Abstrakt

Badania nad zaprogramowaną martwicą dowiodły jej roli w rozwoju i homeostazie organizmu. Fizjologiczna funkcja martwicy warunkuje prawidłowe działanie układu immunologicznego, jest też mechanizmem śmierci komórek o obniżonej gotowości apoptotycznej, w tym komórek nowotworowych. Coraz częściej wskazuje się na jej znaczącą rolę w patogenezie wielu chorób. Podważono pogląd, że martwica jest procesem biernym, patologicznym i niezależnym od genów, jednak wiedza o jej mechanizmach molekularnych jest wciąż niepełna. Przyczyną jest mnogość i złożoność szlaków wyzwalających, brak swoistych markerów identyfikujących komórki umierające w mechanizmie martwicy i nieprecyzyjna nomenklatura. W pracy omówiono stan wiedzy o mechanizmach molekularnych powodujących zaprogramowaną martwicę, a zwłaszcza jej swoistą i częstą odmianę – nekroptozę. Podsumowano rolę kinaz RIP1 i RIP3 w nekroptozie. Zwrócono uwagę na odmienne skutki ligacji czynnika martwicy nowotworu α do jego receptora, TNFR1, tj. przeżycie, apoptozę lub nekroptozę.

Wprowadzenie

Opublikowane niedawno prace nad mechanizmami śmierci komórkowej doprowadziły do zachwiania uznanego paradygmatu, w myśl którego komórka ludzka umiera w procesie apoptozy albo martwicy (nekrozy). Typową apoptozę, nazwaną w piśmiennictwie „kanoniczną”, okre- ślano na podstawie kryteriów morfologicznych, zwłaszcza charakterystycznej fragmentacji materiału genetycznego jądra, czyli kariopyknozy. Z czasem definicję poszerzono o obligatoryjne działanie enzymów grupy kaspaz i czynników rodziny BCL [25,27]. Uznano, że apoptoza jest zawsze zależna od precyzyjnej kontroli mechanizmów genetycznych i obecności energii swobodnej (ATP), podczas gdy martwica (nekroza) jest wyłącznie bierną odmianą śmierci komórkowej, niezależną od działania genów, dostawy energii i czynności kaspaz [2,27]. Ten czytelny dydaktycznie obraz, celnie opisujący odmiany śmierci komórek nicieni i owadów, uległ jednak zakłóceniu, gdy badania prowadzone u gryzoni wykazały, że nawet brak podstawowych genów odpowiedzialnych za apoptozę, nie zaburza procesów śmierci komórkowej [59].

Obecnie wiadomo, że istnieje wiele rodzajów śmierci komórki, odrębnych od apoptozy, nad którymi przejmują kontrolę swoiste mechanizmy genetyczne, a które morfologicznie przypominają martwicę [36]. Nie umniejszając roli tradycyjnie pojmowanej nekrozy – nagłego niezależ- nego od genów działania mechanicznego, termicznego lub chemicznego uszkodzenia komórki – trzeba podkreślić, że częste przypadki śmierci komórkowej o cechach nekrozy również bywają zaprogramowane genetycznie. Jak przedstawiono niżej, uczestniczą one w procesach rozwojowych oraz w patogenezie licznych chorób [10,19,61].

Wśród tych procesów szczególną uwagę zwraca tzw. zaprogramowana martwica, czyli nekroza oraz jej szczególna odmiana – nekroptoza. Mechanizmy nekroptozy, zajmującej pośrednie miejsce między apoptozą i martwicą, są przedmiotem rozważań tej pracy. Podsumowano aktualną wiedzę dotyczącą szlaków molekularnych wyzwalających zaprogramowaną martwicę, omówiono mechanizmy decydujące o aktywacji alternatywnych szlaków śmierci, nekroptozy lub apoptozy bądź o prze- życiu komórki.

Apoptoza kanoniczna

Warto skrótowo omówić podstawowe wiadomości o klasycznej apoptozie, tzw. apoptozie kanonicznej. Dokładniej opisano dwa najlepiej poznane szlaki apoptozy, zewnątrzi wewnątrzpochodny, zwłaszcza że – jak się obecnie uważa – różne ich elementy mogą paradoksalnie uczestniczyć w inicjacji i propagacji nekroptozy.

Definicja apoptozy

Apoptoza, zależna od energii odmiana śmierci komórkowej, wywołuje charakterystyczne zmiany w morfologii komórki. Utrata wody zmniejsza jej objętość i powoduje pofałdowanie powierzchni [44]. Cytoplazma i chromatyna ulegają kondensacji, a DNA – międzynukleosomowej fragmentacji [11,29]. Inną typową cechą procesu jest przemieszczenie się fosfatydyloseryny na zewnętrzną stronę błony komórkowej, przez co traci wyjściową asymetrię. Dochodzi do powstania ciałek apoptotycznych – obłonionych fragmentów komórek zawierających organelle i fragmenty chromatyny [35,45]. Apoptoza nie wyzwala stanu zapalnego, gdyż zawartość umierających komórek nie wydostaje się poza obręb ciałek apoptotycznych, pochłanianych następnie przez makrofagi, fibroblasty i inne sąsiadujące komórki [30,36].

Mechanizmy inicjujące apoptozę

Zgodnie z klasyczną interpretacją apoptozy, zachodzi ona za pośrednictwem jednego z pięciu szlaków sygnalizacyjnych:

a) zewnątrzpochodnego (zależnego od receptorów śmierci),

b) wewnątrzpochodnego (mitochondrialnego),

c) pseudoreceptorowego,

d) sfingomielinowo-ceramidowego lub

e) indukowanego stresem; wybór drogi zależy zwykle od typu komórki [36].

Szlak zewnątrzpochodny (receptorowy) apoptozy

Jest wyzwalany wskutek pobudzenia receptorów śmierci – należących do nadrodziny receptora TNF – przez ich ligandy. Do najlepiej poznanych par receptor/ligand należą: TNFR1/TNF-α, Fas/FasL oraz DR4 (lub DR5)/TRAIL [16]. Wspomniane receptory zawierają domenę zewną- trzkomórkową, swoiście rozpoznającą odpowiedni ligand, a także cytoplazmatyczną, zawierającą tzw. domeny śmierci (death domain, DD). Przyłączenie odpowiedniego ligandu prowadzi do trimeryzacji receptora. Domena śmierci receptora łączy się z homologiczną DD jednego z dwóch białek adaptorowych: FADD (receptora Fas i DR4) lub TRADD (TNFR1); to drugie przekazuje sygnał również do FADD [2,16,33]. Białka adaptorowe zawierają także domenę efektorową śmierci (death effector domain, DED), łącząc się z jej pomocą z homologiczną domeną prokaspazy 8. Trzy składowe: receptor, adaptor i prokaspaza, tworzą kompleks sygnałowy DISC (death inducing signaling complex), w obrębie którego zachodzi autokatalityczna aktywacja kaspazy 8. Uruchomieniu podlega kaskada kaspaz wykonawczych (3 i 7), co wywołuje nieodwracalną śmierć komórki [23,31,60,70].

Szlak wewnątrzpochodny (mitochondrialny) apoptozy

Szlak wewnątrzpochodny jest wyzwalany przez wiele czynników, np. stres oksydacyjny, uszkodzenie DNA, utrata czynników wzrostu lub hipoksja [2]. Powoduje to zwiększenie przepuszczalności błony mitochondrialnej, co określa się jako permeabilizacja zewnętrznej błony mitochondrium (mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP) [5]. Proces kontroluje grupa białek rodziny BCL, wśród których wyróżnia się czynniki proapoptotyczne – BAK oraz BAX (podrodzina BAX), a także antyapoptotyczne – BCL-2 i BCL-xL (podrodzina BCL-2). Pierwsze z nich rozszczelniają zewnętrzną błonę mitochondrium, drugie działają przeciwstawnie. Ich wzajemną równowagę regulują odgórnie białka podrodziny BH3-only, m.in. BIM, BID, BAD oraz PUMA [53]. W wyniku zjawiska MOMP do cytoplazmy zostaje uwolnionych wiele czynników, w tym cytochrom C i APAF-1, które wiążą prokaspazę 9; powstaje kompleks zwany apoptosomem. W jego obrębie zachodzi aktywacja kaspazy 9, co podobnie jak w szlaku receptorowym uruchamia kaskadę kaspaz wykonawczych i śmierć komórki [34,54]. We wczesnej fazie procesu oba zasadnicze szlaki apoptozy, zewnątrz- i wewnątrzpochodny, spaja białko BID. Kaspaza 8 katalizuje wspomniany czynnik, a produkt reakcji, skrócona postać BID (truncated BID, tBID), wzbudza drogę mitochondrialną, gdyż aktywuje czynność BAX i BAK [2,14].

Pojęcie i rola zaprogramowanej martwicy

Klasyczna definicja martwicy (nekrozy

Do niedawna obowiązująca definicja martwicy podkreśla jej niezależny od genów charakter i opisuje ją jako wynik miejscowego uszkodzenia lub działania czynników chemicznych i termicznych, w tym hipoksji, zmiany temperatury, ciśnienia osmotycznego lub pH [22,49]. Nekroza jest niezależna od kaspaz – głównych mediatorów apoptozy i ma dotyczyć na ogół większej grupy komórek, nawet całych tkanek i narządów [27,64]. W jej przebiegu dochodzi do obrzęku organelli komórkowych, onkozy czyli zwiększenia objętości komórki, przerwania ciągłości błony komórkowej i uwolnienia zawartości do otoczenia [46,52,63,67]. Miejscowo rozwija się stan zapalny [32]. Tak rozumiana nekroza jest więc przeciwieństwem kanonicznej apoptozy – zależnej od genów, niewywołującej zapalenia i dotyczącej zwykle pojedynczych komórek [27].

Zaprogramowana martwica (zaprogramowana nekroza)

Klasyczna definicja martwicy przestała ostatecznie obowiązywać odkąd wykazano udział genów w regulacji jej zapoczątkowania i przebiegu. Wydaje się, że genom komórki dąży do możliwie jak najdłuższego sprawowania kontroli nad procesem własnej śmierci, nawet jeśli przebiega pod postacią martwicy. Dobrym przykładem jest aktywny udział w tych procesach enzymów grupy kalpain i katepsyn, a także kinazy RIP1 (receptor (TNFRSF) – interacting serine-threonine kinase 1), cyklofiliny D, czynnika PARP-1 i kojarzonego dotąd wyłącznie z apoptozą białka AIF [18,19]. Udowodniono też, że nawet po zapoczątkowaniu apoptozy, podanie inhibitorów kaspaz przekierowuje ten proces na drogę nekrozy [69]. Badania ostatnich lat zaowocowały więc opisaniem odmiany martwicy, któ- ra jest swoiście regulowana przez program genetyczny. Wyzwala ją m.in. alkilacyjne uszkodzenie DNA, egzocytotoksyny, a także pobudzenie receptorów śmierci przez ich ligandy, zachodzące w określonych warunkach [20].

Obecnie trudno o precyzyjną definicję zjawiska zaprogramowanej martwicy. Wśród przyczyn wymienia się zawiłość, niejednoznaczność i dowolność terminologii stosowanej przez badaczy. Wielu z nich, wraz z rozwojem wiedzy na temat molekularnych mechanizmów śmierci komórki, wprowadziło nowe pojęcia, odzwierciedlające zastosowane modele badawcze i wypływające wnioski. Opisano np. kilka różnych szlaków sygnalizacyjnych regulowanej martwicy, powstały też nowe terminy, takie jak nekroptoza, które to pojęcie wyjaśniono niżej. Nieuzasadnione powielanie terminologii, wprowadzanie nowych oraz jednoczesne używanie starszych, ogólniejszych pojęć, skłoniło Komitet do spraw Nazewnictwa Śmierci Komórkowej (Nomenclature Committe on Cell Death, NCCD) do uporządkowania stosowanej nomenklatury. W wytycznych z 2012 r., Komitet zalecił autorom, aby każdorazowo definiowali opisowo omawiane pojęcia regulowanej martwicy, a zwłaszcza badany mechanizm molekularny [20]. Ma to ułatwić porównanie poszczególnych ścieżek molekularnych regulujących zjawisko zaprogramowanej martwicy. Jednak autorzy często nie stosują się do tych zaleceń.

Pojęcie nekroptozy

Szczególne postaci zaprogramowanej martwicy to: aponekroza i nekroptoza. Pojęcie „aponekroza” wprowadzono w celu opisania procesu o jednoczesnych molekularnych i morfologicznych cechach apoptozy i nekrozy [13]. Nekroptozę zdefiniowano pierwotnie jako proces zachodzący po ligacji TNF-α z jego receptorem (TNFR1), hamowany przez białko o złożonej nazwie: chemiczna nekrostatyna 1 hamują- ca RIP1 (RIP1-targeting chemical necrostatin-1) w obecności inhibitorów kaspaz; jest to więc proces od kaspaz niezależny [8]. Oba pojęcia bywają traktowane jako synonimy: starsze definicje nekroptozy również zwracały uwagę na obecność wspólnych cech apoptozy i martwicy, definiując ją jako mniej lub bardziej zaawansowaną apoptozę, która została przerwana i przeszła w martwicę [27,58]. Jest to notabene zgodne z pierwotną definicją aponekrozy [13].

Niekiedy termin nekroptozy stosuje się wymiennie z zaprogramowaną martwicą. Jest to jednak niezgodne z wytycznymi NCCD, który zaleca, by mianem nekroptozy określać regulowaną nekrozę, zależną od kinaz RIP1 i RIP3, pod warunkiem wyraźnego zasygnalizowania ich ekspresji przy pierwszym użyciu tego terminu [20]. Tę ostatnią definicję uściślono w wyniku dwóch obserwacji: 1) poznana wcze- śniej kinaza RIP1 przekazuje sygnały sprzyjające nekrozie za pośrednictwem interakcji ze swoim homologiem – RIP3; 2) odkryto postaci regulowanej martwicy zależne wyłącznie od RIP3 (a więc bez udziału RIP1) [17]. Obecnie przez nekroptozę uważa się kaskadę zdarzeń molekularnych prowadzącą do martwicy komórki, kontrolowaną przez jej genom i zależną od kinazy RIP3.

Nekroptoza jest szczególną odmianą bardziej ogólnego zjawiska, jakim jest zaprogramowana, a więc regulowana genetycznie martwica (nekroza). Zgodnie z najnowszym piśmiennictwem i zaleceniami NCCD, innymi odrębnymi postaciami regulowanej martwicy są również regulowana nekroza zależna od permeabilizacji błon mitochondrium oraz zjawisko parthanatos – niezależny od kaspaz proces, angażujący szczególnie enzymy naprawcze DNA jak PARP-1 [17,20].

Dowody na udział mechanizmów genetycznych w martwicy

O genetycznie zaprogramowanym charakterze nekrozy świadczy jej udział w procesach rozwojowych ssaków. Uczestniczy np. w śmierci ludzkich chondrocytów podczas wzrostu kości [19] lub w dojrzewaniu pęcherzyków Graffa [48]. Martwica bierze więc udział w fizjologicznych procesach rozwoju organizmu, co obaliło dogmat, w myśl którego nekrozę uważano wyłącznie za proces patologiczny – w opozycji do apoptozy mogącej być zarówno zjawiskiem fizjologicznym, jak i patologicznym.

Regulowaną martwicę wyzwala kontakt z niektórymi patogenami, zwłaszcza wirusami, stąd jest uważana obecnie za istotny mechanizm obronny [6]. Wiadomo, że wirus HIV-1 zabija limfocyty T CD4+ raczej w procesie nekrozy niż apoptozy [39,71]. Odkryto, że wirus cytomegalii (CMV) indukuje nekroptozę zależną od RIP3, ale nie RIP1, co potwierdza ważną rolę RIP3 w regulowanej martwicy w przebiegu niektórych infekcji wirusowych [62]. Opisano postać martwicy istotną dla wyzwolenia antybakteryjnej odpowiedzi immunologicznej [66]. Nekroptoza może wyzwolić „fizjologiczną” śmierć komórek układu immunologicznego i nerwowego, co potwierdzono, wykazując w tych przypadkach ekspresję licznych genów, przypuszczalnie regulujących proces martwicy, w tym udział RIP3 w homeostazie limfocytów [3]. Podobne wnioski wynikają z obserwacji Hitomi i wsp., którzy udowodnili, że nekrostatyna Nec-1, allosteryczny inhibitor RIP1, odgrywa istotną rolę w regulacji liczby makrofagów aktywowanych podczas infekcji, gdyż wydłuża czas ich prze- życia [28]. Wiele doniesień wskazuje również na istotną rolę nekroptozy w takich procesach, jak niedokrwienne uszkodzenie mózgu, zawał serca i śmierć komórek nowotworowych powodowana przez cytostatyki [8,24,42,55,58]. Proces ten uczestniczy również w patogenezie zapalenia trzustki, posocznicy, chorób neurodegeneracyjnych i chorób siatkówki (odwarstwienie, utrata fotoreceptorów) [10,26,61,62]. Zaprogramowana martwica bywa też skutkiem ekspozycji komórek na toksyny [71]. Nadmierna aktywacja PARP-1 (czyli proces parthanatos) uczestniczy w martwicy wyzwalanej alkilacją DNA [18].

Zaburzenia szlaków sygnalizacyjnych kontrolujących nekroptozę biorą udział w nowotworzeniu. W komórkach przewlekłej białaczki limfatycznej wykazano defekt ważnych efektorów tego procesu, takich jak RIP3 i CYLD, a w czerniaku dotyczył tylko CYLD. Polimorfizm genu RIP3 wiąże się ze zwiększonym ryzykiem rozwoju chłoniaków nieziarniczych [1,43,67]. Nekroptoza, podobnie jak apoptoza, odpowiada za śmierć komórek nowotworu wywołaną radioterapią, terapią fotodynamiczną, promieniowaniem jonizującym, a także cytostatykami [15]. Zakłada się, że nekroptoza może być pomocniczym mechanizmem śmierci w niezdolnych do apoptozy komórkach nowotworowych, uruchamianym pod nieobecność niezbędnych determinantów apoptozy [18,28]. Jak wynika z powyższego przeglądu piśmiennictwa, to właśnie nekroptoza jest najczęściej obserwowaną odmianą regulowanej martwicy. Należy podkreślić, że zachodzi przy braku aktywacji kaspaz, a ponadto podlega dodatkowemu wzmocnieniu, jeśli ich inhibitory znajdują się w środowisku komórki [64].

Nekroptoza – molekularne mechanizmy. Główna rola kinaz R

Wystąpienie zjawiska nekroptozy zależy od czynników genetycznych, epigenetycznych i  farmakologicznych [18]. Nie ma wątpliwości, że może ją wyzwolić połączenie receptorów śmierci z ich ligandami. I tak wzbudzenie TNFR1, Fas, receptorów TRAIL, a także RIP1 może spowodować zarówno apoptozę, jak i martwicę. O wyborze mechanizmu, w którym umiera komórka decyduje interakcja z innymi białkami, stężenie glukozy oraz dostępność ATP niezbędnego do aktywacji kaspaz [19,69].

Kinazy RIP1 i RIP3

Aktywność kinaz RIP1 i RIP3 jest nieodzowna w mechanizmie nekroptozy, natomiast niektóre postaci zaprogramowanej nekrozy są od nich niezależne [65]. Białka te należą do rodziny kinaz serynowo-treoninowych. Kinaza RIP1 ma domenę śmierci (death domain, DD) i domenę rekrutującą kaspazy (caspase recruitment domain, CARD), tym samym przypomina swoją budową białko adaptorowe FADD. Są to cechy strukturalne niezwykle istotne dla pełnionych przez nią funkcji. Natomiast kinaza RIP3 zawiera homotypowy motyw (RIP homotypic interaction motif, RHIM), który występuje w jednej z domen kinazy RIP1. Umożliwia to wzajemną interakcję obu białek [12]. Wykazują aż 33% homologii domeny kinazowej, jednak różnice budowy sprawiają, iż inhibitor RIP1 – wspomniana nekrostatyna Nec-1 – nie hamuje kinazy RIP3 [7]. Kinaza RIP1 uczestniczy nie tylko w wyzwalaniu procesu zaprogramowanej nekrozy, ale też apoptozy. Pełni ponadto zasadniczą rolę w aktywacji NF-кB w wyniku działania TNF-α (vide niżej), co w przypadku krwinek białych stymuluje syntezę cytokin prozapalnych. Wraz ze swym homologiem – kinazą RIP3 – uwalnia alarminy, czyli białka promujące odpowiedź immunologiczną w wielu chorobach. Z rozważań tych płynie wniosek o istotnej roli RIP1 i RIP3 w wywo ływaniu zapalenia w dwóch mechanizmach – zależnym i niezależnym od nekrozy [40,46].

W procesie nekroptozy obie kinazy powodują swą wzajemną fosforylację i tworzą pronekrotyczny kompleks, kontrolujący wytwarzanie wolnych rodników tlenowych (reactive oxygen species, ROS) [6]. Aktywność kinaz RIP jest niezbędna dla nekroptozy mediowanej przez receptory śmierci w obecności inhibitora kaspaz Z-VAD.fmk, zarówno w komórkach mysich, jak i ludzkich [18]. RIP1 jest przy tym zaangażowana aż w trzy różne procesy regulujące żywotność komórki – apoptozę, nekroptozę i aktywację czynnika transkrypcyjnego NF-κB, który promuje przeżycie. Istotne dla zrozumienia w jaki sposób zapada „decyzja” o przeżyciu bądź śmierci jest poznanie mechanizmów regulujących działanie tej kinazy [7].

Przeżycie, apoptoza i nekroptoza – trzy główne procesy wyzwalane przez ten sam czynnik

Czynnikiem inicjującym jest zwykle przyłączenie czynnika martwicy nowotworu α (TNF-α) do jego receptora typu I (TNFR1), co prowadzi do trimeryzacji i aktywacji tego ostatniego oraz rekrutacji wielu białek, np. TRADD, RIP1 i TRAF2 [15]. Opisując to zjawisko bardziej szczegółowo, do aktywnego receptora przyłącza się czynnik adaptorowy TRADD. Powstaje platforma, do której dołączają się kinazy RIP i białka adaptorowe FADD i TRAF2. Powstały kompleks uczestniczy w wielu szlakach molekularnych i jest punktem wyjścia do powstania podkompleksów zaangażowanych w sygnalizację komórkową [41]. To właśnie ligacja TNF-α/TNFR prowadzi do rozwoju jednego z trzech zupełnie odmiennych, wymienionych już scenariuszy: 1) przeżycia, 2) apoptozy i 3) nekroptozy. Na załączonych rycinach przedstawiono je z pominięciem mniej ważnych elementów w celu zachowania przejrzystości. Za przeżycie komórki (ryc. 1) odpowiada inaktywacja RIP1, z jednoczesnym wzbudzeniem aktywnej postaci NF-κB. Ak-tywacja tego czynnika zachodzi w wyniku rekrutacji RIP1 i jej następczej, zależnej od ligandu ubikwitynacji, która ogranicza powstanie proapoptotycznego kompleksu sygnalizacyjnego (DISC). Aktywacja czynnika transkrypcyjnego NF-κB (dzięki działaniu IKK), zwiększa ekspresję genów odpowiedzialnych za przeżycie komórki. Korzystna wydaje się też częściowa aktywacja kaspazy 8: niewielkie jej stężenia nie są w stanie wzbudzić szlaku zewnątrzpochodnego apoptozy, ale wystarczają do skutecznej degradacji RIP1, tym samym hamują więc nekroptozę [9,40,50].

W przypadku apoptozy (ryc. 2) powstanie typowego kompleksu DISC dokonuje się za sprawą przyłączenia TNF-α do jego receptora, jednak w sytuacjach sprzyjających apoptozie, którymi w warunkach doświadczalnych są obecność inhibitorów syntezy białek, stosunkowo duże stężenie ATP, nadekspresja polipeptydu o nazwie zinc-finger like protein, a także niedostateczna sygnalizacja kinazy FAK (focal adhesion kinase). Wówczas na skutek działania nekrostatyn jest hamowany szlak nekroptozy, a niewielkie stężenie deubikwitynazy CYLD powoduje, iż kinaza RIP1 pozostaje nieaktywna. W tych warunkach program apoptozy jest realizowany w komórce przez opisany wyżej szlak zewnątrzpochodny [7,9].

Jeśli natomiast po inicjacji opisanego procesu nie zostają spełnione warunki zaistnienia apoptozy, komórka wchodzi w szlak nekroptozy (ryc. 3). Bezpośrednią przyczyną takiego zjawiska może być np. obserwowane w komórkach nowotworowych zahamowanie aktywności kaspaz w następstwie mutacji ich genów lub też opisywane w warunkach doświadczalnych działanie swoistych inhibitorów. Najczęstszą przyczyną wydaje się jednak nagła utrata ATP lub nadmierna ekspozycja komórki na wolne rodniki tlenowe i azotowe (reactive nitrogen species, RNS) [9]. Należy podkreślić, że głównym elementem uruchamiającym proces nekroptozy jest aktywacja kinazy RIP1, wyjściowo zahamowanej w wyniku ubikwitynacji. Proces ten dokonuje się pod wpływem enzymu deubikwitynazy CYLD. Tak więc, nekroptoza dokonuje się w obecności odpowiednio aktywnych RIP1 oraz – jak już wyjaśniono – RIP3 [7]. Szczegółowy opis tych procesów zawarto w opisach do ryc. 1-3.

Rola FADD, ROSi innych czynników w regulacji nekroptozy

Jak wcześniej wspomniano, białko adaptorowe FADD bierze udział w wyzwalaniu nekroptozy przez TNF-α. Odgrywa główną rolę w procesach apoptozy i nekroptozy wywołanych przez aktywację Fas, a utrata jego ekspresji hamuje indukcję obu procesów. Wydaje się, że w przypadku nekroptozy oligomeryzacja FADD jest wystarczającym sygnałem do zapoczątkowania procesu [59]. Przypuszczalnie także ligand śmierci TRAIL, działając przez FADD, może oprócz apoptozy indukować właśnie nekroptozę [38]. Wykazano, że nekroptoza może zachodzić mimo braku inhibitorów kaspaz. Jednak proces ten, jeśli wyzwala go stymulacja receptorów Fas, DR4 lub DR5, wymaga zahamowania czynności kaspaz.

Podsumowując, białko FADD jest niezbędne do zapoczątkowania nekroptozy, gdy proces śmierci jest wyzwalany przez FasL bądź TRAIL. Jeśli natomiast proces jest inicjowany przez TNF-α, to rola FADD jest sporna. Część doniesień przemawia za jego rolą jako negatywnego regulatora, który sprzyja apoptozie i hamuje nekroptozę [65]. Wiadomo jednak, że w przypadku nekroptozy wynikającej z ligacji TNF-α/TNFR1, FADD pośredniczy w akumulacji wolnych rodników tlenowych [41]. Komórki, w których białko RIP1 jest hamowane lub go brak, są na ogół oporne na nekroptozę mediowaną przez TNF-α i Fas [59]. Ostatnie badania prowadzone na modelu embrionalnych fibroblastów mysich wskazują jednak, że TNF-α może z pominięciem RIP1 aktywować kinazę RIP3 i doprowadzić w ten sposób do zaprogramowanej martwicy, mimo braku RIP1. Warunkiem koniecznym jest ekspresja TNFR1 oraz TRADD [47].

Innym czynnikiem niezbędnym do wyzwolenia nekroptozy są jony wapnia, które pobudzają wytwarzanie kwasu mlekowego i tlenku azotu oraz aktywację kalpain. Mitochondria promują martwicę w razie gwałtownej permeabilizacji błon tej organelli. Długotrwały wzrost przepuszczalności błony wewnętrznej mitochondriów prowadzi do obrzęku organelli, przerwania jej błony zewnętrznej i uwolnienia do cytoplazmy wielu czynników, zwłaszcza cytochromu C, co może stanowić bezpośredni bodziec indukujący nekroptozę [57]. Wybór tego drugiego szlaku śmierci komórkowej (należy jeszcze raz podkreślić, że oba zjawiska mogą być następstwem działania m.in. TNF-α), zależy przypuszczalnie od nadmiernego wytwarzania ROS i wyczerpania zapasów ATP, spowodowanego dysfunkcją mitochondriów [4]. W modelu embrionalnych fibroblastów mysich Lin i wsp. wykazali, że głównym elementem warunkującym akumulację ROS w procesie nekroptozy wzbudzanej przez TNF-α są białka RIP, TRAF2 oraz – jak wspomniano wyżej – FADD [41]. Generacja ROS prowadzi do uszkodzeń DNA, a pośrednio stymuluje też uwalnianie PARP-1, odpowiedzialnego za naprawę nici DNA. Jest to jednak proces zależny od energii, więc działaniem niepo- żądanym wzmożonej aktywności PARP-1 jest wyczerpanie zasobów NAD+ i ATP. Znaczny spadek stężenia ATP w komórce stwarza warunki stymulujące rozwój nekroptozy.

Natomiast całkowite wyczerpanie zasobów ATP wywo- łuje „katastrofę energetyczną”, która uruchamia proces odmienny zarówno od apoptozy, jak i regulowanej martwicy, przywodzący na myśl klasyczną nekrozę [4]. Należy podkreślić, że dane piśmiennictwa charakteryzujące rolę mitochondriów w nekroptozie są niekompletne [68]. Niguet i wsp. wykazali, że nekroza komórek nerwowych „dzieli” z apoptozą wewnętrzny szlak tego procesu, czyli uwolnienie do cytoplazmy cytochromu C i powstanie apoptosomu, a nawet aktywację kaspazy 9 i kaspaz wykonawczych [49].

Nadal nie poznano dokładnie mechanizmów regulują- cych dalsze etapy aponekrozy. Są przypuszczalnie powiązane z aktywacją autofagii i zwiększoną syntezą jej markera LC3II, który jest efektywnie hamowany przez białko Nec-1 o potwierdzonych właściwościach inhibicyjnych wobec samej nekroptozy [28]. Autofagia to katalityczny proces polegający na degradacji wielkocząsteczkowych składników cytoplazmy, a nawet całych organelli komórkowych [36]. Odpowiada za zachowanie homeostazy i umożliwia przeżycie komórki w warunkach stresowych [51]. Degradowane cząsteczki i organella są zamykane w obłonionych pęcherzykach zwanych autofagosomami, które łączą się z lizosomami, co strawia ich zawartość [21]. Niektórzy badacze sugerują, iż autofagia jest mechanizmem wykonawczym nekroptozy, ze względu na częstą obecność autofagosomów w komórkach przechodzących aponekrozę. Uważa się, iż autofagia może stanowić swoisty mechanizm uprzątający zawartość komórki w przebiegu regulowanej martwicy [68].

Podsumowanie

Dokładniejsze zrozumienie procesów odpowiedzialnych za zaprogramowaną martwicę, w tym za jej szczególną postać, nekroptozę, stwarza szansę na nowe sposoby leczenia, zwłaszcza w chorobach nowotworowych. Wiedza ta może się przyczynić do stworzenia leków aktywujących nekrotyczny szlak śmierci komórkowej w przypadkach opornych na apoptozę. Podobne nadzieje należy wiązać ze zrozumieniem złożonych mechanizmów decydujących o przeżyciu lub śmierci komórki. Umiejętne sterowanie tymi procesami mogłoby się stać cennym narzędziem zarówno badawczym, jak i terapeutycznym.

Przypisy

• 1. Alameda J.P., Moreno-Maldonado R., Navarro M., Bravo A., RamírezA., Page A., Jorcano J.L., Fernández-Aceñero M.J., CasanovaM.L.: An inactivating CYLD mutation promotes skin tumor progressionby conferring enhanced proliferative, survival and angiogenicproperties to epidermal cancer cells. Oncogene, 2010; 29: 6522-6532
  Google Scholar
• 2. Burz C., Berindan-Neagoe I., Balacescu O., Irimie A.: Apoptosis incancer: key molecular signaling pathways and therapy targets. ActaOncol., 2009; 48: 811-821
  Google Scholar
• 3. Ch’en I.L., Tsau J.S., Molkentin J.D. Komatsu M., Hedrick S.M.:Mechanisms of necroptosis in T cells. J. Exp. Med., 2011; 208: 633-641
  Google Scholar
• 4. Chaabane W., User S.D., El-Gazzah M. Jaksik R., Sajjadi E., Rzeszowska-WolnyJ., Los M.J.: Autophagy, apoptosis, mitoptosis andnecrosis: interdependence between those pathways and effects oncancer. Arch. Immunol. Ther. Exp., 2013; 61: 43-58
  Google Scholar
• 5. Chipuk J.E., Bouchier-Hayes L., Green D.R.: Mitochondrial outermembrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystanderscenario. Cell Death Differ., 2006; 13: 1396-1402
  Google Scholar
• 6. Cho Y.S., Challa S., Moquin D. Genga R., Ray T.D., Guildford M.,Chan F.K.: Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complexregulates programmed necrosis and virus-induced inflammation.Cell, 2009; 137: 1112-1123
  Google Scholar
• 7. Christofferson D.E., Yuan J.: Necroptosis as an alternative formof programmed cell death. Curr. Opin. Cell Biol., 2010; 22: 263-268
  Google Scholar
• 8. Degterev A., Huang Z., Boyce M. Li Y., Jagtap P., Mizushima N.,Cuny G.D., Mitchison T.J., Moskowitz M.A., Yuan J.: Chemical inhibitorof nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemicbrain injury. Nat. Chem. Biol., 2005; 1: 112-119
  Google Scholar
• 9. Degterev A., Yuan J.: Expansion and evolution of cell death programmes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2008; 9: 378-390
  Google Scholar
• 10. Duprez L., Takahashi N., Van Hauwermeiren F. VandendriesscheB., Goossens V., Vanden Berghe T., Declercq W., Libert C., Cauwels A.,Vandenabeele P.: RIP kinase-dependent necrosis drives lethal systemicinflammatory response syndrome. Immunity, 2011; 35: 908-918
  Google Scholar
• 11. Elmore S.: Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol.Pathol., 2007; 35: 495-516
  Google Scholar
• 12. Festjens N., Vanden Berghe T., Cornelis S., Vandenabeele P.: RIP1,a kinase on the crossroads of a cell’s decision to live or die. Cell DeathDiffer., 2007; 14: 400-410
  Google Scholar
• 13. Formigli L., Papucci L., Tani A. Schiavone N., Tempestini A., OrlandiniG.E., Capaccioli S., Orlandini S.Z.: Aponecrosis: morphologicaland biochemical exploration of a syncretic process of cell deathsharing apoptosis and necrosis. J. Cell. Physiol., 2000; 182: 41-49
  Google Scholar
• 14. Fulda S.: Caspase-8 in cancer biology and therapy. Cancer Lett.,2009; 281: 128-133
  Google Scholar
• 15. Fulda S.: The mechanism of necroptosis in normal and cancercells. Cancer Biol. Ther., 2013; 14: 999-1004
  Google Scholar
• 16. Fulda S., Debatin K.M.: Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathwaysin anticancer chemotherapy. Oncogene, 2006; 25: 4798-4811
  Google Scholar
• 17. Galluzzi L., Kepp O., Krautwald S. Kroemer G., Linkermann A.:Molecular mechanisms of regulated necrosis. Semin. Cell Dev. Biol.,2014; 35: 24-32
  Google Scholar
• 18. Galluzzi L., Kroemer G.: Necroptosis: a specialized pathway ofprogrammed necrosis. Cell, 2008; 135: 1161-1163
  Google Scholar
• 19. Galluzzi L., Maiuri M.C., Vitale I. Zischka H., Castedo M., ZitvogelL., Kroemer G.: Cell death modalities: classification and pathophysiologicalimplications. Cell Death Differ., 2007; 14: 1237-1243
  Google Scholar
• 20. Galluzzi L., Vitale I., Abrams J.M., Alnemri E.S., Baehrecke E.H.,Blagosklonny M.V., Dawson T.M., Dawson V.L., El-Deiry W.S., FuldaS., Gottlieb E., Green D.R., Hengartner M.O., Kepp O., Knight R.A.,Kumar S. i wsp.: Molecular definitions of cell death subroutines:recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012 Cell Death Differ., 2012; 19: 107-120
  Google Scholar
• 21. Glick D., Barth S., Macleod K.F.: Autophagy: cellular and molecularmechanisms. J. Pathol., 2010; 221: 3-12
  Google Scholar
• 22. Golstein P., Kroemer G.: Cell death by necrosis: towards a moleculardefinition. Trends Biochem. Sci., 2007; 32: 37-43
  Google Scholar
• 23. Guicciardi M.E., Gores G.J.: Life and death by death receptors.FASEB J., 2009; 23: 1625-1637
  Google Scholar
• 24. Han W., Li L., Qiu S. Lu Q., Pan Q., Gu Y., Luo J., Hu X.: Shikonincircumvents cancer drug resistance by induction of a necroptoticdeath. Mol. Cancer Ther., 2007; 6: 1641-1649
  Google Scholar
• 25. Hassan M., Watari H., AbuAlmaaty A., Ohba Y., Sakuragi N.: Apoptosisand molecular targeting therapy in cancer. Biomed. Res. Int.,2014; 2014: 150845
  Google Scholar
• 26. He S., Wang L., Miao L. Wang T., Du F., Zhao L., Wang X.: Receptorinteracting protein kinase-3 determines cellular necrotic responseto TNF-α. Cell, 2009; 137: 1100-1111
  Google Scholar
• 27. Helewski K.J., Kowalczyk-Ziomek G.I., Konecki J.: Apoptoza i martwica– dwie drogi do jednego celu. Wiad. Lek., 2006; 59: 679-684
  Google Scholar
• 28. Hitomi J., Christofferson D.E., Ng A. Yao J., Degterev A., XavierR.J., Yuan J.: Identification of a molecular signaling networkthat regulates a cellular necrotic cell death pathway. Cell, 2008;135: 1311-1323
  Google Scholar
• 29. Hu W., Kavanagh J.J.: Anticancer therapy targeting the apoptoticpathway. Lancet Oncol., 2003; 4: 721-729
  Google Scholar
• 30. Häcker G.: The morphology of apoptosis. Cell Tissue Res., 2000;301: 5-17
  Google Scholar
• 31. Jin Z., El-Deiry W.S.: Overview of cell death signaling pathways.Cancer Biol. Ther., 2005; 4: 139-163
  Google Scholar
• 32. Kelly K.J., Plotkin Z., Dagher P.C.: Guanosine supplementationreduces apoptosis and protects renal function in the setting of ischemicinjury. J. Clin. Invest., 2001; 108: 1291-1298
  Google Scholar
• 33. Khan K.H., Blanco-Codesido M., Molife L.R.: Cancer therapeutics:targeting the apoptotic pathway. Crit. Rev. Oncol. Hematol.,2014; 90: 200-219
  Google Scholar
• 34. Kopiński P.: Apoptoza limfocytów pęcherzykowych w wybranychśródmiąższowych chorobach płuc. Rozprawa habilitacyjna.Wydawnictwo Naukowe UMK, Bydgoszcz 2012
  Google Scholar
• 35. Kopiński P., Chorostowska-Wynimko J., Dyczek A., Giżycka A.:Apoptoza limfocytów pęcherzykowych. Część 1 – szlaki apoptozylimfocytów Pneumonol. Alergol. Pol., 2014; 82: 170-182
  Google Scholar
• 36. Kopinski P., Gizycka A., Chorostowska-Wynimko J.: Zaprogramowanaśmierć komórkowa: czy tylko apoptoza? Pol. Merk. Lekarski,2014; 37: 201-205
  Google Scholar
• 37. Krysko D.V., Vanden Berghe T., D’Herde K. Vandenabeele P.:Apoptosis and necrosis: detection, discrimination and phagocytosis.Methods, 2008; 44: 205-221
  Google Scholar
• 38. Lee E.W., Seo J., Jeong M., Lee S., Song J.: The roles of FADD inextrinsic apoptosis and necroptosis. BMB Rep., 2012; 45: 496-508
  Google Scholar
• 39. Lenardo M.J., Angleman S.B., Bounkeua V. Dimas J., Duvall M.G.,Graubard M.B., Hornung F., Selkirk M.C., Speirs C.K., Trageser C.,Orenstein J.O., Bolton D.L.: Cytopathic killing of peripheral bloodCD4(+) T lymphocytes by human immunodeficiency virus type 1appears necrotic rather than apoptotic and does not require env. J.Virol., 2002; 76: 5082-5093
  Google Scholar
• 40. Li H., Kobayashi M., Blonska M. You Y., Lin X.: Ubiquitination ofRIP is required for tumor necrosis factor α-induced NF-κB activation.J. Biol. Chem., 2006; 281: 13636-13643
  Google Scholar
• 41. Lin Y., Choksi S., Shen H.M., Yang Q.F., Hur G.M., Kim Y.S., TranJ.H., Nedospasov S.A., Liu Z.G.: Tumor necrosis factor-induced nonapoptoticcell death requires receptor-interacting protein-mediatedcellular reactive oxygen species accumulation. J. Biol. Chem., 2004;279: 10822-10828
  Google Scholar
• 42. Linkermann A., Bräsen J.H., Darding M. Jin M.K., Sanz A.B., HellerJ.O., De Zen F., Weinlich R., Ortiz A., Walczak H., Weinberg J.M., GreenD.R., Kunzendorf U., Krautwald S.: Two independent pathways ofregulated necrosis mediate ischemia-reperfusion injury. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 2013; 110: 12024-12029
  Google Scholar
• 43. Liu P., Xu B., Shen W., Zhu H., Wu W., Fu Y., Chen H., Dong H., ZhuY., Miao K., Xu W., Li J.: Dysregulation of TNFα-induced necroptoticsignaling in chronic lymphocytic leukemia: suppression of CYLDgene by LEF1. Leukemia, 2012; 26: 1293-1300
  Google Scholar
• 44. Malinowska I.: Rola apoptozy w patogenezie i leczeniu nowotworówukładu hematopoetycznego. Postępy Hig. Med. Dośw., 2004;58: 548-559
  Google Scholar
• 45. Marek Ł.: Rola apoptosomu w aktywacji prokaspazy 9. PostępyHig. Med. Dośw. 2013; 67: 54-64
  Google Scholar
• 46. Moriwaki K., Chan F.K.: Necrosis-dependent and independentsignaling of the RIP kinases in inflammation. Cytokine Growth FactorRev., 2014; 25: 167-174
  Google Scholar
• 47. Moujalled D.M., Cook W.D., Okamoto T. Murphy J., Lawlor K.E.,Vince J.E., Vaux D.L.: TNF can activate RIPK3 and cause programmednecrosis in the absence of RIPK1. Cell Death Dis., 2013; 4: e465
  Google Scholar
• 48. Murdoch W.J., Wilken C., Young D.A.: Sequence of apoptosis andinflammatory necrosis within the formative ovulatory site of sheepfollicles. J. Reprod. Fertil., 1999; 117: 325-329
  Google Scholar
• 49. Niquet J., Seo D.W., Wasterlain C.G.: Mitochondrial pathways ofneuronal necrosis. Biochem. Soc. Trans., 2006; 34: 1347-1351
  Google Scholar
• 50. Piotrowska A., Izykowska I., Podhorska-Okołów M. Zabel M.,Dziegiel P.: Budowa białek z rodziny NF-κB i ich rola w procesie apoptozy.Postępy Hig. Med. Dośw., 2008; 62: 64-74
  Google Scholar
• 51. Polewska J.: Autofagia – mechanizm molekularny, apoptozai nowotwory. Postępy Hig. Med. Dośw., 2012; 66: 921-936
  Google Scholar
• 52. Poon I.K., Hulett M.D., Parish C.R.: Molecular mechanisms of lateapoptotic/necrotic cell clearance. Cell Death Differ., 2010; 17: 381-397
  Google Scholar
• 53. Przybylski G, Wielikdzień J., Kopiński P.: Mechanizmy zaprogramowanejśmierci efektorowych limfocytów T. Postępy Hig. Med.Dośw., 2013; 67: 1374-1390
  Google Scholar
• 54. Rupniewska Z., Bojarska-Junak A.: Apoptoza: Przepuszczalnośćbłony mitochondrialnej i rola pełniona przez białka z rodziny Bcl-2.Postępy Hig. Med. Dośw., 2004; 58: 538-547
  Google Scholar
• 55. Saddoughi S.A., Gencer S., Peterson Y.K., Ward K.E., MukhopadhyayA., Oaks J., Bielawski J., Szulc Z.M., Thomas R.J., Selvam S.P.,Senkal C.E., Garrett-Mayer E., De Palma R.M., Fedarovich D., Liu A.i wsp.: Sphingosine analogue drug FTY720 targets I2PP2A/SET andmediates lung tumour suppression via activation of PP2A-RIPK1-dependentnecroptosis. EMBO Mol. Med., 2013; 5: 105-121
  Google Scholar
• 56. Scaffidi P., Misteli T., Bianchi M.E.: Release of chromatin proteinHMGB1 by necrotic cells triggers inflammation. Nature, 2002;418: 191-195
  Google Scholar
• 57. Siu W.P., Pun P.B., Latchoumycandane C., Boelsterli U.A.: Bax-mediatedmitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP),distinct from the mitochondrial permeability transition, is a keymechanism in diclofenac-induced hepatocyte injury: multiple protectiveroles of cyclosporin A. Toxicol. Appl. Pharmacol., 2008; 227:451-461
  Google Scholar
• 58. Smith C.C., Davidson S.M., Lim S.Y. Simpkin J.C., Hothersall J.S.,Yellon D.M.: Necrostatin: a potentially novel cardioprotective agent?Cardiovasc. Drugs Ther., 2007; 21: 227-233
  Google Scholar
• 59. Tait S.W., Green D.R.: Caspase-independent cell death: leavingthe set without the final cut. Oncogene, 2008; 27: 6452-6461
  Google Scholar
• 60. Thorburn A.: Death receptor-induced cell killing. Cell. Signal.,2004; 16: 139-144
  Google Scholar
• 61. Trichonas G., Murakami Y., Thanos A. Morizane Y., Kayama M.,Debouck C.M., Hisatomi T., Miller J.W., Vavvas D.G.: Receptor interactingprotein kinases mediate retinal detachment-induced photoreceptornecrosis and compensate for inhibition of apoptosis. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 2010; 107: 21695-21700
  Google Scholar
• 62. Upton J.W., Kaiser W.J., Mocarski E.S.: Virus inhibition of RIP3–dependent necrosis. Cell Host Microbe, 2010; 7: 302-313
  Google Scholar
• 63. Vanden Berghe T., Grootjans S., Goossens V. Dondelinger Y.,Krysko D.V., Takahashi N., Vandenabeele P.: Determination of apoptoticand necrotic cell death in vitro and in vivo. Methods, 2013;61: 117-129
  Google Scholar
• 64. Vandenabeele P., Melino G.: The flick of a switch: which deathprogram to choose? Cell Death Differ., 2012; 19: 1093-1095
  Google Scholar
• 65. Vanlangenakker N., Vanden Berghe T., Vandenabeele P.: Manystimuli pull the necrotic trigger, an overview. Cell Death Differ.,2012; 19: 75-86
  Google Scholar
• 66. Willingham S.B., Allen I.C., Bergstralh D.T. Brickey W.J., HuangM.T., Taxman D.J., Duncan J.A. Ting J.P.: NLRP3 (NALP3, Cryopyrin)facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 releasevia inflammasome-dependent and -independent pathways. J.Immunol., 2009; 183: 2008-2015
  Google Scholar
• 67. Wu W., Liu P., Li J.: Necroptosis: an emerging form of programmedcell death. Crit. Rev. Oncol. Hematol., 2012; 82: 249-258
  Google Scholar
• 68. Yuan J., Kroemer G.: Alternative cell death mechanisms in developmentand beyond. Genes Dev., 2010; 24: 2592-2602
  Google Scholar
• 69. Zhivotovsky B., Orrenius S.: Clinical perspectives of cell death:where we are and where to go. Apoptosis, 2009; 14: 333-335
  Google Scholar
• 70. Zielinski R.R., Eigl B.J., Chi K.N.: Targeting the apoptosis pathwayin prostate cancer. Cancer J., 2013; 19: 79-89
  Google Scholar
• 71. Zong W.X., Thompson C.B.: Necrotic death as a cell fate. GenesDev., 2006; 20: 1-15
  Google Scholar

Pełna treść artykułu