Abstrakt

Ostatnie lata, przynoszą systematyczny wzrost zainteresowania ośrodków naukowych opracowaniem wydajnych, roślinnych systemów ekspresji heterologicznych białek o szerokim zastosowaniu. Stanowią alternatywę wobec systemów tradycyjnych wykorzystujących komórki bakteryjne, drożdżowe, owadzie czy ssacze. Techniki identyfikacji, charakteryzowania i izolacji genów oraz skuteczne metody transformacji genetycznej roślin pozwalają na poszerzanie źródeł pozyskiwania produktów białkowych. Duże nadzieje wiąże się z możliwością wykorzystania roślin jako swoistych bioreaktorów do produkcji białek o znaczeniu terapeutycznym. Metoda ma wiele zalet, z których najważniejsze to: możliwość znaczącego obniżenia kosztów produkcji, bezpieczeństwo stosowania otrzymanych produktów, czy tzw. obróbka potranslacyjna białka typowa dla komórek eukariotycznych. Grupą białek budzących największe zainteresowanie są liczne farmaceutyki, a wiele udanych doświadczeń potwierdza możliwość uzyskiwania heterogennych białek o potencjale terapeutycznym. Należą do nich m.in.: przeciwciała monoklonalne, antygeny szczepionkowe czy różne cytokiny. W pracy omówiono wybrane rekombinowane białka należące do trzech wymienionych grup, których ekspresję uzyskano w komórkach roślinnych. Białka te mogą w przyszłości znaleźć zastosowanie w terapii lub prewencji wielu chorób wirusowych, bakteryjnych czy nowotworowych.

Wstęp

Od lat biofarmaceutyki są integralną częścią szeroko rozumianego systemu ochrony zdrowia. Należy do nich bardzo wiele białek, podstawowych związków wykorzystywanych w terapii licznych schorzeń. Ich szczególne cechy czynią je atrakcyjnymi w porównaniu z lekami należącymi do innych grup związków. Białka te są: 1) bardzo swoiste, wykazując złożony mechanizm działania, często niemożliwy do zastąpienia przez inne cząsteczki, 2) rzadko zakłócają naturalne procesy fizjologiczne, wykazując minimalne działania niepożądane, 3) zwykle dobrze tolerowane przez organizm, rzadko indukując niepożądane odpowiedzi układu immunologicznego, 4) w przypadku chorób o podłożu genetycznym, mogą być skutecznym remedium, ograniczając konieczność stosowania terapii genowej, 5) czas potrzebny do wprowadzenia terapeutycznego białka do użycia bywa krótszy w porównaniu do leków innych grup, 6) unikatowość struktury i funkcji białek zapewnia im skuteczną ochronę patentową, istotną m.in. ze względów ekonomicznych [41].

Wraz z  intensywnym rozwojem nowych technologii (w tym inżynierii genetycznej) pula bardziej skutecznych i mniej szkodliwych terapeutyków stale się poszerza. Możliwość transferu informacji genetycznej między niespokrewnionymi gatunkami stworzyła szansę ekspresji pożądanego białka poza organizmem naturalnego gospodarza, co dało alternatywę wobec produkcji terapeutyków uzyskiwanych tradycyjnymi metodami [50]. Obecnie stosunkowo niewiele białek terapeutycznych jest pozyskiwanych ze źródeł naturalnych. Zaawansowane technologie rekombinowanego DNA pozwalają optymalizować wytwarzanie białek w tak różnych systemach ekspresyjnych jak: komórki bakteryjne [88], drożdżowe [82], owadzie [12], ssacze [29]. Oprócz wymienionych, duże zainteresowanie budzą sposoby produkcji biofarmaceutyków w komórkach roślinnych (w tab. 1. zebrano dane nt. wybranych aspektów produkcji heterologicznych białek w różnych systemach ekspresyjnych).

O atrakcyjności roślin jako potencjalnych miejsc syntezy rekombinowanych białek decydują: 1) szczególne możliwości biosyntezy związków organicznych (fotosynteza) umożliwiające szybki przyrost biomasy oraz akumulacji białek przy stosunkowo niskich nakładach finansowych, 2) możliwość prowadzenia potranslacyjnych modyfikacji białek, istotnych w przypadku pozyskiwania aktywnych białek organizmów eukariotycznych, 3) możliwość zastosowania różnych skali i układów (kultury zawiesinowe, hodowla in vitro, uprawa polowa), 4) brak ryzyka przenoszenia ludzkich czy zwierzęcych patogenów, co podnosi bezpieczeństwo produktu, 5) obniżenie kosztów związanych z koniecznością zastosowania wyspecjalizowanych metod oczyszczania finalnego produktu, 6) możliwość wyboru komórek i organów docelowych (nasiona, bulwy, liście), w których produkt jest najbardziej stabilny i występuje w dużych stężeniach, 7) możliwość niemal całkowitej automatyzacji produkcji białek i szybkość uzyskania białka z biomasy (kilka tygodni), co jest niezwykle istotne w warunkach zwiększonego zapotrzebowania na biofarmaceutyki (np. okres pandemii) [85].

Przeciwciała monoklonalne

Jednym z terapeutyków uzyskiwanych z powodzeniem w systemach roślinnych są przeciwciała. To immunoglobuliny wytwarzane przez limfocyty B (komórki plazmatyczne), będące częścią systemu odpornościowego kręgowców. Wykazują zdolność rozpoznawania epitopów antygenów oraz ich skutecznej neutralizacji. Przeciwciała monoklonalne (mAb) są identycznymi kopiami cząsteczek immunoglobulin, mającymi tę samą strukturę i identyczną swoistość wobec danego epitopu. Znajdują szerokie zastosowanie w diagnostyce i leczeniu chorób zakaźnych czy nowotworowych. Pierwszy lek oparty na przeciwciałach monoklonalnych dopuszczono do stosowania przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków w 1986 r. Muromonab jest mysim przeciwciałem monoklonalnym klasy IgG, swoistym dla antygenu DC3 limfocytów T, stosowanym w przeszłości w terapii immunosupresyjnej u pacjentów z reakcją odrzutu przeszczepu. Od tego czasu na rynku farmaceutycznym pojawiła się szeroka gama produktów, rutynowo stosowanych w terapii wielu schorzeń. Przeciwciała są drugą po szczepionkach grupą terapeutyków produkowaną na dużą skalę, co dodatkowo uzasadnia prowadzenie zaawansowanych badań [11]. Zalety roślinnych systemów ekspresyjnych, otwierają możliwości wydajnego źródła ich pozyskiwania. W 1989 r. pojawiło się pierwsze doniesienie o udanej transformacji genetycznej N. tabacum. Wprowadzony do tytoniu DNA, kodował łańcuchy gamma i kappa immunoglobulin. W transgenicznej roślinie uzyskano pożądany wynik w postaci jednoczesnej ekspresji obu wymienionych peptydów. Funkcjonalne przeciwciało, występują- ce w wysokim stężeniu (do 1,3% TSP, tj. całkowitej puli białek rozpuszczalnych), wykazywało wszystkie cechy analogicznych przeciwciał, pochodzących z mysich komórek hybrydoma [31]. Powyższe doświadczenie uchodzi za znaczące osiągnięcie współczesnej biotechnologii, potwierdza nowe możliwości pozyskiwania przeciwciał monoklonalnych w alternatywnych do tradycyjnie stosowanych układach ekspresyjnych.

Przeciwciała monoklonalne wytwarzane w  roślinach (plantibodies), można uzyskiwać w  wyniku ekspresji stabilnej lub przejściowej, w gatunkach jedno- lub dwuliściennych, także w kulturach zawiesinowych komórek roślinnych. Ważnym osiągnięciem było opracowanie metody magnifekcji wykorzystującej infiltrację próżniową Agrobacterium, jako systemu wprowadzania do komórek roślinnych replikonów wirusa roślinnego [21]. Jej walorem jest wysoki poziom ekspresji pożądanego białka w bardzo krótkim czasie [32].

Wśród wielu medycznych zastosowań przeciwciał otrzymywanych w roślinach, wyjątkowo obiecująca wydaje się możliwość ich użycia do celów biernej immunizacji. Obecnie, możliwe jest wytwarzanie przeciwciał, które mogą być stosowane w prewencji i terapii chorób wirusowych czy bakteryjnych. Nakanishi i wsp. opisują ekspresję dimerycznych, hybrydowych przeciwciał IgG/IgA, wykazujących zdolność neutralizacji toksyny Shiga 1 (Stx-1) wytwarzanej przez enterokrwotoczne szczepy E. coli (EHEC) i będącej powodem krwotocznego zapalenia okrężnicy oraz zespołu hemolityczno-mocznicowego (odpowiednio HC, HUS) [56]. Infekcje enterokrwotocznymi szczepami E. coli wraz z zakażeniami Shigella dysenteriae występują prawie u 150 mln osób rocznie będąc przyczyną około 3 mln zgonów, stąd opracowanie skutecznej ochrony wydaje się niezwykle istotne [56]. Zakażenia takie są szczególnie niebezpieczne u dzieci poniżej 10 roku życia oraz u osób w wieku podeszłym, ze względu na największe prawdopodobieństwo wystąpienia HUS, prowadzącego do ostrej niewydolności nerek, anemii oraz małopłytkowości [47]. W pracy wykazano ekspresję hybrydowych przeciwciał w transgenicznych roślinach A. thaliana, przy zachowaniu biologicznej aktywności immunoglobulin do neutralizacji holotoksyny Stx1 in vitro. Dowodzi to możliwości generowania transgenicznych gatunków jadalnych roślin w celu ochrony przed zatruciami pokarmowymi wywoływanymi przez tę toksynę.

Przykładem możliwości neutralizacji toksycznego działania związków występujących w otoczeniu człowieka są wyniki badań O’Hary i wsp. [57]. Potwierdzają one możliwość produkcji w tytoniu (N. benthamiana) chimerycznych pochodnych przeciwciał przeciwrycynowych GD12 (cGD12), których regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich połączono ze strukturą ludzkich przeciwciał klasy IgG1 . Wykazano jednocześnie potencjał tych białek w neutralizacji toksyny w warunkach in vitro oraz in vivo. Rezultaty badań potwierdzają zalety roślinnego systemu wytwarzania przeciwciał i otwierają możliwość wykorzystania takich białek przeciwko zatruciom toksyną.

Rycyna to niebezpieczne dimeryczne białko wydzielane przez rącznika pospolitego (R. communis L.). Po przedostaniu się do ustroju (zakwalifikowane do kategorii B w skali zagrożeń bioterrorystycznych przez CDC – Centrum Zwalczania i Zapobiegania Chorobom), może doprowadzić do śmierci, co uzasadnia prace nad modelami profilaktyki i terapii chorych poddanych intoksykacji tym białkiem. Również groźne neurotoksyny botulinowe, wytwarzane przez liczne serotypy Clostridium botulinum mogą być neutralizowane w podobny sposób, tj. dzięki produktom uzyskiwanym w transgenicznych roślinach [2]. Omawiany system umożliwia wydajną ekspresję jednołańcuchowych fragmentów zmiennych scFV C25 zdolnych w warunkach in vitro do neutralizowania toksyny BoNT/A.

Oprócz prac opisujących uzyskanie przeciwciał o właściwościach neutralizujących szkodliwe dla zdrowia toksyny, obszarem o dużym potencjale aplikacyjnym jest uzyskiwanie „roślinnych” przeciwciał antywirusowych. HIV jest wirusem, który zakaża na świecie około 2 mln ludzi rocznie i mimo intensywnych działań nad powstrzymaniem jego transmisji, skuteczność metod jest niewielka, co stawia go na czele listy najgroźniejszych patogenów (głównie w krajach rozwijających się). Zapotrzebowanie na szeroko dostępne, bezpieczne i tanie metody profilaktyki przedekspozycyjnej jest więc bardzo duże. Skutecznym czynnikiem profilaktycznym okazały się monoklonalne przeciwciała o szerokim zakresie neutralizacji przeciwko wirusowi HIV-1 (bnMAb VRC01p). Możliwości ich pozyskania oparte o wykorzystanie N. benthamiana przedstawia Hamorsky i wsp. [27]. Potwierdzono ich efektywną ekspresję w czasie kilku dni, przy zachowaniu neutralizujących właściwości wobec wirusa. Otrzymane immunoglobuliny wykazywały też synergiczne, przeciwwirusowe właściwości m.in. z lektyną GRFT, co stwarza możliwości opracowania kombinowanej terapii przeciwko epidemii wirusa HIV-1. Rosenberg i wsp. również przedstawili metodę szybkiego otrzymywania w tytoniu 6 przeciwciał monoklonalnych (b12, 2G12, 2F5, 4E10, m43, VRC01) neutralizujących wirusa HIV [65].

Przeciwwirusową aktywność przeciwciał pozyskanych z roślin opisano też względem rotawirusów. Zakażenia nimi są poważnym problemem ze względu na możliwość ciężkiego przebiegu choroby w postaci martwiczego lub krwotocznego zapalenia jelit, trzustki, mózgu i móżdżku czy kamicy układu moczowego prowadzącej do niewydolności nerek [48]. W nasionach transgenicznego ryżu doprowadzono do ekspresji fragmentów przeciwciał (MucoRice-ARP1), wykazujących zdolność neutralizacji rotawirusów [78]. Co ważne, białka te zachowują swoją aktywność nawet po rocznym okresie przechowywania oraz obróbce termicznej (94oC/30’). Doświadczenia te mogą być przykładem nowego podejścia w leczeniu schorzeń wywołanych tymi wirusami, szczególnie w sytuacjach przeciwskazań do podawania szczepionek. Opracowana technologia może się okazać przydatna do wytwarzania przeciwciał przeciw innym patogenom lub schorzeniom jelitowym innego pochodzenia. Poza wspomnianymi przykładami, istnieją też liczne doniesienia na temat przeciwciał przeciwko takim patogenom jak wirus wścieklizny [20,43], wirus Zachodniego Nilu [30,40] czy Ebola [59].

W opisywaną problematykę wpisują się też badania nad czynnikami terapeutycznymi w chorobach nowotworowych. I tak, w liściach N. tabacum uzyskano nimotuzumab – nieglikozykowane przeciwciała blokujące receptory epidermalnego czynnika wzrostu komórki [63]. Wykazano, że modyfikowane przeciwciała wykazują farmakokinetykę i biodystrybucję porównywalną z odpowiednikami pochodzącymi z komórek ssaków. Nimotuzumab dopuszczono do stosowania w wielu krajach azjatyckich (Tajlandia, Birma, Kambodża, Indonezja, Filipiny) w terapii wysoce złośliwego glejaka oraz w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi. Opisano też ekspresję trastuzumabu, rekombinowanego, humanizowanego przeciwciała monoklonalnego klasy Ig1, które wybiórczo łączy się z receptorem naskórkowego czynnika wzrostu typu 2 (HER2) [37]. Przeciwciała te wykorzystano w leczeniu raka piersi z nadekspresją receptorowego białka HER2 lub amplifikacją genu HER2. Uzyskany trastuzumab pochodzący z roślin (PMT) wykazywał spowalnianie wzrostu komórek ludzkiego raka jajnika SKOV3 Her2+ [38].

Szczepionki

Choroby zakaźne pozostają ogromnym problem dzisiejszego świata. Każdego roku prawie jedna trzecia wszystkich zgonów jest spowodowana przez różnorodne czynniki zakaźne. Szacuje się, że ponad 15 z 57 milionów zgonów rocznie ma bezpośrednie powiązanie z chorobami zakaźnymi [54]. Szczepienia, zapewniając masową profilaktykę, ciągle pozostają jednym z bardziej skutecznych działań w zakresie ochrony zdrowia. Dzięki nim wyeliminowano lub znacznie ograniczono wpływ licznych chorób zakaźnych, znacząco zwiększyło to długość życia i poprawiło jego jakość. Jednocześnie jednak koszty szczepień nadal pozostają wysokie, co jest szczególnie dotkliwe w społeczeństwach krajów rozwijających się. Potrzeba uproszczenia dotychczasowych procedur uzyskiwania szczepionek i związana z tym szansa obniżenia rosnących kosztów produkcji skłoniły badaczy do poszukiwań alternatywnych strategii wobec metod tradycyjnych [86]. Dzięki tym potrzebom powstała koncepcja wykorzystania do tego celu roślin.

Z perspektywy minionych lat wydaje się, że uzyskiwanie szczepionek tym sposobem jest jedną z bardziej spektakularnych możliwości wykorzystania roślin do produkcji rekombinowanych białek. Poza wymienionymi wcześniej czynnikami preferującymi systemy roślinne, w przypadku szczepionek pochodzenia roślinnego, warto wymienić możliwość wykorzystania jadalnych części roślin jako szczepionki doustnej. Istotną rolę odegrać powinna też powszechna dostępność, łatwość transportu i przechowywania takich szczepionek, bez konieczności korzystania z pomocy kwalifikowanego personelu medycznego. Dla milionów ludzi, głównie w ubogich krajach afrykańskich i azjatyckich, gdzie zapotrzebowanie na szczepienia jest największe, mogą stanowić wielką nadzieję [33].

Rośliny mogą pełnić rolę bioreaktorów, a dzięki zastosowaniu technologii inżynierii genetycznej doprowadzić w nich można do profilowanej odpowiedzi immunologicznej. Historia badań nad białkami pochodzenia roślinnego mogącymi pełnić rolę szczepionek (plant-derived vaccine) ma wieloletnią tradycję. Lista takich preparatów uzyskiwanych w laboratoriach jest niezwykle bogata (tab. 3). Obejmuje wiele peptydów wywołujących bezpośrednią odpowiedź immunologiczną, takich jak konwencjonalne szczepionki bądź zwiększające immunogenność po właściwym szczepieniu. Liczba gatunków, w których podjęto próby wytwarzania takich białek jest znacząca (m.in. pomidor, ziemniak, banan, marchew, sałata, ryż), a pozycję lidera zajmuje tytoń, modelowa roślina w tym profilu badań. Nie wszystkie gatunki okazały się odpowiednie do produkcji szczepionek. Na podstawie zdobytych doświadczeń uzasadnione nadzieje budzą np. sałata czy marchew, które można spożywać na surowo (wykorzystane np. do wytwarzania antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B, dopuszczonego do badań przedklinicznych). Udane próby przeprowadzono na ryżu, którego zaletą, poza powszechną obecnością w diecie milionów ludzi, jest też gromadzenie rekombinowanego białka w nasionach i możliwości umiejscowienia rekombinowanego białka w nasionach, co ze względu na małą aktywność proteaz zapewnia im doskonałe warunki przechowywania [33]. Właśnie w ryżu z powodzeniem wyprodukowano kilka antygenów w tym m.in. białko otoczki wirusa zapalenia mózgu (VEP), które użyte jako szczepionki dawały wyższy poziom immunoglobulin IgG i IgA, niż odpowiedź na tradycyjne, rekombinowane białko pochodzące z E. coli [84].

Szczepionki w postaci podjednostek rozmaitych białek pełniących rolę antygenów czy ich epitopów mogą wywoływać kompleksową reakcję organizmu w postaci zarówno tzw. odpowiedzi miejscowej (generują przeciwciała IgA w błonach śluzowych), jak i systemicznej, tj. wytwarzanie przeciwciał głównie klasy IgG we krwi. Odnotowano, że w przypadku szczepionki przeciwko wirusowi polio, dochodzi dodatkowo do indukcji reakcji cytotoksycznej limfocytów skierowanych do zwalczania komórek zakażonych wirusem. Różnorodność patogenów, przeciwko którym mogą być wykorzystywane szczepionki pochodzenia roślinnego jest bardzo duża i obejmuje choroby pochodzenia bakteryjnego, wirusowego czy te wywoływane przez pierwotniaki. Uzasadnione nadzieje budzą też w terapii nowotworowej czy cukrzycy (szacuje się, że około 15% raka żołądka, wątroby czy szyjki macicy powodują zakaźne mikroorganizmy), a także w indywidualizacji terapii [1].

W pracach nad omawianymi białkami stosunkowo długo poważnym ograniczeniem był niski poziom ich ekspresji w systemach roślinnych (nie przekraczał granicy 0,1- 0,2% TSP). Oparte były głównie na genomach jądrowych [28,35,51]. Zdobywane doświadczenia pozwoliły na pokonanie tej bariery i obecnie wiele białek jest wytwarzanych ze znacznie lepszą wydajnością sięgającą kilku-kilkunastu procent TSP. Przykładami są m.in. błonowe antygeny przeciw cholerze i malarii czy podjednostka proinsuliny ludzkiej (białka fuzyjne odpowiednio: CTB:ama-1, CTB-msp-1 i CTB:Pins) [14,66]. Korzystne działanie osiągnięto wieloma sposobami, m.in. przez dobór odpowiednich promotorów, konkretnego osobnika czy organu. Jednak główną rolę odegrało wykorzystanie chloroplastów jako miejsca docelowej ekspresji białek. Transplastomiczne podejście wydaje się obiecującą strategią, pozwala bowiem na uzyskanie bardzo dużej wydajności (> 10% TSP) [10]. Plastydy nie są oczywiście systemem idealnym (nie zachodzi tu np. tzw. potranslacyjna obróbka białek złożonych nadająca części z nich finalną aktywność biologiczną), niemniej lista oraz różnorodność antygenów uzyskiwanych tym sposobem jest dziś długa. Poza wymienionymi wyżej pozytywne wyniki uzyskano także dla antygenów przeciw pałeczkom dżumy Yersinia pestis [4], antygenów HIV-1 [89], antygenów OspA, OspA-T przeciw boreliozie [23], antygenu Pag przeciw laseczkom wąglika Bacillus anthracis [39] oraz antygenów L1 przeciw wirusowi brodawczaka ludzkiego HPV [18]. W większości przypadków do tego celu wykorzystywano chloroplasty tytoniu, lecz zadowalające wyniki uzyskano także w przypadku sałaty i glonu Chlamydomonas reinhardtii [66,83].

Poszukiwania optymalnych warunków do wysokiej i stabilnej ekspresji omawianych białek nie ograniczały się do wykorzystania genomów jądrowego czy chloroplastowego. Podejmowano próby transformacji trwałej (stable transformation) wykorzystującej zwykle mechanizm agroinfekcji bądź transformacji przejściowej (transient transformation) infekując rośliny rekombinowanymi wirusami czy szczepami A.tumefaciens (jej modyfikacją jest wydajna magnifekcja) [22]. Jedną z zalet drugiego z wymienionych modeli okazał się krótki czas niezbędny do uzyskania wyników, czyli ekspresji antygenów (kilka-kilkanaście dni wobec kilkunastu miesięcy w przypadku transformacji trwałej) [9].

Ciekawym nurtem, a jednocześnie nowym etapem w rozwoju szczepionek roślinnych stała się możliwość konstrukcji i wykorzystania chimerycznych białek. Tym sposobem uzyskiwano skuteczne szczepionki o podwójnym działaniu, jak np. przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B i zespołowi nabytego niedoboru odporności (AIDS). Shchelkunov i wsp. opisali wytwarzanie w pomidorze fuzyjnego peptydu HBS-TBI zawierającego powierzchniowe białko wirusa zapalenia wątroby typu B (HBS) i epitopy env i gag ludzkiego wirusa niedoboru odporności (TBI), a podawanie myszom pokarmu z suszonymi pomidorami zawierającymi to białko wywołało u nich wyraźną odpowiedź immunologiczną, zarówno w surowicy jak i w błonie śluzowej [71]. Jako rodzaj platformy fuzyjnej stosowano też model VLP (virus-like particles) oparty o wykorzystanie cząsteczek wirusopodobnych. Strategię wykorzystywano w produkcji heterologicznych antygenów jako szczepionki przeciw HIV. Spektakularnym przykładem jest peptyd zawierający osiem epitopów białek gag i pol z HIV-1 tworzących fuzję z białkiem powierzchniowym wirusa HBV w celu wytworzenia HIV-1-HBV VLP. Zadawalający poziom ekspresji takiego zrekombinowanego białka uzyskano w N. tabacum i A.thaliana [25].

Zainteresowanie badaczy tym kierunkiem badań jest duże i stale rośnie, a przykładami szczepionek pochodzenia roślinnego, które pomyślnie przeszły etap badań klinicznych są dziś m.in.: antygen powierzchniowy HbsAg wirusa zapalenia wątroby typu B, podjednostka B termolabilnej enterotoksyny z E.coli wywołująca biegunkę, glikoproteina wirusa wścieklizny czy jednołańcuchowy peptyd Fv przeciw chłoniakowi nieziarniczemu (NHL) [87].

Cytokiny

Cytokiny to największa i najbardziej heterogenna grupa omawianych białek. Tworzą ją rozpuszczalne, niewielkie glikoproteiny będące składnikiem układu odpornościowego człowieka. Wytwarzane są głównie w leukocytach, lecz ich obecność potwierdzono także w fibroblastach i komórkach śródbłonka [76]. Kontrolują tak ważne procesy jak m.in. odporność wrodzoną i nabytą, procesy hematopoetyczne czy zapalne. Cytokiny oddziałują zarówno na komórki, które je wydzielają oraz te znajdujące się w bezpośrednim ich sąsiedztwie, jak również na komórki innych narządów (działanie autokrynowe, parakrynowe i endokrynowe). Mogą być wydzielane zarówno podczas odpowiedzi immunologicznej organizmu, jak i podczas zdarzeń nieimmunologicznych. Związki tej grupy łączą trzy podstawowe cechy: plejotropia, tj. zdolność do oddziaływania na różne typy komórek, redundancja – wywoływanie tego samego skutku przez różne typy cytokin oraz „multifunkcjonalność” tj. możliwość regulowania różnych funkcji immunologicznych przez tę samą cytokinę [76]. Działają za pośrednictwem receptorów, których zewnątrzkomórkowe domeny, odpowiadają za swoistość wiązanych przez nie ligandów i regulują przekaz sygnału już po związaniu się z odpowiednią cytokiną.

Wcześniejsze opracowania, uwzględniając rodzaj komórek wydzielających cytokiny dzieliły je na: limfokiny (wydzielane przez limfocyty) i monokiny (makrofagi i monocyty). Nowsze podziały, uwzględniają funkcje pełnione przez grupy cytokin i wyróżniają wśród nich: interleukiny, chemokiny, interferon, czynniki hematopoetyczne oraz czynniki martwicy nowotworów (ryc.1) [76].

Rezultaty licznych badań potwierdziły skuteczność cytokin w leczeniu raka, chorób autoimmunologicznych czy podczas infekcji [79]. Pozytywne wyniki testów klinicznych sprawiły, że wiele tych związków dopuszczono do użycia, a pierwszym z nich był interferon [76]. Inne przykłady cytokin zarejestrowanych jako leki to: Intron A, Imukin oraz Proleukine [24]. Problemami, ograniczającymi szersze ich zastosowanie są wysokie koszty produkcji (w tym oczyszczania), a także to, że większość komercyjnie dostępnych cytokin jest wytwarzana w komórkach E.coli, co pozbawia je istotnego wyniku glikozylacji. Wady tej są pozbawione systemy roślinne. Ponadto, podobnie jak w przypadku innych rekombinowanych białek, rośliny i tu stwarzają nadzieję taniej produkcji, nietoksycznych cytokin [79]. W dalszej części pracy, eksponując rolę systemów roślinnych wykorzystywanych do ekspresji, zaprezentowano przykłady wybranych cytokin, reprezentujących kilka podstawowych grup.

Interleukiny

Klasę tę tworzą liczne rodziny białek zaangażowanych w procesy regulacji odpowiedzi immunologicznej, indukcji proliferacji komórek NK, limfocytów T i B czy stany zapalne i hematopoetyczne [44]. Interleukiny znalazły szerokie zastosowanie w leczeniu takich schorzeń jak: choroba Crohna, zapalenie kości i stawów, astma, łuszczyca, czerniak [24]. Przykładem komercyjnie dostępnych interleukin jest m.in. Oprelvekin (Neumega), będący postacią rekombinowanej ludzkiej IL-11, którą od naturalnej IL-11 różni brak wspomnianej glikozylacji. Jednym z  pierwszych białek tej klasy wytwarzanych w systemach roślinnych były IL-2 i IL-4. Ich ekspresję uzyskano w 1998 r. w kulturze zawiesinowej tytoniu, niestety jej wydajność była niezadowalająca (0,10 i 0,18 μg/ ml) [49]. Obecna skuteczność jest znacząco lepsza. Przykładem jest nadmierne wytwarzanie IL-10 z wykorzystaniem wektora z promotorem gluteinowym i jej gromadzenie w ziarniakach ryżu. Opisaną interleukinę, w postaci niekowalencyjnych dimerów, cechowała 10-krotnie większa aktywność niż komercyjne preparaty otrzymywane z E. coli. Zaletą „roślinnej” IL-10 było też znikome zanieczyszczenie endotoksynami, co stwarza szerokie możliwości klinicznego jej stosowania [19].

Czynniki hematopoetyczne

Erytropoetyna, hormon wytwarzany w nerkach, który znacząco wpływa na tworzenie czerwonych krwinek, jest stosowany podczas leczenia anemii oraz chorób nerek. Najnowsze badania wykazały, że systematyczne podawanie wysokich dawek hormonu zwiększa też regenerację wątroby [26] oraz wpływa na regenerację kości związaną z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi [55]. Prace Matsumoto i wsp. zapoczątkowały rozwój badań nad otrzymywaniem ludzkiej erytropoetyny w systemach roślinnych [52]. Ekspresję tego białka uzyskano m.in. w komórkach tytoniu (N. benthamiana) transformowanych A.tumefaciens, gdzie jednoczesna koekspresja ludzkich genów odpowiedzialnych za przyłączenie grupy sialowej, pozwoliła zwiększyć stabilność rekombinowanej erytropoetyny (rhEPO). Uzyskany produkt stanowił około 2% wszystkich rozpuszczalnych białek, podczas gdy we wcześniejszych pracach wydajność była stokrotnie niższa [36].

Ciekawy przykład zwiększania ekspresji białek w systemie roślinnym opisano na podstawie wytwarzania czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF). Początkowo był produkowany w komórkach zawiesinowych tytoniu transformowanych z użyciem wektora pod kontrolą promotora CaMV 35S. Maksymalne stężenie GM-CSF jakie uzyskiwano sięgało 0,5% wydzielonych białek [34]. Dodanie do podłoża polimerów stabilizujących (głównie żelatynę) zapobiegających skutkom degradacji GM-CSF, doprowadziło do niemal 3-krotnego wzrostu poziomu ekspresji tego białka [42]. Najlepsze rezultaty uzyskano w kulturach zawiesinowych ryżu (aż 25% wszystkich wydzielanych białek), stosując transformację z użyciem wektora pod kontrolą amylazowego promotora 3D [72].

Interferony

Interferony α, β, γ zależnie od typu, są wydzielane odpowiednio przez monocyty, fibroblasty i limfocyty T, co stanowi odpowiedź na infekcje wirusowe. Zakres ich aktywności obejmuje hamowanie proliferacji komórek, regulowanie wytwarzania przeciwciał przez limfocyty B oraz wzmaganie fagocytozy. Jako terapeutyki są często stosowane w leczeniu chorób nowotworowych nerki, pęcherza, jajnika oraz podczas leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu B osób zakażonych wirusem HPV.

W początkach lat 90 XX w. podjęto próby uzyskania ekspresji interferonu w komórkach roślinnych. Sukcesem było otrzymanie IFN-α po transformacji protoplastów ryżu metodą lipofekcji [91]. Wykazano jednocześnie, że transformacja chloroplastów może wywołać bardzo wysoką ekspresją interferonu, co potwierdzono na przykładzie tytoniu wytwarzającego IFN-α2b na poziomie 20% wszystkich rozpuszczalnych białek (hodowlę prowadzono też w warunkach polowych). Aktywność uzyskanego interferonu była porównywalna do komercyjnie dostępnego preparatu PEG-Intron™. Chronił on komórki przed replikacją wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej oraz hamował wczesne fazy infekcji wirusa HIV [3]. Wielokrotnie otrzymywano ekspresję interferonu w różnych gatunkach roślin m.in.: w marchwi (Daucus carota), w kapuście rzepaku (Brassica napus), a także w aloesie (Aloe vera) [45,46,69].

Czynnik martwicy nowotworów

TNF, czynnik martwicy nowotworów jest wytwarzany głównie przez monocyty i makrofagi. Stymuluje cytotoksyczność i proliferację komórek NK, pobudza wydzielanie wielu innych cytokin i ma działanie antynowotworowe, a wraz z IL-2, zwiększa cytotoksyczność monocytów i makrofagów. Literatura naukowa poruszająca problem ekspresji TNF w systemach roślinnych nie jest tak bogata jak w przypadku wcześniej omawianych cytokin, niemniej, udaną próbę opisano w ziemniaku (Solanum tuberosum) transformowanego dwoma różnymi konstruktami. Pierwszy, zawierał m.in. promotor CaMV 35S oraz wzmacniacz translacji TMV Ω, drugi był dodatkowo wzbogacony na końcu 5’o sekwencję nukleotydową z genu kodującego leguminę oraz sekwencję SEKDEL na końcu 3’. Działania miały na celu zwiększenie stabilności produktu w komórkach roślinnych, uzyskane wyniki nie były jednak zadowalające. Poziom ekspresji TNF-α otrzymany w ziemniaku wydaje się jednak wystarczający do wykorzystania takiego systemu do zastosowań klinicznych [58].

Przytoczone przykłady uzyskania ekspresji różnych cytokin w systemach roślinnych budzą uzasadnione nadzieje badaczy. Podobnie jak w przypadku innych omawianych białek, również tutaj istnieje pełna świadomość wyzwań i problemów, które nie zostały do tej pory skutecznie rozwiązane. Wymienić należy problem stabilnej i dobrej wydajności wytwarzania, aktywności białek czy doboru odpowiedniego i taniego sposobu oczyszczania produktu finalnego. Poważną przeszkodą wydają się także problemy natury prawnej [73], co najpełniej znajduje odbicie w tym, że żadna z cytokin nie została zaakceptowana przez FDA w latach 2008-2011 [74].

Podsumowanie

Z organizmami GM, których genom zostaje zmieniony w celu uzyskania nowych właściwości, wiąże się zarówno wielkie nadzieje (zwłaszcza w biologii i medycynie), jak i obawy, zwłaszcza dotyczące niekorzystnych skutków dla rolnictwa i środowiska.

Niekwestionowane zalety roślin, jako potencjalnych producentów różnorodnych białek o charakterze terapeutycznym, potwierdzone mnogością udanych eksperymentów, kontrastują obecnie z liczbą tych, które przeszły z powodzeniem etap badań klinicznych. Jednoznaczne zdefiniowanie przyczyn nie jest łatwe, wydaje się, że większe koncerny farmaceutyczne są zainteresowane raczej produktami przeznaczonymi dla zwierząt [7]. Produkcja rekombinowanych białek w roślinach/komórkach roślinnych jest tania, w związku z tym ewentualne dochody mogą się okazać zbyt niskie, żeby były opłacalne dla dużych firm biotechnologicznych.

Istotnym czynnikiem tłumaczącym limitowane wykorzystanie roślin GM jest, niezwykle złożona, ścieżka legislacyjna. Podstawowe znaczenie mają normy mię- dzynarodowe, a najważniejszymi aktami prawa związanymi z GMO są Konwencja z Rio de Janeiro z 1992 r. (do polskiego porządku prawnego wprowadzona 10 lat później) oraz dołączony do niej Protokół z Kartageny. Są podstawą wielu aktów prawnych wydanych przez Polskę i Unię Europejską. Każdego roku akty te wzbogacane są w nowe dyrektywy i rozporządzenia. Wśród nich wymienia się m.in. Rozporządzenie 726/2004/WE ustanawiające wspólnotowe procedury wydawania pozwoleń dla produktów leczniczych stosowanych u ludzi i nadzoru nad nimi. Inne akty to Dyrektywa 98/44/WE w sprawie ochrony prawnej wynalazków biotechnologicznych czy Dyrektywa 2001/83/EC dotycząca rekombinowanych białek uzyskiwanych z transgenicznych roślin w Europie i podlegające wytycznym Europejskiej Agencji Leków. Produkcję biofarmaceutyków w  ca- łych roślinach lub w systemach komórek roślinnych (uprawy zamknięte) reguluje Dyrektywa 2009/41EC. Przygotowywanie wspomnianych dokumentów zajęło kilkanaście lat z powodu wielu wątpliwości o charakterze politycznym, prawnym, ekonomicznym i etycznym związanymi z patentowaniem wynalazków biotechnologicznych.

Substancje o właściwościach leczniczych składające się z GMO lub je zawierające muszą przejść procedury dopuszczania ich na rynek, podobnie jak leki niezawierające GMO. Przed dopuszczeniem do obrotu środków leczniczych, należy uzyskać zgodę na uwolnienie GMO do środowiska zgodnie z regulacjami części B Dyrektywy 2001/18. Praca dotyczy wykorzystania roślin (komórek roślinnych), jako potencjalnego źródła pozyskiwania białek terapeutycznych i w tym kontekście można mówić o zamkniętym charakterze zastosowania GMO, rozumianym jako każde działanie, które ma na celu modyfikację genetyczną organizmów oraz dokładny tok postępowania, tj. warunki hodowli, przechowywania, transportu. Podczas wszystkich tych procesów muszą być zastosowane specjalne zabezpieczenia w celu zminimalizowania kontaktu GMO z ludźmi i środowiskiem. Oznacza to, że każde doświadczenie przeprowadzane w laboratoriach naukowych, musi być zgłoszone i podlega dalszym procedurom.

W Polsce, podstawowym aktem prawnym normującym sprawy organizmów genetycznie modyfikowanych jest ustawa z 22.06.2001 r. o organizmach genetycznie modyfikowanych (weszła w życie 26.10.2001), która obejmuje m.in. zamknięte użycie organizmów genetycznie zmodyfikowanych. Na podstawie tej ustawy zostały wydane liczne akty wykonawcze. Powyższy opis, w niewielkim stopniu, oddaje skalę złożoności omawianego problemu i wydaje się wielce prawdopodobne, że właśnie to może być ważnym czynnikiem spowalniającym proces pojawienia się wielu opisywanych w artykule substancji jako oferty rynku farmaceutycznego. Niemniej, zebrane różnorodne doświadczenia pozwalają mieć nadzieję, że w nieodległej przyszłości sytuacja ulegnie korzystnej zmianie.

Przypisy

• 1. Ahmad P., Ashraf M., Younis M., Hu X., Kumar A., Arkam N.A.,Al-Qurainy F.: Role of transgenic plants in agriculture and biopharming.Biotechnol. Adv., 2012; 30: 524-540
  Google Scholar
• 2. Almquist K.C., McLean M.D., Niu Y., Byrne G., Olea-Popelka F.C.,Murrant C., Barclay J., Hall J.C.: Expression of an anti-botulinum toxinA neutralizing single-chain Fv recombinant antibody in transgenictobacco. Vaccine, 2006; 24: 2079-2086
  Google Scholar
• 3. Arlen P.A., Falconer R., Cherukumilli S., Cole A., Cole A.M., OishiK.K., Daniell H.: Field production and functional evaluation of chloroplast-derivedinterferon-α2b. Plant Biotechnol. J., 2007; 5: 511-525
  Google Scholar
• 4. Arlen P.A., Singleton M., Adamovicz J.J., Ding Y., Davoodi-SemiromiA., Daniell H.: Effective plague vaccination via oral delivery ofplant cells expressing F1-V antigens in chloroplasts. Infect. Immun.,2008; 76: 3640-3650
  Google Scholar
• 5. Aziz M.A., Singh S., Anand Kumar P., Bhatnagar R.: Expression ofprotective antigen in transgenic plants: a step towards edible vaccineagainst anthrax. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002; 299: 345-351
  Google Scholar
• 6. Bouquin T., Thomsen M., Nielsen L.K., Green T.H., Mundy J., DziegielM.H.: Human anti-rhesus D IgG1 antibody produced in transgenicplants. Transgenic Res., 2002; 11: 115-122
  Google Scholar
• 7. Brodzik R., Glogowska M., Bandurska K., Okulicz M., Deka D., KoK., van der Linden J., Leusen J.H., Pogrebnyak N., Golovkin M., SteplewskiZ., Koprowski H.: Plant-derived anti-Lewis Y mAb exhibitsbiological activities for efficient immunotherapy against humancancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 8804-8809
  Google Scholar
• 8. Brodzik R., Spitsin S., Pogrebnyak N., Bandurska K., PortocarreroC., Andryszak K., Koprowski H., Golovkin M.: Generation of plant-derivedrecombinant DTP subunit vaccine. Vaccine, 2009; 27: 3730-3734
  Google Scholar
• 9. Budzianowski J.: Tytoń – wysokowydajny producent szczepionek.Przegl. Lek., 2010; 67: 1071-1076
  Google Scholar
• 10. Cardi T., Lenzi P., Maliga P.: Chloroplasts as expression platformsfor plant-produced vaccines. Expert Rev. Vaccines, 2010; 9: 893-911
  Google Scholar
• 11. Carter P.J.: Potent antibody therapeutics by design. Nat. Rev.Immunol., 2006; 6: 343-357
  Google Scholar
• 12. Chen H., Shaffer P.L., Huang X., Rose P.E.: Rapid screening ofmembrane protein expression in transiently transfected insect cells.Protein Expr. Purif., 2013; 88: 134-142
  Google Scholar
• 13. Daniell H., Singh N.D., Mason H., Streatfield S.J.: Plant-madevaccine antigens and biopharmaceuticals. Trends Plant Sci., 2009;14: 669-679
  Google Scholar
• 14. Davoodi-Semiromi A., Schreiber M., Nalapalli S., Verma D., SinghN.D., Banks R.K., Chakrabarti D., Daniell H.: Chloroplast-derived vaccineantigens confer dual immunity against cholera and malariaby oral or injectable delivery. Plant Biotechnol. J., 2010; 8: 223-242
  Google Scholar
• 15. De Neve M., De Loose M., Jacobs A., Van Houdt H., Kaluza B., WeidleU., Van Montagu M., Depicker A.: Assembly of an antibody andits derived antibody fragment in Nicotiana and Arabidopsis. TransgenicRes., 1993; 2: 227-237
  Google Scholar
• 16. De Wilde C., De Neve M., De Rycke R., Bruyns A.M., De JaegerG., Van Montagu M., Depicker A., Engler G.: Intact antigen-bindingMAK33 antibody and Fab fragment accumulate in intercellular spacesof Arabidopsis thaliana. Plant Sci., 1996; 114: 233-241
  Google Scholar
• 17. Desai P.N., Shrivastava N., Padh H.: Production of heterologousproteins in plants: strategies for optimal expression. Biotechnol.Adv., 2010; 28: 427-435
  Google Scholar
• 18. Fernandez-San Millan A., Ortigosa S.M., Hervás-Stubbs S., Corral-MartínezP., Seguí-Simarro J.M., Gaétan J., Coursaget P., VeramendiJ.: Human papillomavirus L1 protein expressed in tobaccochloroplasts self-assembles into virus-like particles that are highlyimmunogenic. Plant Biotechnol. J., 2008; 6, 427-441
  Google Scholar
• 19. Fujiwara Y., Aiki Y., Yang L., Takaiwa F., Kosaka A., Tsuji N.M.,Shiraki K., Sekikawa K.: Extraction and purification of human interleukin-10from transgenic rice seeds. Protein Expr. Purif., 2010;72: 125-130
  Google Scholar
• 20. Girard L.S., Fabis M.J., Bastin M., Courtois D., Pétiard V., KoprowskiH.: Expression of a human anti-rabies virus monoclonalantibody in tobacco cell culture. Biochem. Biophys. Res. Commun.,2006; 345: 602-607
  Google Scholar
• 21. Giritch A., Marillonnet S., Engler C., van Eldik G., BottermanJ., Klimyuk V., Gleba Y.: Rapid high-yield expression of full-size IgGantibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 14701-14706
  Google Scholar
• 22. Gleba Y., Klimyuk V., Marillonnet S.: Magnifection – a new platformfor expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine, 2005;23: 2042-2048
  Google Scholar
• 23. Glenz K., Bouchon B., Stehle T., Wallich R., Simon M.M., WarzechaH.: Production of a recombinant bacterial lipoprotein in higherplant chloroplasts. Nat. Biotechnol., 2006; 24: 76-77
  Google Scholar
• 24. Góra-Sochacka A., Radkiewicz P., Napiórkowska B., Sirko A.: Wykorzystaniesystemów roślinnych do produkcji rekombinowanychcytokin. Post. Biochem., 2009; 55: 85-94
  Google Scholar
• 25. Greco R., Michel M., Guetard D., Cervantes-Gonzalez M., PelucchiN., Wain-Hobson S., Sala F., Sala M.: Production of recombinantHIV-1/HBV virus-like particles in Nicotiana tabacum and Arabidopsisthaliana plants for a bivalent plant-based vaccine. Vaccine, 2007;25: 8228-8240
  Google Scholar
• 26. Gul M., Cömert M., Çakmak G.K., Kurtis G., Ugurbas E., Oner M.O.:Effect of erythropoietin on liver regeneration in an experimentalmodel of partial hepatectomy. Int. J. Surg., 2013; 11: 59-63
  Google Scholar
• 27. Hamorsky K.T., Grooms-Williams T.W., Husk A.S., Bennett L.J.,Palmer K.E., Matoba N.: Efficient single tobamoviral vector-basedbioproduction of broadly neutralizing anti-HIV-1 monoclonal antibodyVRC01 in Nicotiana benthamiana plants and utility of VRC01 incombination microbicides. Antimicrob. Agents Chemother., 2013;57: 2076-2086
  Google Scholar
• 28. Haq T.A., Mason H.S., Clements J.D., Arntzen C.J.: Oral immunizationwith a recombinant bacterial antigen produced in transgenicplants. Science, 1995; 268: 714-716
  Google Scholar
• 29. Hassaine G., Deluz C., Tol M.B., Li X.D., Graff A., Vogel H., NuryH.: Large scale expression and purification of the mouse 5-HT3 receptor.Biochim. Biophys. Acta, 2013; 1828: 2544-2552
  Google Scholar
• 30. He J., Lai H., Brock C., Chen Q.: A novel system for rapid andcost-effective production of detection and diagnostic reagents ofWest Nile virus in plants. J. Biomed. Biotechnol., 2012, 2012: 1-10
  Google Scholar
• 31. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K.: Production of antibodies intransgenic plants. Nature, 1989; 342: 76-78
  Google Scholar
• 32. Hiatt A., Pauly M.: Monoclonal antibodies from plants: a newspeed record. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 14645-14646
  Google Scholar
• 33. Horn M.E., Woodard S.L., Howard J.A.: Plant molecular farming:systems and products. Plant Cell Rep., 2004; 22: 711-720
  Google Scholar
• 34. James E.A., Wang C., Wang Z., Reeves R., Shin J.H., MagnusonN.S., Lee J.M.: Production and characterization of biologically activehuman GM-CSF secreted by genetically modified plant cells. ProteinExpr. Purif., 2000; 19: 131-138
  Google Scholar
• 35. Jani D., Meena L.S., Rizwan-ul-Haq Q.M., Singh Y., Sharma A.K.,Tyagi A.K.: Expression of cholera toxin B subunit in transgenic tomatoplants. Transgenic Res., 2002; 11: 447-454
  Google Scholar
• 36. Jez J., Castilho A., Grass J., Vorauer-Uhl K., Sterovsky T., AltmannF., Steinkellner H.: Expression of functionally active sialylated humanerythropoietin in plants. Biotechnol. J., 2013; 8: 371-382
  Google Scholar
• 37. Kolenda P., Litwiniuk M.: Kontynuacja terapii trastuzumabempo operacyjnym leczeniu przerzutu do mózgu – opis przypadku.Wsp. Onkol., 2010; 14: 393-396
  Google Scholar
• 38. Komarova T.V., Kosorukov V.S., Frolova O.Y., Petrunia I.V., SkrypnikK.A., Gleba Y.Y., Dorokhov Y.L.: Plant-made trastuzumab (herceptin)inhibits HER2/Neu+ cell proliferation and retards tumor growth.PLoS One, 2011; 6: e17541
  Google Scholar
• 39. Koya, V., Moayeri M., Leppla S.H., Daniell H.: Plant-based vaccine:mice immunized with chloroplast-derived anthrax protectiveantigen survive anthrax lethal toxin challenge. Infect. Immun.,2005; 73: 8266-8274
  Google Scholar
• 40. Lai H., Engle M., Fuchs A., Keller T., Johnson S., Gorlatov S., DiamondM.S., Chen Q.: Monoclonal antibody produced in plants efficientlytreats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 2010; 107: 2419-2424
  Google Scholar
• 41. Leader B., Baca Q.J., Golan D.E.: Protein therapeutics: a summaryand pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov.,2008; 7: 21-39
  Google Scholar
• 42. Lee J.H., Kim N.S., Kwon T.H., Jang Y.S., Yang M.S.: Increasedproduction of human granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor (hGM-CSF) by the addition of stabilizing polymer in plantsuspension cultures. J. Biotechnol., 2002; 96: 205-211
  Google Scholar
• 43. Lee J.H., Park D.Y., Lee K.J., Kim Y.K., So Y.K., Ryu J.S., Oh S.H., HanY.S., Ko K., Choo Y.K., Park S.J., Brodzik R., Lee K.K., Oh D.B., HwangK.A., Koprowski H., Lee Y.S., Ko K.: Intracellular reprogramming ofexpression, glycosylation, and function of a plant-derived antiviraltherapeutic monoclonal antibody. PLoS One, 2013, 8: e68772
  Google Scholar
• 44. Lewko W.M., Oldham R.K.: Cytokines, W: Principles of CancerBiotherapy, red.: Oldham R.K., Dillman R.O., Springer Netherlands,Nowy Jork, 2009, 155-276
  Google Scholar
• 45. Lowther W., Lorick K., Lawrence S.D., Yeow W.S.: Expression ofbiologically active human interferon alpha 2 in Aloe vera. TransgenicRes., 2012; 21: 1349-1357
  Google Scholar
• 46. Luchakivskaya Y., Kishchenko O., Gerasymenko I., OlevinskayaZ., Simonenko Y., Spivak M., Kuchuk M.: High-level expression ofhuman interferon alpha-2b in transgenic carrot (Daucus carota L.)plants. Plant Cell Rep., 2011; 30: 407-415
  Google Scholar
• 47. Łoś J.M., Węgrzyn G.: Enterokrwotoczne szczepy Escherichiacoli (EHEC) i bakteriofagi kodujące toksyny Shiga. Post. Mikrobiol.,2011; 50: 175-190
  Google Scholar
• 48. Łoś-Rycharska E., Czerwionka-Szaflarska M.: Biegunki rotawirusowe– dlaczego warto im zapobiegać. Prz. Gastroenterol., 2011;6: 60-68
  Google Scholar
• 49. Magnuson N.S., Linzmaier P.M., Reeves R., An G., HayGlass K.,Lee J.M.: Secretion of biologically active human interleukin-2 andinterleukin-4 from genetically modified tobacco cells in suspensionculture. Protein Expr. Purif., 1998; 13: 45-52
  Google Scholar
• 50. Mahmoud K.: Recombinant protein production: strategic technologyand a vital research tool. Res. J. Cell Mol. Biol., 2007; 1: 9-22
  Google Scholar
• 51. Mason H.S., Haq T.A.; Clements J.D.; Arntzen C.J.: Edible vaccineprotects mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoesexpressing a synthetic LT-B gene. Vaccine, 1998; 16: 1336-1343
  Google Scholar
• 52. Matsumoto S., Ishii A., Ikura K., Ueda M., Sasaki R.: Expression ofhuman erythropoietin in cultured tobacco cells. Biosci. Biotechnol.Biochem., 1993; 57: 1249-1252
  Google Scholar
• 53. Matsumura T., Itchoda N., Tsunemitsu H.: Production of immunogenicVP6 protein of bovine group A rotavirus in transgenicpotato plants. Arch. Virol., 2002; 147: 1263-1270
  Google Scholar
• 54. Morens D.M., Folkers G.K., Fauci A.S.: The challenge of emergingand re-emerging infectious diseases. Nature, 2004; 430: 242-249
  Google Scholar
• 55. Nair A.M., Tsai Y.T., Shah K.M., Shen J., Weng H., Zhou J., SunX., Saxena R., Borrelli J.Jr., Tang L.: The effect of erythropoietin onautologous stem cell-mediated bone regeneration. Biomaterials,2013; 34: 7364-7371
  Google Scholar
• 56. Nakanishi K., Narimatsu S., Ichikawa S., Tobisawa Y., KurohaneK., Niwa Y., Kobayashi H., Imai Y.: Production of hybrid-IgG/IgAplantibodies with neutralizing activity against Shiga toxin 1. PLoSOne, 2013; 8: e80712
  Google Scholar
• 57. O’Hara J.M., Whaley K., Pauly M., Zeitlin L., Mantis N.J.: Plant–based expression of a partially humanized neutralizing monoclonalIgG directed against an immunodominant epitope on the ricin toxinA subunit. Vaccine, 2012; 30: 1239-1243
  Google Scholar
• 58. Ohya K., Itchoda N., Ohashi K., Onuma M., Sugimoto C., MatsumuraT.: Expression of biologically active human tumor necrosisfactor-alpha in transgenic potato plant. J. Interferon Cytokine Res.,2002; 22: 371-378
  Google Scholar
• 59. Olinger G.G.Jr., Pettitt J., Kim D., Working C., Bohorov O., BratcherB., Hiatt E., Hume S.D., Johnson A.K., Morton J., Pauly M., WhaleyK.J., Lear C.M., Biggins J.E., Scully C., Hensley L., Zeitlin L.: Delayedtreatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonalantibodies provides protection in rhesus macaques. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 2012; 109: 18030-18035
  Google Scholar
• 60. Oszvald M., Kang T.J., Tomoskozi S., Jenes B., Kim T.G., Cha Y.S.,Tamas L., Yang M.S.: Expression of cholera toxin B subunit in transgenicrice endosperm. Mol. Biotechnol., 2008; 40: 261-268
  Google Scholar
• 61. Pogrebnyak N., Markley K., Smirnov Y., Brodzik R., BandurskaK., Koprowski H., Golovkin M.: Collard and cauliflower as a base forproduction of recombinant antigens. Plant Sci., 2006; 171: 677-685
  Google Scholar
• 62. Ramessar K., Rademacher T., Sack M., Stadlmann J., Platis D.,Stiegler G., Labrou N., Altmann F., Ma J., Stöger E., Capell T., ChristouP.: Cost-effective production of a vaginal protein microbicideto prevent HIV transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008; 105:3727-3732
  Google Scholar
• 63. Rodríguez M., Pujol M., Pérez L., Gavilondo J.V., Garrido G., AyalaM., Pérez M., Bequet-Romero M., Cabrera G., Ramos O., HernándezI., González E.M., Huerta V., Sánchez B., Mateo C. i wsp.: Transgenicplants of Nicotiana tabacum L. express aglycosylated monoclonalantibody with antitumor activity. Biotecnol. Apl., 2013; 30: 157-161
  Google Scholar
• 64. Rosales-Mendoza S., Soria-Guerra R.E., López-Revilla R., Moreno-FierrosL., Alpuche-Solís A.G.: Ingestion of transgenic carrotsexpressing the Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit protectsmice against cholera toxin challenge. Plant Cell Rep., 2008;27: 79-84
  Google Scholar
• 65. Rosenberg Y., Sack M., Montefiori D., Forthal D., Mao L., Hernandez-AbantoS., Urban L., Landucci G., Fischer R., Jiang X.: Rapidhigh-level production of functional HIV broadly neutralizing monoclonal antibodies in transient plant expression systems. PLoSOne, 2013; 8: e58724
  Google Scholar
• 66. Ruhlman T., Ahangari R., Devine A., Samsam M., Daniell H.:Expression of cholera toxin B-proinsulin fusion protein in lettuceand tobacco chloroplasts – oral administration protects against developmentof insulitis in non-obese diabetic mice. Plant Biotechnol.J., 2007; 5: 495-510
  Google Scholar
• 67. Rybicki E.P.: Plant-made vaccines for humans and animals. PlantBiotechnol. J., 2010; 8: 620-637
  Google Scholar
• 68. Sack M., Paetz A., Kunert R., Bomble M., Hesse F., Stiegler G.,Fischer R., Katinger H., Stoeger E., Rademacher T.: Functional analysisof the broadly neutralizing human anti-HIV-1 antibody 2F5produced in transgenic BY-2 suspension cultures. FASEB J., 2007;21: 1655-1664
  Google Scholar
• 69. Sakhno L.O., Krasko O.Y., Olevinska Z.M., Spivak M.Y., KuchukM.V.: Creation of transgenic Brassica napus L. plants expressing humanalpha 2b interferon gene. Tsitol. Genet., 2012; 46: 12-18
  Google Scholar
• 70. Sharp J.M., Doran P.M.: Effect of bacitracin on growth and monoclonalantibody production by tobacco hairy roots and cell suspensions.Biotechnol. Bioprocess Eng., 1999; 4: 253-258
  Google Scholar
• 71. Shchelkunov S.N., Salyaev R.K., Pozdnyakov S.G., RekoslavskayaN..I, Nesterov A.E., Ryzhova T.S., Sumtsova V.M., PakovaN.V., Mishutina U.O., Kopytina T.V., Hammond R.W.: Immunogenicityof a novel, bivalent, plant-based oral vaccine against hepatitisB and human immunodeficiency viruses. Biotechnol. Lett.,2006; 28: 959-967
  Google Scholar
• 72. Shin Y.J., Hong S.Y., Kwon T.H., Jang Y.S., Yang M.S.: High levelof expression of recombinant human granulocyte-macrophage colonystimulating factor in transgenic rice cell suspension culture.Biotechnol. Bioeng., 2003; 82: 778-783
  Google Scholar
• 73. Sirko A., Vaněk T., Góra-Sochacka A., Radkiewicz P.: Recombinantcytokines from plants. Int. J. Mol. Sci., 2011; 12: 3536-3552
  Google Scholar
• 74. Swiech K., Picanço-Castro V., Covas D.T.: Human cells: new platformfor recombinant therapeutic protein production. Protein Expr.Purif., 2012; 84: 147-153
  Google Scholar
• 75. Tackaberry E.S, Dudani A.K.; Prior F., Tocchi M., Sardana R.,Altosaar I., Ganz P.R.: Development of biopharmaceuticals in plantexpression systems: cloning, expression and immunological reactivityof human cytomegalovirus glycoprotein B (UL55) in seeds oftransgenic tobacco. Vaccine, 1999; 17: 3020-3029
  Google Scholar
• 76. Tayal V., Kalra B.S.: Cytokines and anti-cytokines as therapeutics– an update. Eur. J. Pharmacol., 2008; 579: 1-12
  Google Scholar
• 77. Thanavala Y., Mahoney M., Pal S., Scott A., Richter L., NatarajanN., Goodwin P., Arntzen C.J., Mason H.S.: Immunogenicity inhumans of an edible vaccine for hepatitis B. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 2005; 102: 3378-3382
  Google Scholar
• 78. Tokuhara D., Álvarez B., Mejima M., Hiroiwa T., Takahashi Y.,Kurokawa S., Kuroda M., Oyama M., Kozuka-Hata H., Nochi T., SagaraH., Aladin F., Marcotte H., Frenken L.G., Iturriza-Gómara M. i wsp.:Rice-based oral antibody fragment prophylaxis and therapy againstrotavirus infection. J. Clin. Invest., 2013; 123: 3829-3838
  Google Scholar
• 79. Tremblay R., Wang D., Jevnikar A.M., Ma S.: Tobacco, a highlyefficient green bioreactor for production of therapeutic proteins.Biotechnol. Adv., 2010; 28: 214-221
  Google Scholar
• 80. Triguero A., Cabrera G., Cremata J.A., Yuen C.T., Wheeler J.,Ramírez N.I.: Plant-derived mouse IgG monoclonal antibody fusedto KDEL endoplasmic reticulum-retention signal is N-glycosylatedhomogeneously throughout the plant with mostly high-mannose–type N-glycans. Plant Biotechnol. J., 2005; 3: 449-457
  Google Scholar
• 81. Vézina L.P., Faye L., Lerouge P., D’Aoust M.A., Marquet-Blouin E.,Burel C., Lavoie P.O., Bardor M., Gomord V.: Transient co-expressionfor fast and high-yield production of antibodies with human-like N–glycans in plants. Plant Biotechnol. J., 2009; 7: 442-455
  Google Scholar
• 82. Virágh M., Vörös D., Kele Z., Kovács L., Fizil A., Lakatos G., MarótiG., Batta G., Vágvölgyi C., Galgóczy L.: Production of a defensin-likeantifungal protein NFAP from Neosartorya fischeri in Pichia pastorisand its antifungal activity against filamentous fungal isolates fromhuman infections. Protein Expr. Purif., 2014; 94: 79-84
  Google Scholar
• 83. Wang X., Brandsma M., Tremblay R., Maxwell D., Jevnikar A.M.,Huner N., Ma S.: A novel expression platform for the production ofdiabetes-associated autoantigen human glutamic acid decarboxylase(hGAD65). BMC Biotechnol., 2008; 8: 87
  Google Scholar
• 84. Wang Y., Deng H., Zhang X., Xiao H., Jiang Y., Song Y., Fang L.,Xiao S., Zhen Y., Chen H.: Generation and immunogenicity of Japaneseencephalitis virus envelope protein expressed in transgenic rice.Biochem. Biophys. Res. Commun., 2009; 380: 292-297
  Google Scholar
• 85. Wirz H., Sauer-Budge A.F., Briggs J., Sharpe A., Shu S., Sharon A.:Automated production of plant-based vaccines and pharmaceuticals.J. Lab. Autom., 2012; 17: 449-457
  Google Scholar
• 86. Xu K., Evans D.B., Carrin G., Aguilar-Rivera A.M., Musgrove P.,Evans T.: Protecting households from catastrophic health spending.Health Aff., 2007; 26: 972-983
  Google Scholar
• 87. Yusibov V., Streatfield S.J., Kushnir N.: Clinical development ofplant-produced recombinant pharmaceuticals: vaccines, antibodiesand beyond. Hum. Vaccin., 2011; 7: 313-321
  Google Scholar
• 88. Zhang C., Allegretti M., Vonck J., Langer J.D., Marcia M., Peng G.,Michel H.: Production of fully assembled and active Aquifex aeolicus F1FOATP synthase in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 2014; 1840: 34-40
  Google Scholar
• 89. Zhou F., Badillo-Corona J.A., Karcher D., Gonzalez-Rabade N.,Piepenburg K., Borchers A.M., Maloney A.P., Kavanagh T.A., GrayJ.C., Bock R.: High-level expression of human immunodeficiencyvirus antigens from the tobacco and tomato plastid genomes. PlantBiotechnol. J., 2008; 6: 897-913
  Google Scholar
• 90. Zhou Y.X, Lee M.Y., Ng J.M., Chye M.L., Yip W.K., Zee S.Y., LamE.: A truncated hepatitis E virus ORF2 protein expressed in tobaccoplastids is immunogenic in mice. World J. Gastroenterol., 2006;12: 306-312
  Google Scholar
• 91. Zhu Z., Hughes K.W., Huang L., Sun B., Liu C., Li Y., Hou Y., Li X.:Expression of human α-interferon cDNA in transgenic rice plants.Plant Cell Tissue Organ Cult., 1994; 36: 197-204
  Google Scholar

Pełna treść artykułu