Abstrakt

W ostatnich latach antybiotyki coraz częściej okazują się nieskuteczne w leczeniu infekcji bakteryjnych. Nabywanie antybiotykooporności przez drobnoustroje jest związane z krążącymi w środowisku genami, które ją warunkują. Drogą horyzontalnego transferu genów (HGT) determinanty oporności mogą zostać przeniesione do bakterii patogennych. Wykazano, że jednym z głównych mechanizmów odpowiedzialnych za rozprzestrzenianie genów antybiotykooporności jest koniugacja – proces bardzo wydajny, który omija bariery restrykcji i modyfikacji. Niektóre moduły koniugacyjne umożliwiają transfer plazmidów nawet pomiędzy odległymi filogenetycznie gatunkami bakterii. Wiele doniesień naukowych wskazuje, że istotnym rezerwuarem genów antybiotykooporności jest żywność. Geny wywołujące oporność na antybiotyki identyfikowane są m.in. w produktach mięsnych, w mleku, na owocach czy warzywach. Powodem tak szerokiego rozprzestrzenienia genów oporności na antybiotyki w dużym stopniu jest nadużywanie antybiotyków przez hodowców roślin i zwierząt, a także horyzontalny transfer genów. Wykazano, iż determinanty oporności wyizolowane z produktów spożywczych mogą z łatwością zostać przeniesione do innej niszy, jeśli umiejscowione są na mobilnych elementach genetycznych. Geny warunkujące oporność na antybiotyki są obecne w środowisku już od co najmniej 30 000 lat. Usunięcie ich z produktów spożywczych jest niemożliwe, a zagrożenia związane z pojawieniem się chorobotwórczych szczepów wieloantybiotykoopornych są bardzo duże. Jedyne co można zrobić to kontrolować pojawianie się, selekcję i ich rozprzestrzenianie. Dlatego też trwają poszukiwania metod zapobiegających horyzontalnemu transferowi genów. Obiecujące wydają się koncepcje zakładające połączenie założeń biologii rozwoju, ewolucji i ekologii w walce z szerzeniem się antybiotykooporności.

Wstęp

Wiek XX nazwano wiekiem antybiotyków – „cudownych leków”, którymi można zwalczyć prawie każde zakażenie bakteryjne, natomiast obecnie świat wszedł w „erę poantybiotykową”. Dlaczego tak szybko antybiotyki stały się nieskuteczne? Czemu przegrywamy w wyścigu zbrojeń z drobnoustrojami? Czy najważniejsze są zdolności adaptacyjne drobnoustrojów i żywność, która jest rezerwuarem genów warunkujących lekooporność bakterii?

Celem publikacji jest próba odpowiedzi na powyższe pytania, a także wskazanie sposobów walki z transferem genów determinujących oporność bakterii na antybiotyki. Antybiotyki – substancje stosowane w leczeniu zakażeń drobnoustrojami, wykazują działanie bakteriobójcze i/ lub bakteriostatyczne. Za początek ery antybiotyków uważa się 1928 r. – datę odkrycia penicyliny przez A. Fleminga. Było to wydarzenie przełomowe, co potwierdza przyznana w 1945 r. Nagroda Nobla za wyizolowanie i wykorzystanie tego antybiotyku. Jednocześnie rozpoczęły się, trwające do dziś, poszukiwania nowych substancji o działaniu antybakteryjnym.

Odkryte antybiotyki mają zróżnicowane mechanizmy działania. Wśród nich są związki, które wpływają na syntezę: mureiny, DNA, RNA, białka, funkcjonowanie błony komórkowej czy są antymetabolitami. Również pod względem chemicznym antybiotyki nie stanowią jednorodnej grupy, od prostych peptydów po złożone związki wielopierścieniowe [28].

Zastosowanie antybiotyków

Pierwszym i najważniejszym zastosowaniem antybiotyków jest zastosowanie przeciw zakażeniom bakteryjnym. Niestety nie zawsze związki te są stosowane odpowiednio lub zgodnie z przeznaczeniem. Okazuje się, iż prawie 90% wszystkich antybiotyków wykorzystywanych w leczeniu człowieka, przepisywanych jest przez lekarzy pierwszego kontaktu pacjentom z zaka- żeniami dróg oddechowych, które nie zawsze są spowodowane przez bakterie [25]. Zdarza się, że pacjenci z zakażeniami bakteryjnymi, zbyt krótko stosują antybiotyki lub też zażywają za niską dawkę substancji antybakteryjnej. W wyniku takich działań rozwija się oporność bakterii na antybiotyki (antibiotic resistance, AR). AR jest uważana za jedno z największych zagrożeń dla zdrowia ludzi na świecie, zwłaszcza jeśli dotyczy wielooporności patogennych bakterii. Szczególnie groźne bywają zakażenia szpitalne wywoływane przez wielolekooporne pałeczki Pseudomonas aeruginosa czy gronkowce Staphylococcus aureus. Okazuje się, iż tylko jeden gatunek bakterii – oporny na metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA) zabija rocznie więcej Amerykanów niż HIV/AIDS, rozedma płuc i choroba Parkinsona [14].

Przeraża to, iż zużycie antybiotyków w celach medycznych nie jest duże w porównaniu z ilościami antybiotyków stosowanych przy produkcji żywności pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. W USA, w 2009 r. około 80% wszystkich sprzedanych antybiotyków wykorzystano w gospodarstwach hodowlanych [31]. W związku z popularnością stosowania antybiotyków, migracją ludzi, zwierząt i mobilnością ruchomych elementów genetycznych doniesienia o szczepach lekoopornych izolowanych z różnego rodzaju produktów spożywczych napływają z całego świata.

Udowodniono, że stosowanie streptomycyny na terenie Unii Europejskiej doprowadziło do rozprzestrzenienia genów warunkujących oporność na ten antybiotyk [38]. Przyczyną opisanego zjawiska było stosowanie go już od lat 50 XX w. w sadownictwie do kontroli zakażeń jabłoni i gruszy spowodowanych bakterią Erwinia amylovora [30]. W Izraelu, Kanadzie, Meksyku czy Nowej Zelandii streptomycyna jest nadal zarejestrowanym i wykorzystywanym preparatem antybakteryjnym [43].

Geny warunkujące antybiotykooporność rozprzestrzeniły się na świecie także za sprawą produktów mlecznych. W Czechach np. w latach 2010-2013 z surowego mleka wyizolowano szczepy E. coli wieloantybiotykooporne. Analizy genetyczne wykazały, że większość z nich przenosi geny determinujące oporność na antybiotyki β-laktamowe, tetracyklinę i chinolony [40]. Również w Iranie w surowym mleku i niepasteryzowanych serach bytują patogenne szczepy E. coli oporne na ciprofloksacynę, trimetoprim, oksytetracyklinę, gentamycynę, kwas nalidyksowy, ampicylinę, streptomycynę [5].

Coraz więcej doniesień dotyczących antybiotykoopornych bakterii dotyczy mięsa. W Kanadzie, w południowym Ontario, z cielęciny kupionej w lokalnym sklepie wyizolowano bakterie E. coli, które były oporne m.in. na ceftiofur, ceftriakson, ciprofloksacynę, kwas nalidyksowy [7]. Badania, przeprowadzone w Rumunii, wykazały, iż w około jednej piątej przebadanych próbek surowego mięsa wieprzowego i pakowanych produktów wieprzowych bytują bakterie z rodzaju Salmonella, które są rezerwuarem genów determinujących oporność na antybiotyki, m.in. tetracyklinę, ampicylinę, trimetoprim, amoksycylinię, tazobactam, imipenem, ciprofloksacynę i norfloksacynę. Pod tym kątem badano również miejsca uboju i rozbioru tusz, w których przygotowywano mięso. W 40% pobranych próbek wykazano obecność bakterii Salmonella przenoszących geny rozkładające antybiotyki [32]. Rozprzestrzenienie determinantów lekooporności w tym środowisku jest prawdopodobnie wynikiem stosowania antybiotyków w niewielkich stężeniach jako stymulatorów wzrostu zwierząt. W Danii wykazano, że stosowanie tylozyny u warchlaków i świń w okresie tuczu wstępnego doprowadziło do rozwoju oporności na erytromycynę i azytromycynę u bakterii [45].

W Polsce około 40% spożywanego mięsa to mięso wieprzowe [47]. Według prognoz spożycie wieprzowiny w krajach Unii Europejskiej wzrośnie o 2% do 2020 r.[47]. Ze względów ekonomicznych hodowcom zależy na szybkim przyroście masy prosiąt, a stosowanie antybiotyków jako stymulatorów wzrostu doprowadza do rozwoju bakterii antybiotykoopornych na tuczonych zwierzętach. Problem zanieczyszczenia mięsa wieprzowego genami warunkującymi antybiotykooporność może dotyczyć też Polski.

Szczególnie niebezpieczne jest przedostanie się AR do środowiska. Determinanty oporności wyselekcjonowane w leczonych zwierzętach są wydalane z kałem. Pola uprawne nawożone takim bionawozem są miejscem powielania genów warunkujących lekooporność i ich transferu do bakterii glebowych czy bytujących w środowisku wodnym. Również tą drogą determinanty oporności mogą trafić do organizmu ludzkiego [46] (ryc. 1)

Wprowadzenie antybiotyku, a więc silnej presji selekcyjnej do ekosystemu, doprowadza do szybkiej adaptacji danej populacji drobnoustrojów. Pojawienie się genów wywołujących oporność na antybiotyki bardzo rzadko jest wynikiem mutacji w narażonych populacjach. Najczęściej nabywanie i rozprzestrzenianie „oporności” zachodzi za pośrednictwem mobilnych elementów genetycznych i ich transferu do antybiotykowrażliwych drobnoustrojów za pośrednictwem horyzontalnego transferu genów (HGT, horizontal gene transfer).

Przeprowadzone analizy wykazują, iż bakterie bytujące na żywności zawierają „mobilne determinanty oporności”, jak np. izolowana z miodu bakteria – Paenibacillus larvae. Przenosi plazmidy, które warunkują oporność na tetracyklinę (pPL373 – szczep PL373, pPL374 – PL374 czy pPL395 – PL395). Analiza bioinformatyczna sugeruje, iż na wektorach tych znajdują się sekwencje oriT oraz geny mob, które prawdopodobnie umożliwiają plazmidom koniugacyjny transfer. Wykazano również, że bardzo podobne wektory są izolowane z innych szczepów bakterii Gram-dodatnich m.in. Bhargavaea, Bacillus, Lactobacillus czy Sporosarcina, co wskazuje, że transfer koniugacyjny się odbywa, a wektory mogą mieć szeroki zakres gospodarzy (BHR) [2]. Innym przykładem drobnoustrojów, u których zidentyfikowano mobilne elementy genetyczne są bakterie z rodzaju Enterococcus, dla któ- rych wykazano horyzontalny transfer genów ze szczepu bytującego w żywności do szczepów klinicznych. W doświadczeniach in vitro potwierdzono koniugacyjny transfer genu tet warunkującego oporność na tetracyklinę ze szczepu Enterococcus faecium S27 izolowanego z żywności do klinicznych szczepów E. faecium i E. faecalis 82916. Podobna sytuacja dotyczy genów oporności na streptomycynę aadA, które przeniesiono w warunkach laboratoryjnych ze szczepu E. faecium S27 do szczepu E. faecalis 82916 [15].

W Polsce dopiero rozpoczęły się badania nad identyfikacją, genów, od których zależy lekooporność bakterii izolowanych z gotowych produktów spożywczych, takich jak sery, wędliny, kiełbasy, wędzone ryby. Analizowano genotypy i fenotypy koagulazoujemnych gronkowców. Wykryto oporność na metycylinę, cefotaksym, klindamycynę, tigecylinę, ryfampicynę, erytromycynę, tetracyklinę. Szczególnie niebezpieczne jest umiejscowienie genów, warunkujących oporność na tetracyklinę, na mobilnych elementach genetycznych (na transpozonach z rodziny Tn916-Tn1545). W wyniku horyzontalnego transferu genów determinanty oporności mogą trafić do bakterii komensalnych organizmu człowieka [6].

Transfer koniugacyjny/transformacja

Proces otrzymania genów niewynikający z nabycia ich od organizmu rodzicielskiego w procesie różnego typu rozmnażania nazywa się horyzontalnym transferem genów (HGT) [3]. Jednym z głównych mechanizmów odpowiedzialnych za horyzontalne rozprzestrzenianie się informacji genetycznej (HGT) jest transfer koniugacyjny. Odgrywa niezwykle istotną rolę w ewolucji mikroorganizmów. Transfer koniugacyjny jest procesem ukierunkowanym: DNA transferowane jest z komórki zawierającej plazmid koniugacyjny lub transpozon koniugacyjny do komórki, która nie ma takiego lub podobnego modułu transferowego. Koniugacja po raz pierwszy opisana została dla plazmidu F z Escherichia coli przez J. Lederberga i E. Tatuma w 1946 r. W oparciu o dotychczasową wiedzę o różnych systemach koniugacyjnych plazmidów z bakterii Gram-ujemnych wyłania się obraz skomplikowanego procesu, w którym uczestniczą dwa wieloskładnikowe kompleksy: relaksosom i transferosom. Relaksosom to nukleoproteinowy kompleks zaangażowany w rozpoznanie i procesowanie oriT (miejsce inicjacji transferu), a następie dostarczanie jednej nici DNA do transferosomu, systemu transportu przez błony komórkowe (T4SS, type IV secretion system). Połączenie między relaksosomem a transferosomem zapewnia białko łącznikowe (coupling protein), które wiąże się z kompleksem relaksosomu i transportuje go do T4SS umiejscowionego w błonach. Białka relaksosomu działające w regionie oriT, odpowiedzialne za przygotowanie DNA do transferu, są kodowane przez geny Dtr (DNA transfer and replication), natomiast produkty białkowe genów Mpf (Mating pair formation) są zaangażowane w proces tworzenia koniugacyjnych par. Relaksazy (nikazy) i białka pomocnicze wiążące się do DNA są wysoce swoiste, rozpoznają tylko własne oriT, natomiast najmniej swoisty w modułach koniugacyjnych jest system tworzenia koniugacyjnych par – Mpf (z tego samego systemu transferosomu mogą korzystać różne kompleksy relaksosomów). Swoistość białka łącznikowego wobec relaksosomu i transferosomu jest różna w zależności od typu plazmidu koniugacyjnego. Plazmidy koniugacyjne są zdolne do mobilizacji transferu horyzontalnego plazmidów niekoniugacyjnych, pod warunkiem posiadania przez te plazmidy sekwencji oriT (origin transferu) i obecności (na plazmidzie mobilizowalnym lub koniugacyjnym) genów kodujących swoisty dla danego oriT kompleks relaksosomu (minimalna kaseta mobilizacyjna mob). Mimo wspólnego schematu przygotowania DNA do transferu koniugacyjnego struktury relaksosomów różnią się od siebie i wykazują swoistość plazmidową. Globalne analizy wykazały, iż prawie jedna czwarta wszystkich plazmidów to plazmidy koniugacyjne, natomiast około połowa to plazmidy mobilizowalne. Plazmidy mobilizowalne są mniejsze, kodują oriT, własny relaksosom, ewentualnie białko łącznikowe. Do transferu, podobnie jak transpozony mobilizacyjne, wymagają obecności pomocniczych plazmidów bądź transpozonów koniugacyjnych. Moduł koniugacyjny na plazmidzie lub transpozonie niesie sekwencję oriT, geny kodujące relaksazę, białka pomocnicze, białko łącznikowe i dodatkowo białka kompleksu transferosomu (12-30 w zależności od systemu) [41]. Koniugacja jest procesem niezwykle wydajnym, który omija bariery restrykcji i modyfikacji. Niektóre systemy koniugacyjne bakterii Gram-ujemnych w warunkach optymalnych umożliwiają zamianę nawet 100% biorców na transkoniuganty po 30 min od dodania dawcy w temperaturze 37ºC. W takich warunkach utworzenie par koniugacyjnych przez aparat Mpf zajmuje około 5-7 min, natomiast transfer DNA zachodzi z szybkością 45 kb min-1 [21].

Innym mechanizmem doprowadzającym do szybkich zmian w genomach bakteryjnych jest transformacja. W procesie tym niezwykle istotna jest kompetencja, czyli zdolność do pobierania nagiego DNA ze środowiska. Transformacja została opisana po raz pierwszy w 1928 r. przez F.Griffith dla bakterii z rodzaju Streptococcus. Avery i wsp. w latach 40 XX w. odkryli, że substratem w tym procesie jest DNA. Zauważono zdolność do naturalnej transformacji bakterii Gram-dodatnich z rodzaju Bacillus i Staphylococcuss pp [17,26], a także bakterii Gram- -ujemnych, m.in. Neisseria i Haemophilus [34]. W procesie transformacji bakterie kompetentne mogą pobierać ze środowiska fragmenty DNA z genami oporności na antybiotyki.

Wiek XXI – era poantybiotykowa

Dużym zagrożeniem dla zdrowia człowieka stała się wielolekowa oporność drobnoustrojów [42]. Bakterie oporne na kilka antybiotyków są izolowane z trzody chlewnej, bydła czy drobiu [9,22,29], a także są przenoszone na produkty spożywcze pochodzenia zwierzęcego, takie jak: surowe mięso drobiowe, wieprzowe, wołowe [18,20,35], mleko i jego przetwory [11,13,19,36,37] czy produkty rybne [44]. Wieloantybiotykooporność nie zawsze jest związana z posiadaniem przez bakterie kilku czy nawet kilkunastu genów oporności na antybiotyki. Wynikać to może z obecności pojedynczego genu lub mutacji, która zmienia strukturę lub skład ściany komórkowej drobnoustroju, syntezę otoczki czy też tworzy pompy, które aktywnie usuwają szkodliwą substancję z komórki [16].

Wciąż napływające doniesienia o antybiotykooporności sugerują, że świat wchodzi w „erę poantybiotykową”. Oporność na antybiotyki rozprzestrzenia się szybciej, niż trwanie procesu wprowadzenia związku do rutynowego leczenia ludzi czy zwierząt.

Czemu więc tak szybko pojawia się lekooporność? Nowo zidentyfikowane substancje o działaniu bakteriobójczym lub bakteriostatycznym przed wprowadzeniem na rynek oprócz praco- i czasochłonnych badań fizykochemicznych i klinicznych testowane są także pod kątem pojawiania się na nie antybiotykooporności. Tak m.in. sprawdzano „nowy” antybiotyk teiksobaktynę – związek wyizolowany z Eleftheriaterrae. W warunkach laboratoryjnych nie udało się uzyskać mutantów Staphylococcus aureus czy Mycobacterium tuberculosis na niego opornych [24].

Okazuje się, iż geny warunkujące oporność na antybiotyki były już w środowisku od milionów lat, a nabywanie oporności zazwyczaj nie zależy od przypadkowych mutacji. Podczas analiz DNA z wiecznej zmarzliny sprzed 30 000 lat zidentyfikowano różnorodne geny mogące warunkować oporność na β-laktamy, tetracykliny czy glikopeptydy [8]. Pulę genów determinujących antybiotykooporność bowiem zwiększają sami producenci antybiotyków. Dodatkowo produkty tych genów mogą być zaangażowane w metabolizm podstawowy komórki bakteryjnej [33].

Lekooporność stała się problemem na skalę światową. W celu „ratowania antybiotyków” wprowadzono regulacje prawne dotyczące ich stosowania. W 2006 r. Unia Europejska zakazała stosowania antybiotyków jako stymulatorów wzrostu w hodowlach zwierzęcych [1]. W Polsce minister zdrowia ogłosił „Narodowy Program Ochrony Antybiotyków” na lata 2011-2015, a zanieczyszczenia antybiotykami objęto badaniami kontrolnymi według Załącznika 1 rozporządzenia ministra rolnictwa i rozwoju wsi z 20 marca 2003 r. [39]. Działania te powinny być jednak wspomagane. Wiadomo, iż determinanty oporności rozprzestrzeniają się w środowisku.

Niemożliwe jest usunięcie wszystkich genów warunkujących lekooporność, ponieważ niektóre z nich peł- nią istotną rolę w funkcjonowaniu organizmu zupełnie niezwiązaną z antybiotykoopornością [33]. Można jedynie kontrolować pojawianie się, selekcjonowanie i rozprzestrzenienie tych genów w bakteriach, które mają kontakt z ludźmi, zwierzętami i roślinami [48]. Szansą jest spowolnienie procesu rozprzestrzeniania genów tworzących oporność.

Leczyć pacjenta czy środowisko?

Powstały nowe koncepcje walki z antybiotykooporno- ścią np. eco-evo – integrująca ekologię i biologię rozwoju czy eco-evo-devo – spajająca ekologię, ewolucję i biologię rozwoju [4]. Zwolennicy tych teorii uważają niszę, w której żyją antybiotykooporne bakterie za środowisko chore, które należy uzdrowić. Nie zakładają usuwania genów antybiotykooporności, ale proponują poszukiwanie związków, które będą hamowały rozprzestrzenianie antybiotykooporności i blokowały procesy prowadzące do powstania nowych determinantów wywołujących niewrażliwość na antybiotyki [4]. W myśl tej hipotezy zanieczyszczona antybiotykoopornością żywność może być leczona.

Dane literaturowe wskazują, iż można hamować m.in. koniugację czy rekombinację [4]. Udowodniono, że nienasycone kwasy tłuszczowe blokują koniugację plazmidu R388. Jest to działanie swoiste systemowo, czyli w obecności nienasyconych kwasów tłuszczowych zatrzymana jest tylko koniugacja wektorów z systemami koniugacyjnymi plazmidu R388 [10]. Również bardzo wydajnie blokują transfer przeciwciała przeciwko relaksazie plazmidu R388. Działają one swoiście plazmidowo, w komórkach biorcy plazmidu R388 [12]. Proces transferu koniugacyjnego plazmidu F może zostać zatrzymany przez białko gp3 z bakteriofaga M13, które wpływa negatywnie na proces formowania T4SS [23]. Bisfosfoniany są także proponowane jako inhibitory koniugacji [27]. Związki hamujące wymienione procesy są niezwykle specyficzne. Stąd też, aby „wyleczyć” produkty spo- żywcze z genów warunkujących antybiotykooporność należy poszczególne grupy produktów poznać. Uwolnienie żywności od tych genów jest trudne. Można jednak podjąć działania mające na celu np. zablokowanie transferu koniugacyjnego genów oporności w obrębie produktu spożywczego pozwalające na zahamowanie transferu genów do bakterii patogennych czy bakterii komensalnych organizmu człowieka.

Podsumowanie

W ostatnich latach wieloantybiotykooporne bakterie patogenne, komensalne i środowiskowe są identyfikowane na całym świecie. Podjęte działania mające na celu zmniejszenie liczby przepisywanych pacjentom antybiotyków i zakaz stosowania antybiotyków jako stymulatorów wzrostu zwierząt hodowlanych wydają się niewystarczające. Do niedawna antybiotykooporność była kojarzona jedynie ze środowiskiem szpitalnym. Szczegółowe zbadanie problemu wykazało, iż rezerwuarem genów lekooporności jest też żywność. Łańcuch pokarmowy może odgrywać znaczącą rolę w transmisji genów determinujących lekooporność między środowiskiem a człowiekiem. Usunięcie z produktów spożywczych genów antybiotykooporności jest niemoż- liwe. Można jedynie kontrolować pojawianie się, selekcję i rozprzestrzenianie genów AR. Częściową kontrolę procesu zapewniają substancje blokujące koniugacyjny transfer plazmidów/transpozonów opornościowych. Proponowane działania łączą ewolucję i ekologię, dzięki czemu mogą zmniejszyć szerzenie się antybiotykooporności w środowisku.

Pełna treść artykułu