Abstrakt

Zewnątrzkomórkowe pęcherzyki błonowe (EVs, extracellular vesicles), początkowo uważane za elementy zniszczonych komórek, okazały się niezwykle istotnym sposobem przekazywania informacji między komórkami, bez ich bezpośredniego kontaktu. Ze względu na powszechne występowanie EVs w komórkach organizmów zarówno jedno-, jak i wielokomórkowych należących do różnych grup systematycznych oraz ze względu na pełnioną rolę w komunikacji międzykomórkowej stały się przedmiotem licznych badań i dyskusji. EVs są uwalniane przez komórki prokariotyczne, jak i eukariotyczne, zarówno w warunkach in vivo, jak i in vitro. Chociaż uzyskiwane frakcje EVs są zwykle mieszaniną różnorodnych struktur pochodzenia błonowego wprowadzono klasyfikację pęcherzyków przede wszystkim na podstawie ich wielkości i prawdopodobnego mechanizmu powstawania. EVs jako nośniki informacji zawierają różnorodny materiał komórkowy, a jednak dzięki intensywnym pracom badawczym coraz więcej wiadomo o ich funkcji w różnego rodzaju procesach np. nowotworowych. W pracy przedstawiono obecny stan wiedzy na temat pęcherzyków błonowych biorących udział w szeroko pojętych interakcjach żywiciel-pasożyt, obejmujących inwazję i kolonizację żywiciela, ustalanie równowagi między partnerami czy modulację odpowiedzi immunologicznej żywiciela w czasie zarażenia. Poruszono kwestie potencjalnego wykorzystania pęcherzyków w immunoprofilaktyce oraz diagnostyce chorób inwazyjnych. Najwięcej miejsca poświęcono inwazjom spowodowanym przez pierwotniaki, ze szczególnym uwzględnieniem parazytoz o największym znaczeniu medycznym i społecznym w skali globalnej, co znajduje także swoje odzwierciedlenie w literaturze światowej. Zebrano także dość skąpe na razie doniesienia na temat udziału EVs w przebiegu inwazji wywoływanych przez gatunki pasożytnicze zaliczane do grupy helmintów.

Wstęp

Zewnątrzkomórkowe pęcherzyki błonowe (EVs, extracellular vesicles) stanowią podstawę komunikacji między komórkami, zarówno w systemach jedno-, jak i wielokomórkowych. Ze względu na uniwersalność i ogromne znaczenie biologiczne są przedmiotem dużego zainteresowania oraz intensywnych badań, czego wyrazem może być powstanie nowego czasopisma Journal of Extracellular Vesicles. EVs, traktowane początkowo tylko jako szczątki komórek (cellular debris), okazały się zasadniczym elementem horyzontalnego przekazywania informacji między różnymi komórkami, bez ich bezpośredniego kontaktu.

Akronim EVs oznacza heterogenną populację pęcherzyków, w większości kulistych, uwalnianych z komórek prokariotycznych i eukariotycznych, w warunkach in vivo i in vitro. Podstawą klasyfikacji EVs może być ich wielkość, gęstość, metoda izolacji czy obecność typowych markerów, jednak nawet oczyszczone frakcje EVs są mieszaniną różnorodnych pęcherzykowatych struktur pochodzenia błonowego. Biorąc pod uwagę wielkość i przypuszczalne szlaki biogenezy wyróżniono trzy klasy EVs:

• ciałka apoptotyczne (800-5000 nm, uwalniane podczas programowanej śmierci komórek),

• mikropęcherzyki zwane też ektosomami (50-1000 nm, formowane przez pączkowanie błony, zależne od Ca2+) i

• egzosomy (40-100 nm, najprawdopodobniej pochodzenia endocytarnego).

Pęcherzyki niosą różnorodny materiał komórkowy, któ- ry krąży w makroorganizmie w bardzo stabilnej postaci subkomórkowej. Elementami budulcowymi są peptydy, białka, miRNA, mRNA, DNA i lipidy. Ich kompozycja jest bardzo zróżnicowana, zależna od rodzaju komórki, co wykazano m.in. na podstawie profili RNA [12]. Budowę, mechanizm powstawania, wielorakie funkcje EVs, a zwłaszcza ich rolę w chorobach nowotworowych, omó- wiono już wcześniej w 2014 r. [54].

Szczególnie interesujący aspekt funkcji EVs dotyczy ich udziału w budowaniu złożonych relacji pasożyt-żywiciel i tym właśnie zagadnieniom, w odniesieniu do wybranych pasożytniczych pierwotniaków i robaków (helmintów), poświęcono niniejszy artykuł. Typowymi cechami inwazji pasożytniczych jest ich przewlekły charakter, co wskazuje, że układ odpornościowy żywicieli nie jest w stanie wyeliminować pasożytów, które stosują różne i bardzo wyrafinowane metody modyfikowania aktywności obronnej żywicieli, klasyfikowane jako unik odpornościowy, wyzysk molekularny i molekularne piractwo [13].W wyniku wieloletniej koewolucji pasożytów i ich żywicieli wytworzyły się skomplikowane wzajemne relacje, a w ich ukształtowaniu pierwszorzędną rolę odgrywają właśnie EVs, ponieważ są nośnikiem m.in. czynników zjadliwości i immunomodulatorów [2,49]. Ma to szczególne znaczenie w przypadku wewnątrzkomórkowych patogenów, któ- rych bezpośredni kontakt z układem odpornościowym jest ograniczony.

Pierwotniaki

Plasmodium (typ Apicomplexa), zarodziec malarii, atakuje człowieka i liczne gatunki zwierząt. Malaria pozostaje od lat najgroźniejszą chorobą pasożytniczą ludzi. Dane CDC (http://www.cdc.gov/malaria/about/facts.html) w Atlancie wskazują, że tylko w 2013 r. zanotowano na świecie 627 000 przypadków śmiertelnych, a ponad 3 mld osób żyje na terenach endemicznych tej parazytozy. Objawy ciężkich postaci malarii u ludzi, w tym malarii mózgowej, wiążą się bezpośrednio z silną indukcją odpowiedzi prozapalnej i zwiększonym uwalnianiem mikropęcherzyków przez komórki krwi zarażonych osób. Zaobserwowano, że u osób zarażonych P. vivax na terenie brazylijskiej Amazonii poziom tych struktur w osoczu podczas ostrej fazy choroby był znacząco wyższy niż w wiekowo zgodnej grupie osób zdrowych. Ponadto stwierdzono wyraźną liniową korelację między intensywnością uwalniania mikropęcherzyków przez płytki krwi a falą gorączki i długością fazy objawowej. Spadek poziomu krążących MVs okazał się także czułym biomarkerem skuteczności prowadzonej chemioterapii [8]. Mikropęcherzyki, głównie pochodzenia erytrocytarnego, wyizolowane od zarażonych myszy powodowały in vitro silną stymulację makrofagów, wyrażoną wzrostem ekspresji cząsteczek CD40 i wytwarzaniem TNF [10]. Aktywacja makrofagów nie angażowała jednak ani receptora TL4, ani cząsteczki adaptorowej MyD88. Nie jest też znany mechanizm uwalniania pęcherzyków, ponieważ dojrzałe erytrocyty nie mają żadnych wewnętrznych błon i maszynerii uczestniczącej w procesach egzo- i endocytozy. Sugeruje się udział w wydzielaniu mikropęcherzyków struktur cytoplazmatycznych wewnątrz erytrocytów zwanych szczelinami Maurera, które oddzielają się od błony wakuoli pasożytniczej [47]. Badania ilościowe wykazały, że erytrocyty zarażone Plasmodium wytwarzają 10-krotnie więcej EVs niż niezarażone, a maksimum uwalniania przypada na krótko przed opuszczeniem erytrocytów przez pasożyty [32]. W tym samym czasie znikają też szczeliny Maurera [24].

EVs uwalniane przez erytrocyty zarażone P. falciparum (zwane też egzosomopodobnymi) są narzędziem komunikowania się pasożytów, umożliwiając im synchronizację i zamknięcie złożonego cyklu rozwojowego, obejmującego fazę bezpłciową i płciową, którym towarzyszą zmiany form rozwojowych. Punktem wyjścia do sformułowania tego wniosku była obserwacja, że zarażone Plasmodium erytrocyty pochłaniają EVs i kierują je do cytosolu pasożytów [32]. Pęcherzyki egzosomopodobne, powstające w odpowiedzi na niekorzystne warunki mikrośrodowiska u żywiciela (np. stres wywołany przez leki), promują przekształcenie komórek stadium krwinkowego pasożyta do postaci płciowych (gametocytów męskich i żeńskich), które są pobierane przez komary. Analiza proteomu EVs wykazała, że zawierają składniki pochodzące z komórek pasożyta (np. białka biorące udział w inwazji do erytrocytów żywiciela) [32,41]. Zidentyfikowano białko efektorowe PfPTP2, które odpowiada za komunikację, a konkretnie za transport innego ważnego białka pasożyta, białka zjadliwości PfEMP1 [41].

Dużym problemem w eradykacji malarii jest szybko narastająca lekooporność pasożyta. Nawet w przypadku skojarzonej chemioterapii, z włączeniem artemizyniny jako pierwszorzędowego leku, obserwowano lekooporne epizody, stąd stale trwają prace nad opracowaniem nowych leków [16]. Proces uwalniania EVs może służyć do prowadzenia badań podstawowych z zakresu mechanizmu i skuteczności działania leków antymalarycznych. Wykazano na przykład, że pochodne indolu, indukujące powstawanie długo utrzymujących się rodników tlenowych, wzmagały zależne od dawki leku wytwarzanie EVs, a wrażliwą postacią docelową pasożyta okazały się jego postaci pierścieniowate [39]. Reaktywne formy tlenu destabilizują błonę zewnętrzną erytrocytów, obniżają oporność mechaniczną erytrocytów, przez co stają się mniej przyjaznym środowiskiem do dojrzewania pasożytów.

Zarodźce gatunku P. vivax i P. yoelli zarażają preferencyjnie lub nawet wyłącznie młode postaci erytrocytów, retykulocyty. Egzosomy uwolnione z retykulocytów myszy BALB/c zarażonych P. yoelli okazały się bardzo skutecznym materiałem szczepionkowym. Podane z adiuwantem CpG (niemetylowane motywy cytozyna-guanina) wzbudzały silną odpowiedź odpornościową z udziałem limfocytów Th1, czego wyrazem było wysokie stężenie swoistych przeciwciał podklas IgG2a i IgG2b. Wytworzona odporność poszczepienna chroniła aż 83% myszy przed śmiertelną dawką pasożyta [36].

Leishmania. Pasożyty rodzaju Leishmania (typ Kinetoplastida) są czynnikami etiologicznymi leiszmaniozy skórnej (np. L. major), trzewnej (np. L. donovani) i skórno-śluzówkowej (L. brasiliensis). Są to choroby endemiczne występujące w strefie klimatu sub- i tropikalnego oraz na terenie po- łudniowej Europy, zagrażające około 350 mln zamieszkujących tam ludzi. Liczba nowo rozpoznanych przypadków wynosi prawie 2 mln rocznie, a istotnym rezerwuarem tych pasożytów na terenach miejskich są psy [18,29]. Leiszmanioza jest przenoszona na człowieka z udzia- łem muchówek z rodzaju Phlebotomus i Lutzomyia. To one wprowadzają do skóry promastigoty, które po sfagocytowaniu przez makrofagi przekształcają się w nieruchliwe amastigoty, umiejscowione w fagolizosomach. Silverman i wsp. [42] wykazali, że uwalnianie egzosomów u hodowanych postaci promastigota Leishmania donovani to ich główny mechanizm sekrecyjny. Egzosomopodobne struktury są uwalnianie z błony plazmatycznej i z kieszonki wici (w tym drugim przypadku za pośrednictwem ciała wielopęcherzykowego). Analiza proteomu EVs wykazała obecność aż 329 białek, co stanowi ponad 52% sekretomu tego pasożyta [43]. Obecność EVs wykryto także wewnątrz makrofagów zarażonych Leishmania. Wykazano, że niezarażone makrofagi pobierają egzosomy ze środowiska zewnętrznego, co selektywnie wzbudza wydzielanie IL- 8. Obserwacje wskazują, że egzosomy są narzędziem komunikacji między makrofagami żywiciela i pasożytami. Wydzielona IL-8 przyciąga neutrofile, które są pośrednimi komórkami żywicielskimi. Apoptotyczne neutrofile mogą być wykorzystywane do przenoszenia postaci promastigota do wnętrza docelowych komórek żywicielskich (makrofagów), za pośrednictwem tzw. „cichej fagocytozy”, tj. bez aktywacji tych komórek [51]. Podobnie jak w przypadku innych wewnątrzkomórkowych patogenów, przeżycie i namnażanie Leishmania w tak skrajnych warunkach jak wnętrze makrofagów wymaga z pewnością modyfikacji przekazywania sygnałów w komórkach żywicielskich. Zaobserwowano, że zewnątrzkomórkowe promastigoty Leishmania „wysyłają” mikropęcherzyki zawierające m.in. główny czynnik wirulencji Leishmania, tj. metaloproteazę gp63 (leiszmanolizynę) oraz EF1-α (elongation factor-1 alpha), które przygotowują makrofagi na „przyjęcie” paso- żyta („functional priming”). Czynniki aktywują fosfatazy makrofagowe, a te powodują defosforylację składowych szlaku sygnałowego IFN-γ/Jak-STAT1. W wyniku zablokowania transdukcji sygnału, makrofagi tracą zdolność wytwarzania pasożytobójczych cząsteczek efektorowych (NO, TNF-α i reaktywnych form tlenu), stając się potem przyjaznym mikrośrodowiskiem dla pasożyta [46]. Mutanty gp63-defektywne wytwarzały EVs o odmiennym składzie białkowym i słabszym działaniu przeciwzapalnym, w porównaniu ze szczepem dzikim pasożyta, co sugeruje udział metaloproteazy gp63 w sortowaniu białek egzosomalnych. Wykazano, że podczas infekcji zmianie ulega ekspresja genów metabolizmu lipidów spowodowana bezpośrednio lub pośrednio przez miRNA. Metaloproteaza gp63, zawarta w egzosomach wydzielanych przez leiszmanie, reaguje z enzymem Dicer1, powodując obniżenie stężenia miRNA-122 w hepatocytach oraz cholesterolu w osoczu krwi, co koreluje z nasileniem namna- żania pasożyta [23]. Opisane badania wskazują, że w wyniku koewolucji Leishmania wypracowała zróżnicowane i wyrafinowane strategie obronne, które pozwalają jej unikać eradykacji z organizmu żywiciela [30]. Egzosomy Leishmania podane myszom C57Bl/6 wykazały działanie propasożytnicze, wzmagając wytwarzanie IL-10 w śledzionie i nasilając infekcję [44]. Jest interesującym to, że szczep typu knockout w zakresie Hsp100 wytwarzał egzosomy o przeciwstawnej aktywności, stymulowały bowiem różnicowanie się limfocytów CD4+ i wytwarzanie IFN-γ w śledzionie, co wzbudziło nadzieję, że wprowadzenie ich z efektywnym adiuwantem typu Th1 może doprowadzić do wytworzenia odporności ochronnej. Pierwsze próby z użyciem nowego lipidowego adiuwantu CAF01 przyniosły obiecujące wyniki i być może zapoczątkują opracowanie skutecznej szczepionki przeciw leiszmaniozie [30].

Różne egzogenne bodźce, w tym czynniki infekcyjne, np. wirusy, wewnątrzkomórkowe bakterie i pierwotniaki, stymulują także wydzielanie egzosomów z komórek makroorganizmu, który zasiedlają. Analiza porównawcza proteomu egzosomów uwalnianych przez makrofagi linii J774, niestymulowane i stymulowane (LPS albo promastigotami L. mexicana), wykazała, że jest on zależny od stymulatora, chociaż ponad połowa składu (głównie białka błony zewnętrznej, opiekuńcze i metabolizmu) była identyczna. Metaloproteazę gp63 znaleziono jednak wyłącznie w egzosomach makrofagów stymulowanych L. mexicana. Egzosomy te indukowały wytwarzanie cząsteczek sygnalizacyjnych i czynników transkrypcyjnych w niestymulowanych makrofagach [27]. Zaobserwowano także bardzo silny wzrost ekspresji receptora adenozynowego. Przypuszcza się, że jest wykorzystywany przez Leishmania w tłumieniu reakcji zapalnej, ułatwiając pasożytowi zasiedlenie sąsiednich makrofagów.

Trypanosoma (typ Kinetoplastida) to grupa pasożytniczych pierwotniaków dwużywicielskich (kręgowiec i owady dwuskrzydłe, kleszcze oraz pijawki) o dużym znaczeniu medycznym, weterynaryjnym i ekonomicznym, zwłaszcza w krajach klimatu gorącego [11,19]. To pasożyty krwi, które wytworzyły wiele skomplikowanych metod unikania reakcji układu odpornościowego swoich żywicieli, m.in. przez hiperzmienność glikoproteiny powierzchniowej VSG (Variable Surface Glycoprotein, ponad 2000 wariantów antygenowych). Badanie sekretomu T. brucei (czynnika etiologicznego śpiączki afrykańskiej, endemicznej w Afryce Subsaharyjskiej) wykazało obecność aż 444 białek, z których bardzo znaczna część nie zawierała peptydu sygnałowego. Białka były wydzielane z komó- rek Trypanosoma za pośrednictwem egzocytozy, w mikropęcherzykach o średnicy 50-100 nm uwalnianych z błony zewnętrznej świdrowca [22]. Wykazano ponadto, że zarówno nieinwazyjne epimastatigoty, jak i inwazyjne metacykliczne trypomastigoty uwalniają białka sekrecyjne przynajmniej na dwa sposoby: pączkowania błony zewnętrznej (większe EVs zwane mikropęcherzykami) i egzocytozy zawartości ciała wielopęcherzykowego w kieszonce wici (mniejsze EVs, czyli egzosomy) [3]. Mikropę- cherzyki uwalniane przez metacykliczne trypomastigoty mogą dostarczać swoją zawartość do komórek żywicielskich endocytozy, a te zainfekowane komórki – również wydzielają EVs.

U jednokomórkowych organizmów np. Trypanosoma, kanoniczny model regulacji potranskrypcyjnej genów (interferencja RNA z użyciem siRNA) nie występuje lub jest obecny w uproszczonej formie. Jest zastąpiony przez homogenne populacje małych cząsteczek RNA, pochodzących z tRNAi rRNA, które są wydzielane na zewnątrz komórek w egzosomach. Egzosomy wytwarzane przez postaci epimastigotyczne pasożyta, zawierają tsRNA i są narzędziem komunikowania się pasożytów (indukcja przemiany w inwazyjne formy metacykliczne), jak również komórkę pasożyta i komórkę żywiciela (potwierdzenie ich wrażliwości na infekcję) [20]. Kardiomiopatie to typowy objaw przewlekłej trypanosomozy amerykańskiej. Iniekcja EVs przed doświadczalnym zarażeniem myszy T. cruzi nasilała parazytemię, zmiany patologiczne w sercu i reakcję zapalną, której towarzyszył wzrost biosyntezy IL-4 i IL-10 oraz przyspieszona i zwiększona śmiertelność zwierząt [50]. Jeżeli kardiomiocyty czy fibroblasty zaadsorbują EVs stają się tarczą dla krążących swoistych przeciwciał antypasożytniczych. Trypomastigoty T. cruzi stymulują także wydzielanie EVs z monocytów i limfocytów, opłaszczają się nimi, a zawarty wewnątrz pęcherzyków TGF-β inaktywuje konwertazę C3 komplementu, chroniąc w ten sposób pasożyty przed naturalnymi mechanizmami odporności wrodzonej (unik odpornościowy), a ostatecznie przed lizą [9,33]. Wszystkie te obserwacje wyraźnie wskazują, że EVs uczestniczą w modulowaniu reakcji odpornościowych żywiciela i patogenezie trypanosomozy.

Toxoplasma gondii (typ Apicomplexa) jest powszechnym pasożytem zwierząt endotermicznych i człowieka. Ekstensywność zarażenia w populacji ludzkiej ocenia się na prawie 2 miliardy. Inwazja pasożyta ma przeważnie charakter asymptomatyczny, a burzliwy i zagrażający życiu przebieg obserwuje się u osobników z osłabioną odpornością (płody, chorzy na AIDS, biorcy przeszczepów traktowani immunosupresorami itp.). Dożywotnie nosicielstwo pasożyta (przewlekła, subkliniczna toksoplazmoza), okupującego preferencyjnie komórki układu nerwowego, wiąże się jednak ze zmianami behawioralnymi żywicieli, co wykazano w licznych badaniach przeprowadzonych u gryzoni [17,21]. Mechanizm patologicznego oddziaływania toksoplazmy na komórki zarażonego osobnika jest niewyjaśniony, ale można przypuszczać, że biorą w nim udział egzosomy samego pasożyta lub wytwarzane przez komórki żywicielskie. Warto podkreślić, że pionierskie badania nad możliwością wykorzystania egzosomów w profilaktyce chorób pasożytniczych wykonano na modelu Toxoplasma gondii. Ponieważ komórki dendrytyczne są profesjonalnymi i bardzo efektywnymi prezenterami antygenu [14] stymulowano linię komórek dendrytycznych mysich DC2.4 (H-2b) rozpuszczalnymi antygenami T. gondii i w podłożu pohodowlanym metodą elektronomikroskopii wykazano obecność struktur typowych dla egzosomów („cup-shaped”) [1]. Po iniekcji dożylnej myszom C57Bl/6 (H-2b), egzosomy kierowały się preferencyjnie do śledziony („homing”) i wzbudzały silną uogólnioną odpowiedź immunologiczną komórkową z udziałem swoistych limfocytów Th1, która chroniła myszy przed rozwojem zarówno ostrej, jak i przewlekłej toksoplazmozy. Obserwowano przedłużenie czasu przeżycia myszy o 67%, w porównaniu do 20% u myszy kontrolnych szczepionych komórkami DC2.4 „niepulsowanymi” antygenem. Zanotowano także spadek liczby wytwarzanych cyst tkankowych pasożyta w mózgowiu o 75%. Wskazuje to, że egzosomy są bardzo skutecznym, bezkomórkowym materiałem szczepionkowym, łączą- cym funkcje antygenu i adiuwantu. Mechanizm stymulacji limfocytów T jest jednak niejasny. Egzosomy mogą bezpośrednio prezentować antygeny swoistym limfocytom T, ale nie można wykluczyć, że mogą być najpierw pobierane przez APC, w których bodziec: peptyd antygenowy-prezentująca cząsteczka MHC ulega wzmocnieniu [48]. Dalsze badania na modelu mysiej doświadczalnej toksoplazmozy wykazały, że egzosomy uwalniane przez komórki dendrytyczne indukują ochronę nie tylko w układzie syngenicznym, ale i allogenicznym [5]. W drugim przypadku, egzosomy są prawdopodobnie najpierw pobierane przez APC (pośrednia droga prezentacji antygenu). Stopień uzyskanej ochrony korelował z wytworzeniem dużego stężenia przeciwciał surowiczych IgG oraz wydzielniczych IgA w śluzie przewodu pokarmowego. Splenocyty stymulowane antygenami odpowiadały intensywną proliferacją i wytwarzaniem IFN-γ, a więc głównej ochronnej cytokiny w inwazji T. gondii. Uwzględniając szczególnie tragiczne skutki infekcji wewnątrzmacicznej T. gondii, spróbowano także zastosować egzosomy wydzielone z komórek dendrytycznych do profilaktyki toksoplazmozy wrodzonej [4]. Na mysim modelu doświadczalnym wykazano, że zwierzęta szczepione egzosomami były bardziej płodne niż szczepione rozpuszczalnym antygenem pasożyta. Podobnie korzystnie kształtowały się inne parametry, takie jak masa ciała i przeżywalność potomstwa. Zanotowano tak- że, że wskutek szczepienia matek liczba cyst u noworodków obniżyła się o 65% w stosunku do grupy kontrolnej, nieszczepionej. Powyższe dane wskazują, że egzosomy uwolnione ze stymulowanych antygenem komórek dendrytycznych, wolne od DNA, mogą być rozważane jako szczepionka przeciw wrodzonej toksoplazmozie.

W związku z neurotropizmem i neuropatogennością T. gondii interesujące są wyniki wstępnych badań Pope i Lässera [40]. Zarazili oni in vitro komórki nabłonkowe linii HFF szczepem Prugniaud T. gondii i po 24-72 godz. w płynie pohodowlanym stwierdzili obecność pęcherzyków o wielkości typowej dla egzosomów (< 100 nm). Używając do kontroli hodowli komórek HFF niezarażonych, ale stymulowanych do uwalniania egzosomów przez umieszczenie w pożywce bezsurowiczej, porównali profil mRNA i miRNA w wytwarzanych EVs. Infekcja powodowała bardzo znaczący (od kilku do kilkudziesięciu razy) wzrost stężenia mRNA dla czterech czynników o aktywności neurologicznej: Rab-13, EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor alpha1), tymozyny β4 i homologa białka LLP, a wśród miRNA zanotowano wzrost miR-23β, który reguluje aktywność IL-17. Intrygującym pozostaje zwią- zek między powyższymi zmianami molekularnymi a zmianami behawioru zwierząt zarażonych T. gondii. Egzosomy pasożytniczych pierwotniaków, „eksportujące” ich białka na zewnątrz, mogą spowodować tolerancję pasożyta przez tłumienie odporności żywiciela lub przeciwnie, wzbudzać patologiczne reakcje zapalne [43,45].

Helminty

Helminty to heterogenna grupa pasożytów, do której zaliczane są przywry, tasiemce, obleńce oraz pijawki i kolcogłowy. Częstość zarażeń pasożytami z tej grupy wśród ludzi jest bardzo duża, szacuje się bowiem, iż co czwarty mieszkaniec globu jest nosicielem co najmniej jednego gatunku helminta. Do najczęściej notowanych parazytoz powodowanych przez robaki zalicza się glistnicę (askariozę), schistosomozę (bilharcjozę), trichuriozę oraz filariozy. Dane epidemiologiczne wskazują, że zarażenie tylko glistą ludzką (Ascaris lumbricoides) dotyczy około 1,2-1,5 miliarda ludzi, żyjących głównie w rozwijających się krajach tropikalnych i subtropikalnych o niskich standardach higienicznych. Ponadto, inwazja A. lumbricoides powoduje około 60000 zgonów rocznie, przede wszystkim wśród dzieci, często wskutek towarzyszących tej parazytozie poważnych komplikacji obejmujących najczęściej układ oddechowy lub pokarmowy [15,26,31].

O EVs pasożytniczych robaków wiadomo stosunkowo niewiele; pierwsze wzmianki pojawiły się wprawdzie już w latach 80. XX w. i dotyczyły np. Taenia solium [53], a potem Hymenolepis di minuta [38] i Echinococcus multilocularis [28], ale dopiero w 2012 r. wykazano, że przywry (Trematoda) dwóch gatunków: Echinostoma caproni i Faciola hepatica uwalniają egzosomopodobne struktury, które mogą odgrywać zasadniczą rolę w komunikacji pasożyt-żywiciel, bo są pobierane przez żywe komórki nabłonka jelitowego żywiciela [35]. Białka pęcherzyków są gatunkowo swoiste, ale zawierają domieszkę białek żywiciela. Mechanizm wydzielania EVs może tłumaczyć występowanie w preparatach ESP (excreted/secreted proteins) uzyskanych z helmintów, białek nietypowych, pozbawionych sekwencji sygnałowych, np. enolaza u przywry Echinostoma caproni [34] czy białko serpinopodobne u glisty świńskiej Ascaris suum [52]. Obecność egzosomopodobnych pęcherzyków stwierdzono także u motyliczki wątrobowej Dicrocoelium dendriticum [6]. Wykazano wówczas po raz pierwszy, że EVs tego pasożyta zawierają oprócz licznych białek także miRNA. Enkapsulacja do białkowych pęcherzyków otoczonych lipidową błoną chroni cząsteczki miRNA przed działaniem nukleaz w płynach ustrojowych i warunkuje ich skuteczne oddziaływanie na organizm żywiciela przez potranskrypcyjną regulację aktywności jego genów, jak sugerują m.in. Hansen i wsp. [25] w odniesieniu do inwazji pasożytniczym nicieniem Trichuris suis u świń. Buck i wsp. [7], na modelu jelitowego nicienia Heligmosomoides polygyrus zaobserwowali, że egzosomy tego pasożyta zawierają, oprócz miRNA, pełnej długości Y RNA oraz białko Argonaute, wchodzące w skład kompleksu RISC (RNA-induced silencing complex – kompleks wyciszający indukowany przez RNA), który bierze udział w wyciszaniu lub wyłączaniu ekspresji genów. Wprowadzenie donosowe takich egzosomów myszom hamowało wrodzone reakcje odpornościowe typu 2 na antygeny pleśni Alternaria i napływ eozynofilów. Znacznie obniżoną ekspresję zauważono w przypadku mysiego genu Dusp1, głównego regulatora szlaku sygnałowego z udziałem MAPK (mitogen-associated protein kinase) oraz genu IL-33R, kodującego podjednostkę receptora IL-33, głównej cytokiny promującej rozwój swoistych limfocytów Th2 i odporności ochronnej w inwazjach wielokomórkowymi pasożytami.

Przyszłe badania powinny odpowiedzieć, czy EVs mogą być strukturami tarczowymi przy opracowywaniu nowych strategii diagnostyki, profilaktyki i terapii parazytoz spowodowanych przez helminty.

Podsumowanie

Zewnątrzkomórkowe pęcherzyki błonowe są zróżnicowaną grupą struktur wydzielanych przez komórki prokariotów i eukariotów. Ich uwalnianie z komórek jest uniwersalnym mechanizmem komunikacji międzykomórkowej, ważnym zarówno w procesach fizjologicznych, jak i patogenezie chorób o różnej etiologii, w tym w chorobach pasożytniczych. Szczególnie interesującym aspektem funkcji EVs jest ich rola w modulowaniu reakcji odpornościowych makroorganizmu na inwazje pasożytów [37]. Intensywne badania mechanizmu złożonych relacji pasożyt-żywiciel, w których pierwszorzędną rolę pełnią EVs, doprowadziły nie tylko do poznania podstaw patogenezy chorób pasożytniczych, ale także do identyfikacji cząsteczek pasożytów (tj. powierzchniowych i wydzielniczo-wydalniczych białek), które mogą być wykorzystane jako molekularne tarcze w diagnostyce, profilaktyce i terapii chorób pasożytniczych.

Przypisy

• 1. Aline F., Bout D., Amigorena S., Roingeard P., Dimier-Poisson I.:Toxoplasma gondii antigen-pulsed-dendritic cell-derived exosomesinduce a protective immune response against T. gondii infection.Infect. Immun., 2004; 72: 4127-4137
  Google Scholar
• 2. Barteneva N.S., Maltsev N., Vorobjev I.A.: Microvesicles and intercellularcommunication in the context of parasitism. Front. Cell.Infect. Microbiol., 2013; 3: 49
  Google Scholar
• 3. Bayer-Santos E., Aguilar-Bonavides C., Rodrigues S.P., CorderoE.M., Marques A.F., Varela-Ramirez A., Choi H., Yoshida N., da SilveiraJ.F., Almeida I.C.: Proteomic analysis of Trypanosoma cruzi secretome:characterization of two populations of extracellular vesicles and solubleproteins. J. Proteome Res., 2013, 12, 883-897
  Google Scholar
• 4. Beauvillain C., Juste M.O., Dion S., Pierre J., Dimier-Poisson I.:Exosomes are an effective vaccine against congenital toxoplasmosisin mice. Vaccine, 2009; 27: 1750-1757
  Google Scholar
• 5. Beauvillain C., Ruiz S., Guiton R., Bout D., Dimier-Poisson I.: A vaccinebased on exosomes secreted by a dendritic cell line confersPiśmiennictwoprotection against T. gondii infection in syngeneic and allogeneicmice. Microb. Infect., 2007; 9: 1614-1622
  Google Scholar
• 6. Bernal D., Trelis M., Montaner S., Cantalapiedra F., Galiano A., HackenbergM., Marcilla A.: Surface analysis of Dicrocoelium dendriticum.The molecular characterization of exosomes reveals the presenceof miRNAs. J. Proteomics, 2014; 105: 232-241
  Google Scholar
• 7. Buck A.H., Coakley G., Simbari F., McSorley H.J., Quintana J.F., LeBihan T., Kumar S., Abreu-Goodger C., Lear M., Harcus Y., Ceroni A.,Babayan S.A., Blaxter M., Ivens A., Maizels R.M.: Exosomes secretedby nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells andmodulate innate immunity. Nat. Commun., 2014; 5: 5488
  Google Scholar
• 8. Campos F.M., Franklin B.S., Teixeira-Carvalho A., Filho A.L., de PaulaS.C., Fontes C.J., Brito C.F., Carvalho L.H.: Augmented plasma microparticlesduring acute Plasmodium vivax infection. Malaria J., 2010; 9: 327
  Google Scholar
• 9. Cestari I., Ansa-Addo E., Deolindo P., Inal J., Ramirez M.I.: Trypanosomacruzi immune evasion mediated by host cell-derived microvesicles.J. Immunol., 2012; 188: 1942-1952
  Google Scholar
• 10. Couper K.N., Barnes T., Hafalla J.C.R., Combes V., Ryffel B., SecherT., Grau G.E., Riley E.M., de Souza J.B.: Parasite-derived plasmamicroparticles contribute significantly to malaria infection-inducedinflammation through potent macrophage stimulation. PLoSPathog.; 2010; 6: e1000744
  Google Scholar
• 11. Coura J.R.: Chagas disease: control, elimination and eradication.Is it possible? Mem. Inst. Oswaldo Cruz., 2013; 108: 962-967
  Google Scholar
• 12. Crescitelli R., Lässer C., Szabó T.G., Kittel A., Eldh M., DianzaniI., Buzás E.I., Lötvall J.: Distinct RNA profiles in subpopulations ofextracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.J. Extracell. Vesicles, 2013; 2: 20677
  Google Scholar
• 13. Damian R.T.: Parasite immune evasion and exploitation: reflectionsand projections. Parasitology, 1997; 115, suppl.: S169-S175
  Google Scholar
• 14. Dimier-Poisson I., Aline F., Mevelec M.-N., Beauvillain C., Buzoni–Gatel D., Bout D.: Protective mucosal Th2 immune response againstToxoplasma gondii by murine mesenteric lymph node dendritic cells.Infect. Immun., 2003; 71: 5254-5265
  Google Scholar
• 15. Dold C., Holland C.V.: Ascaris and ascariasis. Microbes Infect.,2011; 13: 632-637
  Google Scholar
• 16. Dondorp A.M., Yeung S, White L., Nguon C., Day N.P., Socheat D.,von Seidlein L.: Artemisinin resistance: current status and scenariosfor containment. Nat. Rev. Microbiol., 2010; 8: 272-280
  Google Scholar
• 17. Flegr J.: How and why Toxoplasma makes us crazy. Trends Parasitol.,2013; 29: 156-163
  Google Scholar
• 18. Foroughi-Parvar F., Hatam G.: Vaccines for canine leishmaniasis.Adv. Prev. Med., 2014; 2014: 569193
  Google Scholar
• 19. Franco J.R., Simarro P.P., Diarra A., Jannin J.G.: Epidemiology ofhuman African trypanosomiasis. Clin. Epidemiol., 2014; 6: 257-275
  Google Scholar
• 20. Garcia-Silva M.R.., Cabrera-Cabrera F., das Neves R.F., Souto-PadrónT., de Souza W., Cayota A.: Gene expression changes induced byTrypanosoma cruzi shed microvesicles in mammalian host cells: relevanceof tRNA-derived halves. BioMed Res. Int., 2014; 2014: 305239
  Google Scholar
• 21. Gatkowska J., Wieczorek M., Dziadek B., Dzitko K., Dlugonska H.:Behavioral changes in mice caused by Toxoplasma gondii invasion ofbrain. Parasitol. Res., 2012; 111: 53-58
  Google Scholar
• 22. Geiger A., Hirtz C., Bécue T., Bellard E., Centeno D., Gargani D.,Rossignol M., Cuny G., Peltier J.B.: Exocytosis and protein secretionin Trypanosoma. BMC Microbiol., 2010; 10: 20
  Google Scholar
• 23. Ghosh J., Bose M., Roy S., Bhattacharyya S.N.: Leishmania donovanitargets Dicer1 to downregulate miR-122, lower serum cholesterol,and facilitate murine liver infection. Cell Host Microbe,2013; 13: 277-288
  Google Scholar
• 24. Grüring C., Heiber A., Kruse F., Ungefehr J, Gilberger T.W., SpielmannT.: Development and host cell modifications of Plasmodium falciparumblood stages in four dimensions. Nat. Commun., 2011; 2: 165
  Google Scholar
• 25. Hansen E.P., Kringel H., Williams A.R., Nejsum P.: Secretion ofRNA-containing extracellular vesicles by the porcine whipworm,Trichuris suis. J. Parasitol., 2015; 101: 336-340
  Google Scholar
• 26. Harhay M.O., Horton J., Olliaro P.L.: Epidemiology and controlof human gastrointestinal parasites in children. Expert Rev. AntiInfect. Ther., 2010; 8: 219-234
  Google Scholar
• 27. Hassani K., Olivier M.: Immunomodulatory impact of Leishmania-inducedmacrophage exosomes: a comparative proteomic andfunctional analysis. PLoS Negl. Trop. Dis., 2013; 7: e2185
  Google Scholar
• 28. Ito A., Kanazawa T., Nakao M., Sako Y., Ishikawa Y., Nakaya K.:Comparison of the antigenicity of protoscoleces and microvesiclesof Echinococcus multilocularis prepared from rats. J. Helminthol., 2001;75: 355-358
  Google Scholar
• 29. Kumar R., Engwerda C.: Vaccines to prevent leishmaniasis. Clin.Transl. Immunology, 2014; 3: e13
  Google Scholar
• 30. Lambertz U., Silverman J.M., Nandan D., McMaster W.R., ClosJ., Foster L.J., Reiner N.E.: Secreted virulence factors and immuneevasion in visceral leishmaniasis. J. Leuk. Biol., 2012; 91: 887-899
  Google Scholar
• 31. Li Q.Y., Zhao D.H., Qu H.Y., Zhou C.N.: Life-threatening complicationsof ascariasis in trauma patients: a review of the literature.World J. Emerg. Med., 2014; 5: 165-170
  Google Scholar
• 32. Mantel P.Y., Hoang A.N., Goldowitz I., Potashnikova D., HamzaB., Vorobjev I., Ghiran I., Toner M., Irimia D., Ivanov A.R., BartenevaN., Marti M.: Malaria-infected erythrocyte-derived microvesiclesmediate cellular communication within the parasite population andwith the host immune system. Cell Host Microbe, 2013; 13: 521-534
  Google Scholar
• 33. Mantel P.Y., Marti M.: The role of extracellular vesicles in Plasmodiumand other protozoan parasites. Cell. Microbiol., 2014: 16: 344-354
  Google Scholar
• 34. Marcilla A., Perez-Garcia A., Espert A., Bernal D., Muñoz-AntoliC., Esteban J.G., Toledo R.: Echinostoma caproni: identification of enolasein excretory/secretory products, molecular cloning, and functionalexpression. Exp. Parasitol., 2007; 117: 57-64
  Google Scholar
• 35. Marcilla A., Trelis M., Cortés A., Sotillo J., Cantalapiedra F. MinguezM.T., Valero M.L., Sánchez del Pino M.M., Muñoz-Antoli C.,Toledo R, Bernal D.: Extracellular vesicles from parasitic helminthscontain specific excretory/secretory proteins and are internalizedin intestinal host cells. PLoS One, 2012; 7: e45974
  Google Scholar
• 36. Martin-Jaular L., Nakayasu E.S., Ferrer M., Almeida I.C., del PortilloH.A.: Exosomes from Plasmodium yoelii-infected reticulocytesprotect mice from lethal infections. PLoS One, 2011; 6: e26588
  Google Scholar
• 37. Montaner S., Galiano A., Trelis M., Martin-Jaular L., del PortilloH.A., Bernal D., Marcilla A.: The role of extracellular vesicles inmodulating the host immune response during parasitic infections.Front. Immunol., 2014; 5: 433
  Google Scholar
• 38. Oaks J.A., Holy J.M.: Hymenolepis diminuta: two morphologicallydistinct tegumental secretory mechanisms are present in the cestode.Exp. Parasitol., 1994; 79: 292-300
  Google Scholar
• 39. Pantaleo A., Ferru E., Vono R., Giribaldi G., Lobina O., Nepveu F.,Ibrahim H., Nallet J.P., Carta F., Mannu F., Pippia P., Campanella E.,Low P.S., Turrini F.: New antimalarial indolone-N-oxides, generatingradical species, destabilize the host cell membrane at early stages ofPlasmodium falciparum growth: role of band 3 tyrosine phosphorylation.Free Radic. Biol. Med., 2012; 52: 527-536
  Google Scholar
• 40. Pope S.M., Lässer C.: Toxoplasma gondii infection of fibroblastscauses the production of exosome-like vesicles containing a uniquearray of mRNA and miRNA transcripts compared to serum starvation.J. Extracell. Vesicles, 2013; 2: 22484
  Google Scholar
• 41. Regev-Rudzki N., Wilson D.W., Carvalho T.G., Sisquella X., ColemanB.M. Rug M., Bursac D., Angrisano F., Gee M., Hill A.F., Baum J.,Cowman A.F.: Cell-cell communication between malaria-infectedred blood cells via exosome-like vesicles. Cell, 2013; 153: 1120-1133
  Google Scholar
• 42. Silverman J.M., Chan S.K., Robinson D.P., Dwyer D.M., NandanD., Foster L.J. Reiner N.E.: Proteomic analysis of the secretome ofLeishmania donovani. Genome Biol., 2008; 9: R35
  Google Scholar
• 43. Silverman J.M., Clos J., de’Oliveira C.C., Shirvani O., Fang Y., WangC., Foster L.J., Reiner N.E.: An exosome-based secretion pathway isresponsible for protein export from Leishmania and communicationwith macrophages. J. Cell Sci., 2010; 123: 842-852
  Google Scholar
• 44. Silverman J.M., Clos J., Horakova E., Wang A.Y., Wiesgigl M.,Kelly I., Lynn M.A., McMaster W.R., Foster L.J., Levings M.K., ReinerN.E.: Leishmania exosomes modulate innate and adaptive immuneresponses through effects on monocytes and dendritic cells. J. Immunol.,2010; 185: 5011-5022
  Google Scholar
• 45. Silverman J.M., Reiner N.E.: Exosomes and other microvesiclesin infection biology: Organelles with unanticipated phenotypes.Cell. Microbiol., 2011; 13: 1-9
  Google Scholar
• 46. Silverman J.M., Reiner N.E.: Leishmania exosomes deliver preemptivestrikes to create an environment permissive for early infection. Front. Cell. Infect. Microbiol., 2012; 1: 26
  Google Scholar
• 47. Spycher C., Rug M., Klonis N., Ferguson D.J., Cowman A.F., BeckH.P., Tilley L.: Genesis of and trafficking to the Maurer’s clefts ofPlasmodium falciparum-infected erythrocytes. Mol. Cell. Biol., 2006;26: 4074-4085
  Google Scholar
• 48. Thery C., Duban L, Segura E., Veron P., Lantz O., Amigorena S.:Indirect activation of naive CD4+ T cells by dendritic cell-derivedexosomes. Nat. Immunol., 2002; 3: 1156-1162
  Google Scholar
• 49. Torrecilhas A.C., Schumacher R.I., Alves M.J., Colli W.: Vesicles ascarriers of virulence factors in parasitic protozoan diseases. Microb.Infect., 2012; 14: 1465-1474
  Google Scholar
• 50. Trocoli Torrecilhas A.C., Tonelli R.R., Pavanelli W.R., da Silva J.S.,Schumacher R.I., de Souza W., E Silva N.C., de Almeida AbrahamsohnI., Colli W., Manso Alves M.J.: Trypanosoma cruzi: parasite shed vesiclesincrease heart parasitism and generate an intense inflammatoryresponse. Microbes Infect., 2009; 11: 29-39
  Google Scholar
• 51. van Zandbergen G., Klinger M., Müller A., Dannenberg S., GebertA., Solbach W., Laskay T.: Cutting edge: neutrophil granulocyteserves as a vector for Leishmania entry into macrophages. J. Immunol.,2004; 173: 6521-6525
  Google Scholar
• 52. Wang T., Van Steendam K., Dhaenens M., Vlaminck J., DeforceD. Jex A.R., Gasser R.B., Geldhof P.: Proteomic analysis of the excretory-secretoryproducts from larval stages of Ascaris suum revealshigh abundance of glycosyl hydrolases. PLoS Negl. Trop. Dis., 2013;7: e2467
  Google Scholar
• 53. Willms K., Merchant M.T.: The inflammatory reaction surroundingTaenia solium larvae in pig muscle: ultrastructural and light microscopicobservations. Parasite Immunol., 1980; 2: 261-275
  Google Scholar
• 54. Wójtowicz A., Baj-Krzyworzeka M., Baran J.: Charakterystykai znaczenie biologiczne mikropęcherzyków błonowych. Postępy Hig.Med. Dośw., 2014; 68: 1421-1432
  Google Scholar

Pełna treść artykułu