Ekspresja i aktywność czynnika transkrypcyjnego SNAIL w trakcie przejścia nabłonkowo- mezenchymalnego (EMT) w procesie nowotworzenia
Izabela Papiewska-Pająk 1 , Maria A. Kowalska 1 , Joanna Boncela 1Abstrakt
Hamowanie transkrypcji genu kodującego E-kadherynę przez czynnik transkrypcyjny SNAIL jest uznawane za podstawowy etap w procesie przejścia nabłonkowo-mezechymalnego – EMT. Epigenetyczna regulacja ekspresji E-kadheryny polega na wiązaniu się SNAIL do sekwencji E-box w promotorze genu CDH1 i tworzeniu kompleksu z enzymami wchodzącymi w skład kompleksów represorowych, które są bezpośrednio odpowiedzialne za modyfikacje histonów oraz metylację DNA prowadzące do zmian w strukturze chromatyny. Udział SNAIL w nabywaniu przez komórki fenotypu migracyjno-inwazyjnego polega przede wszystkim na bezpośrednim wpływie na spadek poziomu białek budujących połączenia ścisłe i szczelinowe komórek.Do utrzymania aktywności SNAIL w komórce niezbędne jest jego jądrowe umiejscowienie, zabezpieczające czynnik przed degradacją proteasomalną w cytoplazmie. Główną rolę w tym procesie pełni kinaza syntazy glikogenu 3 (GSK-3β). Ekspresja i stabilność SNAIL poza tym jest regulowana na poziomie transkrypcji oraz na etapach potranskrypcyjnych przez cząsteczki sygnałowe i czynniki biologiczne, np.: TGF-β, TNF-α, ILK czy NF-κB. SNAIL w komórkach nowotworowych jest regulowany również przez mikroRNA, głównie miR-34.Podwyższony poziom SNAIL, występujący w wielu nowotworach, jest powiązany ze wzrostem oporności komórek nowotworowych na chemio-, radio – czy immunoterapię, z nabywaniem właściwości komórek CSC oraz właściwości migracyjnych i inwazyjnych, prowadzących do metastazy guzów. Poznanie mechanizmów działania SNAIL umożliwia tworzenie nowych terapii skierowanych na modulację konkretnych ścieżek sygnałowych aktywujących lub aktywowanych przez SNAIL w czasie progresji nowotworowej.
Wstęp
Czynniki transkrypcyjne należące do rodziny Snail peł- nią zachowaną ewolucyjnie rolę w procesach związanych z rozwojem u bezkręgowców i kręgowców. Czynnik transkrypcyjny SNAIL, opisany po raz pierwszy w 1987 r. u Drosophila melanogaster, uczestniczy w procesie powstawania mezodermy, reguluje profil genowy komórek nabłonka (epitelium) [3,10]. U kręgowców, wpływając na adhezję komórek nabłonka i na ich właściwości migracyjne pełni kluczową rolę w procesie przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (epithelial-mesenchymal transition, EMT). Proces zachodzi nie tylko w czasie embriogenezy (np. tworzenie grzebienia nerwowego), ale również jest jednym z głównych mechanizmów odpowiedzialnych za progresję i przerzutowanie nowotworów [1]. Zaangażowanie SNAIL w regulację tak ważnych procesów biologicznych spowodowało w ostatnich latach wzrost liczby doniesień związanych z poznaniem szczegółowych zjawisk odpowiedzialnych za regulację ekspresji oraz funkcji tego czynnika. Podobnie jak inne regulatory transkrypcji, SNAIL jest trudnym celem terapeutycznym. Dotychczas nie powiodły się próby bezpośredniej regulacji jego aktywno- ści transkrypcyjnej. Obecnie uwaga została zwrócona na modulację konkretnych ścieżek sygnałowych aktywują- cych lub aktywowanych przez SNAIL.
Rodzina czynników Snail
Do rodziny czynników transkrypcyjnych Snail należą białka: SNAIL (inne stosowane nazwy: Snail, Snail1, Snai1), SLUG (inne nazwy: Slug Snail2, Snai2) oraz SMUC (Smuc, Snail3) [53]. Wszystkie te białka wykazują homologię sekwencji aminokwasowej, w domenie końca C (ryc. 1) [39].
W warunkach fizjologicznych, w dorosłym organizmie SNAIL nie jest wykrywany w komórkach nabłonka. Białko to jest identyfikowane w komórkach nowotworowych pochodzenia nabłonkowego, w fibroblastach w obrębie uszkodzonych tkanek, w makrofagach w tkankach objętych stanem zapalnym oraz w nowotworach pochodzenia mezenchymalnego [2,32,42,86].
Struktura białek rodziny Snail
Ludzkie czynniki należące do rodziny Snail, o średniej masie 30 kDa, są zbudowane z 264-292 aminokwasów. W strukturze białek rodziny Snail wyróżnia się trzy domeny: rejon końca N, zachowaną ewolucyjnie w obrę- bie rodziny domenę końca C oraz bogaty w serynę i prolinę rejon centralny zawierający sekwencje charakterystyczne dla danego czynnika z rodziny Snail (ryc. 1). U kręgowców czynniki transkrypcyjne z rodziny Snail zawierają w części końca N charakterystyczną, krótką domenę SNAG (Snail-Gfi1), zbudowaną u SNAIL z 9 aa.
Rejony końca C łańcucha białkowego czynników rodziny Snail są zbudowane z 4-6 tandemowo ułożonych motywów palca cynkowego klasy C2H2, przy czym obecność 4 motywów warunkuje ich prawidłowe funkcjonowanie [33,73]. Domena zawiera również sygnał lokalizacji jądrowej (nuclear localization signal, NLS) [106].
SNAIL w centralnej części sekwencji ma dwa motywy docelowe dla kinazy serynowo-treoninowej GSK-3β: miejsce I – sekwencja destrukcyjna (aa 96-104) i bogate w leucyny miejsce II – sygnał eksportu jądrowego – NES (aa 107-119) [116]. SLUG natomiast w centralnej części cząsteczki ma domenę SLUG, która bierze udział w represji genu E-kadheryny przez wiązanie z korepresorem CtBP1 (C-terminal binding protein-1) (ryc. 1) [71].
Represja genów zależna od SNAIL
Przejście nabłonkowo-mezenchymalne jest głównym procesem zachodzącym podczas morfogenezy zarówno u kręgowców, jak i bezkręgowców. W dorosłym organizmie proces, jako fizjologiczny, występuje np. podczas gojenia się ran. EMT został również poznany i dokładnie opisany w stanach patologicznych, ponieważ stanowi jeden z podstawowych mechanizmów progresji nowotworowej [84]. Wiele wewnątrzkomórkowych szlaków przekazywania sygnałów, indukowanych przez czynniki mikrośrodowiska nowotworu, składających się na EMT, prowadzi do utraty połączeń międzykomórkowych, zmiany polarności komórki, zwiększenia jej mobilności i nabycia zdolności migracji.
Mechanizm działania czynnika SNAIL na przykładzie regulacji genu CDH1
Przejście nabłonkowo-mezenchymalne podlega złożonej regulacji na poziomie transkrypcyjnym. Czynnik transkrypcyjny SNAIL bierze udział w podstawowym dla EMT etapie, oddziałuje bezpośrednio na promotor genu CDH1 kodującego E-kadherynę, co powoduje obniżenie poziomu tego białka w komórkach epitelialnych [7,13]. E-kadheryna jest glikozylowanym białkiem transbłonowym odgrywają- cym istotną rolę w utrzymywaniu polarności komórek, ich integralności oraz w zależnym od jonów wapnia tworzeniu połączeń adhezyjnych między komórkami. Białko jest zaliczane również do supresorów transformacji nowotworowej, gdyż spadek jego ekspresji jest powiązany ze wzrostem progresji nowotworowej i przerzutowaniem [100].
Odwrotna korelacja między poziomem SNAIL a E-kadheryny została zaobserwowana w wielu nowotworach, m.in. w czerniaku, raku wątrobowokomórkowym (hepatocellular carcinoma), raku płaskonabłonkowym ust (oral squamous cell carcinoma), raku piersi czy w typie rozlanym raka żołądka [8,48,82,85,111]. Zahamowanie transkrypcji genów zależne od SNAIL polega na związaniu SNAIL do sekwencji E-box (CAGGTG, CACCTG, GGCCGG) w promotorze genu przez domenę końca C czynnika oraz zaangażowaniu kompleksów białek korepresorowych przez ich wiązanie z sekwencją SNAG.
W obrębie fragmentu od – 178 do +92 promotora ludzkiego genu kodującego E-kadherynę znajdują się trzy sekwencje E-box. Wszystkie są jednocześnie zaangażowane w proces regulacji transkrypcji genu, przy czym wiązanie SNAIL do miejsca w pozycji od +22 do +27 powoduje najsilniejszy efekt represji [7]. Białka wchodzące w skład kompleksów korepresorowych są enzymami bezpośrednio odpowiedzialnymi za epigenetyczną regulację ekspresji genów. Regulacja obejmuje modyfikacje histonów oraz metylację DNA doprowadzające do zmian w strukturze chromatyny [5]. Dotąd zidentyfikowano wiele kompleksów białek korepresorowych mogących wiązać się bezpośrednio z represorami transkrypcji [101].
Liczne badania wykazały współdziałanie czynnika SNAIL zarówno z enzymami modyfikującymi chromatynę, jak metylującymi DNA w regionach regulatorowych genów, tzw. wyspach CpG. Mechanizmy tworzenia niektórych z tych kompleksów (np. z LSD1) zostały szczegółowo opisane, a inne nie zostały jeszcze tak dokładnie poznane.
Czynnik SNAIL współdziała w kompleksach z następują- cymi enzymami:
• z deacetylazami histonowymi 1 i 2 (HDAC1 i HDAC2) oraz korepresorem Sin3A (wchodzącym w skład kompleksu SIN3), co prowadzi do deacetylacji histonów 3 i 4 oraz metylacji lizyny w pozycji 9 w histonie 3, a w konsekwencji do modyfikacji organizacji chromatyny [75];
• z deacetylazą histonową 3 (HDAC3), aktywowaną przez czynnik indukowany przez hipoksję-1α (hypoxia inducible factor-1α – HIF-1α). W warunkach niedotlenienia komórek nowotworowych, wiążąc się ze SNAIL prowadzi do represji CDH1 [102];
• z metylotransferazą argininy 5 (PRMT5) oraz korepresorem AJUBA, powodując metylację argininy w pozycji 3 w histonie 4 [43];
• z kompleksem białkowym grupy Polycomb PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2), przez bezpośrednie oddziaływanie z należącymi do kompleksu białkami SUZ12 i EZH2, co indukuje trimetylację lizyny w pozycji 27 w histonie 3 (H3K27me3) [40];
• z lizynoswoistą demetylazą 1 (LSD1) oraz kompleksem CoREST [62]. LSD1 powoduje demetylację lizyny w pozycji 4 oraz 9 w ogonie histonu 3 (H3K4, H3K9). Tworzący kompleks z LSD1 korepresor CoREST przeciwdziała jej proteasomalnej degradacji oraz moduluje strukturę domeny katalitycznej (catalytic amino oxidase domain) w LSD1, wpływając na jej interakcję z substratem – ogonem histonu 3 [91]. SNAIL, przez domenę SNAG, oddzia- łuje z domeną katalityczną LSD1, dzięki podobieństwu sekwencji SNAG do sekwencji wiążącej LSD1 w ogonie histonu H3. Dla tego oddziaływania są niezbędne arginina w pozycji 3 i 8 oraz lizyna w pozycji 9 w sekwencji SNAG czynnika. Utworzenie kompleksu SNAIL-LSD1- -CoREST stabilizuje cząsteczkę SNAIL; N-końcowa domena SNAIL staje się niedostępna dla GSK3β, a w konsekwencji nie dochodzi do degradacji SNAIL w proteasomie. CoREST wpływa również na stabilność wiązania LSD1-SNAIL w kompleksie. Lin i wsp., na przykładzie regulacji genu CDH1, zaproponowali następujący model wyciszania genów z udziałem SNAIL: SNAIL, przez domenę SNAG (pełniącą rolę molekularnego „haczyka”), oddziałuje z kompleksem LSD1–CoREST. Powstały, stabilny kompleks SNAIL-LSD1–CoREST jest przyłączany do sekwencji promotorowej genu dzięki wiązaniu motywów palca cynkowego w C-końcowej domenie SNAIL do sekwencji E-box w promotorze. Następnie dochodzi do demetylacji H3K4me2 w promotorze genu kodującego E-kadherynę. Dalszych wyjaśnień wymaga sposób w jaki, równocześnie do opisanego modelu, zachodzi deacetylacja (H3 i H4) oraz metylacja (H3K27 i H4R3);
• z metylotransferazą G9a, odpowiedzialną za mono – i dimetylację lizyny w pozycji 9 w histonie 3 (H3K9me1, H3K9me2) w euchromatynie oraz heterochromatynie fakultatywnej. Badania in vitro oraz in vivo wykazały, że SNAIL wchodzi w interakcję z metylotransferazą G9a i jest zaangażowany w demetylację H3K9me2 [28]. Utworzenie kompleksu G9a ze SNAIL następuje dzięki bezpośredniemu oddziaływaniu enzymatycznej domeny SET i domeny strukturalnej zawierającej powtórzenia ankiryny (ankyrin-repeat domain) w G9a z C-koń- cowym regionem palców cynkowych w SNAIL. Dong i wsp. wykazali również współistnienie SNAIL w kompleksach z metylotransferazami DNA; DNMT1, DNMT3a i DNMT3b. Kompleksy te są tworzone pośrednio przez metylotransferazę G9a. SNAIL więc może być ważnym czynnikiem łączącym modyfikacje histonów i metylację DNA w celu wyciszenia transkrypcji genów;
• z metylotransferazą Suv39H1, odpowiedzialną za trimetylację lizyny 9 w histonie 3 (H3K9me3), co ma miejsce głównie w heterochromatynie konstytutywnej. Kompleks SNAIL-Suv39H1 powstaje przez oddziaływanie domeny SNAG czynnika z domeną katalityczną metylotransferazy i wykazano, że jest niezbędny do zahamowania transkrypcji genu kodującego E-kadherynę w modelowych liniach komórkowych raka piersi HMLE i MCF10A oraz w liniach komórkowych raka piersi podstawnopodobnego BLBC [27];
• z ligazami Ring1A i Ring1B, które należąc do kompleksu PRC1 (Polycomb Repressive Complex 1), powodują monoubikwitynację histonu H2A w lizynie w pozycji 119 [17]. Tak jak w przypadku metylotransferazy G9a, dzięki zaangażowaniu domeny palców cynkowych (a nie domeny SNAG) białka SNAIL oraz domen RING ligaz dochodzi do powstania kompleksu obu bia- łek. Wykazano, że proces jest odpowiedzialny za zwiększenie migracji komórek nowotworowych trzustki. Ponadto zaobserwowano, że utworzenie kompleksu SNAIL z białkiem składowym kompleksu PRC2-EZH2 prowadzi do wydajniejszego tworzenia kompleksów SNAIL z Ring1A/B.
SNAIL, poprzez tworzenie kompleksów z szeregiem kofaktorów i enzymów modulujących chromatynę, wpisuje się w ideę „reader-writer”. W modelu tym SNAIL „czyta” promotor genu docelowego (np. sekwencje E-box w promotorze CDH1), a współdziałające z czynnikiem enzymy „redagują” chromatynę, modulując informację epigenetyczną, a powstały kompleks aktywuje lub hamuje transkrypcję genów [61].
Rola SNAIL w epigenetycznej regulacji ekspresji genów
SNAIL jest uważany za jeden z głównych węzłów ścieżek sygnałowych w EMT. Jest on nie tylko represorem genu CDH1, ale również pod jego kontrolą znajduje się wiele innych genów kodujących białka komórek nabłonkowych.
W tabela 1 zestawiono geny bezpośrednio regulowane przez SNAIL, których produkty są zaangażowane w EMT oraz utrzymanie polarności komórek. Zmiany zachodzące pod wpływem czynnika SNAIL potwierdzają jego udział w nabywaniu przez komórki fenotypu migracyjno-inwazyjnego. SNAIL powoduje spadek poziomu białek budujących połączenia ścisłe komórek (tight junctions), m.in. klaudyny-3, – 4, – 7 oraz okludyny, zmianę lokalizacji wewnątrzkomórkowej białka strefy zamykającej ZO-1 i spadek poziomu tworzącej połączenia szczelinowe typu gap koneksyny 43 [23,45]. SNAIL bierze również udział w regulacji ekspresji metaloproteaz (MMP) degradujących macierz zewnątrzkomórkową, takich jak: MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9 i MT1-MMP [49,69,110].
Mimo, że SNAIL uważany jest przede wszystkim za represora transkrypcji, bierze również udział w bezpośredniej indukcji transkrypcji niektórych genów, np. interleukiny 8 czy miozyny Va [44,57].
SNAIL ma zdolność działania plejotropowego; jest zaangażowany nie tylko w represję genów na poziomie transkrypcji, ale także na etapie potranskrypcyjnym, np. wpływając na alternatywne składanie mRNA białek p120 i ZO-1 oraz modulując proces inicjacji translacji klaudyny-1 [74].
Współdziałanie SNAIL z innymi czynnikami transkrypcyjnymi
W czasie EMT, podczas embriogenezy oraz w warunkach patologicznych, wiele czynników transkrypcyjnych współdziała synergicznie lub addytywnie. Wykazano, że represję genu kodującego E-kadherynę, poza rodziną Snail, wywołują: czynnik TWIST, białka z rodziny ZEB: delta-EF1 (ZEB-1) i SIP1 (ZEB-2) oraz produkty alternatywnego składania genu E2A – czynniki E12/E47 [21,37,81,108]. Stopień udziału poszczególnych czynników transkrypcyjnych w obniżeniu poziomu E-kadheryny jest zależny od stopnia powinowactwa wią- zania do badanej sekwencji E-box w danym typie komó- rek. Może to wskazywać na istnienie pewnej hierarchii udziału czynników w represji w konkretnych warunkach in vivo. Tę teorię potwierdza analiza wiązania czynników transkrypcyjnych do elementu E-pal (E-box2 i E-box1) w mysim promotorze genu cdh1 przez zastosowanie metod EMSA (electrophoretic mobility shift assay) oraz CEMSA (capillary electrophoretic mobility shift assays), wykazały one dwukrotnie wyższe powinowactwo SNAIL niż E47, natomiast powinowactwo wiązania SLUG było najniższe spośród tych trzech badanych czynników [9].
Oprócz różnego stopnia zaangażowania w represję genów, obserwuje się również zróżnicowany udział czynników represorowych w poszczególnych etapach inwazji nowotworowej. Przejściowy wzrost poziomu SNAIL lub ZEB-2 w komórkach, w czasie EMT, jest związany z inicjacją inwazji, podczas gdy wzrost SLUG, E47 oraz ZEB-1 z utrzymaniem fenotypu migracyjno-inwazyjnego komórek [77]. Model taki wyjaśniałby rozbieżności w publikowanych wynikach badań, np. obserwowane występowanie różnych represorów transkrypcyjnych w analizach linii komórkowych raka piersi może być uzależnione od stopnia progresji nowotworowej i inwazyjności badanych komórek. W progresji czerniaka następuje zmiana poziomu ekspresji czynników transkrypcyjnych obejmująca spadek poziomu SLUG i ZEB2 przy jednoczesnym wzroście poziomu TWIST1 i ZEB1 [14].
Czynniki transkrypcyjne biorące udział w EMT są powią- zane szeregiem wzajemnych oddziaływań. Badanie tych interakcji poprzez analizę ”interaktomu EMT” pokazało, że rodzina czynników ZEB jest zależna od czynników SNAIL oraz TWIST [97]. Mianowicie, SNAIL (współdziałając z TWIST) wpływa na wzrost ekspresji ZEB-1 na poziomie transkrypcyjnym oraz potranskrypcyjnym w trakcie EMT wywoływanego przez TGF-β. SNAIL jest niezbędny do stabilizacji poziomu białka TWIST i wzrostu ekspresji mRNA TWIST1 oraz translokacji do jądra czynnika ETS1. TWIST i ETS1 bezpośrednio oddziałują na promotor genu ZEB-1 [22].
Regulacja ekspresji i aktywności SNAIL
Umiejscowienie SNAIL w komórce jest istotne dla jego aktywności. Ekspresja i aktywność czynników nale- żących do rodziny Snail jest regulowana na poziomie transkrypcji oraz na różnych etapach potranskrypcyjnych i obejmuje wiele ścieżek przekazywania sygnałów wewnątrzkomórkowych.
Lokalizacja wewnątrzkomórkowa SNAIL
Spośród czynników należących do rodziny Snail tylko SNAIL jest białkiem zidentyfikowanym zarówno w cytoplazmie, jak i w jądrze komórkowym. Obecny w cytoplazmie SNAIL jest białkiem niestabilnym (czas połowicznego zaniku 25 min), bardzo szybko degradowanym przez proteasom w sposób zależny od ubikwitynacji. W procesie tym najistotniejszym enzymem jest kinaza syntazy glikogenu 3 (GSK-3β), która fosforylując seryny w pozycjach 96 oraz 100 w miejscu I powoduje, że SNAIL jest rozpoznawany przez ligazę β-TrCP (β-transducing repeat- -containing protein), a następnie ubikwitynowany i degradowany w proteasomie. Fosforylacja seryn w tym motywie jest poprzedzona fosforylacją seryny w pozycji 104 przez kinazę CK1ε [105]. Natomiast w jądrze komórkowym, fosforylacja miejsca docelowego NES (seryn w pozycjach 107, 111, 115, 119) przez GSK-3β powoduje eksport czynnika z jądra do cytoplazmy (ryc. 2) [116].
Translokację SNAIL do cytoplazmy umożliwia również fosforylacja w przyległej do NES sekwencji bogatej w serynę (serine-rich sequence) powodująca, że NES staje się dostępna dla eksportyny jądrowej Crm1 [26]. Brak sekwencji NES u innych przedstawicieli rodziny Snail powoduje, że ich lokalizacja ogranicza się do jądra komórkowego. Domena C-końca SNAIL jest fosforylowana przez kinazę PAK-1, która fosforylując serynę w pozycji 246 powoduje stabilizację białka w jądrze [109].
Ponadto za zwiększenie stabilności SNAIL w jądrze jest odpowiedzialna fosfataza SCP (small C-terminal domain phosphatase), która, wiążąc się z końcem C czą- steczki SNAIL, indukuje defosforylację seryn w rejonach destruction box i NES (ryc. 2) [104]. Wykazano również dodatkowy mechanizm stabilizacji SNAIL w cytoplazmie. Aktywowana w odpowiedzi na uszkodzenie DNA kinaza ATM fosforyluje serynę w pozycji 100 w SNAIL, co blokuje powstawanie kompleksu SNAIL-GSK-3β, a zatem zahamowanie procesu degradacji w proteasomie. Do ufosforylowanej seryny w pozycji 100 przyłącza się białko HSP90α, dodatkowo stabilizując SNAIL [94].
Rola białek sygnałowych w regulacji ekspresji i aktywności SNAIL
Ekspresja SNAIL jest regulowana przez wiele cząsteczek sygnałowych i czynników biologicznych. Wiązanie się czynników wzrostu do swoistych receptorów, np. czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) do receptora FGFR1 lub czynnika wzrostu naskórka (EGF) do EGFR, aktywuje ścieżki przekazywania sygnału prowadzące do wzrostu poziomu SNAIL. FGFR1 oraz FGF-2 i FGF8 są niezbędne do indukcji ekspresji SNAIL w czasie rozwoju zarodkowego [20,46].
Natomiast EGF w linii komórek ludzkiego raka łuskowatokomórkowego A431 (epidermoid carcinoma) powoduje wzrost poziomu SNAIL przez obniżenie ekspresji kaweoliny-1, co podwyższa, niezależną od GSK-3β, aktywność transkrypcyjną kompleksu β-kateniny z czynnikiem transkrypcyjnym TCF/LEF-1 (białka szlaku Wnt) [65].
Rola rodziny transformujących czynników wzrostu β (transforming growth factor β – TGF-β) w EMT, w tym EMT w progresji nowotworowej została szczegółowo poznana i opisana [15,55].
TGF-β1 indukuje ekspresję SNAIL w linii komórkowej raka płuc H441 [88]. Wpływ TGF-β1 na poziom SNAIL jest podwyższony w komórkach nowotworowych z aktywną onkogenną GTP-azą Ras, co wskazuje na synergizm wpływu tych dwóch czynników na SNAIL [89]. W komórkach epitelialnych wątroby, będących w fazie przejścia w fenotyp „fibroblastoidalny” pod wpływem TGF-β1, w indukcję ekspresji Snai1 zależną od TGF-β1 i Ras jest zaangażowana kinaza 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K) oraz aktywator kinazy ERK/kinaza kinazy białkowej aktywowanej mitogenami 1 i 2 (ERK activator kinase, MEK1/2) [34,78]. W nowotworowych liniach pochodzenia nabłonkowego potwierdzono, że w przekazywanie sygnałów wewnątrzkomórkowych generowanych przez TGF-β1 na drodze zależnej od PI3K jest zaangażowana aktywna Akt [36].
Znany jest wpływ cytokiny prozapalnej – czynnika martwicy nowotworu (tumor necrosis factor, TNF-α) na wiele procesów powiązanych z nowotworzeniem [58]. TNF-α zwiększa migrację komórek, obniża poziom E-kadheryny oraz powoduje translokację SNAIL do jądra w komórkach raka nabłonka przewodów żółciowych [98]. Wydzielany przez makrofagi obecne w mikrośrodowisku nowotworu (tumor associated macrophages, TAMs) TNF-α stabilizuje SNAIL w komórkach nowotworowych przez aktywację szlaku jądrowego czynnika κB (nuclear factor-κB, NFκB). NFκB indukuje transkrypcję sygnalosomu COP9 (podjednostka CSN2), który następnie hamuje fosforylację SNAIL przez GSK-3β, a przez to degradację SNAIL [103].
Podwyższony poziom lub aktywność kinazy ILK są skorelowane ze wzrostem poziomu SNAIL w wielu typach nowotworów złośliwych [6,90,115]. ILK powoduje wzrost migracji i inwazyjności komórek nowotworowych przez indukowanie procesu EMT [16]. Obserwacje te potwierdziły się również w badaniach z wykorzystaniem linii komórkowej raka jelita grubego (colorectal cancer, CRC) SW480 z nadekspresją ILK. Nadekspresja ILK w badanych komórkach obniża poziom E-kadheryny przez aktywację szlaku NFκB. ILK podwyższa poziom SNAIL i SLUG, jednak zaangażowanie w ten proces ścieżki NFκB wymaga dalszych badań [107]. W komórkach CRC ze zmutowanym genem supresora APC, kinaza ILK powoduje wzrost ekspresji genu kodującego SNAIL. W opisanym układzie ani APC ani białka szlaku Wnt (β-katenina, TCF) nie mają wpływu na poziom SNAIL [95].
Należące do rodziny Ras, onkogenne białko K-Ras stabilizuje SNAIL na drodze zależnej od kinazy ATR (ataxia telangiectasia and Rad3-related protein, FRP1) [60].
Transbłonowe białko Notch dwojako wpływa na poziom SNAIL w komórkach nowotworowych. Wewnątrzkomórkowa domena Notch (Notch1 intracellular domain, NICD), stanowiąca aktywną postać tego receptora, wiąże się do promotora SNAIL, powodując wzrost transkrypcji. NICD, w warunkach niedotlenienia, nasila również wią- zanie się czynnika HIF1α do promotora genu oksydazy lizylowej (lysyl oxidase, LOX), powodując wzrost ekspresji oksydazy [87]. LOXL2, przez oksydację lizyny w pozycji 98 lub/i lizyny w pozycji 137 w sekwencji SNAIL, powoduje konformacyjną zmianę cząsteczki SNAIL, co chroni ją przed degradacją zależną od GSK-3β (ryc. 2) [76]. A zatem aktywność SNAIL jest regulowana poprzez utrzymanie dynamicznej równowagi między działaniem GSK-3β i LOXL2 w komórce. Aktywowanie ścieżki sygna- łowej Notch podwyższające poziom SNAIL w liniach komórkowych raka piersi oraz fibroblastach związanych z nowotworem (cancer-assosiated fibroblasts, CAFs) jest stymulowane przez 17β-estradiol oraz jego receptor GPR30/GPER [83].
Na stabilność SNAIL w komórce mają wpływ również kinaza kazeinowa 2 (casein kinase-2, CK2) oraz kinaza białkowa A (protein kinase A, PKA), fosforylując odpowiednio seryny w pozycjach 92 i 11 (ryc. 2). Być może procesy te modulują interakcje między czynnikiem SNAIL a jego korepresorem mSin3A, wpływając na represorową aktywność SNAIL w stosunku do CDH1 [66].
Opisano powiązania między czynnikiem SNAIL a elementami ścieżki sygnałowej Wnt. Białka klasycznej ścieżki sygnałowej Wnt mogą hamować fosforylację SNAIL przez GSK-3β [112]. W doświadczeniach z użyciem linii gruczolakoraka piersi MCF-7 wykazano, że aksyna 2 kontroluje poziom GSK-3β w jądrze komórkowym [113]. W badaniach na liniach komórkowych raka jelita grubego wykazano, że SNAIL, przez stymulację transkrypcji zależnej od kompleksu β-katenina/TCF, wpływa na wzrost poziomu aksyny 2 oraz innych genów zależ- nych od ścieżki Wnt [93]. W warunkach indukowanego EMT w linii HepG2 raka wątrobokomórkowego potwierdzono istnienie wzajemnych oddziaływań między SNAIL a β-kateniną, w następstwie aktywacji białek szlaku MAPK [118]. SNAIL reguluje swoją ekspresję przez ujemne sprzężenie zwrotne. Promotor SNAIL w pozycji – 146 od miejsca startu transkrypcji zawiera aktywną sekwencję E-box (5’-CACCTG-3’) [79].
Wpływ czynników regulujących transkrypcję na regulację ekspresji SNAIL
Poznanie powiązań i wzajemnych zależności między białkami w EMT umożliwiło zidentyfikowanie czynników transkrypcyjnych i epigenetycznych, które regulują poziom SNAIL w komórkach.
Kompleks NF-κB ma wpływ zarówno na ekspresję Snai1, zwiększając poziom transkrypcji SNAIL, jak i na aktywność białka przez stabilizację cząsteczki SNAIL w komórkach [50,103]. Barberà i wsp. wykazali, że ludzki NF-κB stymuluje transkrypcję genu SNAIL, wiążąc się do jego promotora w miejscu – 195 a – 78 pz [6]. Wpływ NF-κB na transkrypcję czynnika w komórkach epitelialnych, może być znoszony przez działanie kinazy GSK-3β [4]. Również czynnik SNAIL wpływa na poziom NF-κB, w komórkach raka prostaty podwyższony pod wpływem działania TGF-β lub EGF poziom SNAIL powodował obniżenie transkrypcji NF-κB/p65 [18]. Zaktywowany przez c-MYC czynnik transkrypcyjny AP4 powoduje wzrost ekspresji SNAIL w komórkach raka jelita grubego [47]. Niezbędny do proliferacji komórek czynnik transkrypcyjny B-Myb jest pozytywnym regulatorem procesu EMT w liniach komórkowych raka piersi, gdzie odpowiada za podwyższenie poziom SNAIL [96].
Czynniki SNAIL i TWIST w różnym stopniu wzajemnie oddziałują na siebie w czasie EMT indukowanym przez TGF-β, Obniżenie poziomu TWIST skutkuje opóźnieniem w indukcji ekspresji SNAIL przez TGF-β [22]. Wykazano również wiązanie regionu końca N sekwencji aminokwasowej metylotransferazy DNA 1 (DNMT1) do sekwencji SNAG czynnika SNAIL. DNMT1 uniemożliwia wiązanie SNAIL do promotora CDH1. Oddziaływanie to nie wymaga zaangażowania domeny kaktalitycznej DNMT1 odpowiedzialnej za metylacje DNA [29].
Rola mikroRNA w regulacji aktywności czynnika SNAIL
W ostatnich latach wiele badań skupia się na niekodujących RNA, a zwłaszcza mikroRNA (miRNA, miR), jako czynnikach regulujących ekspresję genów, zarówno w procesach fizjologicznych, jak i patologicznych. Niektóre z miRNA mogą wpływać na fenotyp komó- rek przez supresję genów zaangażowanych w kontrolowanie (epitelialnego lub mezenchymalnego) stanu komórki. Poziom SNAIL w komórkach nowotworowych jest regulowany przez miR-34a/b/c [54,92]. Aktywne białko supresorowe p53 indukuje ekspresję miR-34, które bezpośrednio wpływa na obniżenie poziomu mRNA kodującego SNAIL. W nowotworach ze zmutowanym lub epigenetycznie zinaktywowanym genem TP53 hamowanie ekspresji SNAIL przez miR-34 jest obniżone. W tym przypadku jest obserwowane sprzężenie zwrotne – powstający SNAIL wiąże się do sekwencji E-box w promotorach miR34a/b/c, hamując ich aktywność. Negatywne sprzężenie zwrotne między SNAIL a miRNA było obserwowane również w przypadku mir-203 w liniach komórkowych raka piersi [70].
Natomiast w komórkach czerniaka nadekspresja miR-9 wpływa na obniżenie poziomu SNAIL, bezpośrednio oddziałując na NF-κB1 [63]. Ponadto w hepatocytarnej linii AML12 czy w czasie EMT w niedrobnokomórkowym raku płuc miR-30 wpływa bezpośrednio na obniżenie poziomu SNAIL, hamując wywołany przez TGF-β proces EMT [56,114]. SNAIL bezpośrednio hamuje również miR- 200, który obniża poziom Slug [25].
Regulacja na poziomie translacji
Zidentyfikowano również wiele innych procesów, które regulują SNAIL na poziomie translacji. Zahamowanie funkcji represora translacji 4E-BP1, charakterystycznego dla epitelium białka wiążącego eIF-4E, uniemożliwia powstawanie kompleksu eIF4F inicjującego translację onkogennych mRNA [12]. W nowotworach szlaki przekazywania sygnałów PI3K/AKT i Ras-MAPK prowadzą do fosforylacji 4E-BP1, która znosi funkcję inhibitorową tego czynnika. Obniżenie poziomu 4E-BP1 w komórkach linii raka piersi i raka jelita grubego powoduje wzrost ekspresji SNAIL, a co za tym idzie wzrost właściwości migracyjnych i inwazyjnych badanych linii komórkowych oraz zwiększenie metastazy w modelu myszy bezgrasiczych. Ponadto w badanych liniach komórkowych MDA-MB-468 i HCT116 wykazano, że inhibitor kinazy mTOR AZD8055 hamuje fosforylację 4E-BP1, obniżając poziom SNAIL. Potwierdza to rolę 4E-BP1 w regulacji ekspresji SNAIL na poziomie inicjacji translacji zależnej od czapeczki, a w związku z tym w regulacji EMT [12]. Natomiast czynnik YB-1 (Y-box binding protein) indukuje translację mRNA SNAIL przez proces inicjacji translacji niezależny od czapeczki związany z sekwencją IRES (internal ribosome entry site – wewnętrzne miejsce wią- zania rybosomu) [30].
Znaczenie SNAIL w nowotworzeniu i inwazyjności nowotworowej
Na podstawie badań przeprowadzonych na materiale uzyskanym od chorych wnioskuje się, że SNAIL jest potencjalnym czynnikiem prognostycznym, m.in. w przeżywalności pacjentów i nawrocie choroby nowotworowej po nefrektomii w raku jasnokomórkowym nerki, przeżywalności chorych na raka pęcherza moczowego poddanych chemioterapii czy chorych na raka piersi [35,64,72]. W raku jelita grubego oraz w liniach komórkowych wywodzących się z nowotworów jelita grubego zwiększony poziom czynnika SNAIL powoduje wzrost właściwości migracyjnych i inwazyjnych komórek w wyniku procesu EMT [44].
Obserwuje się także wpływ SNAIL na indukcję swoistego fenotypu nowotworowych komórek macierzystych (cancer stem cells, CSC) [31,44]. W przypadku raka trzustki SNAIL jest istotnym czynnikiem podtrzymującym ekspresję markerów CSC i ich zdolność samoodnowy (wzrost ekspresji czynników transkrypcyjnych Sox2 i Oct-4) [117]. SNAIL indukuje również fenotyp CSC linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi oraz wzmaga ich oporność na chemioterapię [68]. SNAIL wpływa także na zahamowanie mechanizmów komórkowych prowadzących do apoptozy, a więc na wzrost oporności komórek nowotworowych na chemio-, radio – czy immunoterapię. Wykazano, że czynnik ten w warunkach uszkodzenia DNA, obniża poziom i stabilność białka p53, kontrolującego szlaki indukcji apoptotycznej śmierci komórkowej [51]. W badaniach in vivo SNAIL wykazuje właściwości ochronne, zmniejszając zmiany indukowane uszkodzeniami DNA powstającymi w wyniku stosowania radioterapii [80]. SNAIL jest wykrywany w dużej mierze w fibroblastach zrębu guzów, a jego ekspresja w zrębie jest związana z krótszą przeżywalnością chorych [32]. Poziom mRNA SNAIL w fibroblastach związanych z nowotworem (CAFs) koreluje ze wzrostem migracji i proliferacji komórek raka jelita grubego, co wraz z dostępną, zmienioną pod wpływem SNAIL, pulą cytokin wydzielanych przez CAFs wskazuje na ich własności sprzyjające procesowi nowotworzenia [41].
Podsumowanie
Patologiczna indukcja procesu EMT w komórkach nowotworowych jest powiązana między innymi ze zniekształconym profilem metylacji DNA, zahamowaniem mechanizmów komórkowych prowadzących do apoptozy, a więc wzrostem oporności komórek nowotworowych na chemio-, radio – czy immunoterapię, z nabywaniem właściwości komórek CSC, właściwości migracyjnych i inwazyjnych, prowadzących do metastazy guzów. Czynnik transkrypcyjny SNAIL stanowi ważny element indukujący EMT przez opisane powy- żej mechanizmy epigenetycznej regulacji genów. Lepsze zrozumienie procesów jakim podlega SNAIL w komórkach, może mieć istotne znaczenie w projektowaniu innowacyjnych terapii mających na celu zahamowanie metastazy nowotworowej, a także służyć do celów diagnostycznych i prognostycznych.
Przypisy
- 1. Acloque H., Adams M.S., Fishwick K., Bronner-Fraser M., Nieto M.A.:Epithelial-mesenchymal transitions: The importance of changing cellstate in development and disease. J. Clin. Invest., 2009; 119: 1438-1449
Google Scholar - 2. Alba-Castellón L., Batlle R., Francí C., Fernández-Aceñero M.J.,Mazzolini R., Peña R., Loubat J., Alameda F., Rodríguez R., Curto J.,Albanell J., Muñoz A., Bonilla F., Ignacio Casal J., Rojo F., García deHerreros A.: Snail1 expression is required for sarcomagenesis. Neoplasia,2014; 16: 413-421
Google Scholar - 3. Alberga A., Boulay J., Kempe E., Dennefeld C., Haenlin M.: Thesnail gene required for mesoderm formation in Drosophila is expresseddynamically in derivatives of all three germ layers. Development,1991; 111: 983-992
Google Scholar - 4. Bachelder R.E., Yoon S.O., Franci C., de Herreros A.G., MercurioA.M.: Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snailtranscription: implications for the epithelial-mesenchymal transition.J. Cell Biol., 2005; 168: 29-33
Google Scholar - 5. Bannister A.J., Kouzarides T.: Regulation of chromatin by histonemodifications. Cell Res., 2011; 21: 381-395
Google Scholar - 6. Barberà M.J., Puig I., Domínguez D., Julien-Grille S., Guaita-EsteruelasS., Peiró S., Baulida J., Francí C., Dedhar S., Larue L., Garciade Herreros A.: Regulation of Snail transcription during epithelialto mesenchymal transition of tumor cells. Oncogene, 2004; 23:7345-7354
Google Scholar - 7. Batlle E., Sancho E., Francí C., Domínguez D., Monfar M., BaulidaJ., García De Herreros A.: The transcription factor snail is a repressorof E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat.Cell Biol., 2000; 2: 84-89
Google Scholar - 8. Blanco M.J., Moreno-Bueno G., Sarrio D., Locascio A., Cano A.,Palacios J., Nieto M.A.: Correlation of Snail expression with histologicalgrade and lymph node status in breast carcinomas. Oncogene,2002; 21: 3241-3246
Google Scholar - 9. Bolós V., Peinado H., Pérez-Moreno M.A., Fraga M.F., Esteller M.,Cano A.: The transcription factor Slug represses E-cadherin expressionand induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparisonwith Snail and E47 repressors. J. Cell Sci., 2003; 116: 499-511
Google Scholar - 10. Boulay J.L., Dennefeld C., Alberga A.: The Drosophila developmentalgene snail encodes a protein with nucleic acid binding fingers.Nature, 1987; 330: 395-398
Google Scholar - 11. Boutet A., De Frutos C.A, Maxwell P.H., Mayol M.J., Romero J.,Nieto M.A.: Snail activation disrupts tissue homeostasis and inducesfibrosis in the adult kidney. EMBO J., 2006; 25: 5603-5613
Google Scholar - 12. Cai W., Ye Q., She Q.B.: Loss of 4E-BP1 function induces EMTand promotes cancer cell migration and invasion via cap-dependenttranslational activation of snail. Oncotarget, 2014; 5: 6015-6027
Google Scholar - 13. Cano A., Pérez-Moreno M.A., Rodrigo I., Locascio A., BlancoM.J., del Barrio M.G., Portillo F., Nieto M.A.: The transcription factorSnail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressingE-cadherin expression. Nat. Cell Biol., 2000; 2: 76-83
Google Scholar - 14. Caramel J., Papadogeorgakis E., Hill L., Browne G., Richard G.,Wierinckx A., Saldanha G., Osborne J., Hutchinson P., Tse G., LachuerJ., Puisieux A., Pringle J.H., Ansieau S., Tulchinsky E.: A switch in theexpression of embryonic EMT-inducers drives the development ofmalignant melanoma. Cancer Cell, 2013; 24: 466-480
Google Scholar - 15. Chapnick D.A., Warner L., Bernet J., Rao T., Liu X.: Partners incrime: the TGFβ and MAPK pathways in cancer progression. CellBiosci., 2011; 1: 42
Google Scholar - 16. Chen D., Zhang Y., Zhang X., Li J., Han B., Liu S., Wang L., LingY., Mao S., Wang X.: Overexpression of integrin-linked kinase correlateswith malignant phenotype in non-small cell lung cancerand promotes lung cancer cell invasion and migration via regulatingepithelial-mesenchymal transition (EMT)-related genes. ActaHistochem., 2013; 115: 128-136
Google Scholar - 17. Chen J., Xu H., Zou X., Wang J., Zhu Y., Chen H., Shen B., DengX., Zhou A., Chin Y.E., Rauscher F.J., Peng C., Hou Z.: Snail recruitsRing1B to mediate transcriptional repression and cell migration inpancreatic cancer cells. Cancer Res., 2014;74: 4353-4363
Google Scholar - 18. Chen X.H., Liu Z.C., Zhang G., Wei W., Wang X.X., Wang H., KeH.P., Zhang F., Wang H.S., Cai S.H., Du J.: TGF-β and EGF inducedHLA-I downregulation is associated with epithelial-mesenchymaltransition (EMT) through upregulation of snail in prostate cancercells. Mol. Immunol., 2015; 65: 34-42
Google Scholar - 19. Cicchini C., Filippini D., Coen S., Marchetti A., Cavallari C., LaudadioI., Spagnoli F.M., Alonzi T., Tripodi M.: Snail controls differentiationof hepatocytes by repressing HNF4α expression. J. Cell.Physiol., 2006; 209: 230-238
Google Scholar - 20. Ciruna B., Rossant J.: FGF signaling regulates mesoderm cell fatespecification and morphogenetic movement at the primitive streak.Dev. Cell, 2001; 1: 37-49
Google Scholar - 21. Comijn J., Berx G., Vermassen P., Verschueren K., Van GrunsvenL., Bruyneel E., Mareel M., Huylebroeck D., Van Roy F.: The two-handedE box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherinand induces invasion. Mol. Cell, 2001; 7: 1267-1278
Google Scholar - 22. Dave N., Guaita-Esteruelas S., Gutarra S., Frias À., Beltran M.,Peiró S., García De Herreros A.: Functional cooperation betweensnail1 and twist in the regulation of ZEB1 expression during epithelialto mesenchymal transition. J. Biol. Chem., 2011; 286: 12024-12032
Google Scholar - 23. de Boer T.P., van Veen T.A., Bierhuizen M.F., Kok B., Rook M.B.,Boonen K.J., Vos M.A., Doevendans P.A., de Bakker J.M., van der HeydenM.A.: Connexin43 repression following epithelium-to-mesenchymetransition in embryonal carcinoma cells requires Snail1 transcriptionfactor. Differentiation, 2007; 75: 208-218
Google Scholar - 24. De Craene B., Gilbert B., Stove C., Bruyneel E., van Roy F., Berx G.:The transcription factor Snail induces tumor cell invasion throughmodulation of the epithelial cell differentiation program. CancerRes., 2005; 65: 6237-6244
Google Scholar - 25. Díaz-López A., Díaz-Martín J., Moreno-Bueno G., Cuevas E.P.,Santos V., Olmeda D., Portillo F., Palacios J., Cano, A.: Zeb1 and Snail1engage miR-200f transcriptional and epigenetic regulation duringEMT. Int. J. Cancer, 2015; 136: E62-E73
Google Scholar - 26. Domminguez D., Montserrat-Sentís B., Virgós-Soler A.,GuaitaS., Grueso J., Porta M., Puig I., Baulida J., Francí C., García de HerrerosA.: Phosphorylation regulates the subcellular location andactivity of the Snail transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol., 2003;23: 5078-5089
Google Scholar - 27. Dong C., Wu Y., Wang Y., Wang C., Kang T., Rychahou P.G., ChiY.I., Evers B.M., Zhou B.P.: Interaction with Suv39H1 is critical forSnail-mediated E-cadherin repression in breast cancer. Oncogene,2013; 32: 1351-1362
Google Scholar - 28. Dong C., Wu Y., Yao J., Wang Y., Yu Y., Rychahou P.G., Evers B.M.,Zhou B.P.: G9a interacts with Snail and is critical for Snail-mediatedE-cadherin repression in human breast cancer. J. Clin. Invest., 2012;122: 1469-1486
Google Scholar - 29. Espada J., Peinado H., Lopez-Serra L., Setién F., Lopez-Serra P.,Portela A., Renart J., Carrasco E., Calvo M., Juarranz A., Cano A., EstellerM.: Regulation of SNAIL1 and E-cadherin function by DNMT1in a DNA methylation-independent context. Nucleic Acids Res., 2011;39: 9194-9205
Google Scholar - 30. Evdokimova V., Tognon C., Ng T., Ruzanov P., Melnyk N., FinkD., Sorokin A., Ovchinnikov L.P., Davicioni E., Triche T.J., SorensenP.H.: Translational activation of Snail1 and other developmentallyregulated transcription factors by YB-1 promotes an epithelial-mesenchymaltransition. Cancer Cell, 2009; 15:402-415
Google Scholar - 31. Fan F., Samuel S., Evans K.W., Lu J., Xia L., Zhou Y., Sceusi E.,Tozzi F., Ye X.C., Mani S. A, Ellis L.M.: Overexpression of snail inducesepithelial-mesenchymal transition and a cancer stem cell-like phenotypein human colorectal cancer cells. Cancer Med., 2012; 1: 5-16
Google Scholar - 32. Francí C., Gallén M., Alameda F., Baró T., Iglesias M., VirtanenI., Garcia de Herreros A.: Snail1 protein in the stroma as a new putativeprognosis marker for colon tumours. PLoS One, 2009; 4: 1-7
Google Scholar - 33. Fuse N., Hirose S., Hayashi S.: Diploidy of Drosophila imaginalcells is maintained by a transcriptional repressor encoded by escargot.Genes Dev., 1994; 8: 2270-2281
Google Scholar - 34. Gotzmann J., Huber H., Thallinger C., Wolschek M., Jansen B.,Schulte-Hermann R., Beug H., Mikulits W.: Hepatocytes convert toa fibroblastoid phenotype through the cooperation of TGF-β1 andHa-Ras: steps towards invasiveness. J. Cell Sci., 2002; 115: 1189-1202
Google Scholar - 35. Gou Y., Ding W., Xu K., Wang H., Chen Z., Tan J., Xia G., Ding Q.:Snail is an independent prognostic indicator for predicting recurrenceand progression in non-muscle-invasive bladder cancer. Int.Urol. Nephrol., 2015; 47: 289-293
Google Scholar - 36. Grille S.J., Bellacosa A., Upson J., Klein-Szanto A.J., van Roy F.,Lee-Kwon W., Donowitz M., Tsichlis P.N., Larue L.: The protein kinaseAkt induces epithelial mesenchymal transition and promotesenhanced motility and invasiveness of squamous cell carcinomalines. Cancer Res., 2003; 63: 2172-2178
Google Scholar - 37. Grooteclaes M.L., Frisch S.M.: Evidence for a function of CtBP inepithelial gene regulation and anoikis. Oncogene, 2000; 19: 3823-3828
Google Scholar - 38. Grotegut S., von Schweinitz D., Christofori G., Lehembre F.: Hepatocytegrowth factor induces cell scattering through MAPK/Egr-1-mediated upregulation of Snail. EMBO J., 2006; 25: 3534-3545
Google Scholar - 39. Hemavathy K., Ashraf S.I., Ip Y.T.: Snail/Slug family of repressors:slowly going into the fast lane of development and cancer.Gene, 2000; 257: 1-12
Google Scholar - 40. Herranz N., Pasini D., Díaz V.M., Franci C., Gutierrez A., DaveN., Escrivà M., Hernandez-Muñoz I., Di Croce L., Helin K., García deHerreros A., Peiró S.: Polycomb complex 2 is required for E-cadherinrepression by the Snail1 transcription factor. Mol. Cell. Biol., 2008;28: 4772-4781
Google Scholar - 41. Herrera A., Herrera M., Alba-Castellõn L., Silva J., García V.,Loubat-Casanovas J., Álvarez-Cienfuegos A., Miguel García J., RodriguezR., Gil B., Ma Jesús Citores, Ma Jesús Larriba, Ignacio CasalJ., de Herreros A.G., Bonilla F., Pena C.: Protumorigenic effects ofSnail-expression fibroblasts on colon cancer cells. Int. J. Cancer,2014; 134: 2984-2990
Google Scholar - 42. Hotz B., Visekruna A., Buhr H.J., Hotz H.G.: Beyond epithelialto mesenchymal transition: a novel role for the transcription factorSnail in inflammation and wound healing. J. Gastrointest. Surg.,2010; 14: 388-397
Google Scholar - 43. Hou Z., Peng H., Ayyanathan K., Yan K.P., Langer E.M., LongmoreG.D., Rauscher F.J.: The LIM protein AJUBA recruits protein argininemethyltransferase 5 to mediate SNAIL-dependent transcriptionalrepression. Mol. Cell. Biol., 2008; 28: 3198-3207
Google Scholar - 44. Hwang W.L., Yang M.H., Tsai M.L., Lan H.Y., Su S.H., Chang S.C.,Teng H.W., Yang S.H., Lan Y.T., Chiou S.H., Wang H.W.: SNAIL regulatesinterleukin-8 expression, stem cell-like activity, and tumorigenicityof human colorectal carcinoma cells. Gastroenterology,2011; 141: 279-291
Google Scholar - 45. Ikenouchi J., Matsuda M., Furuse M., Tsukita S.: Regulation oftight junctions during the epithelium-mesenchyme transition: directrepression of the gene expression of claudins/occludin by Snail.J. Cell Sci., 2003; 116: 1959-1967
Google Scholar - 46. Isaac A., Cohn M.J., Ashby P., Ataliotis P., Spicer D.B., Cooke J.,Tickle C.: FGF and genes encoding transcription factors in early limbspecification. Mech. Dev., 2000; 93: 41-48
Google Scholar - 47. Jackstadt R., Röh S., Neumann J., Jung P., Hoffmann R., HorstD., Berens C., Bornkamm G.W., Kirchner T., Menssen A., HermekingH.: AP4 is a mediator of epithelial-mesenchymal transition andmetastasis in colorectal cancer. J. Exp. Med., 2013; 210: 1331-1350
Google Scholar - 48. Jiao W., Miyazaki K., Kitajima Y.J.: Inverse correlation betweenE-cadherin and Snail expression in hepatocellular carcinoma celllines in vitro and in vivo. Br. J. Cancer, 2002; 86: 98-101
Google Scholar - 49. Jordà M., Olmeda D., Vinyals A., Valero E., Cubillo E., Llorens A.,Cano A., Fabra A.: Upregulation of MMP-9 in MDCK epithelial cellline in response to expression of the Snail transcription factor. J.Cell Sci., 2005: 118: 3371-3385
Google Scholar - 50. Julien S., Puig I., Caretti E., Bonaventure J., Nelles L., van Roy F.,Dargemont C., de Herreros A.G., Bellacosa A., Larue L.: Activation ofNF-κB by Akt upregulates Snail expression and induces epitheliummesenchyme transition. Oncogene, 2007; 26: 7445-7456
Google Scholar - 51. Kajita M., Mcclinic K.N., Wade P.A.: Aberrant expression of thetranscription factors Snail and Slug alters the response to genotoxicstress. Mol. Cell. Biol., 2004; 24: 7559-7566
Google Scholar - 52. Kashyap A., Zimmerman T., Ergül N., Bosserhoff A., HartmanU., Alla V., Bataille F., Galle P.R., Strand S., Strand D.: The human Lglpolarity gene, Hugl-2, induces MET and suppresses Snail tumorigenesis.Oncogene, 2013; 32: 1396-1407
Google Scholar - 53. Katoh M., Katoh M.: Identification and characterization of humanSNAIL3 (SNAI3) gene in silico. Int. J. Mol. Med., 2003; 11: 383-388
Google Scholar - 54. Kim N.H., Kim H.S., Li X.Y., Lee I., Choi H.S., Kang S.E., Cha S.Y.,Ryu J.K., Yoon D., Fearon E.R., Rowe R.G., Lee S., Maher C.A., WeissS.J., Yook J.I.: A p53/miRNA-34 axis regulates Snail1-dependent cancercell epithelial-mesenchymal transition. J. Cell Biol., 2011; 195:417-433
Google Scholar - 55. Kim S., Lee J., Jeon M., Nam S.J., Lee J.E.: Elevated TGF-β1 and –β2 expression accelerates the epithelial to mesenchymal transitionin triple-negative breast cancer cells. Cytokine, 2015; 75: 151-158
Google Scholar - 56. Kumarswamy R., Mudduluru G., Ceppi P., Muppala S., KozlowskiM., Niklinski J., Papotti M., Allgayer H.: MicroRNA-30a inhibits epithelial-to-mesenchymaltransition by targeting Snai1 and is downregulatedin non-small cell lung cancer. Int. J. Cancer, 2012; 130:2044-2053
Google Scholar - 57. Lan L., Han H., Zuo H., Chen Z., Du Y., Zhao W., Gu J., Zhang Z.:Upregulation of myosin Va by snail is involved in cancer cell migrationand metastasis. Int. J. Cancer, 2010; 126: 53-64
Google Scholar - 58. Landskron G., De La Fuente M., Thuwajit P., Thuwajit C., HermosoM.A.: Chronic inflammation and cytokines in the tumor microenvironment.J. Immunol. Res., 2014; 2014: 149185
Google Scholar - 59. Larriba M.J., Bonilla F., Muñoz A.: The transcription factorsSnail1 and Snail2 repress vitamin D receptor during colon cancerprogression. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2010; 121: 106-109
Google Scholar - 60. Lee S.H., Lee S.J., Jung Y.S., Xu Y., Kang H.S., Ha N.C., Park B.J.:Blocking of p53-Snail binding, promoted by oncogenic K-Ras, recoversp53 expression and function. Neoplasia, 2009; 11: 22-31
Google Scholar - 61. Lin Y., Dong C., Zhou B.P.: Epigenetic regulation of EMT: the Snailstory. Curr. Pharm. Des., 2014; 20: 1698-1705
Google Scholar - 62. Lin Y., Wu Y., Li J., Dong C., Ye X., Chi Y.I., Evers B.M., Zhou B.P.:The SNAG domain of Snail1 functions as a molecular hook for recruitinglysine-specific demethylase 1. EMBO J., 2010; 29: 1803-1816
Google Scholar - 63. Liu S., Kumar S.M., Lu H., Liu A., Yang R., Pushparajan A., GuoW., Xu X.: MicroRNA-9 up-regulates E-cadherin through inhibitionof NF-κB1-Snail1 pathway in melanoma. J. Pathol., 2012; 226: 61-72
Google Scholar - 64. Liu W., Liu Y., Liu H., Zhang W., An H., Xu J.: Snail predicts recurrenceand survival of patients with localized clear cell renal cell carcinomaafter surgical resection. Urol. Oncol., 2015; 33: 69.e1-e69.e10
Google Scholar - 65. Lu Z., Ghosh S., Wang Z., Hunter T.: Downregulation of caveolin-1function by EGF leads to the loss of E-cadherin, increased transcriptionalactivity of β-catenin, and enhanced tumor cell invasion.Cancer Cell, 2003; 4: 499-515
Google Scholar - 66. MacPherson M.R., Molina P., Souchelnytskyi S., Wernstedt C.,Martin-Pérez J., Portillo F., Cano A.: Phosphorylation of serine 11and serine 92 as new positive regulators of human Snail1 function:potential involvement of casein kinase-2 and the cAMP-activatedkinase protein kinase A. Mol. Biol. Cell, 2010; 21: 244-253
Google Scholar - 67. Martínez-Estrada O.M., Cullerés A., Soriano F.X., Peinado H.,Bolós V., Martínez F.O., Reina M., Cano A., Fabre M., Vilaró S.: Thetranscription factors Slug and Snail act as repressors of Claudin-1expression in epithelial cells. Biochem. J., 2006; 394: 449-457
Google Scholar - 68. Masui T., Ota I., Yook J.-I., Mikami S., Yane K., Yamanaka T., HosoiH.: Snail-induced epithelial-mesenchymal transition promotescancer stem cell-like phenotype in head and neck cancer cells. Int.J. Oncol., 2014; 44: 693-699
Google Scholar - 69. Miyoshi A., Kitajima Y., Sumi K., Sato K., Hagiwara A., Koga Y.,Miyazaki K.: Snail and SIP1 increase cancer invasion by upregulatingMMP family in hepatocellular carcinoma cells. Br. J. Cancer,2004; 90: 1265-1273
Google Scholar - 70. Moes M., Le Béchec A., Crespo I., Laurini C., Halavatyi A., VetterG., Del Soll A., Friederich E.: A novel network integrating a mirnRNA-203/SNAI1 feedback loop which regulates epithelial to mesenchymaltransition. PLoS One, 2012; 7: e35440
Google Scholar - 71. Molina-Ortiz P., Villarejo A., MacPherson M., Santos V., MontesA., Souchelnytskyi S., Portillo F., Cano A.: Characterization of theSNAG and SLUG domains of Snail2 in the repression of E-cadherinand EMT induction: modulation by serine 4 phosphorylation. PLoSOne, 2012; 7: e36132
Google Scholar - 72. Muenst S., Däster S., Obermann E.C., Droeser R.A., Weber W.P.,von Holzen U., Gao F., Viehl C., Oertli D., Soysal S.D.: Nuclear expressionof Snail is an independent negative prognostic factor in humanbreast cancer. Dis. Markers, 2013; 35: 337-344
Google Scholar - 73. Nakayama H., Scott I.C., Cross J.C.: The transition to endoreduplicationin trophoblast giant cells is regulated by the mSNA zincfinger transcription factor. Dev. Biol., 1998; 199: 150-163
Google Scholar - 74. Ohkubo T., Ozawa M.: The transcription factor Snail downregulatesthe tight junction components independently of E-cadherindownregulation. J. Cell Sci., 2004; 117: 1675-1685
Google Scholar - 75. Peinado H., Ballestar E., Esteller M., Cano A.: Snail mediates Ecadherinrepression by the recruitment of the Sin3A/histone deacetylase 1 (HDAC1)/HDAC2 complex. Mol. Cell. Biol., 2004; 24: 306-319
Google Scholar - 76. Peinado H., Del Carmen Iglesias-de la Cruz M., Olmeda D., CsiszarK., Fong K.S., Vega S., Nieto M.A., Cano A., Portillo F.: A molecularrole for lysyl oxidase-like 2 enzyme in snail regulation and tumorprogression. EMBO J., 2005; 24: 3446-3458
Google Scholar - 77. Peinado H., Portillo F., Cano A.: Transcriptional regulation ofcadherins during development and carcinogenesis. Int. J. Dev. Biol.,2004; 48: 365-375
Google Scholar - 78. Peinado H., Quintanilla M., Cano A.: Transforming growth factorβ-1 induces Snail transcription factor in epithelial cell lines.Mechanisms for epithelial mesenchymal transitions. J. Biol. Chem.,2003; 278: 21113-21123
Google Scholar - 79. Peiró S., Escrivà M., Puig I., Barberà M.J., Dave N., Herranz N.,Larriba M.J., Takkunen M., Francí C., Muñoz A., Virtanen I., BaulidaJ., García de Herreros A.: Snail1 transcriptional repressor binds toits own promoter and controls its expression. Nucleic Acids Res.,2006; 34: 2077-2084
Google Scholar - 80. Pérez-Mancera P.A., Pérez-Caro M., González-Herrero I., FloresT., Orfao A., de Herreros A.G., Gutiérrez-Adán A., Pintado B., SagreraA., Sánchez-Martín M., Sánchez-García I.: Cancer developmentinduced by graded expression of Snail in mice. Hum. Mol. Genet.,2005; 14: 3449-3461
Google Scholar - 81. Pérez-Moreno M.A., Locascio A., Rodrigo I., Dhondt G., PortilloF., Nieto M.A., Cano A.: A new role for E12/E47 in the repression ofE-cadherin expression and epithelial-mesenchymal transitions. J.Biol. Chem., 2001; 276: 27424-27431
Google Scholar - 82. Poser I., Domínguez D., Garcia De Herreros A., Varnai A., BuettnerR., Bosserhoff A.K.: Loss of E-cadherin expression in melanoma cellsinvolves up-regulation of the transcriptional repressor Snail. J. Biol.Chem., 2001; 276: 24661-24666
Google Scholar - 83. Pupo M., Pisano A., Abonante S., Maggiolini M., Musti A.M.: GPERactivates Notch signaling in breast cancer cells and cancer-associatedfibroblasts (CAFs). Int. J. Biochem. Cell Biol., 2014; 46: 56-67
Google Scholar - 84. Rhim A.D., Mirek E.T., Aiello N.M., Maitra A., Bailey J.M., McAllisterF., Reichert M., Beatty G.L., Rustgi A.K., Vonderheide R.H., LeachS.D., Stanger B.Z.: EMT and dissemination precede pancreatic tumorformation. Cell, 2012; 148: 349-361
Google Scholar - 85. Rosivatz E., Becker I., Specht K., Fricke E., Luber B., Busch R., Hö-fler H., Becker K.F.: Differential expression of the epithelial-mesenchymaltransition regulators snail, SIP1, and twist in gastric cancer.Am. J. Pathol., 2002; 161; 1881-1891
Google Scholar - 86. Rowe R.G., Li X.Y., Hu Y., Saunders T.L., Virtanen I., Garcia deHerreros A., Becker K.F., Ingvarsen S., Engelholm L.H., Bommer G.T.,Fearon E.R., Weiss S.J.: Mesenchymal cells reactivate Snail1 expressionto drive three-dimensional invasion programs. J. Cell Biol.,2009; 184: 399-408
Google Scholar - 87. Sahlgren C., Gustafsson M.V., Jin S., Poellinger L., Lendahl U.:Notch signaling mediates hypoxia-induced tumor cell migration andinvasion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008; 105: 6392-6397
Google Scholar - 88. Saito R.A., Watabe T., Horiguchi K., Kohyama T., Saitoh M., NagaseT., Miyazono K.: Thyroid transcription factor-1 inhibits transforming growth factor-β-mediated epithelial-to-mesenchymal transitionin lung adenocarcinoma cells. Cancer Res., 2009; 69: 2783-2791
Google Scholar - 89. Saitoh M.: Epithelial–mesenchymal transition is regulated atpost-transcriptional levels by transforming growth factor-β signalingduring tumor progression. Cancer Sci., 2015; 106: 481-488
Google Scholar - 90. Schaeffer D.F., Assi K., Chan K., Buczkowski A.K., Chung S.W.,Scudamore C.H., Weiss A., Salh B., Owen D.A.: Tumor expression ofIntegrin-linked kinase (ILK) correlates with the expression of theE-cadherin repressor Snail: an immunohistochemical study in ductalpancreatic adenocarcinoma. Virchows Arch., 2010; 456: 261-268
Google Scholar - 91. Shi Y.J., Matson C., Lan F., Iwase S., Baba T., Shi Y.: Regulationof LSD1 histone demethylase activity by its associated factors. Mol.Cell, 2005; 19: 857-864
Google Scholar - 92. Siemens H., Jackstadt R., Hünten S., Kaller M., Menssen A., GötzU., Hermeking H.: miR-34 and SNAIL form a double-negative feedbackloop to regulate epithelial-mesenchymal transitions. Cell Cycle,2011; 10: 4256-4271
Google Scholar - 93. Stemmer V., de Craene B., Berx G., Behrens J.: Snail promotesWnt target gene expression and interacts with β-catenin. Oncogene,2008; 27: 5075-5080
Google Scholar - 94. Sun M., Guo X., Qian X., Wang H., Yang C., Brinkman K.L., Serrano-GonzalezM., Jope R.S., Zhou B., Engler D.A., Zhan M., Wong S.T.,Fu L., Xu B.: Activation of the ATM-Snail pathway promotes breastcancer metastasis. J. Mol. Cell Biol., 2012; 4: 304-315
Google Scholar - 95. Tan C., Costello P., Sanghera J., Dominguez D., Baulida J., de HerrerosA.G., Dedhar S.: Inhibition of integrin linked kinase (ILK) suppressesβ-catenin-Lef/Tcf-dependent transcription and expressionof the E-cadherin repressor, snail, in APC-/ – human colon carcinomacells. Oncogene, 2001; 20: 133-140
Google Scholar - 96. Tao D., Pan Y., Jiang G., Lu H., Zheng S., Lin H., Cao F.: B-Myb regulatessnail expression to promote epithelial-to – mesenchymal transitionand invasion of breast cancer cell. Med. Oncol., 2015; 32: 412
Google Scholar - 97. Taube J.H., Herschkowitz J.I., Komurov K., Zhou A.Y., Gupta S.,Yang J., Hartwell K., Onder T.T., Gupta P.B., Evans K.W., Hollier B.G.,Ram P.T., Lander E.S., Rosen J.M., Weinberg R.A., Mani S.A.: Coreepithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expressionsignature is associated with claudin-low and metaplastic breastcancer subtypes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010; 107: 15449-15454
Google Scholar - 98. Techasen A., Namwat N., Loilome W., Bungkanjana P., KhuntikeoN., Puapairoj A., Jearanaikoon P., Saya H., Yongvanit P.: Tumornecrosis factor-α (TNF-α) stimulates the epithelial-mesenchymaltransition regulator Snail in cholangiocarcinoma. Med. Oncol., 2012;29: 3083-3091
Google Scholar - 99. Whiteman E.L., Liu C.J., Fearon E.R., Margolis B.: The transcriptionfactor snail represses Crumbs3 expression and disrupts apicobasalpolarity complexes. Oncogene, 2008; 27: 3875-3879
Google Scholar - 100. Wong A.S., Gumbiner B.M.: Adhesion-independent mechanismfor suppression of tumor cell invasion by E-cadherin. J. Cell Biol.,2003; 161: 1191-1203
Google Scholar - 101. Wong M.M., Guo C., Zhang J.: Nuclear receptor corepressorcomplexes in cancer : mechanism, function and regulation. Am. J.Clin. Exp. Urol., 2014; 2: 169-187
Google Scholar - 102. Wu M.Z., Tsai Y.P., Yang M.H., Huang C.H., Chang S.Y., ChangC.C., Teng S.C., Wu K.J.: Interplay between HDAC3 and WDR5 Is Essentialfor Hypoxia-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition.Mol. Cell, 2011; 43: 811-822
Google Scholar - 103. Wu Y., Deng J., Rychahou P.G., Qiu S., Evers B.M., Zhou B.P.: Stabilizationof Snail by NF-κB is required for inflammation-inducedcell migration and invasion. Cancer Cell, 2009; 15: 416-428
Google Scholar - 104. Wu Y., Evers B.M., Zhou B.P.: Small C-terminal domain phosphataseenhances snail activity through dephosphorylation. J. Biol.Chem., 2009; 284; 640-648
Google Scholar - 105. Xu Y., Lee S.H., Kim H.S., Kim N.H., Piao S., Park S.H., Jung Y.S., Yook J.I., Park B.J., Ha N.C.: Role of CK1 in GSK3β-mediated phosphorylationand degradation of snail. Oncogene, 2010; 29: 3124-3133
Google Scholar - 106. Yamasaki H., Sekimoto T., Ohkubo T., Douchi T., Nagata Y., OzawaM., Yoneda Y.: Zinc finger domain of Snail functions as a nuclearlocalization signal for importin β-mediated nuclear import pathway.Genes Cells, 2005; 10: 455-464
Google Scholar - 107. Yan Z., Yin H., Wang R., Wu D., Sun W., Liu B., Su Q.: Overexpressionof integrin-linked kinase (ILK) promotes migration and invasionof colorectal cancer cells by inducing epithelial-mesenchymaltransition via NF-κB signaling. Acta Histochem., 2014; 116: 527-533
Google Scholar - 108. Yang J., Mani S.A., Donaher J.L., Ramaswamy S., Itzykson R.A.,Come C., Savagner P., Gitelman I., Richardson A., Weinberg R.A.:Twist, a master regulator of morphogenesis, plays an essential rolein tumor metastasis. Cell, 2004;117: 927-939
Google Scholar - 109. Yang Z., Rayala S., Nguyen D., Vadlamudi R.K., Chen S., KumarR.: Pak1 phosphorylation of Snail, a master regulator of epithelialto-mesenchymetransition, modulates Snail’s subcellular localizationand functions. Cancer Res., 2005; 65: 3179-3184
Google Scholar - 110. Yokoyama K., Kamata N., Fujimoto R., Tsutsumi S., TomonariM., Taki M., Hosokawa H., Nagayama M.: Increased invasion andmatrix metalloproteinase-2 expression by Snail-induced mesenchymaltransition in squamous cell carcinomas. Int. J. Oncol., 2003;22: 891-898
Google Scholar - 111. Yokoyama K., Kamata N., Hayashi E., Hoteiya T., Ueda N., FujimotoR., Nagayama M.: Reverse correlation of E-cadherin and snailexpression in oral squamous cell carcinoma cells in vitro. Oral Oncol.,2001; 37: 65-71
Google Scholar - 112. Yook J.I., Li X.Y., Ota I., Fearon E.R., Weiss S.J.: Wnt-dependentregulation of the E-cadherin repressor snail. J. Biol. Chem., 2005; 280; 11740-11748
Google Scholar - 113. Yook J.I., Li X.Y., Ota I., Hu C., Kim H.S., Kim N.H., Cha S.Y., RyuJ.K., Choi Y.J., Kim J., Fearon E.R., Weiss S.J.: A Wnt-Axin2-GSK3β cascaderegulates Snail1 activity in breast cancer cells. Nat. Cell Biol.,2006; 8: 1398-1406
Google Scholar - 114. Zhang J., Zhang H., Liu J., Tu X., Zang Y., Zhu J., Chen J., Dong L.,Zhang J.: MiR-30 inhibits TGF-β1-induced epithelial-to-mesenchymaltransition in hepatocyte by targeting Snail1. Biochem. Biophys. Res.Commun., 2012; 417: 1100-1105
Google Scholar - 115. Zhao D., Tang X.F., Yang K., Liu J.Y., Ma X.R.: Over-expressionof integrin-linked kinase correlates with aberrant expression ofSnail, E-cadherin and N-cadherin in oral squamous cell carcinoma:Implications in tumor progression and metastasis. Clin. Exp. Metastasis,2012; 29: 957-969
Google Scholar - 116. Zhou B.P., Deng J., Xia W., Xu J., Li Y.M., Gunduz M., Hung M.C.:Dual regulation of Snail by GSK-3β-mediated phosphorylation incontrol of epithelial-mesenchymal transition. Nat. Cell Biol., 2004;6: 931-940
Google Scholar - 117. Zhou W., Lv R., Qi,W., Wu D., Xu Y., Liu W., Mou Y., Wang L.: Snailcontributes to the maintenance of stem cell-like phenotype cells inhuman pancreatic cancer. PLoS One, 2014; 9: e87409
Google Scholar - 118. Zucchini-Pascal N., Peyre L., Rahmani R.: Crosstalk betweenβ-catenin and snail in the induction of epithelial to mesenchymaltransition in hepatocarcinoma: role of the ERK1/2 pathway. Int. J.Mol. Sci., 2013; 14: 20768-20792
Google Scholar