Abstrakt

Precyzyjne modyfikacje genomów wprowadzane z dużą wydajnością są istotne do zrozumienia, jaki wpływ na procesy biologiczne i stany chorobowe mają konkretne geny lub inne elementy genomu. W ostatnich latach pojawiły się nowe metody swoistych modyfikacji genomów, określane jako edycja genomu a wykorzystujące tzw. „programowane” nukleazy. Prawdziwą rewolucję w edycji genomu przyniosło zastosowanie systemu CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated), w którym główną rolę odgrywa jedna z tego typu nukleaz, Cas9. System wykorzystuje elementy mechanizmu nabytej odporności bakterii i archeonów na infekcję fagami i transformację obcym materiałem genetycznym. Mikroorganizmy włączają do loci CRISPR w swoim genomie fragmenty obcego DNA, co umożliwia w przyszłości szybkie rozpoznanie i zwalczenie infekcji. Istnieje kilka typów CRISPR-Cas wśród prokariotów, jednak w inżynierii genomowej zastosowanie znalazły narzędzia oparte na systemie CRISPR typu II. CRISPR-Cas typu II wykorzystuje małe cząsteczki RNA (crRNA i tracrRNA) do precyzyjnego nakierowania pojedynczej nukleazy efektorowej – Cas9 – na konkretne miejsce w genomie. To miejsce to sekwencja komplementarna do crRNA. Cas9 może być wykorzystana do: (i) wprowadzania trwałych zmian w genomie (typu knock-out i knock-in) m.in. w procesach modyfikacji genetycznych zwierząt lub linii komórkowych, (ii) aktywacji bądź wyciszenia ekspresji wybranych genów czy (iii) wizualizacji konkretnych miejsc w genomie żywych komórek. Narzędzia oparte na systemie CRISPR-Cas znalazły zastosowanie przy tworzeniu zwierzęcych i komórkowych modeli wielu chorób, np. konkretnych typów nowotworów. W przyszłości, edycja genomu wykorzystująca programowane nukleazy może znaleźć szerokie zastosowanie w medycynie m.in. do walki z chorobami o podłożu genetycznym, a także w terapii osób zakażonych wirusem HIV.

Wprowadzenie

Klasyczna metoda inaktywacji bądź wprowadzenia dodatkowych genów (knock-out i knock-in) w organizmach zwierzęcych polega na ukierunkowanej modyfikacji DNA w macierzystych komórkach embrionalnych (ESC, embryonic stem cells) z wykorzystaniem zjawiska rekombinacji homologicznej [10]. Wprowadzany obcy DNA (np. gen oporności na antybiotyk, gdy celem jest uzyskanie zwierząt knock-out lub gen oporno- ści na antybiotyk wraz z sekwencją kodującą, o którą wzbogaca się genom zwierząt knock-in) otoczony jest sekwencjami homologicznymi do DNA w miejscu pożądanej integracji. Główną przeszkodą w uzyskiwaniu szczepów zwierząt ze swoistymi modyfikacjami jest niska wydajność integracji transgenu w swoistym locus, np. dla mysich ESC szacowana na 10-5-10-7 [10]. Wiele czynników może wpływać na częstotliwość swoistej integracji, np. metoda wprowadzania wektorów do komórek czy długość ramion homologii matrycy donorowej [10,81].

Badania prowadzone pod koniec lat 80. i z początkiem lat 90. ub.w. wykazały, że dwuniciowe pęknięcie helisy DNA (DSB, double-strand break) w obrębie sekwencji docelowej drastycznie zwiększa częstotliwość rekombinacji homologicznej [71,72]. Pęknięcia DNA w komórkach eukariotycznych są naprawiane w dwojaki sposób: przez łączenie nici w  procesie niehomologicznej naprawy rekombinacyjnej (NHEJ, non-homologous end joining) lub przez rekombinację homologiczną (ryc. 1). Modyfikacje genomu z  użyciem programowanych nukleaz opierają się na katalizowaniu powstawania dwuniciowych pęknięć w helisie DNA przez te enzymy w miejscu wybranym przez eksperymentatora i są określane jako edycja genomu (genome editing). Historia edycji genomu komórek ssaczych miała początek w latach 90. ub.w. Po raz pierwszy wykazano wtedy możliwość modyfikacji genomu z użyciem endonukleaz, określanych jako samonaprowadzające endonukleazy (homing endonucleases), znalezionych u prokariotów i niższych eukariotów. Białka te nazywa się również meganukleazami, ze względu na to, że rozpoznają długie sekwencje w DNA, liczące 14-40 par zasad. Dobrze poznanymi meganukleazami są m.in. enzymy: I-SceI, obecny w mitochondriach drożdży Saccharomyces cerevisiae [35] czy I-CreI, którego występowanie opisano w chloroplastach zielenicy Chlamydomonas reinhardtii [79]. Znacząca długość rozpoznawanej sekwencji jest zarówno zaletą jak i największym ograniczeniem w stosowaniu meganukleaz. Zaletą, gdyż warunkuje dużą swoistość, a co za tym idzie niewielką genotoksyczność po wprowadzeniu meganukleaz do komórek ssaczych; ograniczenie, gdyż rozpoznawane przez nie sekwencje występują ekstremalnie rzadko w genomie komórek ssaczych. Próby stworzenia nowych meganukleaz rozpoznających pożądane sekwencje nie przyniosły dobrych rezultatów, głównie przez brak jasnego powiązania między sekwencją aminokwasową meganukleaz a swoistością rozpoznawania konkretnej sekwencji DNA.

Programowane nukleazy

Przełomem okazało się stworzenie nukleaz z domeną palca cynkowego (zinc finger nucleases, ZFN). ZFN to białka fuzyjne, łączące domeny wiążące DNA bazujące na eukariotycznych czynnikach transkrypcyjnych z działającą nieswoiście domeną nukleazową enzymu restrykcyjnego klasy IIS, FokI (ryc. 2). Domena FokI odpowiedzialna za hydrolizę DNA jest aktywna tylko jako dimer [4]. Aby doszło do wygenerowania pęknięć w helisie DNA jest potrzebna para ZFN, w której każda z domen wiążących DNA rozpoznaje sekwencję o długości 9-18 par zasad. Stworzenie białek rozpoznających konkretną sekwencję jest zazwyczaj trudne, czasochłonne i kosztowne w związku z koniecznością stworzenia osobnej pary białek dla każdej targetowanej sekwencji. ZFN charakteryzują się także dość znaczną cytotoksycznością, związaną najczęściej ze zjawiskiem niepożądanej hydrolizy innych niż targetowana, lecz podobnych do niej, sekwencji w genomie, tzw. sekwencji off-target [17].

W ciągu ostatnich kilku lat możliwości edycji genomu poszerzyły się o narzędzia, takie jak białka TALEN (TALE nucleases) [6]. Nukleazy te są podobne do ZFN, jednak domeny z motywem palca cynkowego zostały zastąpione domenami wiążącymi DNA z białek bakterii z rodzaju Xanthomonas. Bakterie Xanthomonas, będące patogenami roślin, wykorzystują białka TALE (transcription activator-like effectors) do regulacji transkrypcji w komórkach gospodarza. Domena wiążąca DNA białka TALE składa się z kilkunastu do kilkudziesięciu powtórzeń sekwencji 33-35 aminokwasów, z których każdy segment jest odpowiedzialny za rozpoznawanie pojedynczej pary zasad w DNA (ryc. 2). Dzięki prostemu kodowi odpowiadają- cemu za rozpoznawanie poszczególnych nukleotydów w DNA, technologia wykorzystująca TALEN charakteryzuje się dużą skutecznością w tworzeniu funkcjonalnych nukleaz. Ponadto, białka TALEN charakteryzują się mniejszą cytotoksycznością w porównaniu do ZFN [60]. Cechy te zadecydowały o popularności nukleaz TALEN jako narzędzi do precyzyjnej edycji genomu komórek eukariotycznych.

Alternatywą powyższych metod jest system CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated), w którym za swoistość rozpoznawania DNA odpowiada nie jak w przypadku ZFN czy TALEN białko, ale krótka, komplementarna cząsteczka RNA (ryc. 2). Jest to dość powszechny system odporności nabytej bakterii i archeonów przeciwko obcym elementom genetycznym, jak plazmidy czy wirusowe kwasy nukleinowe [86]. Loci CRISPR zidentyfikowano w genomach około 45% bakterii i 83% archeonów [59]. Zwykle organizmy mają jeden lub dwa loci CRISPR, chociaż u archeona Methanocaldococcus jannaschii zidentyfikowano aż 18 różnych loci CRISPR[9].

Historia badań nad systemem crispr-cas

Elementy systemu CRISPR po raz pierwszy zidentyfikowano w  1987 r. [86]. Opisano wtedy występowanie w genomie Escherichia coli loci złożonych z 29-nukleotydowych powtórzeń prostych (direct repeats) zawierają- cych sekwencje palindromowe, porozdzielanych przez 32-nukleotydowe różnorodne odcinki DNA – sekwencje rozdzielające (spacers). W późniejszych latach podobne loci, choć różniące się długością sekwencji powtórzonych i rozdzielających znaleziono u innych gatunków bakterii. Loci takie są poprzedzone lub oflankowane genami białek Cas, a  obecność niektórych Cas stanowi podstawę do podziału loci CRISPR na trzy typy (zob. niżej). Funkcja loci CRISPR pozostawała nieznana, dopóki nie zauważono, że sekwencje rozdzielające są identyczne z plazmidowym czy wirusowym DNA [7,58]. Doniesienia te pozwoliły wysunąć hipotezę, że CRISPR jest śladem po infekcjach i pełni rolę systemu odporności przeciwko infekcjom fagowym i inwazji obcych elementów genetycznych [7]. Barrangou i wsp. wykazali, że integracja krótkiej sekwencji DNA fagowego do locus CRISPR bakterii Streptococcus thermophilus zapewnia odporność na infekcję fagiem, z którego pochodziła włączona sekwencja, a także innym, blisko spokrewnionym wirulentnym bakteriofagiem zawierającym w  genomie sekwencję o stuprocentowej zgodności do tej zintegrowanej z locus CRISPR [2]. Ponadto wykazano, że insercja bądź delecja sekwencji wywodzących się z fagowego DNA koreluje odpowiednio ze zmniejszoną bądź zwiększoną podatnością na infekcję tym fagiem [2]. Dalsze eksperymenty potwierdziły udział CRISPR w degradacji obcych kwasów nukleinowych: głównie DNA, ale także RNA [30,73].

Crispr-cas jako system nabytej odporności mikroorganizmów – mechanizm działania

W działaniu systemu CRISPR-Cas można wyróżnić trzy zasadnicze etapy: adaptację, ekspresję i interferencję (ryc. 3). Podczas adaptacji, krótki fragment pochodzący z wirusowego lub plazmidowego DNA (tzw. protospacer) jest włączany do locus CRISPR [2,25]. Długość włączanych sekwencji różni się znacznie między organizmami i wynosi 21-72 nukleotydów; najczęściej są to fragmenty 32-38-nukleotydowe. Insercja zachodzi preferencyjnie na jednym z końców locus, tzw. końcu liderowym (leader end); każdej integracji towarzyszy duplikacja końcowej sekwencji powtórzonej tak, aby zachowana została architektura: powtórzenie proste-sekwencja rozdzielająca-powtórzenie proste [94]. Długość powtórzeń prostych także jest gatunkowo swoista i wynosi 24-47 nukleotydów, chociaż typowo mieści się w przedziale 28-37 nukleotydów [28]. Dokładny mechanizm integracji nowych sekwencji rozdzielających i duplikacji koń- cowego powtórzenia nie jest znany; postuluje się udział białek Cas w tym procesie. Jako najistotniejsze wskazuje się dwie endonukleazy: Cas1 oraz Cas2 [2,8,25,94]. Za ich udziałem w procesie przemawia to, że włączanie nowych sekwencji rozdzielających jest niemożliwe w przypadku mutacji cas1 i cas2 [19]. Ponadto, białka Cas1 i Cas2 są zbędne w pozostałych procesach związanych z biogenezą i działaniem komponentów systemu CRISPR-Cas [8,20]. Wybór sekwencji, która ma zostać włączona do locus CRISPR (na tym etapie określanej jako prekursor sekwencji rozdzielającej, protospacer) zdaje się być podyktowany obecnością motywu PAM (protospacer adjacent motif) na jednym z końców tej sekwencji [25,57]. Motywy PAM składają się z kilku nukleotydów (zazwyczaj 2-5) i róż- nią się od siebie w zależności od typu systemu CRISPR- -Cas [57]. Konieczność występowania PAM na końcu sekwencji protospacer dla systemu CRISPR typu II wykazali Deveau i wsp. dowodząc, że mutacje fagowego DNA w obrębie sekwencji PAM pozwalają wirusowi uniknąć inaktywacji przez enzymy gospodarza [21]. Brak motywu PAM w obrębie powtórzeń prostych w genomie bakterii chroni bakteryjny DNA przed hydrolizą przez komponenty systemu CRISPR-Cas (przynajmniej w przypadku typu I i II) [85].

Następnym krokiem, po etapie adaptacji, jest ekspresja. Powstaje wtedy długi pierwotny transkrypt, obejmujący wszystkie sekwencje powtórzone i  wszystkie sekwencje rozdzielające, który podlega obróbce do dojrzałych CRISPR RNA (crRNA), częściowo komplementarnych do sekwencji obcych elementów genetycznych [8]. Dojrzewanie prekursorowego RNA jest katalizowane przez endorybonukleazy działające albo w wielopodjednostkowym kompleksie, np. w kompleksie Cascade (CRISPR-associated complex for antiviral defence) zidentyfikowanym w E. coli [8] lub jako pojedyncze enzymy, np. nukleaza Cas6 w Pyrococcus furiosus [11]. Badając system CRISPR-Cas bakterii Streptococcus pyogenes odkryto mechanizm dojrzewania prekursorowego RNA kierowany przez cząsteczkę małego RNA, kodowanego w locus CRISPR, o sekwencji częściowo komplementarnej z pre- -crRNA, nazwanego tracrRNA (trans-activating crRNA) [20]. W tym przypadku hydroliza pre-crRNA jest katalizowana przez bakteryjną RNazę III w obecności Cas9.

Ostatnim etapem procesu jest interferencja prowadząca do degradacji obcego materiału genetycznego. W wyniku asocjacji crRNA z białkami Cas powstają kompleksy rybonukleoproteinowe zdolne do rozpoznawania swoistych sekwencji kwasów nukleinowych i hydrolizy wiązań fosfodiestrowych w ich obrębie. Rozpoznawanie obcych elementów genetycznych polega na oddzia- ływaniu crRNA z komplementarną sekwencją w obcym DNA (stanowiącą jedną z nici sekwencji protospacer) lub w obcym transkrypcie. Sekwencja ta może być obecna zarówno w obszarze kodującym białko jak i poza nim [2,8]. W wyniku działania nukleaz z rodziny Cas obie nici obcego DNA w obrębie sekwencji komplementarnej do crRNA ulegają przecięciu [25].

Podział systemów crispr-cas

Systemy CRISPR-Cas zostały podzielone na trzy główne typy (typ I, II i III) oraz dwanaście podtypów, w zależ- ności od organizacji i zawartości genetycznej danego locus, a  także od mechanizmu działania [52]. Występowanie genów cas1 i cas2 jest wspólne dla wszystkich trzech typów; obecność genu cas3, cas9 lub cas10 stanowi wyznacznik przynależności do odpowiedniego typu I, II i III. Loci CRISPR typu II zidentyfikowano jedynie w szczepach bakteryjnych, natomiast loci typu I i III znajdowane są zarówno u bakterii jak i archeonów. W systemach typu I i III w rozpoznawaniu i niszczeniu obcego kwasu nukleinowego uczestniczą duże kompleksy białek związane z crRNA. W systemie CRISPR-Cas typu I za obróbkę prekursorowego RNA odpowiadają endorybonukleazy z  rodziny Cas6. Rozpoznawanie sekwencji docelowej odbywa się z udziałem wielopodjednostkowego kompleksu Cascade. Za trawienie docelowej sekwencji jest odpowiedzialne białko niewchodzące w skład kompleksu Cascade, Cas3 [74]. Motyw PAM jest obecny na końcu 5’ tej nici DNA sekwencji protospacer, która jest (znaczeniowo) identyczna z crRNA.

Wśród systemów CRISPR typu III wyróżnia się dwa podtypy: A  i  B, którym początkowo przypisywano różną swoistość. Cząsteczkami docelowymi dla podtypu IIIA jest DNA i jak niedawno dowiedziono, także powstały na jego matrycy RNA [55,73]; locus CRISPR typu IIIB, przynajmniej in vitro, odpowiada za trawienie jednoniciowego RNA [30,96]. Podobnie jak w typie I, za obróbkę pre-crRNA odpowiadają endorybonukleazy z  rodziny Cas6, jednak w odróżnieniu od typu I, crRNA podlega dodatkowemu cięciu przez nieznaną nukleazę, dzięki czemu powstaje heterogenna populacja dojrzałych crRNA, różniących się długością [31]. W przypadku obu podtypów niszczenie obcych elementów genetycznych wymaga obecności wielopodjednostkowego kompleksu, w skład którego wchodzi Cas10. Dla typu IIIA kompleks ten nazwano Csm, dla typu IIIB – Cmr [52]. W podtypie IIIA trawienie DNA i RNA przez Csm odbywa się niezależnie, angażując inne miejsca aktywne w obrębie kompleksu Csm. Białko Cas10, unikalne dla CRISPR-Cas typu III, odpowiada tu za aktywność nukleolityczną wzglę- dem DNA; hydroliza RNA wymaga natomiast aktywności innego białka kompleksu, Csn3 [73]. Nie udało się jeszcze zidentyfikować sekwencji PAM dla typu III loci CRISPR i przypuszcza się, że nie wymagają one tego typu motywów. Wiadomo jednak, że cięcie obcego DNA in vivo przez Csm wymaga braku homologii między 5’ końcem crRNA (tzw. „crRNA tag”, zawierający 8-nukleotydowy motyw pochodzący z powtórzenia prostego) a obszarem sąsiadującym z końcem 5’ targetowanego DNA [56,73]. Ten wymóg braku homologii uważany jest za mechanizm ochrony bakterii przed niszczeniem własnego DNA przez system CRISPR-Cas typu III. W genomie bakterii obszar sąsiadujący z sekwencją protospacer taką homologię oczywiście wykazuje. Występowanie homologii hamuje proces trawienia DNA, nie wpływa natomiast na hydrolizę RNA [73].

System CRISPR typu II różni się zasadniczo od typów I i III. Nie występuje tu ani swoista endonukleaza odpowiedzialna tylko za obróbkę pre-crRNA, ani wielobiał- kowy kompleks odpowiedzialny za degradację obcych DNA lub RNA. Charakterystyczna dla tego systemu jest natomiast cząsteczka niewielkiego RNA nazwana tracrRNA. Locus CRISPR typu II zawiera zazwyczaj trzy lub cztery geny cas, wśród których obecny jest cas9 (ryc. 4). Cas9 (znane również pod nazwą Csn1) to duże, wielodomenowe białko zawierające dwie domeny nukleazowe: domenę HNH oraz RuvC. Każda z tych domen odpowiada za trawienie jednej nici obcego DNA [34]. Oprócz cas9, w locus CRISPR typu II (tak jak w typach I i III) wystę- pują geny cas1 i cas2. Zgodnie z obecnie przyjętą klasyfikacją, wśród loci typu II wyróżnić można trzy podtypy: A, B oraz C. Przynależność do jednego z podtypów jest zależna od obecności innych genów cas w danym locus. I tak dla podtypu IIA charakterystyczny jest gen csn2, którego produkt, białko Csn2, bierze udział w integracji nowych sekwencji rozdzielających [2]. Podtyp IIB charakteryzuje się obecnością genu cas4. Cas4 ma (przynajmniej in vitro) aktywność egzonukleazy działającej na jednoniciowy DNA [41,95], jednak dokładna rola tego białka w systemie CRISPR-Cas nie została jeszcze wyja- śniona. Loci składające się tylko z minimalnego zestawu genów cas (cas9, cas1 i cas2) zostały sklasyfikowane jako podtyp IIC. Dla wszystkich trzech podtypów kluczowa dla obróbki pre-crRNA jest cząsteczka tracrRNA: niekodującego RNA, o sekwencji częściowo komplementarnej do RNA powstającego na matrycy powtórzeń prostych. W przeciwieństwie do typu I i III, typ II nie ma swoistej endorybonukleazy poświęconej hydrolizie pre-crRNA. Dwuniciowy RNA, złożony z pre-crRNA i tracrRNA, jest substratem dla bakteryjnej RNazy III; hydroliza wiązań w obrębie obu nici RNA następuje tylko w obecności Cas9 [20]. Dojrzałe cząsteczki crRNA pozostają związane z tracrRNA i w kompleksie z nukleazą Cas9, uczestnicząc w rozpoznawaniu i degradacji przez Cas9 obcych DNA. Motyw PAM występuje na końcu 3’ sekwencji tej nici DNA sekwencji protospacer, która jest (znaczeniowo) identyczna z crRNA.

Edycja genomu z wykorzystaniem crispr-cas9

Pierwszym krokiem do wprowadzenia modyfikacji w konkretnym miejscu w genomie jest wyindukowanie powstania DSB w tym rejonie. Dwuniciowe pęknięcia są naprawiane przeważnie przez niehomologiczne łączenie końców, w wyniku czego może dojść do zmiany pierwotnej sekwencji nukleotydów w DNA lub do powstania mutacji typu indel (insercja/delecja). Jeżeli mutacje typu indel pojawią się w  sekwencji kodującej białko, mogą doprowadzić do przesunięcia ramki odczytu genu i pojawienia się przedwczesnych kodonów STOP (PSC, premature stop codon), kończących translację. Choć transkrypcja może przebiegać bez zakłóceń, to nie powstaje funkcjonalne białko. Na ogół nie powstaje też skrócony (do miejsca występowania PSC) peptyd, ponieważ w komórce kodujące go mRNA są usuwane w procesie degradacji transkryptów niosących przedwczesny kodon stop. Poza NHEJ, do naprawy DSB może dojść w procesie rekombinacji homologicznej. Mechanizm ten może być wykorzystany do wprowadzenia ściśle określonych zmian w danym locus: mutacji punktowych, insercji (np. wprowadzenie metki do sekwencji kodującej białko czy zastąpienie segmentu DNA fragmentem kodującym gen markerowy) czy ściśle zdefiniowanych delecji (np. usunięcie sekwencji kodującej fragment białka).

Działanie naturalnych systemów CRISPR-Cas typu II w bakteriach różni się nieco od działania systemu stosowanego do edycji genomu. W  systemach będących narzędziem do precyzyjnej modyfikacji genomowego DNA komórek eukariotycznych nie ma etapu adaptacji; aby wprowadzić zmiany w pożądanym miejscu genomu niezbędne elementy systemu muszą być dostarczone komórce „z  zewnątrz”. Ich ekspresja jest zazwyczaj przejściowa, ale powoduje wprowadzenie stałych zmian w genomie. Targetowany DNA można uznać za odpowiednik sekwencji protospacer.

Pierwsze doniesienia o mutacjach wprowadzonych do genomu komórek ssaczych z wykorzystaniem systemu CRISPR-Cas9 pojawiły się na początku 2013 r. [16,54]. System CRISPR-Cas został z sukcesem wykorzystany do modyfikacji genomu zarówno ludzkich jak i zwierzęcych linii komórkowych, jak i całych organizmów: roślin (m. in. rzodkiewnika pospolitego, tytoniu czy ryżu) i zwierząt: myszy, szczurów, królików, makaków jawajskich, nicienia Caenorhabditis elegans, danio pręgowanego, muszki owocowej, jedwabnika morwowego, a  także zwierząt o znaczeniu gospodarczym: świń, kóz i bydła [48,62,64,77,90]. W inżynierii genomowej zastosowanie znalazły narzędzia oparte na CRISPR typu II. W przeciwieństwie do typów I i III, których poprawne funkcjonowanie wymaga wielopodjednostkowych kompleksów białkowych, działanie typu II opiera się na pojedynczej nukleazie, Cas9. Cong i wsp. udowodnili, że jedynymi komponentami wymaganymi do precyzyjnego cięcia DNA w  komórkach eukariotycznych są crRNA, tracrRNA oraz Cas9 [16]. Dojrzewanie prekursorowego crRNA zachodzi bez udziału bakteryjnej RNazy III, prawdopodobnie zastępowanej przez jeszcze niezidentyfikowaną eukariotyczną nukleazę. System może być uproszczony przez zastosowanie chimerycznego RNA (określanego mianem single-guide RNA, sgRNA lub guide RNA, gRNA), stanowiącego połączenie crRNA z tracrRNA [16,34,54] (ryc. 5). Początkowe eksperymenty wskazywały na większą wydajność wprowadzania mutacji za pomocą Cas9 (pochodzącej ze S. pyogenes, dalej określanej jako SpCas9), crRNA i  tracrRNA w  porównaniu do SpCas9 wraz z sgRNA [16]. W eksperymentach wykorzystano architekturę sgRNA(+48), zawierającą jedynie 48 nukleotydów pochodzących z tracrRNA. Wydłużenie sekwencji tracrRNA na końcu 3’ w kolejnych zmodyfikowanych architekturach – sgRNA(+67) i sgRNA(+85) – znacząco poprawiło wydajność wprowadzania mutacji systemu opartego na sgRNA [33].

Wybór targetowanej sekwencji

Aby wyindukować powstanie DSB w wybranym miejscu w genomie z wykorzystaniem narzędzi opartych o CRISPR-Cas pochodzący z bakterii S. pyogenes, trzeba wprowadzić do komórki, której genom jest modyfikowany, enzym Cas9 oraz sgRNA. Wykorzystuje się w tym celu plazmid kodujący oba elementy lub RNA po transkrypcji in vitro. Część sgRNA, odpowiadającą za rozpoznawanie docelowego DNA stanowi dwadzieścia nukleotydów na jego końcu 5’. Ten fragment sgRNA jest więc komplementarny do jednej, a tym samym tożsamy z drugą nicią targetowanej sekwencji DNA.

Hydroliza DNA przez Cas9 wymaga obecności motywu PAM ulokowanego bezpośrednio za targetowaną sekwencją (sekwencją targetowaną określamy nić DNA identyczną z  sgRNA). Sekwencje PAM rozpoznawane przez różne ortologi Cas9 różnią się znacząco między sobą. Na przykład dla systemu wykorzystującego nukleazę Cas9 ze Streptococcus pyogenes najbardziej wydajne cięcie zachodzi wtedy, gdy targetowany obszar sąsiaduje z motywem 5’-NGG [34,57]. Cięcie może zachodzić również z niewielką wydajnością w obecności innych, niekanonicznych sekwencji PAM, np. 5’-NAG [33] czy 5’-NGA [97]. Cas9 pochodzące z  innych organizmów wymagają odmiennych motywów PAM, np. S. thermophilus szczepu DGCC7710 potrzebuje sekwencji 5’-NNAGAAW (CRISPR1; W oznacza A lub T) lub 5’-NGGNG (CRISPR3) [21,36], a Cas9 z Neisseria meningitidis – 5’-NNNNGATT [32]. Mutanty SpCas9 mogą rozpoznawać inne sekwencje PAM niż SpCas9 typu dzikiego (5’-NGAN, 5’-NGNG i 5’-NGCG odpowiednio w mutantach D1135V/R1335Q/ T1337R, D1135E/R1335Q/T1337R i  D1135V/G1218R/ R1335E/T1337R) [38], co znacząco zwiększa liczbę moż- liwych do modyfikacji miejsc w genomie.

Do syntezy sgRNA w komórkach eukariotycznych wykorzystuje się endogenną polimerazę RNA III, umieszczając transgen pod kontrolą odpowiedniego promotora, często promotora U6. Wydajna transkrypcja z tego promotora wymaga obecności guanylanu na końcu 5’ targetowanej sekwencji. Ograniczenie to można pominąć przez dodanie jednej lub dwóch, niewystępujących w targetowanej sekwencji, nukleotydów guaninowych na końcu 5’ sgRNA [14,15]. W przeciwieństwie do ZFN i TALEN, nukleaza Cas9 jest zdolna do cięcia metylowanego DNA [33].

Jednoczesne cięcie wielu loci

Natura systemu CRISPR-Cas umożliwia jednoczesną transkrypcję wielu pre-crRNA, a co za tym idzie – targetowanie wielu loci jednocześnie. W tym celu wystarczy między sekwencje pre-crRNA dodać sekwencję powtórzenia prostego. Cong i wsp. wykorzystali taką strategię do wprowadzenia mutacji w  DNA komórek HEK293 jednocześnie w loci EMX1 i PVALB [16]. Zamiast pary crRNA-tracrRNA można wykorzystać sgRNA: albo przez jednoczesną transfekcję plazmidami kodującymi różne sgRNA, albo konstruując wektor kodujący kilka sgRNA jednocześnie (ekspresja każdego sgRNA znajduje się wówczas pod kontrolą osobnego promotora). Multipleksowość stwarza możliwość nie tylko jednoczesnego targetowania kilku loci [16,44,48,62,90], ale także wprowadzania dużych delecji (sięgających nawet milionów par zasad) [22,44,88], inwersji [5,44,50,88] czy translokacji [40,50] (ryc. 5).

Cięcie niepożądanych loci

CRISPR-Cas jest jedynym narzędziem inżynierii genomowej, w  którym swoistość rozpoznawanej sekwencji opiera się na parowaniu zasad DNA-RNA zgodnie z modelem Watsona-Cricka, a nie jak w przypadku ZFN czy TALEN na oddziaływaniach białko-DNA. Chociaż ekspresja komponentów systemu w komórkach ssaczych nie wiąże się z widocznymi objawami cytotoksyczności [54], przy wykorzystaniu systemu CRISPR-Cas także może dochodzić do indukowania mutacji w niepożądanych loci [18,23,33]. Według Fu i wsp., tolerowana jest niezgodność nawet do pięciu par zasad między crRNA i komplementarnym do niego odcinkiem DNA [23]. Badania z użyciem nieaktywnej katalitycznie Cas9 (dCas9) wykazały, że białko to może się wiązać do regionów, w których niedopasowanie sgRNA i DNA wynosi nawet dziewięć nukleotydów [39]. Mimo to, w eksperymentach z wykorzystaniem aktywnej nukleazy Cas9 dla większości przetestowanych sekwencji sgRNA nie wykryto mutacji w innych niż w pełni komplementarne loci. Warto zaznaczyć, że sekwencje off-target, do których preferencyjnie wiązała się dCas9, były miejscami podatnymi na trawienie DNazą I (takie jak np. promotory genów, regiony 5’ UTR oraz eksony). Sugeruje to, że struktura chromatyny ma bardzo duży wpływ na zdolność wiązania dCas9 [39]. Cięcie sekwencji off-target zachodzi z większą wydajno- ścią przy wysokich stężeniach Cas9-sgRNA [33,63,83].

Według ostatnich doniesień, nukleaza Cas9 jest zdolna do cięcia sekwencji DNA nie w pełni zgodnych z crRNA (lub z fragmentem odpowiadającym crRNA w obrębie sgRNA) nie tylko w przypadku występowania niekomplementarnych par nukleotydów, ale także wtedy, gdy między crRNA i DNA występują niewielkie, 1-4-nukleotydowe insercje lub delecje [43]. Przekłada się to na występowanie niewielkich wypętleń w obrębie crRNA, gdy w genomowym DNA występuje delecja lub wypę- tleń DNA, gdy targetowany DNA jest dłuższy niż komplementarny crRNA. Zdolność Cas9 do hydrolizy wiązań fosfodiestrowych w DNA zależy w tym przypadku także od umiejscowienia wypętleń. Wang i wsp., wykorzystując zdolność włączania się nieintegrujących wektorów lentiwirusowych do DNA w miejscu występowania DSB, wykazali, że CRISPR-Cas może indukować powstawanie pęknięć DNA w miejscach o większej, sięgającej nawet 13, liczbie niekomplementarnych nukleotydów [83]. Jednak gdy uwzględni się możliwość tworzenia wypętleń, w tym przypadku przez crRNA, liczba niekomplementarnych par nukleotydów zmniejszy się do jednej.

Początkowo w badaniach swoistości systemu CRISPR-Cas9 sugerowano istnienie tzw. sekwencji rdzeniowej (seed sequence) w crRNA, obejmującej około 12 nukleotydów bliższych sekwencji PAM. Wszelkie niedopasowania w jej obrębie miały być mniej tolerowane, niż niezgodności we fragmencie bardziej oddalonym od PAM [16,34]. Późniejsze badania dowiodły, że swoistość systemu zależy nie tylko od liczby oraz pozycji, ale także rozkładu niekomplementarnych par nukleotydów [23,33].

Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo cięcia niepo- żądanych sekwencji, można wykorzystać wersję Cas9 z mutacją punktową znoszącą aktywność jednej z domen nukleazowych (D10A w obrębie domeny RuvC lub H840A w domenie HNH) [70], a więc powodującą, że enzym przecina tylko jedną nić DNA (ryc. 5). Cas9 z unieczynnioną jedną z domen nukleazowych jest określana jako nikaza (Cas9n). Aby uzyskać wówczas inaktywację wybranego genu można wykorzystać zjawisko naprawy przez rekombinację homologiczną, używając nici donorowej, służącej jako matryca w procesie rekombinacji, z wersją genu zawierającą kodon stop. Innym sposobem jest użycie dwóch sgRNA, targetujących sąsiadujące miejsca w obu niciach [70] (ryc. 5). Każdy sgRNA będzie indukował hydrolizę wiązania fosfodiestrowego w obrębie tylko jednej nici DNA; zastosowanie dwóch sgRNA doprowadzi do powstania pęknięcia obu nici DNA w  niewielkiej odległości od siebie. Pęknięcia takie są naprawiane w procesie niehomologicznego łączenia końców, prowadząc do pojawienia się mutacji typu indel. Metoda taka gwarantuje zdecydowanie większą swoistość, gdyż prawdopodobieństwo występowania blisko siebie w genomie dwóch sekwencji rozpoznawanych przez odrębne sgRNA jest znikome, a jednoniciowe pęknięcia w miejscach off- -target w znakomitej większości są naprawiane przez wycięcie zasady (BER, base excision repair) – mechanizm nieindukujący mutacji. Takie podejście pozwoliło zmniejszyć częstotliwość cięcia niepożądanych loci od 50 do nawet 1500 razy w stosunku do Cas9 typu dzikiego [70], jednak nie wyeliminowała ich zupełnie. System wykorzystujący dwa sgRNA i  Cas9n(D10A) do mutacji niektórych loci nadal może indukować powstawanie niepożądanych mutacji w  innych miejscach genomu [29,80]. Częstotliwość niechcianych zmian w genomie można także zredukować, wykorzystując wersję fuzyjną białka dCas9 z  domeną nukleazową FokI (fCas9). FokI może działać tylko jako dimer, co kilkakrotnie podnosi swoistość systemu w stosunku do Cas9n kierowanych dwoma sgRNA [29,80]. Ogranicza to jednak liczbę miejsc w genomie podatnych na modyfikację, ponieważ fCas9 wymaga obecności dwóch sekwencji PAM w odpowiedniej odległości i orientacji, przy czym zakres tolerowanych odległości jest znacznie mniejszy niż w przypadku Cas9n. Istnieje zatem pula genów, dla których nie da się zaprojektować sgRNA współdziałających z fCas9.

Innym sposobem obniżenia aktywności off-target jest zastosowanie sgRNA z częścią komplementarną do targetowanego miejsca skróconą do 17-18 nukleotydów [24]. Takie sgRNA może wykazywać nawet kilkutysięczny spadek aktywności off-target, nie wpływając na wydajność cięcia w targetowanym locus [24]. Skrócone sgRNA mogą być także wykorzystane z Cas9n, dodatkowo obni- żając częstość wprowadzania mutacji w niepożądanych loci [87].

Wykorzystanie edycji genomu w badaniach naukowych, medycynie i biotechnologii

CRISPR-Cas stwarza niezwykłe możliwości edycji genomu, nieograniczające się jedynie do tworzenia linii komórkowych czy zwierząt typu knock-out. Niżej przedstawiono kilka ciekawych możliwości wykorzystania systemu CRISPR-Cas.

Tworzenie zwierzęcych i komórkowych modeli chorób

Wykorzystanie systemu CRISPR-Cas umożliwia znacznie bardziej wydajne, tańsze i szybsze uzyskiwanie transgenicznych zwierząt w stosunku do metod tradycyjnych, opartych tylko na zjawisku rekombinacji homologicznej. Aby wprowadzić zmianę w  określonym miejscu genomu metodą klasyczną niezbędne jest użycie ESC, które są później wszczepiane do blastocysty. Chimeryczne potomstwo musi być krzyżowane ze zwierzętami typu dzikiego, aby wyodrębnić osobniki, w których pożą- dana modyfikacja występuje w komórkach rozrodczych. Takie osobniki trzeba po raz kolejny krzyżować, tym razem między sobą, aby wyodrębnić zwierzęta z modyfikacjami w obu allelach. Edycja genomu wykorzystująca system CRISPR-Cas omija ten problem, gdyż zamiast ESC wykorzystuje zapłodnione komórki jajowe, a dzięki temu otrzymanie zwierząt z biallelicznymi modyfikacjami możliwe jest już w pierwszym pokoleniu. Ponadto, CRISPR-Cas pozwala na tworzenie transgenicznych zwierząt, których otrzymanie klasycznymi metodami było kłopotliwe lub nawet niemożliwe z powodu m.in. trudności z izolacją funkcjonalnych ESC, stanowiących podstawę klasycznej transgenezy [76]. Stosując CRISPR-Cas przełamano tę barierę i uzyskano chimeryczne króliki i naczelne [76,84].

Dzięki systemowi CRISPR-Cas można tworzyć zwierzęce modele chorób genetycznych. Mutacje wprowadzane do genomu zwierzęcia mogą odzwierciedlać mutacje znajdowane u osób cierpiących na poszczególne choroby. Możliwość edycji wielu loci jednocześnie pozwala na tworzenie zwierzęcych modeli chorób wielogenowych.

Aby zmodyfikować dany locus, do komórki jajowej zapłodnionej in vitro, za pomocą mikromanipulatora wprowadza się zazwyczaj transkrypty Cas9 i sgRNA. Stosuje się na ogół „gotowy” RNA a nie plazmid kodujący Cas9 i sgRNA, gdyż wydajność modyfikacji danego locus jest wówczas większa. Taka strategia umożliwiła generację wielu gatunków transgenicznych zwierząt, m.in. myszy, szczurów, królików czy nawet makaka jawajskiego [49,62,90,93]. Wiele genów jest jednak niezbędnych do prawidłowego rozwoju zwierząt w życiu płodowym i ich inaktywacja prowadzi do śmierci. Pomocne w  takich sytuacjach są mutanty warunkowe, w których inaktywacja danego genu zachodzi tylko w niektórych tkankach. Do niedawna większość zwierząt z mutacjami warunkowymi tworzona była w oparciu o rekombinację homologiczną. Wzbogacenie tej techniki o system CRISPR-Cas znacząco podniosło jej efektywność. W  literaturze można odnaleźć liczne przykłady zastosowania techniki CRISPR-Cas do wyprowadzania mutantów warunkowych myszy, szczurów, muszek owocowych czy danio pręgowanych [27,49,91,93].

Wykorzystanie systemu CRISPR-Cas dostarczanego do komórek przez wektory wirusowe umożliwiło wprowadzanie mutacji w komórkach dorosłych zwierząt in vivo. Po wprowadzeniu wektorów adenowirusowych lub lentiwirusowych targetujących geny Alk i Eml4 do płuc myszy w części komórek dochodziło do inwersji fragmentu mię- dzy targetowanymi sekwencjami i tworzenia onkogennego białka fuzyjnego Eml4-Alk [5,50]. Ekspresja takiego białka fuzyjnego prowadziła do rozwoju nowotworów płuc u badanych zwierząt. Analogiczne mutacje znajduje się w niektórych przypadkach ludzkiego niedrobnokomórkowego nowotworu płuc. Stworzono więc znakomity model zwierzęcy choroby o konkretnym podłożu genetycznym. Jednak wykorzystanie wektorów lentiwirusowych niesie za sobą ryzyko mutagenezy insercyjnej, wektory adenowirusowe są natomiast immunogenne. Rozwiązaniem tych problemów mogło być wykorzystanie, jako wektorów, wirusów związanych z adenowirusami (AAV, adeno-associated viruses), ale użycie ich do dostarczenia elementów CRISPR-Cas do komórek dorosłych osobników wymagało przezwyciężenia dodatkowej przeszkody, związanej z ich ograniczoną pojemnością. Wielkość powszechnie stosowanej nukleazy Cas9 z  S. pyogenes uniemożliwiała wykorzystanie pojedynczego wektora AAV. Stało się to możliwe dzięki wykorzystaniu ortologa Cas9 z bakterii Staphylococcus aureus, charakteryzującego się znacznie mniejszym rozmiarem [69].

Wizualizacja swoistych miejsc w genomie żywych komórek

Tradycyjne techniki umożliwiające wizualizację swoistych miejsc w genomie, jak FISH (fluorescence in situ hybridization), wymagają utrwalenia komórek i denaturacji DNA [67], co wyklucza badanie stanu chromatyny podczas procesów zachodzących w  żywych komórkach. Dzięki zastosowaniu nieaktywnej katalitycznie Cas9 (dCas9) połączonej z białkiem fluorescencyjnym i  współdziałającej z  odpowiednio zaprojektowanymi sgRNA, możliwa stała się wizualizacja konkretnych, interesujących badacza, miejsc w genomie żywych komó- rek [1,12]. Takie podejście pozwoliło np. na obserwację dynamiki i  organizacji chromatyny podczas różnych procesów komórkowych czy na lokalizację poszczególnych loci w jądrze komórkowym. Do wizualizacji sekwencji repetytywnych (np. telomerów) wystarcza jeden sgRNA [12]; wizualizacja sekwencji nierepetytywnych np. genu kodującego jakieś białko wymaga zastosowania wielu sgRNA (ich liczba waha się między 26 a 36) zawierających sekwencje komplementarne do różnych fragmentów genu [12]. Wykorzystując różnorodne ortologi dCas9 połączone z białkami fluorescencyjnymi odmiennych kolorów, możliwe jest jednoczesne znakowanie kilku loci [47], a przez to np. wyznaczanie rzeczywistych odległości między interesującymi loci. Metoda ta może się stać niezwykle pomocna przy badaniu architektury jądra komórkowego lub stopnia kondensacji chromatyny w danym obszarze chromosomu.

Aktywacja bądź wyciszanie ekspresji wybranych genów

Nieaktywna katalitycznie wersja Cas9, dCas9, przy jednoczesnej ekspresji sgRNA lub crRNA komplementarnego do nici matrycowej DNA, może być wykorzystana do hamowania transkrypcji wybranych genów. System działa wydajnie w komórkach bakterii [3,68], hamując inicjację lub elongację, zależnie od położenia docelowej sekwencji względem miejsca startu transkrypcji [3]. W komórkach eukariotycznych osiąga się jedynie umiarkowane zahamowanie transkrypcji i to nie we wszystkich badanych loci [68]. Wydajność represji transkrypcji można znacznie zwiększyć przez fuzję dCas9 z domeną represorową, np. domeną KRAB [26,37,68]. Wyciszanie ekspresji genów wykorzystujące system CRISPR zostało nazwane CRISPRi (CRISPR interference) [68]. CRISPRi może być alternatywą dla wyciszania ekspresji genów za pomocą interferującego RNA. CRISPRi działa na poziomie DNA, a  nie RNA (jak interferujący RNA), dzięki czemu można osiągnąć znaczne wyciszenie ekspresji interesującego genu targetując obszar promotorowy genu, a nie tylko sekwencję kodującą [26].

dCas9 może być także przekształcona w aktywator transkrypcji przez dołączenie domeny transaktywującej, jak VP16 (w trzech lub czterech kopiach, nazywanych odpowiednio VP48 i VP64) czy domenę aktywującą z białka p65 [26,37,51,53,65]. Aby osiągnąć wydajną aktywację transkrypcji wybranego genu, trzeba dostarczyć kilka różnych sgRNA, zwykle 2-10. Takie jednoczesne wprowadzenie kilku sgRNA ma działanie synergistyczne – skutkuje większą indukcją ekspresji niż wynikałoby to z sumy efektów pojedynczych sgRNA [51,65].

Spersonalizowana medycyna

Zastosowanie systemu CRISPR-Cas wpływa zasadniczo na poprawę wydajności naprawy przez rekombinację homologiczną [54]. Skuteczne wprowadzenie obcego DNA w  wybrane miejsce w  genomie pozwala m.in. zamienić zmutowany gen na jego poprawną wersję. Zjawisko to mogłoby być w przyszłości wykorzystane w  leczeniu chorób jednogenowych, jak na przykład dystrofia mięśniowa Duchenne’a czy mukowiscydoza.

Aby zmienić gen na jego poprawną wersję wykorzystując mechanizm naprawy przez rekombinację homologiczną, oprócz elementów systemu CRISPR-Cas (sgRNA i Cas9) trzeba jednocześnie wprowadzić do komórki matrycę zawierającą poprawną wersję genu. Taka matryca musi być oflankowana sekwencjami homologicznymi do targetowanego miejsca – są to tzw. ramiona homologii. Jako matrycę donorową wykorzystuje się zwykle plazmidowy DNA (ramiona homologii są zazwyczaj długości 500-1000 par zasad każde) lub krótkie fragmenty jednoniciowego DNA (ssDNA; jego długość wynosi zwykle 40-100 nukleotydów). Wydajność rekombinacji wykorzystującej ssDNA jako matrycę donorową, mimo znacznie zredukowanej długości ramion homologii, może być większa w stosunku do wydajności osiąganej z użyciem plazmidowego DNA [13].

Badania tego rodzaju przeprowadzano już na zwierzę- tach. Long i wsp. naprawili gen dystrofiny w embrionach myszy mdx niosących mutację nonsensowną w  eksonie 23 genu Dmd [46]. Co ciekawe, w  wyniku działania CRISPR-Cas do naprawy mutacji nonsensownej doszło w 2-100% alleli. Naprawa mutacji w zaledwie 17% alleli okazała się wystarczająca do tego, aby ekspresja dystrofiny we włóknach mięśniowych była na podobnym poziomie, jak u myszy typu dzikiego. Wśród myszy, w których został skorygowany gen dystrofiny zidentyfikowano zwierzęta, w których zaszła rekombinacja z udziałem matrycy donorowej, jak również takie, w których kodon stop został usunięty w procesie NHEJ. Stosując wektory AAV udało się częściowo przywrócić ekspresję funkcjonalnej dystrofiny w miocytach i kardiomiocytach myszy w okresie życia płodowego, po urodzeniu, a także u dorosłych zwierząt [45,61].

U ludzi, mutacje w obrębie genu kodującego dystrofinę wywołujące dystrofię mięśniową Duchenne’a (DMD) to często duże zmiany, takie jak utrata lub duplikacja jednego lub kilku eksonów. Jednak najczęściej bezpośrednią przyczyną choroby nie jest brak jakiejś domeny białka, lecz całkowity lub prawie całkowity brak dystrofiny spowodowany zmianą ramki odczytu i pojawieniem się przedwczesnego kodonu stop skutkującym degradacją mRNA. Edycja genomu polegająca na wprowadzeniu zmian przywracających prawidłową ramkę odczytu (przez usunięcie fragmentu genu lub naprawę przez rekombinację czy też zmiany typu indel) mogłaby doprowadzić do pojawienia się aktywnej dystrofiny [42]. Analiza znanych mutacji w genie dystrofiny u pacjentów pozwoliła na przedstawienie opinii, że aż 80% chorych miałoby szansę na częściowe przywrócenie funkcjonalnego białka dzięki edycji genomu (np. z wykorzystaniem CRISPR-Cas) [45,61]. Potwierdzeniem takiej możliwości było uzyskanie ekspresji dystrofiny w indukowanych komórkach pluripotencjalnych (iPSCs) wyprowadzonych z fibroblastów pacjenta z dystrofią wywołaną brakiem 44 eksonu [42]. Wyniki badań wskazują, że długotrwały efekt terapeutyczny można byłoby uzyskać wprowadzając zmiany w genomie komórek satelitowych mięśni [75].

Inna grupa wykazała możliwość naprawy mutacji w  genie HBB, kodującym hemoglobinę beta, w  iPSCs wyprowadzonych z fibroblastów osób cierpiących na beta-talasemię [89]. Komórki, w  których doszło do naprawy genu HBB, po zróżnicowaniu do erytroblastów odzyskiwały ekspresję hemoglobiny beta. Komórki iPSCs wyprowadzane z komórek pacjentów cierpiących na choroby genetyczne, po naprawie wadliwych genów z  wykorzystaniem programowanych nukleaz mogą w przyszłości stanowić źródło komórek do autoprzeszczepów.

Yin i wsp. przedstawili możliwość naprawy zmutowanego genu u dorosłych osobników – udało im się zmienić zmutowany gen hydroksylazy fumarylooctanowej (Fah) w hepatocytach myszy Fah5981SB [92]. Zwierzęta te stanowią model dziedzicznej tyrozynemii typu I. Wektor kodujący sgRNA i SpCas9 oraz matrycę do rekombinacji – jednoniciowy DNA – dostarczono do wątroby przez iniekcję hydrodynamiczną do żyły ogonowej. Początkowa częstość naprawy genu Fah wyniosła około 0,4%. Gdy zaprzestano podawania takim zwierzętom inhibitora szlaku rozkładu tyrozyny dochodziło do ekspansji hepatocytów Fah+ – po 30 dniach od ostawienia inhibitora hepatocyty Fah+ stanowiły już ponad 30% wszystkich hepatocytów. Naprawa zmutowanego genu przez jego zamianę na postać prawidłową ma znaczną przewagę nad klasyczną strategią polegającą na dostarczaniu do komórek dodatkowych, prawidłowych kopii genu – skorygowany gen będzie funkcjonował w swoim naturalnym otoczeniu, co pozwoli ominąć np. problem nienaturalnego poziomu ekspresji transgenu.

Wykorzystanie systemu CRISPR-Cas nie ogranicza się jedynie do naprawy mutacji leżących u podstaw chorób genetycznych. CRISPR-Cas niedawno z  sukcesem wykorzystano do inaktywacji genu CCR5 w  ludzkich komórkach CD4+ [82]. CCR5 jest celem wielu terapii skierowanych przeciwko wirusowi HIV, gdyż receptor ten jest wykorzystywany przez wirusa do zakażania limfocytów T. W ostatnich latach publikowano doniesienia o skutecznej inaktywacji CCR5 z wykorzystaniem nukleazy ZFN i TALEN [60,66]. Pierwsze testy kliniczne z wykorzystaniem ZFN do inaktywacji genu CCR5 w komórkach krwi pobranych od pacjentów zarażonych wirusem HIV wykazały skuteczność terapii: po transfuzji zmutowanych komórek poziom RNA wirusa zmniejszył się (u jednego z czterech pacjentów, którzy ukończyli próbę kliniczną, poziom spadł poniżej progu detekcji) [78]. Wykorzystanie Cas9 zamiast ZFN czy TALEN może umoż- liwić bardziej wydajne wprowadzanie mutacji, a dodatkowo obniżyć koszty przedsięwzięcia.

Przypisy

• 1. Anton T., Bultmann S., Leonhardt H., Markaki Y.: Visualization ofspecific DNA sequences in living mouse embryonic stem cells witha programmable fluorescent CRISPR/Cas system. Nucleus, 2014; 5:163-172
  Google Scholar
• 2. Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyaval P.,Moineau S., Romero D.A., Horvath P.: CRISPR provides acquired resistanceagainst viruses in prokaryotes. Science, 2007; 315: 1709-1712
  Google Scholar
• 3. Bikard D., Jiang W., Samai P., Hochschild A., Zhang F., MarraffiniL.A.: Programmable repression and activation of bacterial geneexpression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic AcidsRes., 2013; 41: 7429-7437
  Google Scholar
• 4. Bitinaite J., Wah D.A., Aggarwal A.K., Schildkraut I.: FokI dimerizationis required for DNA cleavage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1998; 95: 10570-10575
  Google Scholar
• 5. Blasco R.B., Karaca E., Ambrogio C., Cheong T.C., Karayol E., MineroV.G., Voena C., Chiarle R.: Simple and rapid in vivo generationof chromosomal rearrangements using CRISPR/Cas9 technology.Cell Rep., 2014; 9: 1219-1227
  Google Scholar
• 6. Bogdanove A.J., Voytas D.F.: TAL effectors: customizable proteinsfor DNA targeting. Science, 2011; 333: 1843-1846
  Google Scholar
• 7. Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., Ehrlich S.D.: Clustered regularlyinterspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacersof extrachromosomal origin. Microbiology, 2005; 151: 2551-2561
  Google Scholar
• 8. Brouns S.J., Jore M.M., Lundgren M., Westra E.R., Slijkhuis R.J.,Snijders A.P., Dickman M.J., Makarova K.S., Koonin E.V., van der OostJ.: Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science,2008; 321: 960-964
  Google Scholar
• 9. Bult C.J., White O., Olsen G.J., Zhou L., Fleischmann R.D., SuttonG.G., Blake J.A., FitzGerald L.M., Clayton R.A., Gocayne J.D., KerlavageA.R., Dougherty B.A., Tomb J.F., Adams M.D., Reich C.I. i wsp.: Completegenome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcusjannaschii. Science, 1996; 273: 1058-1073
  Google Scholar
• 10. Capecchi M.R.: Altering the genome by homologous recombination.Science, 1989; 244: 1288-1292
  Google Scholar
• 11. Carte J., Wang R., Li H., Terns R.M., Terns M.P.: Cas6 is an endoribonucleasethat generates guide RNAs for invader defense inprokaryotes. Genes Dev., 2008; 22: 3489-3496
  Google Scholar
• 12. Chen B., Gilbert L.A., Cimini B.A., Schnitzbauer J., Zhang W., LiG.W., Park J., Blackburn E.H., Weissman J.S., Qi L.S., Huang B.: Dynamicimaging of genomic loci in living human cells by an optimizedCRISPR/Cas system. Cell, 2013; 155: 1479-1491
  Google Scholar
• 13. Chen F., Pruett-Miller S.M., Huang Y., Gjoka M., Duda K., Taunton J., Collingwood T.N., Frodin M., Davis G.D.: High-frequency genomeediting using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.Nat. Methods, 2011; 8: 753-755
  Google Scholar
• 14. Cho S.W., Kim S., Kim J.M., Kim J.S.: Targeted genome engineeringin human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat.Biotechnol., 2013; 31: 230-232
  Google Scholar
• 15. Cho S.W., Kim S., Kim Y., Kweon J., Kim H.S., Bae S., Kim J.S.:Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guidedendonucleases and nickases. Genome Res., 2014; 24: 132-141
  Google Scholar
• 16. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., WuX., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang F.: Multiplex genome engineeringusing CRISPR/Cas systems. Science, 2013; 339: 819-823
  Google Scholar
• 17. Cornu T.I., Thibodeau-Beganny S., Guhl E., Alwin S., EichtingerM., Joung J.K., Cathomen T.: DNA-binding specificity is a major determinantof the activity and toxicity of zinc-finger nucleases. Mol.Ther., 2008; 16: 352-358
  Google Scholar
• 18. Cradick T.J., Fine E.J., Antico C.J., Bao G.: CRISPR/Cas9 systemstargeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity.Nucleic Acids Res., 2013; 41: 9584-9592
  Google Scholar
• 19. Datsenko K.A., Pougach K., Tikhonov A., Wanner B.L., SeverinovK., Semenova E.: Molecular memory of prior infections activatesthe CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system. Nat. Commun.,2012; 3: 945
  Google Scholar
• 20. Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y.,Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E.: CRISPR RNA maturationby trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature,2011; 471: 602-607
  Google Scholar
• 21. Deveau H., Barrangou R., Garneau J.E., Labonté J., Fremaux C.,Boyaval P., Romero D.A., Horvath P., Moineau S.: Phage response toCRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. J. Bacteriol.,2008; 190: 1390-1400
  Google Scholar
• 22. Essletzbichler P., Konopka T., Santoro F., Chen D., Gapp B.V., KralovicsR., Brummelkamp T.R., Nijman S.M., Bürckstümmer T.: Megabase-scaledeletion using CRISPR/Cas9 to generate a fully haploidhuman cell line. Genome Res., 2014; 24: 2059-2065
  Google Scholar
• 23. Fu Y., Foden J.A., Khayter C., Maeder M.L., Reyon D., Joung J.K.,Sander J.D.: High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Casnucleases in human cells. Nat. Biotechnol., 2013; 31: 822-826
  Google Scholar
• 24. Fu Y., Sander J.D., Reyon D., Cascio V.M., Joung J.K.: ImprovingCRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat.Biotechnol., 2014; 32: 279-284
  Google Scholar
• 25. Garneau J.E., Dupuis M.E., Villion M., Romero D.A., BarrangouR., Boyaval P., Fremaux C., Horvath P., Magadán A.H., Moineau S.:The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophageand plasmid DNA. Nature, 2010; 468: 67-71
  Google Scholar
• 26. Gilbert L.A., Larson M.H., Morsut L., Liu Z., Brar G.A., Torres S.E.,Stern-Ginossar N., Brandman O., Whitehead E.H., Doudna J.A., LimW.A., Weissman J.S., Qi L.S.: CRISPR-mediated modular RNA-guidedregulation of transcription in eukaryotes. Cell, 2013; 154: 442-451
  Google Scholar
• 27. Gratz S.J., Ukken F.P., Rubinstein C.D., Thiede G., Donohue L.K.,Cummings A.M., O›Connor-Giles K.M.: Highly specific and efficientCRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.Genetics, 2014; 196: 961-971
  Google Scholar
• 28. Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C.: The CRISPRdb database andtools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers andrepeats. BMC Bioinformatics, 2007; 8: 172
  Google Scholar
• 29. Guilinger J.P., Thompson D.B., Liu D.R.: Fusion of catalyticallyinactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genomemodification. Nat. Biotechnol., 2014; 32: 577-582
  Google Scholar
• 30. Hale C.R., Zhao P., Olson S., Duff M.O., Graveley B.R., Wells L.,Terns R.M., Terns M.P.: RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA–Cas protein complex. Cell, 2009; 139: 945-956
  Google Scholar
• 31. Hatoum-Aslan A., Samai P., Maniv I., Jiang W., Marraffini L.A.:A ruler protein in a complex for antiviral defense determines thelength of small interfering CRISPR RNAs. J. Biol. Chem., 2013; 288:27888-27897
  Google Scholar
• 32. Hou Z., Zhang Y., Propson N.E., Howden S.E., Chu L.F., SontheimerE.J., Thomson J.A.: Efficient genome engineering in humanpluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 2013; 110: 15644-15649
  Google Scholar
• 33. Hsu P.D., Scott D.A., Weinstein J.A., Ran F.A., Konermann S.,Agarwala V., Li Y., Fine E.J., Wu X., Shalem O., Cradick T.J., MarraffiniL.A., Bao G., Zhang F.: DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9nucleases. Nat. Biotechnol., 2013; 31: 827-832
  Google Scholar
• 34. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., CharpentierE.: A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease inadaptive bacterial immunity. Science, 2012; 337: 816-821
  Google Scholar
• 35. Jurica M.S., Stoddard B.L.: Homing endonucleases: structure,function and evolution. Cell. Mol. Life Sci., 1999; 55: 1304-1326
  Google Scholar
• 36. Karvelis T., Gasiunas G., Miksys A., Barrangou R., Horvath P.,Siksnys V.: crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interferencein Streptococcus thermophilus. RNA Biol., 2013; 10: 841-851
  Google Scholar
• 37. Kearns N.A., Genga R.M., Enuameh M.S., Garber M., Wolfe S.A.,Maehr R.: Cas9 effector-mediated regulation of transcription anddifferentiation in human pluripotent stem cells. Development, 2014;141: 219-223
  Google Scholar
• 38. Kleinstiver B.P., Prew M.S., Tsai S.Q., Topkar V.V., Nguyen N.T.,Zheng Z., Gonzales A.P., Li Z., Peterson R.T., Yeh J.R., Aryee M.J., JoungJ.K.: Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.Nature, 2015; 523: 481-485
  Google Scholar
• 39. Kuscu C., Arslan S., Singh R., Thorpe J., Adli M.: Genome-wideanalysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9endonuclease. Nat. Biotechnol., 2014; 32: 677-683
  Google Scholar
• 40. Lagutina I.V., Valentine V., Picchione F., Harwood F., ValentineM.B., Villarejo-Balcells B., Carvajal J.J., Grosveld G.C.: Modeling ofthe human alveolar rhabdomyosarcoma Pax3-Foxo1 chromosometranslocation in mouse myoblasts using CRISPR-Cas9 nuclease. PLoSGenet., 2015; 11: e1004951
  Google Scholar
• 41. Lemak S., Nocek B., Beloglazova N., Skarina T., Flick R., BrownG., Joachimiak A., Savchenko A., Yakunin A.F.: The CRISPR-associatedCas4 protein Pcal_0546 from Pyrobaculum calidifontis contains a [2Fe–2S] cluster: crystal structure and nuclease activity. Nucleic AcidsRes., 2014; 42: 11144-11155
  Google Scholar
• 42. Li H.L., Fujimoto N., Sasakawa N., Shirai S., Ohkame T., SakumaT., Tanaka M., Amano N., Watanabe A., Sakurai H., Yamamoto T.,Yamanaka S., Hotta A.: Precise correction of the dystrophin gene inDuchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stemcells by TALEN and CRISPR-Cas9. Stem Cell Reports, 2015; 4: 143-154
  Google Scholar
• 43. Lin Y., Cradick T.J., Brown M.T., Deshmukh H., Ranjan P., SarodeN., Wile B.M., Vertino P.M., Stewart F.J., Bao G.: CRISPR/Cas9 systemshave off-target activity with insertions or deletions betweentarget DNA and guide RNA sequences. Nucleic Acids Res., 2014; 42:7473-7485
  Google Scholar
• 44. Liu Y., Ma S., Wang X., Chang J., Gao J., Shi R., Zhang J., Lu W., LiuY., Zhao P., Xia Q.: Highly efficient multiplex targeted mutagenesisand genomic structure variation in Bombyx mori cells using CRISPR/Cas9. Insect. Biochem. Mol. Biol., 2014; 49: 35-42
  Google Scholar
• 45. Long C., Amoasii L., Mireault A.A., McAnally J.R., Li H., Sanchez–Ortiz E., Bhattacharyya S., Shelton J.M., Bassel-Duby R., Olson E.N.:Postnatal genome editing partially restores dystrophin expressionin a mouse model of muscular dystrophy. Science, 2016; 351: 400-403
  Google Scholar
• 46. Long C., McAnally J.R., Shelton J.M., Mireault A.A., Bassel-DubyR., Olson E.N.: Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediatedediting of germline DNA. Science, 2014; 345:1184-1188
  Google Scholar
• 47. Ma H., Naseri A., Reyes-Gutierrez P., Wolfe S.A., Zhang S., PedersonT.: Multicolor CRISPR labeling of chromosomal loci in humancells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2015; 112: 3002-3007
  Google Scholar
• 48. Ma S., Chang J., Wang X., Liu Y., Zhang J., Lu W., Gao J., Shi R.,Zhao P., Xia Q.: CRISPR/Cas9 mediated multiplex genome editingand heritable mutagenesis of BmKu70 in Bombyx mori. Sci. Rep.,2014; 4: 4489
  Google Scholar
• 49. Ma Y., Zhang X., Shen B., Lu Y., Chen W., Ma J., Bai L., Huang X.,Zhang L.: Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Res., 2014; 24: 122-125
  Google Scholar
• 50. Maddalo D., Manchado E., Concepcion C.P., Bonetti C., VidigalJ.A., Han Y.C., Ogrodowski P., Crippa A., Rekhtman N., de StanchinaE., Lowe S.W., Ventura A.: In vivo engineering of oncogenic chromosomalrearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature,2014; 516: 423-427
  Google Scholar
• 51. Maeder M.L., Linder S.J., Cascio V.M., Fu Y., Ho Q.H., Joung J.K.:CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nat.Methods, 2013; 10: 977-979
  Google Scholar
• 52. Makarova K.S., Haft D.H., Barrangou R., Brouns S.J., CharpentierE., Horvath P., Moineau S., Mojica F.J., Wolf Y.I., Yakunin A.F., van derOost J., Koonin E.V.: Evolution and classification of the CRISPR-Cassystems. Nat. Rev. Microbiol., 2011; 9: 467-477
  Google Scholar
• 53. Mali P., Aach J., Stranges P.B., Esvelt K.M., Moosburner M., KosuriS., Yang L., Church G.M.: CAS9 transcriptional activators for targetspecificity screening and paired nickases for cooperative genomeengineering. Nat. Biotechnol., 2013; 31: 833-838
  Google Scholar
• 54. Mali P., Yang L., Esvelt K.M., Aach J., Guell M., DiCarlo J.E., NorvilleJ.E., Church G.M.: RNA-guided human genome engineering viaCas9. Science, 2013; 339: 823-826
  Google Scholar
• 55. Marraffini L.A., Sontheimer E.J.: CRISPR interference limits horizontalgene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science,2008; 322: 1843-1845
  Google Scholar
• 56. Marraffini L.A., Sontheimer E.J.: Self versus non-self discriminationduring CRISPR RNA-directed immunity. Nature, 2010; 463:568-571
  Google Scholar
• 57. Mojica F.J., Diez-Villasenor C., Garcia-Martinez J., AlmendrosC.: Short motif sequences determine the targets of the prokaryoticCRISPR defence system. Microbiology, 2009; 155: 733-740
  Google Scholar
• 58. Mojica F.J., Diez-Villasenor C., Garcia-Martinez J., Soria E.: Interveningsequences of regularly spaced prokaryotic repeats derivefrom foreign genetic elements. J. Mol. Evol., 2005; 60: 174-182
  Google Scholar
• 59. Mojica F.J., Diez-Villasenor C., Soria E., Juez G.: Biological significanceof a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea,Bacteria and mitochondria. Mol. Microbiol., 2000; 36: 244-246
  Google Scholar
• 60. Mussolino C., Morbitzer R., Lütge F., Dannemann N., Lahaye T.,Cathomen T.: A novel TALE nuclease scaffold enables high genomeediting activity in combination with low toxicity. Nucleic Acids Res.,2011; 39: 9283-9293
  Google Scholar
• 61. Nelson C.E., Hakim C.H., Ousterout D.G., Thakore P.I., MorebE.A., Rivera R.M., Madhavan S., Pan X., Ran F.A., Yan W.X., Asokan A.,Zhang F., Duan D., Gersbach C.A.: In vivo genome editing improvesmuscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.Science, 2016; 351: 403-407
  Google Scholar
• 62. Niu Y., Shen B., Cui Y., Chen Y., Wang J., Wang L., Kang Y., Zhao X.,Si W., Li W., Xiang A.P., Zhou J., Guo X., Bi Y., Si C. i wsp: Generationof gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated genetargeting in one-cell embryos. Cell, 2014; 156: 836-843
  Google Scholar
• 63. Pattanayak V., Lin S., Guilinger J.P., Ma E., Doudna J.A., Liu D.R.:High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA–programmed Cas9 nuclease specificity. Nat. Biotechnol., 2013; 31:839-843
  Google Scholar
• 64. Pennisi E.: The CRISPR craze. Science, 2013; 341: 833-836
  Google Scholar
• 65. Perez E.E., Wang J., Miller J.C., Jouvenot Y., Kim K.A., Liu O.,Wang N., Lee G., Bartsevich V.V., Lee Y.L., Guschin D.Y., RupniewskiI., Waite A.J., Carpenito C., Carroll R.G. i wsp: Establishment of HIV-1resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases.Nat. Biotechnol., 2008; 26: 808-816
  Google Scholar
• 66. Perez-Pinera P., Kocak D.D., Vockley C.M., Adler A.F., KabadiA.M., Polstein L.R., Thakore P.I., Glass K.A., Ousterout D.G., LeongK.W., Guilak F., Crawford G.E., Reddy T.E., Gersbach C.A.: RNA-guidedgene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.Nat. Methods, 2013; 10: 973-976
  Google Scholar
• 67. Price C.M.: Fluorescence in situ hybridization. Blood Rev., 1993;7: 127-134
  Google Scholar
• 68. Qi L.S., Larson M.H., Gilbert L.A., Doudna J.A., Weissman J.S.,Arkin A.P., Lim W.A.: Repurposing CRISPR as an RNA-guided platformfor sequence-specific control of gene expression. Cell, 2013;152: 1173-1183
  Google Scholar
• 69. Ran F.A., Cong L., Yan W.X., Scott D.A., Gootenberg J.S., Kriz A.J.,Zetsche B., Shalem O., Wu X., Makarova K.S., Koonin E.V., Sharp P.A.,Zhang F.: In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.Nature, 2015; 520: 186-191
  Google Scholar
• 70. Ran F.A., Hsu P.D., Lin C.Y., Gootenberg J.S., Konermann S., TrevinoA.E., Scott D.A., Inoue A., Matoba S., Zhang Y., Zhang F.: Doublenicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editingspecificity. Cell, 2013; 154: 1380-1389
  Google Scholar
• 71. Rouet P., Smih F., Jasin M.: Expression of a site-specific endonucleasestimulates homologous recombination in mammalian cells.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994; 91: 6064-6068
  Google Scholar
• 72. Rudin N., Sugarman E., Haber J.E.: Genetic and physical analysisof double-strand break repair and recombination in Saccharomycescerevisiae. Genetics, 1989; 122: 519-534
  Google Scholar
• 73. Samai P., Pyenson N., Jiang W., Goldberg G.W., Hatoum-Aslan A.,Marraffini L.A.: Co-transcriptional DNA and RNA Cleavage duringType III CRISPR-Cas Immunity. Cell, 2015; 161: 1164-1174
  Google Scholar
• 74. Sinkunas T., Gasiunas G., Fremaux C., Barrangou R., Horvath P.,Siksnys V.: Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependenthelicase in the CRISPR/Cas immune system. EMBO J., 2011;30: 1335-1342
  Google Scholar
• 75. Tabebordbar M., Zhu K., Cheng J.K., Chew W.L., Widrick J.J.,Yan W.X., Maesner C., Wu E.Y., Xiao R., Ran F.A., Cong L., Zhang F.,Vandenberghe L.H., Church G.M., Wagers A.J.: In vivo gene editingin dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science, 2016;351: 407-411
  Google Scholar
• 76. Tachibana M., Sparman M., Ramsey C., Ma H., Lee H.S., PenedoM.C., Mitalipov S.: Generation of chimeric rhesus monkeys. Cell,2012; 148: 285-295
  Google Scholar
• 77. Tan W., Carlson D.F., Lancto C.A., Garbe J.R., Webster D.A., HackettP.B., Fahrenkrug S.C.: Efficient nonmeiotic allele introgressionin livestock using custom endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2013; 110: 16526-16531
  Google Scholar
• 78. Tebas P., Stein D., Tang W.W., Frank I., Wang S.Q., Lee G., SprattS.K., Surosky R.T., Giedlin M.A., Nichol G., Holmes M.C., GregoryP.D., Ando D.G., Kalos M., Collman R.G. i wsp: Gene editing of CCR5in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. N. Engl. J.Med., 2014; 370: 901-910
  Google Scholar
• 79. Thompson A.J., Yuan X., Kudlicki W., Herrin D.L.: Cleavage andrecognition pattern of a double-strand-specific endonuclease (I–creI) encoded by the chloroplast 23SrRNA intron of Chlamydomonasreinhardtii. Gene, 1992; 119: 247-251
  Google Scholar
• 80. Tsai S.Q., Wyvekens N., Khayter C., Foden J.A., Thapar V., ReyonD., Goodwin M.J., Aryee M.J., Joung J.K.: Dimeric CRISPR RNA-guidedFokI nucleases for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol.,2014; 32: 569-576
  Google Scholar
• 81. Vasquez K.M., Marburger K., Intody Z., Wilson J.H.: Manipulating the mammalian genome by homologous recombination. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 2001; 98: 8403-8410
  Google Scholar
• 82. Wang W., Ye C., Liu J., Zhang D., Kimata J.T., Zhou P.: CCR5 genedisruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guidedRNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One, 2014; 9:e115987
  Google Scholar
• 83. Wang X., Wang Y., Wu X., Wang J., Wang Y., Qiu Z., Chang T.,Huang H., Lin R.J., Yee J.K.: Unbiased detection of off-target cleavageby CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviralvectors. Nat. Biotechnol., 2015; 33: 175-178
  Google Scholar
• 84. Wang Y., Fan N., Song J., Zhong J., Guo X., Tian W., Zhang Q., CuiF., Li L., Newsome P.N., Frampton J., Esteban M.A., Lai L.: Generationof knockout rabbits using transcription activator-like effector nucleases.Cell Regen, 2014; 3: 3
  Google Scholar
• 85. Westra E.R., Semenova E., Datsenko K.A., Jackson R.N., WiedenheftB., Severinov K., Brouns S.J.: Type I-E CRISPR-cas systemsdiscriminate target from non-target DNA through base pairing-independentPAM recognition. PLoS Genet, 2013; 9: e1003742
  Google Scholar
• 86. Wiedenheft B., Sternberg S.H., Doudna J.A.: RNA-guided geneticsilencing systems in bacteria and archaea. Nature, 2012; 482: 331-338
  Google Scholar
• 87. Wyvekens N., Topkar V.V., Khayter C., Joung J.K., Tsai S.Q.: DimericCRISPR RNA-guided FokI-dCas9 nucleases directed by truncatedgRNAs for highly specific genome editing. Hum. Gene Ther.,2015; 26: 425-431
  Google Scholar
• 88. Xiao A., Wang Z., Hu Y., Wu Y., Luo Z., Yang Z., Zu Y., Li W., HuangP., Tong X., Zhu Z., Lin S., Zhang B.: Chromosomal deletions and inversionsmediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. NucleicAcids Res., 2013; 41: e141
  Google Scholar
• 89. Xie F., Ye L., Chang J.C., Beyer A.I., Wang J., Muench M.O., KanY.W.: Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specificiPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac. Genome Res.,2014; 24: 1526-1533
  Google Scholar
• 90. Yan Q., Zhang Q., Yang H., Zou Q., Tang C., Fan N., Lai L.: Generationof multi-gene knockout rabbits using the Cas9/gRNA system.Cell Regen, 2014; 3: 12
  Google Scholar
• 91. Yang H., Wang H., Shivalila C.S., Cheng A.W., Shi L., JaenischR.: One-step generation of mice carrying reporter and conditionalalleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell, 2013;154: 1370-1379
  Google Scholar
• 92. Yin H., Xue W., Chen S., Bogorad R.L., Benedetti E., Grompe M.,Koteliansky V., Sharp P.A., Jacks T., Anderson D.G.: Genome editingwith Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.Nat. Biotechnol., 2014; 32: 551-553
  Google Scholar
• 93. Yin L., Maddison L.A., Li M., Kara N., LaFave M.C., Varshney G.K.,Burgess S.M., Patton J.G., Chen W.: Multiplex conditional mutagenesisusing transgenic expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics,2015; 200: 431-441
  Google Scholar
• 94. Yosef I., Goren M.G., Qimron U.: Proteins and DNA elements essentialfor the CRISPR adaptation process in Escherichia coli. NucleicAcids Res., 2012; 40: 5569-5576
  Google Scholar
• 95. Zhang J., Kasciukovic T., White M.F.: The CRISPR associated proteinCas4 Is a 5› to 3› DNA exonuclease with an iron-sulfur cluster.PLoS One, 2012; 7: e47232
  Google Scholar
• 96. Zhang J., Rouillon C., Kerou M., Reeks J., Brugger K., GrahamS., Reimann J., Cannone G., Liu H., Albers S.V., NaismithJ.H., Spagnolo L., White M.F.: Structure and mechanism of theCMR complex for CRISPR-mediated antiviral immunity. Mol. Cell,2012; 45: 303-313
  Google Scholar
• 97. Zhang Y., Ge X., Yang F., Zhang L., Zheng J., Tan X., Jin Z.B., Qu J.,Gu F.: Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediatedDNA cleavage in human cells. Sci. Rep., 2014; 4: 5405
  Google Scholar

Pełna treść artykułu