,92 na 100 tysięcy mieszkańców [23,24]. Z danych epidemiologicznych przedstawionych w raporcie w 2011 r. przez Europejskie Centrum do Spraw Zapobiegania i Kontroli Chorób (ECDC) w 2009 r. wynika natomiast, że średnia zapadalność na kampylobakteriozę w Europie kształtowała się na poziomie 53,07. I tak, na przykład w 2009 r. zapadalność na kampylobakteriozę w krajach sąsiadujących z Polską wynosiła odpowiednio: w Czechach 193,54 (20259 przypadków zachorowań), w Słowacji 70,45 (3813 zachorowań), w Niemczech 76,57 (62787 przypadków) i na Litwie 24,24 (812 przypadków) [13].

Tak niska liczba potwierdzonych przypadków kampylobakteriozy w naszym kraju, w porównaniu do innych krajów europejskich, wynika z braku powszechnej rutynowej bakteriologicznej diagnostyki w wielu pracowniach diagnostycznych, a także z niezgłaszaniem się do lekarza osób z łagodnym przebiegiem kampylobakteriozy. Aczkolwiek badania przeprowadzone już w latach 80 i 90 XX w. w niektórych ośrodkach w Polsce wskazywały na konieczność wprowadzenia rutynowych badań w kierunku mikrobiologicznej diagnostyki kampylobakteriozy. Obecnie bakteriologiczna diagnostyka kampylobakteriozy wykonywana jest zaledwie w kilku ośrodkach w Polsce w tym m. in. w: Powiatowej Stacji Sanitarno- -Epidemiologicznej w Bielsku-Białej, PSSE w Tarnowie, w Samodzielnym Publicznym Specjalistycznym Szpitalu Zachodnim w Grodzisku Mazowieckim bądź w Samodzielnym Publicznym Dziecięcym Szpitalu Klinicznym w Warszawie [28,32,38,40,44,].

W większości przypadków kampylobakteriozę wywołują głównie pałeczki C. jejuni, znacznie rzadziej C. coli. W 2009 r. pałeczki z rodzaju Campylobacter wyhodowano w Polsce od 283 (78,6%) osób z kampylobakteriozą, z czego w 225 (62,5%) przypadkach były to pałeczki C. jejuni, u 47 (13,0%) pałeczki C. coli a jedynie u 11 (3,0%) osób pałeczki C. upsaliensis [36].

Obraz kliniczny kampylobakteriozy

Kampylobakterioza przebiega najczęściej pod postacią zapalenia żołądka i jelit lub tylko zapalenia jelit. Objawy chorobowe są różnorodne i obejmują: biegunkę (52-100% przypadków) często z obecnością krwi w kale (0,5-32%), nudności (28-59%), wymioty (1-42%), ból brzucha w okolicy pępkowej (56-99%), gorączkę (6-75%) [9,25,29]. Choroba rozwija się w ciągu 1-7 dni od zakażenia i często poprzedzona jest objawami, takimi jak bóle głowy i mięśni czy gorączka [7,14,31]. Objawy kampylobakteriozy zazwyczaj ustępują samoistnie po 2-7 dniach, jednakże znane są tak- że przypadki przewlekłej biegunki. U około 30% pacjentów mogą wystąpić tylko objawy grypopodobne [19]. Na zakażenie pałeczkami C. jejuni i C. coli narażeni są głównie ludzie ze skrajnych grup wiekowych, w tym przede wszystkim małe dzieci poniżej piątego roku życia, a także młodzi ludzie w wieku 15-35 lat [9,13,14,32]. U osób leczonych immunosupresyjnie oraz u osób z obniżoną odpornością w sporadycznych przypadkach może wystąpić uogólniona postać kampylobakteriozy – posocznica oraz zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych [9,13,19].

Przebyte zakażenie pałeczkami C. jejuni może u niektórych osób spowodować po 10‑30 dniach od zakażenia groźne w skutkach powikłania neurologiczne, takie jak zespół Guillaina-Barrégo. Częstość występowania tego zespołu jest szacowana na 1‑2 przypadki rocznie na 100 tys. osób [9,14,29]. Według tych samych źródeł nawet do 40% przypadków tego zespołu może być wynikiem wcześniejszego zakażenia pałeczkami C. jejuni, najczęściej należącymi do serotypu O:19. Do innych pozakaźnych powikłań, również o podłożu autoimmunologicznym, należy reaktywne zapalenie stawów lub zespół Reitera, który zazwyczaj obserwowany jest u osób posiadających antygen HLA B27 [9,14,19]. Częstość występowania stawowych powikłań po kampylobakteriozie ocenia się na 2-3% [25]. Ponadto stwierdzane są inne postacie kampylobakteriozy, takie jak: wrzodziejące zapalenie jelita grubego, zapalenie wątroby, trzustki lub pęcherzyka żółciowego [9,14].

Leczenie chorych z kampylobakteriozą

Kampylobakterioza należy do chorób samoograniczających się i zazwyczaj wymaga jedynie leczenia objawowego, polegającego na podawaniu płynów i elektrolitów, lekkostrawnej diety oraz stosowaniu probiotyków i preparatów witaminowych [9]. Etiotropowe leczenie wskazane jest w przypadku ciężkiego przebiegu zakażenia objawiającego się wysoką gorączką oraz ostrą, krwawą biegunką, utrzymującą się ponad tydzień, a także u osób z niedoborem odporności i u ciężarnych kobiet [9,25,40,48]. Pałeczki C. jejuni/coli są zwykle oporne na większość antybiotyków β-laktamowych (z wyjątkiem karbapenemów), trimetoprim, sulfametoksazol, rifampicynę czy wankomycynę, dlatego też w leczeniu pacjentów ze zdiagnozowana kampylobakteriozą standardem we wstępnej terapii jest podawanie antybiotyków makrolidowych, takich jak erytromycyna czy azytromycyna [1,4,9, 14,20,33,35,48]. O zastosowaniu tych leków w terapii decyduje zazwyczaj łatwość ich użycia, niewystępowanie poważnych działań niepożądanych, a przede wszystkim stosunkowo wysoki stopień skuteczności klinicznej [3]. W Polsce jak dotąd nie obserwuje się występowania oporności na erytromycynę czy azytromycyną wśród szczepów Campylobacter.

W terapii zakażeń o etiologii Campylobacter stosowane też mogą być fluorochinolony, które podaje się pacjentom powyżej 16 r.ż z niezdiagnozowanymi stanami zapalnymi jelit, ze względu na ich szeroki zakres działania [3,9,11,15,17,34,35]. Niestety w ostatnich latach zaobserwowano gwałtownie narastającą oporność szczepów Campylobacter na fluorochinolony, głównie na ciprofloksacynę i  kwas nalidyksowy, sięgającą poziomu ponad 70% opornych szczepów C. jejuni i prawie 100% C. coli. [9,11,20,45,48]. Oporność na te leki związana jest m.in. z mutacjami punktowymi w genach gyrA i gyrB kodujących gyrazę oraz parC i parE kodujących topoizomerazę IV [3,9,35]. Czynnikami ryzyka w zakażeniach szczepami opornymi na fluorochinolony są zagraniczne podróże i wcześniejsze stosowanie tych leków [15]. Spośród innych leków stosowanych w leczeniu kampylobakteriozy należy wymienić: tetracyklinę, gentamycynę, amoksycylinę z kwasem klawulanowym oraz karbapenemy. Jednak wśród 40% szczepów Campylobacter izolowanych w Polsce w 2008 r. stwierdzono oporność na tetracyklinę wynikającą przede wszystkim z częstego stosowania tych antybiotyków zarówno w medycynie, jak i w weterynarii [31,33,34,35,47,50]. Amoksycylina z  kwasem klawulanowym (jednak nie sulbactam ani tazobactam) wydają się lekami skutecznymi [40]. Ostre infekcje powinny być leczone aminoglikozydami, np. gentamycyną lub imipenemem. Gentamycyna może być skuteczna w połączeniu z karbapenemami w leczeniu posocznicy oraz innych układowych zakażeń bakteryjnych jednak nie może być stosowana u kobiet w ciąży [21]. Z kolei imipenem może być stosowany tylko wówczas, gdy inne możliwości antybiotykowe zostały wykorzystane. W terapii zakażeń pałeczkami Campylobacter sp. lekami z wyboru są dwa antybiotyki: erytromycyna u pacjentów ze zdiagnozowaną kampylobakteriozą oraz fluorochinolony u pacjentów z niezdiagnozowanymi stanami zapalnymi jelit [1,9,11,15,16].

Istotnym problemem jest stosowanie rifaksyminy w zakażeniach o etiologii Campylobacter. Pierwotnie lek ten był w Polsce (ale nie w innych krajach) zarejestrowany do stosowania w leczeniu bardzo różnorodnych zakażeń przewodu pokarmowego wywoływanych przez różne bakterie patogenne, w tym pałeczki Salmonella, Shigella oraz Campylobacter. Badania przeprowadzone (dane niepublikowane) w Zakładzie Bakteriologii NIZP-PZH wykazały jednak bardzo wysoki poziom niewrażliwości Campylobacter na ten lek.

Diagnostyka bakteriologiczna

Podstawą laboratoryjnego kryterium rozpoznania kampylobakteriozy jest wyizolowanie patogenu z próbek materiału klinicznego [1,5,9,19,40,46]. Bakteriologiczna diagnostyka kampylobakteriozy obejmuje bezpośrednie badanie mikroskopowe oraz izolację i identyfikację drobnoustrojów. W przypadku zakażeń jelitowych materiałem do badań bakteriologicznych jest próbka kału ewentualnie wymaz z odbytu. W przypadku zakażenia uogólnionego materiałem może być krew lub płyn mózgowo-rdzeniowy [1,9,40,46]. Próbka kału powinna być pobrana w ostrej fazie choroby do jałowego naczynia lub do podłoża transportowego zawierającego węgiel aktywowany (podłoże Amiesa, Stuarta czy Cary-Blaira) i niezwłocznie dostarczona do laboratorium mikrobiologicznego [1,9,46]. Próbka kału pobrana do jałowego pojemniczka powinna zostać dostarczona do laboratorium najpóźniej w ciągu kilku godzin, natomiast do pod- łoża transportowego w ciągu 48 godzin. Próbkę krwi lub płynu mózgowo-rdzeniowego należy posiać na płynne podłoże standardowo przeznaczone do tego rodzaju materiału klinicznego [40].

Hodowlę pałeczek Campylobacter prowadzi się 1-5 dni w warunkach mikroaerofilnych w temperaturze 42°C. Do izolacji pałeczek C. jejuni czy C. coli stosuje się zazwyczaj wzbogacone selektywne pożywki najczęściej z dodatkiem 5% krwi baraniej lub końskiej. Wybór pożywki zależy od rodzaju posiewanej próbki materiału. Jedną z najczęściej wykorzystywanych pożywek do posiewu próbki kału jest podłoże CCDA (Campylobacter blood – free selective medium – charcoal, cefeperazon, deoxycholate agar). Jest to podłoże najbardziej przydatne do izolacji pałeczek C. jejuni i C. coli. Zawiera ono m.in. węgiel drzewny, amfoterycynę B, cefoperazon i dezoksycholan sodu (ryc.1). Innymi stosowanymi do hodowli pożywkami selektywnymi są: Agar Skirrow, Agar Karmali, Agar Prestona [46]. Odpowiednie mikroaerofilne warunki hodowli, tj. atmosferę: 5% O2 , 10% CO2, 85% N2 można zapewnić wykorzystując zamknięte systemy typu CampyGen, GasPak CampyPak czy Generbox, produkowane przez takie firmy jak Oxoid, bioMerieux lub Becton Dickinson [26,46].

Na podłożu CCDA pałeczki Campylobacter rosną w postaci szarych lub mlecznych kolonii. W zależności od szczepu i wilgotności podłoża kolonie mogą być zwarte, okrągłe lub lekko rozlewające się [46]. Po uzyskaniu wzrostu drobnoustrojów na pożywkach stałych przeprowadza się wstępne testy identyfikujące, takie jak preparat przyżyciowy (pozwalający na sprawdzenie zdolności do ruchu), preparat barwiony metodą Grama oraz test na wytwarzanie oksydazy cytochromowej (pałeczki Campylobacter zawsze dają dodatni wynik tego testu). Preparat przyżyciowy wykonujemy przez zawieszenie pojedynczej kolonii w kropli soli fizjologicznej lub podłoża płynnego. Preparaty należy oglądać pod mikroskopem przy powiększeniu 600-krotnym [20,26,46]. W preparacie barwionym metodą Grama poszukujemy Gram-ujemnych, spiralnych lub sierpowatych komórek [1,37]. Pałeczki C. jejuni i C. coli, dzięki pojedynczej rzęsce umieszczonej na jednym lub dwóch biegunach komórki, są zdolne do spiralnego ruchu.

Podejrzane kolonie, o morfologii Gram-ujemnych pałeczek wykazujących dodatni wynik testu na ruch oraz testu na wytwarzanie oksydazy cytochromowej, przesiewa się na podłoże Columbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej (np. Columbia agar + sheep blood plus firmy Oxoid), które następnie inkubuje się przez 24 godziny w temperaturze 42oC. Następnie wykonuje się identyfikację wyrosłych kolonii bakteryjnych [26,46].

W niektórych krajach do izolacji pałeczek C. jejuni i C. coli z próbki kału stosuje się metodę filtracji, wykorzystują- cą dwie bardzo charakterystyczne cechy tych bakterii – ruchliwość i bardzo mały rozmiar komórki. Metoda ta polega na selektywnym przechodzeniu pałeczek Campylobacter przez filtr membranowy o średnicy 0,45-0,65 µm przy jednoczesnym zatrzymaniu pozostałych bakterii jelitowych na membranie. Po usunięciu filtra z podłoża, płytki inkubuje się w warunkach mikroaerofilnych w temperaturze 42oC, po czym wyrosłe kolonie poddaje się dalszej identyfikacji. Szacuje się, że metoda filtracji próbki kału jest przede wszystkich przydatna do izolacji innych niż C. jejuni i C. coli pałeczek Campylobacter (przy zastosowaniu tej metody izolacji zaobserwowano wzrost izolacji tych pałeczek z 1 do prawie 20%) [26,46].

Różnicowanie pałeczek Campylobacter sp., umożliwiające identyfikację wyizolowanych szczepów, polega na ocenie cech morfologicznych wyrosłych kolonii oraz ocenie właściwości biochemicznych, które w większości można oznaczyć testem API Campy firmy bioMérieux [26]. Na podłożu Columbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej, typowe pałeczki Campylobacter tworzą szare kolonie z metalicznym połyskiem lub bez połysku [26,46]. Obecnie podstawowymi testami biochemicznymi wykorzystywanymi do różnicowania pałeczek C. jejuni i C. coli od innych gatunków rodzaju Campylobacter są: zdolność do wytwarzania katalazy, hydrolizy octanu indoksylu i hydrolizy hipuranu sodu. Test na zdolność hydrolizy hipuranu sodu pozwala przede wszystkim na odróżnienie pałeczek C. jejuni, mających taką zdolność, od C. coli, C. lari czy C. upsaliensis, niehydrolizujących hipuranu sodu. Niestety liczne publikacje donoszą o występowaniu szczepów C. jejuni niehydrolizujących hipuranu sodu [15,26,46]. Szacuje się, że izolaty te stanowią około 10% wszystkich izolowanych szczepów tego gatunku. Testami biochemicznymi nie można odróżnić hipuranoujemnych szczepów C. jejuni od szczepów C. coli. W takim przypadku, przynależność wyhodowanego szczepu do gatunku można określić metodą PCR z użyciem odpowiednich, gatunkowo swoistych par starterów [30,45].

Ryc. 1. Wzrost C. jejuni na selektywnym podłożu CCDA

Badanie lekooporności

Obecnie najczęściej lekooporność pałeczek Campylobacter oznacza się paskami E‑test na podłożu stałym Mueller -Hinton agar z dodatkiem 5% krwi końskiej, co pozwala na określenie wartości MIC (MIC – minimal inhibitory concentration) poszczególnych leków. Do kontroli podłoża stosowanego dla pasków E‑testu wykonuje się oznaczanie lekooporności szczepu referencyjnego C. jejuni ATCC 33560 lub C. coli ATCC 33559. Inkubację prowadzi się w warunkach mikroaerofilnych w temperaturze 42°C przez 24  godziny [9,12,14,48]. Europejski Komitet do spraw Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST) sugeruje oznaczanie lekooporności pałeczek C. jejuni czy C. coli tańszą i prostszą w wykonaniu metodą krążkowo-dyfuzyjną [12]. Do tego celu używa się stałego podłoża Mueller-Hinton agar z dodatkiem 5% krwi końskiej. Po rozprowadzeniu na powierzchni podłoża zawiesiny bakterii o gęstości 0,5 McFarlanda, nakłada się krążek z odpowiednim antybiotykiem, tj. ciprofloksacyną, erytromycyną lub tetracykliną. Niestety, obecnie EUCAST podaje wytyczne interpretacyjne jedynie dla ciprofloksacyny, erytromycyny, azytromycyny, klarytromycyny, doksycyliny oraz tetracykliny. Na stronie EUCAST można znaleźć aktualne wytyczne dotyczące wyznaczonych wartości MIC dla poszczególnych antybiotyków [12]. Jednak ze względu na fakt, iż dla wielu antybiotyków nie ma jednoznacznych kryteriów interpretacyjnych dla metody krążkowo-dyfuzyjnej obecnie do oznaczania lekooporności szczepów pałeczek C. jejuni przez EUCAST preferowana jest metoda pasków E-test, która stosowana jest już od wielu lat w niektórych ośrodkach [12,31,33].

Badania genetyczne

W określaniu gatunku pałeczek Campylobacter wykorzystano technikę PCR, wykrywającą swoiste dla różnych gatunków sekwencje DNA, w tym głównie sekwencje 16S rDNA, sekwencje genu hipO kodującego hipurykazę lub genu asp kodującego aspartokinazę [2,22]. Jedną z zalet metody PCR jest krótki czas oczekiwania na wynik identyfikacji tych bakterii w porównaniu do metod stosowanych w testach biochemicznych. Z danych opublikowanych przez Bessede i wsp. [7] wynika, że metoda PCR, w stosunku do hodowli, jak i metody oznaczania antygenu pałeczek Campylobacter w próbce kału, odznacza się 85,7% czułością oraz 99,3% swoistością. W związku z tym, do różnicowania gatunkowego pałeczek Campylobacter stosowana jest metoda PCR. Obecnie nie ma dostępnych na rynku komercyjnych zestawów umożliwiających identyfikację i różnicowanie szczepów Campylobacter wyizolowanych z materiału klinicznego metodą PCR. Identyfikacja pałeczek Campylobacter metodą PCR wykonywana jest m. in. w Zakładzie Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie [6].

Ponadto w ostatnich latach do identyfikacji pałeczek C. jejuni i różnicowania ich od innych innych drobnoustrojów wywołujących zakażenia przewodu pokarmowego, takich jak Yersinia, Salmonella i Shigella wykorzystywana jest jakościowa i ilościowa metoda real-time PCR [2,21,49,51].

Oznaczanie antygenu pałeczek C. jejuni iC. coli w próbce kału

W diagnostyce zakażeń pałeczkami C. jejuni i C. coli coraz bardziej powszechne są badania serologiczne. Obecnie dostępne są komercyjne testy ELISA umożliwiające wykrycie odczynem immunoenzymatycznym ELISA antygenu pałeczek C. jejuni i/lub C. coli w próbce kału [7,17]. W sprzedaży dostępne są komercyjne zestawy ELISA, takie jak: Prospec T Campylobacter EIA firmy Remel (test dostępny jest od ponad 10 lat w USA, a obecnie również w Europie), PremierCAMPY EIA i ImmunoCard STAT! CAMPY firmy Meridian Bioscience (USA) (tabela 1). Z badań przeprowadzonych przez Granato i wsp. wynika, iż testy te odznaczają się wysoką czułością, która wynosi odpowiednio dla testu Prospec T 80-96%, testu PremierCAMPY EIA 96,7% i testu ImmunoCard STAT! CAMPY 98,1% [17]. Istotną zaletą tej metody jest możliwość uzyskania wyniku badania już po około 2 godzinach. Ze względu na możliwość uzyskania nieswoistego wyniku badania, laboratoryjna diagnostyka kampylobakteriozy nie może być jednak oparta wyłącznie na poszukiwaniu antygenu w próbkach kału. Ostatnie publikacje potwierdzają, iż poszukiwanie antygenu odczynem ELISA, tak samo jak i metodą PCR, nabierają coraz większego znaczenia w rutynowej diagnostyce kampylobakteriozy i stanowią bardzo dobre uzupełnienie tradycyjnych metod [7,17].

Oznaczanie poziomu swoistych przeciwciał w surowicy

Podobnie jak poszukiwanie antygenu w  próbce kału, oznaczanie poziomu swoistych przeciwciał w próbce surowicy, należy traktować jako badanie uzupełniające diagnostykę bakteriologiczną i/lub genetyczną.

Początkowo w serodiagnostyce kampylobakteriozy stosowano odczyn wiązania dopełniacza [6,8,18,27,28,39]. Obecnie, ze względu na wysoką czułość oraz możliwość określania poziomu swoistych przeciwciał dla różnych antygenów pałeczek C. jejuni/C. coli w poszczególnych klasach immunoglobulin w serologicznej diagnostyce kampylobakteriozy i jej powikłań stosuje się odczyn immunoenzymatyczny ELISA oraz odczyn western-immunoblotting [27,28,39]. Badania serologiczne wykonywane są powszechnie w wielu krajach Europy Zachodniej i USA, a od 2008 r. również w Polsce (NIZP-PZH) [28]. Są one szczególnie przydatne w diagnostyce powikłań występujących po zakażeniu pałeczkami C. jejuni, takich jak reaktywne zapalenie stawów czy zespołach Guillaina‑Barrégo i Millera-Fishera [6,28,29]. Badania serologiczne w kierunku kampylobakteriozy mają również znaczenie w przypadku, gdy u pacjenta rozpoczęto leczenie antybiotykami lub objawy kliniczne wskazują na zakażenie pałeczkami C. jejuni i/lub C. coli, a wynik badania bakteriologicznego był ujemny [28]. Dostępnych jest na rynku wiele testów komercyjnych, takich jak Serion ELISA Classic Campylobacter IgA/IgG/IgM firmy Virion/Serion (Niemcy) czy recomWell Campylobacter IgA/IgG firmy Mikrogen (Niemcy) (tabela 1) [6,28,29,36, 39]. W teście ELISA firmy Virion/Serion producent zastosował uzyskane w warunkach natywnych termostabilne białko o masie 45 kDa będące głównym białkiem błony zewnętrznej pałeczek Campylobacter jejuni [18]. W podobnym teście firmy Mikrogen zastosowano z kolei rekombinowane białka C. jejuni i C. coli, takie jak: PEB4, OMP18, P39 [28].

Serodiagnostyka kampylobakteriozy napotyka jednak na wiele problemów, związanych z dużą antygenową róż- norodnością szczepów Campylobacter i zmienną, zależną od przebiegu klinicznego, odpowiedzią immunologiczną osób chorych [8,28]. W przebiegu zakażenia wywołanego przez pałeczki Campylobacter wytwarzane są surowicze przeciwciała klasy IgA, IgM i IgG [6,8,9,25,39]. Przeciwciała klasy IgA dla antygenów pałeczek C. jejuni pojawiają się w surowicy około piątego dnia od zakażenia osiągając maksymalny poziom w drugim tygodniu choroby [9,19]. Przeciwciała tej klasy można wykryć na diagnostycznie znamiennym poziomie w surowicy osób z przebytą kampylobakteriozą do trzech miesięcy od początku objawów klinicznych [9,19]. Poziom przeciwciał klasy IgG narasta powoli, lecz utrzymuje się na wysokim poziomie nawet do kilku-kilkunastu miesięcy [19]. Uważa się, że w celu potwierdzenia ostrej infekcji jelitowej, najwyższą wartość diagnostyczną ma wykazanie znamiennego przyrostu poziomu przeciwciał klasy IgA i IgM, rzadziej klasy IgG, w dwóch próbkach surowicy uzyskanych w odstępie 2 tygodni [28,39]. W przypadku powikłań kampylobakteriozy przyjęto, iż największe znaczenie ma wykazanie serokonwersji przeciwciał klasy IgA i IgG [6,8,10,28,29,39].

Obecnie w wielu krajach prowadzone są badania mające na celu uzyskanie nowych rekombinowanych antygenów pałeczek C. jejuni i C.coli. Wydaje się, iż odpowiednio wyselekcjonowane białka staną się w najbliższym czasie podstawą do opracowania prototypu nowych testów diagnostycznych umożliwiających nie tylko rozpoznanie kampylobakteriozy czy jej powikłań, ale również różnicowanie faz tej choroby [10].

Podsumowanie

Diagnostyka mikrobiologiczna zakażeń pałeczkami C. jejuni i C. coli obejmuje zarówno metody izolacji bakterii z próbek materiału klinicznego, jak i techniki biologii molekularnej i metody serologiczne. Trzeba pamiętać, że złotym standardem w diagnostyce kampylobakteriozy jest metoda izolacji i hodowli tych drobnoustrojów. Istnieją jednak ograniczenia tej metody polegające na stosunkowo niewielkiej czułości w późniejszych fazach choroby, konieczności użycia specjalistycznych pożywek oraz na długim okresie oczekiwania na wynik badania bakteriologicznego. W przypadku wyizolowania z próbki materiału klinicznego szczepu C. jejuni czy C. coli należy określić jego lekowrażliwość. W diagnostyce kampylobakteriozy wykorzystywana jest również metoda PCR umożliwiająca określenie przynależności danego szczepu do określonego gatunku Campylobacter sp., jak również ocenę występowania poszczególnych markerów zjadliwości. W przypadku dłużej utrzymujących się infekcji i w diagnostyce powikłań występujących po zakażeniu pałeczkami C. jejuni i/lub C. coli, takich jak reaktywne zapalenie stawów czy zespół Guillaina-Barrégo przydatne są metody serologiczne umożliwiające poszukiwanie swoistych przeciwciał w próbkach surowicy osób chorych.

Tabela 1. Metody laboratoryjnej diagnostyki zakażeń wywoływanych przez pałeczki C. jejuni i C. coli

Europejskie statystyki epidemiologiczne wskazują, że zapadalność na tę chorobę w Polsce jest znacznie niższa niż w pozostałych krajach europejskich. Ze względu na dużą liczbę przypadków bezobjawowej kampylobakteriozy u ludzi znaczna część tych przypadków pozostaje nierozpoznana. Dodatkowo, badania bakteriologiczne jak i serologiczne w kierunku kampylobakteriozy wykonywane są w Polsce w nielicznych laboratoriach.

Przypisy

• 1. Adedayo O., Kirkpatrick B.: Campylobacter jejuni infections:update of presentation, diagnosis, and management. Hosp. Physician.,2008; 44: 9-15
  Google Scholar
• 2. Al Amri A., Senok A.C., Ismaeel A.Y., Al-Mahmeed A.E., BottaG.A.: Multiplex PCR for direct identification of Campylobacterspp. in human and chicken stools. J. Med. Microbiol., 2007; 56:1350-1355
  Google Scholar
• 3. Albrecht P., Kotowska M. Antybiotykoterapia bakteryjnych zaka-żeń przewodu pokarmowego – Helicobacter pylori, Yersinia enterocolitica,Campylobacter jejuni. Przew. Lek, 2007; 2: 133-138
  Google Scholar
• 4. Allos B.M.: Campylobacter jejuni infections: Update on emerginingissues and trends. Clin Infect. Dis., 2001; 32: 1201-1206
  Google Scholar
• 5. Allos B., Taylor D.: Campylobacter infections. W: Bacterial infectionsof humans. Epidemiology and control., red. Evans A., BrachmanPh. New York and London 1998, 169-190
  Google Scholar
• 6. Ang C.W., Krogfelt K., Herbrink P., Keijser J., van Pelt W., DalbyT., Kuijf M., Jacobs B.C., Bergman M.P., Schiellerup P., Visser C.E.:Validation of an ELISA for the diagnosis of recent Campylobacterinfections in Guillain- Barre and reactive arthritis patients. Clin.Microbiol. Infect., 2007; 13: 915-922
  Google Scholar
• 7. Bessede E., Delcamp A., Sifre E., Buissonniere A., Megraud F.: Newmethods for detection of Campylobacters in stool samples in comparisonto culture. J. Clin. Microbiol., 2011; 49: 941-944
  Google Scholar
• 8. Blaser M., Duncan D.: Human serum antibody response to Campylobacterjejuni infections as measured in an enzyme-linked immunosorbentassay. Infect. Immun., 1984; 44: 292-298
  Google Scholar
• 9. Blaser M.J., Engberg J.: Clinical aspects of Campylobacter jejuniand Campylobacter coli infections. W: Campylobacter, 3rd ed., red.:Nachamkin J., Szymanski C.M., Blaser J., ASM Press, Washington,2008; 99-121
  Google Scholar
• 10. Corso J., Lugert R., Groß U., Zautner A.E.: Is the Campylobacterjejuni secretory protein Cj0069 a suitable antigen for serodiagnostics?Eur. J. Microbiol. Immunol., 2011; 1: 86-94
  Google Scholar
• 11. Daczkowska-Kozon E.: Co wiemy i czego nie wiemy o Campylobactersp.? Postępy Mikrobiol., 2002: 41: 85-104
  Google Scholar
• 12. European Centre for Disease Prevention and Control: Annualepidemiological report. Reporting on 2009 surveillance data and 2010 epidemic intelligence data. Stockholm: ECDC; 2011; 71-73; www.ecdc.europa.eu (06.07.2012)
  Google Scholar
• 13. Europejski Komitet Do Spraw Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST):Zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwościdrobnoustrojów – zalecenia ekspertów EUCAST, wersja 1, kwiecień2008http://www.korld.edu.pl/pdf/eucast/Eucast_expert_rules_strona_20.pdf(16.07.2012)
  Google Scholar
• 14. Everest P, Ketley M.: Campylobacter. W: Molecular Medical Microbiology,red. Sussman M., Academic Press, Londyn, 2002, 1311-1329
  Google Scholar
• 15. Fitzgerald C., Whichard J., Nachamkin I.: Diagnosis and antimicrobialsusceptibility of Campylobacter species. W: Campylobacter,3d ed., red. Nachamkin J., Szymański C.M. and Blaser M.J., ASM Press,Washington, 2008, 227-244
  Google Scholar
• 16. Garlicki A., Leśniak M.: Leczenie chorób biegunkowych o etiologiizakaźnej u dorosłych. Przegl. Epidemiol., 2009; 63: 395-400
  Google Scholar
• 17. Granato P.P., Chen L., Holiday I., Rawling R.A., Nowak-WeekleyS.M., Quinlan T., Musser K.A.: Comparison of premier CAMPY enzymeimmunoassay (EIA), ProSpecT Campylobacter EIA, and ImmunoCardSTAT! CAMPY tests with culture for laboratory diagnosisof Campylobacter enteric infections. J. Clin. Microbiol., 2010; 48:4022-4027
  Google Scholar
• 18. Jakubczak A., Rastawicki W., Jagielski M.: Wykorzystanie odczynuELISA w serologicznej diagnostyce kampylobateriozy. Med. Dośw.Mikrobiol., 2007; 59: 359-370
  Google Scholar
• 19. Janssen R., Krogfelt K.A., Cawthraw S., van Pelt W., WagenaarJ.A., Owen R.J.: Host-pathogen interactions in Campylobacter infections:the host perspective. Clin. Microbiol. Rev., 2008; 21: 505-518
  Google Scholar
• 20. Krutkiewicz A.: Kampylobakterioza u ludzi i zwierząt. ŻycieWeterynaryjne, 2008; 83: 285-289
  Google Scholar
• 21. Lehtopolku M., Nakari U.M., Kotilainen P., Huovinen P., SiitonenA., Haakanen A.J.: Antimicrobial susceptibility of multidrug-resistentCampylobacter jejuni and C. coli strains: in vitro activities of 20 antimicrobialagents. Antimicrob. Ag. Chemiother., 2010, 54: 1232-1236
  Google Scholar
• 22. Linton D., Lawson R., Owen R.J., Stanley J.: PCR detection, identificationto species level, and fingerprinting of Campylobacter jejuniand Campylobacter coli direct from diarrheic samples. J. Clin.Microbiol., 1997; 35: 2568-2572
  Google Scholar
• 23. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny– Zakład Epidemiologii, Główny Inspektor Sanitarny. Chorobyzakaźne i zatrucia w Polsce w 2010 roku., Warszawa, 2011, http://www.pzh.gov.pl/oldpage/epimeld/index_p.html (06.07.2012)
  Google Scholar
• 24. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny– Zakład Epidemiologii, Główny Inspektor Sanitarny: „Meldunkio zachorowaniach na choroby zakaźne, zakażeniach i zatruciachw Polsce”, Warszawa,http://www.pzh.gov.pl/oldpage/epimeld/index_p.html#01.(06.07.2012)
  Google Scholar
• 25. Peterson M.C.: Clinical aspects of Campylobacter jejuni infectionsin adults. West J. Med., 1994; 161: 148-152
  Google Scholar
• 26. Przybylska A.: Zatrucia i zakażenia pokarmowe w Polsce w 2002roku. Przegl. Epidemiol., 2004; 58: 85-101
  Google Scholar
• 27. Rokosz N., Rastawicki W., Jagielski M.: Ocena odczynem westernimmunoblottingantygenowych właściwości białek Campylobacterjejuni i Campylobacter coli. Med. Dośw. Mikrobiol., 2008; 60: 121-129
  Google Scholar
• 28. Rokosz N., Rastawicki W., Jagielski M.: Ocena przydatności komercyjnegotestu recomWell Campylobacter do rutynowej serodiagnostykizakażeń wywoływanych przez pałeczki Campylobacterjejuni i Campylobacter coli. Med. Dośw. Mikrobiol., 2008; 60: 289-295
  Google Scholar
• 29. Rokosz N., Rastawicki W., Jagielski M., Hetkowska-Abramczyk Z.:Wykrywanie przeciwciał dla pałeczek Campylobacter jejuni u dzieciz zespołem Guillain- Barre przy zastosowaniu różnych preparatówantygenowych. Med. Dośw. Mikrobiol., 2011; 63: 255-261
  Google Scholar
• 30. Rożynek E., Dzierżanowska-Fangrat K., Jóźwiak P., PopowskiJ., Korsak D., Dzierżanowska D.: Prevalence of potential virulencemarkers in Polish Campylobacter jejuni and C. coli isolates obtainedfrom hospitalized children and from chicken carcasses. J. Med. Microbiol.,2005; 54: 615-619
  Google Scholar
• 31. Rożynek E., Dzierżanowska-Fangrat K., Korsak D., Konieczny P.,Wardak S., Szych J., Jarosz M., Dzierżanowska D.: Comparison of antimicrobialresistance of Campylobacter jejuni and Campylobactercoli isolated from humans and chicken carcasses in Poland. J. FoodProt., 2008; 71: 602-607
  Google Scholar
• 32. Rożynek E., Dzierżanowska D., Stafiej-Modrowska E. OrłowskiL.: Biochemical and serologic characteristic of Campylobacter jejuni/colistrains causing diarrhea in children. Med. Dośw. Mikrobiol.,1989; 41: 37-42
  Google Scholar
• 33. Rożynek E., Dzierżanowska-Fangrat K., Szczepańska B., WardakS., Szych J., Konieczny P., Albrecht P., Dzierżanowska D.: Trends inantimicrobial susceptibility of Campylobacter isolates in Poland(2000-2007). Pol. J. Microbiol., 2009; 58: 111-115
  Google Scholar
• 34. Rutkiewicz A., Klimuszko D.: Mechanizmy oporności pałeczekCampylobacter spp. na chemioterapeutyki. Postępy Mikrobiol., 2008,47: 489-495
  Google Scholar
• 35. Rzewuska K., Korsak D, Maćkiw E.: Oporność bakterii Campylobactersp. na antybiotyki i chemioterapeutyki. Przegl. Epidemiol.,2010, 64: 63-68
  Google Scholar
• 36. Sadkowska-Todys M., Kucharczyk B.: Kampylobakterioza w Polscew 2009 roku. Przegl. Epidemiol., 2011; 65: 239-241
  Google Scholar
• 37. Sadkowska-Todys M., Kucharczyk B.: Kampylobakterioza w Polscew 2010 roku. Przegl. Epidemiol., 2012; 66: 255-258
  Google Scholar
• 38. Sadkowska-Todys M., Wardak S.: Kampylobakterioza w 2006roku. Przegl. Epidemiol., 2008; 62: 295-299
  Google Scholar
• 39. Strid M.A., Engberg J., Larsen L.B., Begtrup K., Molbak K., KrogfeltK.A.: Antibody responses to Campylobacter infections determinedby an enzyme-linked immunosorbent assay: 2-year follow-up studyof 210 patients. Clin. Diag. Lab. Immunol., 2001; 8: 314-319
  Google Scholar
• 40. Szych J.: Kampylobakterioza. W: Choroby zakaźne i pasożytnicze- epidemiologia i profilaktyka. Red. Magdzik W., Naruszewicz–Lesiuk D., Zieliński A. Alfa-Medica Press, Bielsko-Biała 2007; 154-158
  Google Scholar
• 41. Taxa covered by the ICSP Subcommittee on the Taxonomy ofCampylobacter and related bacteria – August 2011. http://www.the–icsp.org/taxa/Campylobacterlist.htm (30.09.2013)
  Google Scholar
• 42. Ustawa z dnia 13 lipca 2012 r. o zapobieganiu oraz zwalczaniuzakażeń i chorób zakaźnych u ludzi. Kancelaria Sejmu
  Google Scholar
• 43. Vandamme P.: Taxonomy of the Family Campylobacteraceae.Campylobacter 2d ed. Red.: Nachamkin J., Blaser J., ASM Press, Washington,2000; 3-26
  Google Scholar
• 44. Wardak S., Duda U., Szych J.: Epidemiologiczna analiza zakażeńwywoływanych przez pałeczki Campylobacter sp. wykrytych przezStację Sanitarno-Epidemiologiczną w Bielsku-Białej. Przegl. Epidemiol.,2007; 61: 417-424
  Google Scholar
• 45. Wardak S., Szych J.: Występowanie wybranych genów zjadliwościw szczepach pałeczek Campylobacter jejuni izolowanych odludzi na terenie Polski w latach 2003-2005. Med. Dośw. Mikrobiol.,2006; 58: 217-222
  Google Scholar
• 46. Wardak S., Szych J.: Zakażenia przewodu pokarmowego zatruciapokarmowe wywoływane przez bakterie rosnące w warunkach mikroaerofilnych.W: Etiologia, obraz kliniczny i diagnostyka ostrychzakażeń i zarażeń przewodu pokarmowego oraz zatruć pokarmowych.,red. Marek Jagielski, Fundacja Pro Pharmacia Futura, Warszawa,2010; 123-129
  Google Scholar
• 47. Wardak S., Szych J.: Ocena wrażliwości na tygecyklinę klinicznychszczepów pałeczek Campylobacter jejuni opornych na tetracyklinę.Med. Dośw. Mikrobiol., 2010; 62: 345-350
  Google Scholar
• 48. Wardak S., Szych J., Duda U.: Wrażliwość na antybiotyki i chemioterapeutykiszczepów pałeczek Campylobacter sp. izolowanychod ludzi w latach 2005-2006 w regionie Bielsko-Białej. Med. Dośw.Mikrobiol., 2007; 59: 43-49
  Google Scholar
• 49. Wiemer D., Loderstaedt U., von Wulffen H., Priesnitz S., TannichE., Hagen R.M.: Real-time multiplex PCR for simultaneous detectionof Campylobacter jejuni, Salmonella, Shigella and Yersinia species infecal samples. Int. J. Med. Microbiol., 2011; 301: 577-584
  Google Scholar
• 50. Wołkowicz T., Szych J., Wardak S.: Analiza podłoża genetycznegoi mechanizmów rozprzestrzeniania się oporności na tetracyklinępopulacji szczepów z rodzaju Campylobacter izolowanych w Polscew latach 2007-2008. Med. Dośw. Mikrobiol., 2011; 63: 305-334
  Google Scholar
• 51. Zhang M.J., Qiao B., Xu X.B., Zhang J.Z.: Development and applicationof a real-time polymerase chain reaction method for Campylobacterjejuni detection. World J. Gastroenterol., 2013, 19: 3090-3095
  Google Scholar

Pełna treść artykułu