Abstrakt

Szacuje się, że każdego roku ponad 2 mln ludzi cierpi z powodu biegunek, wynikających ze spożycia zanieczyszczonego mięsa. Najczęściej za infekcje pokarmowe odpowiadają małe Gram-ujemne laseczki Campylobacter. Ich gospodarzami są głównie ptaki, u których wchodzą w skład prawidłowej flory jelitowej. W czasie przemysłowego uboju istnieje prawdopodobieństwo kontaminacji tusz przez bakterie obecne w treści jelitowej. W Europie, aż do 90% stad drobiu może być rezerwuarem patogenu. Zgodnie z raportem Europejskiego Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności z 2015 r. liczba zgłoszonych i potwierdzonych przypadków ludzkiej kampylobakteriozy przekracza 200 tys. rocznie i utrzymuje się od kilku lat na stałym poziomie. Zjawisko narastającej antybiotykooporności bakterii wymusza ograniczenie stosowania antybiotyków w hodowli zwierząt. W związku z tym w Unii Europejskiej na farmach dopuszcza się tylko zaostrzone zabiegi prewencyjne i higieniczne. Wyhodowanie kurczaków wolnych od Campylobacter z użyciem tych metod jest możliwe, jednak trudne w realizacji i kosztowne. Wykorzystanie wirusów bakteryjnych – bakteriofagów może być metodą zapewniającą higieniczne warunki hodowli drobiu i przetwarzania żywności. Preparaty stosowane w ochronie żywności powinny zawierać bakteriofagi ściśle lityczne, apirogenne oraz długo zachowujące aktywność biologiczną. Obecnie na rynku dostępne są komercyjne preparaty bakteriofagowe stosowane w rolnictwie, jednak żaden nie zawiera fagów przeciw Campylobacter. Niemniej jednak w ciągu ostatnich lat opublikowano wyniki badań dotyczące zastosowania bakteriofagów przeciw Campylobacter u kur i w produktach drobiowych. Zgodnie z szacunkami redukcja Campylobacter w tuszach drobiowych o dwie jednostki logarytmiczne przyczyni się do 30-krotnego zmniejszenia częstości kampylobakteriozy u ludzi. Badania nad bakteriofagami przeciw Campylobacter mają znaczenie poznawcze i gospodarcze. W opracowaniu przedstawiono aktualny stań badań nad bakteriofagami skierowanymi przeciw Campylobacter.

Wstęp

Historia odkryć bakteriofagów sięga początku 1896 r., w którym Ernest Hanbury Hankin, skojarzył obniżenie zapadalności na cholerę z rytualną kąpielą oraz piciem wody Gangesu i Jamuny [1]. Zjawisko wyjaśnił Félix d’Hérelle, franko-kanadyjski mikrobiolog, który odkrył w wodzie wirusy degradujące bakterie, a w 1917 r. skutecznie zastosował bakteriofagi w leczeniu czwórki pacjentów chorych na czerwonkę bakteryjną [40,59]. Prace Alexandra Fleminga prowadzące do odkrycia penicyliny spowolniły na wiele lat badania nad bakteriofagami. Sukces terapeutyczny penicylin spowodował rozwój badań nad innymi grupami antybiotyków doprowadzając do ich masowego wykorzystania [40]. Antybiotyki powszechnie stosowane w hodowli zwierząt rzeźnych, jako stymulatory wzrostu (antybiotykowe stymulatory wzrostu – ASW) miały pełnić funkcję profilaktyczną, pobudzającą wzrost i zwiększającą wydajność produkcji. Działanie stymulacyjne zostało osiągnięte przez zwalczanie patogenów, które wywo- łują przewlekły nieżyt jelit u zwierząt. Ich stosowanie zwiększa wchłanianie składników pokarmowych i obniża koszty zużycia paszy. Nadmierne wykorzystanie ASW jest jednak przyczyną przedostawania się antybiotyków do środowiska, w wyniku czego zwiększa się pula genów antybiotykooporności [67]. Zjawisko jest obecnie szeroko rozpowszechnione wśród patogenów, takich jak np. Campylobacter jejuni, Escherichia coli czy Salmonella [46].

Obawy dotyczące wykorzystania chemicznych dodatków w produkcji żywności doprowadziły do wydania przez Unię Europejską zakazu stosowania wielu antybiotyków oraz stymulatorów wzrostu w hodowli drobiu. Nakaz ograniczający wykorzystanie antybiotyków może spowodować obniżenie jakości produkcji, rentowności oraz bezpieczeń- stwa mikrobiologicznego. Czynnikiem, który dodatkowo powoduje wzrost ryzyka zanieczyszczenia mikrobiologicznego jest ograniczenie wykorzystania chloru podczas przeprowadzania zabiegów chemicznych w rzeźniach [6]. Natomiast w przypadku metod fizycznych, takich jak para wodna, suche ciepło i promieniowanie UV pojawiają się problemy związane z akceptowalnością pogarszających się właściwości organoleptycznych żywności [22].

Komisja Europejska nie zatwierdza zabiegów odkażają- cych, ponieważ istnieje obawa, że mogą maskować niehigieniczne praktyki uboju lub doprowadzić do powstania oporności na środki antymikrobiologiczne [35]. Środki interwencyjne skupiają się natomiast na zapobieganiu kolonizacji i zmniejszaniu jej stopnia podczas hodowli oraz odkażaniu tusz drobiowych po uboju [18]. Dosyć skuteczna jest kontrola pracowników gospodarstw na wejściu, mycie i odkażanie rąk oraz zmiana butów i odzieży wierzchniej przed wejściem [56]. Znaczna poprawa bezpieczeństwa biologicznego na fermach drobiu może być bardzo kosztowna i trudna do utrzymania. Powoduje to wzrost zainteresowania poszukiwaniami w pełni akceptowalnych oraz opłacalnych sposobów zapobiegania zakażeniom drobiu. Wykorzystanie bakteriofagów jest jedną z możliwości osiągnięcia tego celu. Zastąpienie antybiotyków przez wyselekcjonowane szczepionki bakteriofagowe może pozwolić na uzyskanie podobnego wyniku stymulacyjnego z jednoczesnym ograniczeniem zagrożenia narastania antybiotykooporności w środowisku [6]. Obserwowany rozwój badań nad bakteriofagami charakteryzuje się szerokim zakresem działań: od przedsięwzięć inżynierii genetycznej po próby terapii zakażeń [31]. Zastosowanie bakteriofagów może rozwiązać wiele wyzwań stawianych obecnej medycynie i biotechnologii, umożliwiając m.in. wykrywanie i eliminację patogenów z żywności, ale dzia- łając również jako środki przeciwrakowe, nośniki leków i szczepionki. Ważnym obszarem zastosowań bakteriofagów jest ich wykorzystanie do zwalczania zanieczyszczeń mikrobiologicznych w technologii żywności [28,31].

Campylobacter jako źródło zakażeń przewodu pokarmowego

Laseczki z rodzaju Campylobacter (poznanych jest 25 gatunków) należą do gromady Proteobacteria, klasy ɛ-Proteobacteria, rzędu Campylobacterales, rodziny Campylobacteraceae [29,48,56,66].

Nazwa Campylobacter pochodzi od greckiego słowa „kampylos”, co oznacza „zakrzywiona” [33]. Uważa się, że pierwszym doniesieniem dotyczącym Campylobacter było opisanie przez Theodora Eschericha w 1886 r. niedających się hodować spiralnych bakterii. Po raz pierwszy zostały zidentyfikowane w 1906 r. przez brytyjskich weterynarzy – McFadyeana i Stockmana u ciężarnej owcy, natomiast klasyfikację do rodzaju Campylobacter zaproponowali w 1963 r. Sebald i Véron [56].

Campylobacter to Gram-ujemne, cienkie, małe (0,2-0,8 μm×0,5 μm), spiralnie zakrzywione nieprzetrwalnikujące laseczki. Dwie lub więcej komórek może się układać w kształt przypominający literę S lub V, czy też skrzydło mewy. Większość gatunków wykazuje ruch koziołkowy, z powodu obecności pojedynczej biegunowo usytuowanej rzęski na jednym lub dwóch końcach komórki [56]. Bakterie rosną najlepiej w atmosferze mikroaerofilnej (5% O2 , 10% CO2 , 85% N2 ), ale mogą przetrwać także w warunkach tlenowych i beztlenowych [23,29]. Większość gatunków z rodzaju Campylobacter wzrasta w temperaturze 37-42˚C, ale niektóre mogą rosnąć w temperaturze poniżej 30˚C. Optymalna temperatura wzrostu wynosi 41,5-42˚C, a pH mieści się w przedziale 6,5-7,5 (C. jejuni nie może przetrwać w pH poniżej 4,9 i powyżej 9,0) [29,56]. Bakterie nie fermentują ani nie utleniają węglowodanów, a głównym źródłem energii są dla nich aminokwasy lub pośrednie produkty cyklu Krebsa. Prawie wszystkie gatunki charakteryzują się obecnością oksydazy. C. jejuni wykazuje zdolność hydrolizy hipuranu, octanu indoksylu i redukcji azotanów [56]. Większość szczepów jest oporna na cefalotynę i coraz częściej na fluorochinolony [14,56]. C. jejuni i C. coli wykazują również oporność na tetracyklinę i zmniejszoną wrażliwość na erytromycynę [65]. Wykazano, że zamrażanie i rozmrażanie zmniejsza liczebność bakterii z rodzaju Campylobacter. Czyste kultury są zazwyczaj inaktywowane podczas przechowywania w temperaturze -15˚C w przeciągu trzech dni. Zamrażanie nie eliminuje jednak patogenów podczas przechowywania żywności [56]. Bakterie z rodzaju Campylobacter tworzą biofilmy w celu przezwyciężenia niekorzystnych warunków środowiskowych, takich jak obecność tlenu, wysuszenie, ogrzewanie, środki dezynfekujące czy kwaśne środowisko często spotykane w procesie obróbki żywności [55].W niekorzystnych warunkach bakterie mogą tworzyć postacie niedające się hodować (viable but nonculturable, VBNC) [44].

Campylobacter jest mikroorganizmem zdolnym do prze- życia w wielu różnych środowiskach, jednym z rezerwuarów są wody powierzchniowe [33]. Jednak bakterie Campylobacter są głównie komensalnymi organizmami występującymi zazwyczaj u bydła, świń i ptaków. Ze względu na wyższą temperaturę ciała, ptaki są ich najczęstszymi gospodarzami [56]. Badania przeprowadzone w Europie wykazały, że procent stad drobiu, u których wykryto obecność Campylobacter waha się w przedziale 18-90. Kraje wysunięte najbardziej na północ charakteryzują się znacznie mniejszymi wartościami niż te na południu, co może być spowodowane ciepłolubnością Campylobacter [12]. Gatunki z rodzaju Campylobacter są wykrywane już u 2-3-tygodniowych kurczaków, a docelowym miejscem kolonizacji jest jelito ślepe, cienkie, grube i stek [37]. Namnażanie i kolonizacja przewodu pokarmowego drobiu przez Campylobacter zachodzi szybko, a źródłami zakażenia są zanieczyszczenia ze środowiska i koprofagia [12]. Skolonizowane kurczaki mogą przenosić C. jejuni – ludzki patogen, jako część swojej prawidłowej flory jelitowej [58].

Infekcje spowodowane przez Campylobacter należą do najczęstszych bakteryjnych infekcji pokarmowych na świecie [29]. Kampylobakteriozę u ludzi wywołują głównie termotolerancyjne szczepy Campylobacter. Gatunki, które są związane z zakażeniem u ludzi to C. jejuni, C. coli, C. lari, lecz inne gatunki Campylobacter łącznie z nietermofilnym C. fetus mogą również sporadycznie wywoływać zaka- żania [16]. Podaje się, że około 90% przypadków kampylobakteriozy jest spowodowane zakażeniem C. jejuni, a pozostałe 10% jest wywołane głównie przez C. coli [54]; dawka zakaźna jest na ogół niska [16]. Niektórzy autorzy podają, że bardzo zakaźne szczepy C. jejuni mogą wywo- łać chorobę już przy dawce zakażającej około 800 komó- rek [62]. Średni okres inkubacji u ludzi wynosi 2-5 dni. Przebieg zakażenia może być łagodny lub ciężki. Do typowych objawów klinicznych należą: wodnista lub krwawa biegunka, ból brzucha, gorączka, ból głowy, skurcze oraz mdłości. Przeważnie zakażenie ustępuje samoistnie w przeciągu kilku dni, jednak w niektórych przypadkach mogą wystąpić powikłania, takie jak: infekcje jelitowe, reaktywne zapalenie stawów, zaburzenia neurologiczne oraz zespół Guillaina-Barrégo (w tym wariant Millera Fishera) [16,20,34,35]. C. jejuni stał się najczęstszą przyczyną zespołu Guillaina-Barrégo – podobnej do poliomyelitis postaci paraliżu, która może doprowadzić do niewydolności oddechowej, ciężkich zaburzeń neurologicznych, a nawet śmierci [16,35]. W Unii Europejskiej kampylobakterioza jest najczęściej zgłaszaną zoonozą i główną przyczyną bakteryjnego nieżytu żołądka i jelit u ludzi [56,58]. Według EFSA (Europejskiego Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności) trend ten utrzymuje się od 2005 r. Liczba zgłoszonych i potwierdzonych przypadków ludzkiej kampylobakteriozy w 2013 r. przekroczyła 200 tys. (ryc. 1). Mimo dużej liczby przypadków kampylobakteriozy u ludzi oraz ciężkiego przebiegu zgłaszanych przypadków śmiertelność jest niska (0,05%) [17].

Najwyższe wskaźniki powiadomień na 100 000 o zaka- żeniu Campylobacterw 2013 r. stwierdzono w Czechach (173,7), Luksemburgu (125,7), Słowacji (108,0) i Wielkiej Brytanii (104,0). Natomiast najniższe wskaźniki powiadomień podaje się na Łotwie, w Rumunii, Polsce i Buł- garii (<2,0) [17]. Od 2012 r. w Polsce każdy przypadek kampylobakteriozy podlega obowiązkowej rejestracji [48]. WHO (Światowa Organizacja Zdrowia) szacuje, że ponad 2 mln ludzi corocznie umiera z powodu biegunek, przeważnie spowodowanych spożyciem zanieczyszczonego mięsa [56]. Głównym źródłem infekcji Campylobacter jest mięso drobiowe. Pozostałe źródła to surowe mięso innego pochodzenia, niepasteryzowane mleko czy zanieczyszczona woda [32]. Do głównych czynników ryzyka transmisji Campylobacter zalicza się spożywanie niedogotowanego mięsa drobiowego oraz zanieczyszczenia przenoszone na inne produkty podczas przetwarzania [18,37]. Ze względu na największe spożycie, ryzyko jest najwyższe w przypadku kurczaków [56]. Bakterie z rodzaju Campylobacter dość dobrze radzą sobie w środowisku pakowania próżniowego, modyfikowanej atmosferze i warunkach chłodniczych, dlatego izoluje się je również z pakowanych wyrobów z kurczaka [45]. Kolonizacja broilerów przez jelitowy patogen C. jejuni jest szeroko rozpowszechniona i trudno jej zapobiec. Doustne infekcje tym patogenem stały się najczęstszą przyczyną chorób przenoszonych drogą pokarmową w krajach uprzemysłowionych, co przekłada się na 20-30% ludzkich przypadków kampylobakteriozy, podczas gdy 50-80% można powiązać z całym rezerwuarem kurzym [22,56].

Szacowana liczba przypadków kampylobakteriozy występujących na świecie rocznie przekłada się na koszty ponoszone przez gospodarkę. Na straty finansowe składają się utracone zarobki, koszty medyczne, sądowe, wycofania produktów i inne koszty pośrednie [56]. Panel ds. Zagrożeń Biologicznych EFSA uważa redukcję na poziomie farm za najbardziej korzystną dla zdrowia publicznego [34]. Konieczne jest zatem ograniczenie narażenia ludzi na zakażenie Campylobacter przez zmniejszenie częstości jego występowania u kurczaków w czasie hodowli oraz w tuszach podczas uboju i środowiska przetwarzania [35]. Poprawa bezpieczeństwa biologicznego na farmach spowodowała uwolnienie kurczaków od Campylobacter, jednak w ubojniach może nadal dochodzić do zakażenia krzyżowego [37].

Ogólna chraktertyska bakteriofagów

Bakteriofagi (fagi) są relatywnie prostymi (genetycznie i strukturalnie), wirusowymi pasożytami bakteryjnymi [46], których cykl życiowy trwa 20-60 min [46]. Ich niewielkie wymiary (20-200 nanometrów) sprawiają, że są przeciętnie około stukrotnie mniejsze niż większość komórek bakteryjnych [32]. Fagi infekują ponad 140 rodzajów bakterii, lecz mimo to są swoiste wobec określonych szczepów – jedne atakują tylko jeden lub kilka podobnych szczepów, podczas gdy inne mogą infekować szczepy spośród różnych gatunków [21,36]. Nie poznano jeszcze fagów zdolnych do infekowania jednocześnie bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych [36]. Bakteriofagi nie są zdolne do infekowania komórek innych niż prokariotyczne. Ludzki układ immunologiczny postrzega je jak każde inne cząstki wirusowe, co powoduje ich wychwyt przez układ siateczkowo-śródbłonkowy, a przez to ich akumulację w wątrobie i śledzionie. Jednak badania wykazują, że mimo to fagi mogą przetrwać w organizmie do kilku dni od ich podania [50].

W  przyrodzie bakteriofagi znajdują się w równowadze z bakteriami hamując ich niekontrolowany rozwój. Liczbę bakterii w środowisku szacuje się na 46 × 1030 komórek, natomiast bakteriofagów na 1031 cząstek [26,64]. Utrzymanie liczebności bakteriofagów na tak wysokim poziomie jest związane z masowym infekowaniem gospodarzy bakteryjnych. Szacuje się, że zabijanych jest 20-50% populacji bakterii. Nie obniża to jednak gwałtownie liczebności bakterii na świecie, ale dowodzi, że wciąż trwający między bakteriofagami i bakteriami „wyścig zbrojeń” jest główną siłą napędową ich ewolucji i pozwala im współistnieć w tych samych środowiskach [42]. Fagi występują powszechnie w glebie, kanalizacji, ściekach gospodarczych i przetwórczych, odchodach i produktach żywnościowych, także w wodzie morskiej i środowiskach słodkowodnych [3,31]. Nawet gdyby z ostrożnością podejść do szacunków mówią- cych o zawartości 1,5 × 108 bakteriofagów w 1 g gleby [3], to w tak dużej populacji różnorodnych nanocząstek jest duże prawdopodobieństwo wykrycia, wyizolowania i  scharakteryzowania bakteriofagów o oczekiwanych właściwościach.

Bakteriofagi cechuje zdolność do szybkiej replikacji i samoistnego zanikania. Zastosowany fag będzie się namnażać tak długo, jak długo w jego otoczeniu będą występować komórki bakterii, które może atakować [55]. Bakteriofagi dzieli się na ściśle lityczne i lizogeniczne (łagodne), choć wyróżnia się czasem także pseudołagodne, pozostające w cytoplazmie w postaci plazmidów [21]. Fagi zawierają w białkowym płaszczu DNA lub RNA, lecz większość prac dotyczących fagów litycznych opisuje fagi ogonkowe z dsDNA, które są najczęściej izolowane (około 96%) [21,46]. Fagi ściśle lityczne mają tylko jeden cykl lityczny, polegający na zarażeniu komórki, przeprogramowaniu jej i uwolnieniu potomnych fagów przez lizę po ustalonym, krótkim czasie [36]. Końce ogonków mogą się przyłączać do określonych receptorów na powierzchni ściany komórkowej bakterii w sposób bardzo swoisty [36,55]. Przyłączenie jest pierwszym etapem infekcji faga [21,58]. Następnie fagowe DNA przechodzi przez ogonek do cytoplazmy [36]. Kolejnymi etapami są transkrypcja genów fagowych oraz replikacja genomu [21]. Materiał genetyczny faga tworzy szablon nowego DNA wirusa i dostarcza informacji niezbędnej do przekształcenia komórki w „fabrykę” nowych wirionów [36]. Następnie syntezie ulegają białka, które składają się na główki (kapsydy) i ogonki (fagi ogonkowe). Do kapsydów pakowany jest materiał genetyczny i tak powstają nowe wiriony [21]. Ostatnim krokiem w cyklu litycznym jest liza komórki. Pośredniczą w niej dwa składniki: holina i endolizyna (lizyna). Holina tworzy pory w błonie cytoplazmatycznej, a lizyna, zyskuje dostęp do peptydoglikanu i hydrolizuje go [21,52]. W wyniku uwolnienia do otoczenia powiela się liczba bakteriofagów, zdolnych do infekowania bakterii [41]. Alternatywnie w ciągu kilku minut po wstrzyknięciu DNA, bakteriofag może wbudować swoje DNA do chromosomu bakterii (w zależno- ści od jej kondycji metabolicznej) [21]. Wbudowany fag nazywany jest profagiem i ulega replikacji wraz z genomem bakteryjnym [21,46]. Fagowe białko represorowe utrzymuje większość jego genów w stanie bezczynno- ści [36]. Taki mechanizm wykazują fagi łagodne, które w odpowiednich warunkach mogą jednak aktywować uśpiony potencjał lityczny [41]. Do tego procesu może dojść spontanicznie lub w wyniku działania np. promieniowania UV, mitomycyny czy zmiany środowiska [36]. Komórka bakteryjna, która zawiera przynajmniej jednego profaga jest w zasadzie odporna na infekcje przez inne fagi tej samej grupy [21].

Cechy bakteriofagów nie wykluczają możliwości powstawania u bakterii nowych cech patogenności indukowanych ich obecnością [39]. Bakteriofagi (profagi) niekiedy mogą działać, jako wektory niepożądanych cech – genów antybiotykooporności i wirulencji, które mogą być przenoszone horyzontalnie z jednej bakterii do drugiej w wyniku transdukcji [22,46]. Fagi łagodne pośredniczą w konwersji lizogenicznej [22]. W wielu przypadkach lizogenizacja przyczynia się do zwiększania patogenno- ści szczepów bakteryjnych, np. u Staphylococcus aureus, E. coli, Salmonella enterica i Streptococcus pyogenes [21,39]. Nie wiadomo jaki procent bakteriofagów litycznych jest zdolnych do indukowania lizogenezy [27]. Wiadomo natomiast, że wzrost patogenności po lizogenizacji nadaje nowych właściwości, które zapewniają bakteriom większe szanse przetrwania w nowo zasiedlonej niszy ekologicznej [39]. W cyklu lizogenicznym właściwości te zapewnia ekspresja dodatkowych genów pochodzących z genomów fagowych – moronów (more-extra DNA) [21,39]. Niedawne postępy w badaniach sprawiają, że możliwe staje się zrozumienie przepływu genów u fagów oraz ich gospodarzy. Potencjalnie szkodliwych bakteriofagów można unikać lub przeprojektować je na takie, które nie będą przenosić niepożądanych cech lub jakichkolwiek systemów rozpowszechniania genów [22].

Bakteriofagi w zwalczaniu zanieczyszczeń żywności

Produkcji wyrobów spożywczych zagrażają dwa główne źródła zanieczyszczenia: pierwsze dotyczy surowców, które mogą zawierać bakterie chorobotwórcze dla ludzi, a drugie samych ludzi, którzy mogą skazić produkty w czasie ich przetwarzania [42]. Na powierzchniach urządzeń bezpośrednio kontaktujących się z żywno- ścią, zwłaszcza tych, których utrzymanie w czystości jest kłopotliwe, mogą przetrwać trudno usuwalne biofilmy tworzone przez chorobotwórcze bakterie [55]. Do zanieczyszczenia żywności może dochodzić podczas uboju, udoju, fermentacji, przetwarzania, przechowywania, czy też pakowania [22]. Bakterie, takie jak Campylobacter, Salmonella, E. coli i Listeria monocytogenes to główne przyczyny występowania infekcji pokarmowych u ludzi na świecie, są zatem odpowiedzialne za duże wydatki finansowe przemysłu spożywczego i służby zdrowia [52]. Pomimo rosnącej świadomości i poprawy warunków higienicznych w większości państw zachodnich, liczba ognisk zaka- żeń pokarmowych nie ulega zmianie lub nawet wzrasta [52]. Stało się oczywiste, że antybiotykooporne szczepy patogennych bakterii pochodzące z sektora rolniczego i hodowlanego mogą być z łatwością przenoszone na człowieka przez łańcuch pokarmowy. W związku z tym zarówno rośliny uprawne, jak i zwierzęta konsumpcyjne stanowią potencjalny rezerwuar niebezpiecznych bakterii przyczyniających się corocznie do zakażeń ludzi na świecie [25]. Zmniejszenie liczby zatruć pokarmowych przez wykorzystanie szybkich i powszechnie dostępnych metod detekcji oraz kontroli liczebności patogenów jest przedmiotem wielu badań [8]. Idealne techniki dekontaminacji nie powinny w żaden sposób zmieniać właściwo- ści organoleptycznych i odżywczych żywności. Powinny być bezpieczne, niedrogie i powszechnie akceptowalne w społeczeństwie. Spełnienie tych wszystkich kryteriów jest trudne i dlatego wciąż poszukuje się nowych i funkcjonalnych rozwiązań [37]. Zrealizowanie celu być może stanie się realne dzięki zastosowaniu bakteriofagów [25]. Wirusy te cechuje duża swoistość, co ogranicza straty naturalnej pożytecznej mikroflory oraz stosunkowo niewielka toksyczność w porównaniu do chemioterapeutyków, co wynika z ich nieskomplikowanej budowy. W związku z tym nie jest konieczne usuwanie preparatów z miejsc, w których działają [55]. W celu osiągnięcia wła- ściwego działania fagów, dobrym rozwiązaniem jest izolacja z tego samego siedliska czy niszy co gospodarze, gdyż wtedy będą lepiej przystosowane do replikacji i przeżywania w wymaganych warunkach [22]. Bakteriofagi izolowano z różnorodnych produktów spożywczych, m.in. z mięsa (wołowina, kurczak), produktów fermentowanych (sery, jogurty), owoców morza (ostrygi, małże), czy nawet gotowych przetworzonych produktów, takich jak placki, ciasta, a nawet z pieczonego drobiu [55]. Fagi są tanie, łatwe do pozyskania i wytrzymałe na warunki występujące podczas przetwórstwa żywności [52,55]. Charakteryzuje je mała wrażliwość na zmiany temperatury i pH oraz rozpuszczalniki organiczne czy proteazy [52].

Bakteriofagi stosowane w ochronie żywności powinny spełniać wiele wymogów, a głównym z nich jest ich ścisła lityczność. Preparaty fagowe powinny być oczyszczone, pozbawione elementów pochodzących z bakterii, apirogenne oraz długo zachowywać aktywność biologiczną [29]. Nie można wykluczyć, że zanieczyszczenia obecne w takich preparatach mogą wpływać na wyniki badań. Biotechnologiczne metody oczyszczania biologicznych makrocząstek nie mogą być bezkrytycznie adaptowane do oczyszczania bakteriofagów [60]. W bakteriofagach namnażanych w bakteriach Gram-ujemnych (m.in. Campylobacter) istotnym zanieczyszczeniem jest obecność pirogenów (głównie lipopolisacharydu) [38]. Zróżnicowanie elementów budulcowych – wiele rodzajów białek i kwas nukleinowy, nadaje nanocząstkom fagowym wiele zmiennych właściwości fizykochemicznych w różnych obszarach bakteriofaga [15,19]. Z tego powodu stosowanie popularnych chromatografii jonowymiennych znajduje ograniczone zastosowanie przekładające się na niskie wydajności izolacji bakteriofagów [9]. Obecnie są dostępne także inne metody usuwania pirogenów. Bakteriofagi mogą być oczyszczane przez precypitację glikolem polietylenowym w obecno- ści niejonowego detergentu [10]. Innym rozwiązaniem jest wykorzystanie powinowactwa białek fagowych do endotoksyn, czego przykładem jest złoże EndoTrap [43]. Zastosowano również układy heterofazowe wykorzystujące logarytmiczne różnice współczynników podziału endotoksyn między fazą wodną a fazą niemieszających się z wodą rozpuszczalników organicznych [61].

Zastosowanie bakteriofagów przed rozpoczęciem procesu produkcyjnego może znacznie zmniejszyć prawdopodobieństwo skażenia obecnego w surowcu wyjściowym, a w czasie dalszej obróbki zapobiec wtórnemu zanieczyszczeniu produktu końcowego [42]. Zasadne jest stosowanie terapii fagowej w celu zmniejszenia liczby patogenów kolonizujących organizmy zwierząt konsumpcyjnych. Taką strategię powinno się stosować w produkcji podstawowej tuż przed ubojem lub w okresie wzrostu zwierząt, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo zakażenia krzyżowego odchodami podczas przetwarzania żywności [49]. Niektóre bakteriofagi mogą być stosowane jako środki konserwacji żywności, ze względu na możliwość lizy komórek bakterii nawet w niskich temperaturach (1°C). Ogranicza to rozwój chorobotwórczych i gnilnych bakterii rozwijających się w żywności przechowywanej w lodówce, natomiast po przeniesieniu żywności do temperatury pokojowej fagi mogą limitować namnażanie bakterii [55]. Bardzo ważnym w wykorzystaniu fagów do zwalczania biologicznego patogenów było zatwierdzenie przez FDA (Agencję Żywności i Leków) i Unię Europejską mieszanki sześciu fagów oznaczonej jako LMP-102 do stosowania w „gotowym do spożycia” mięsie w celu ograniczenia zanieczyszczenia L. monocytogenes [36,46]. Następnym preparatem zatwierdzonym przez FDA jest produkt o nazwie Listex P100 [11]. W USA zastosowanie fagów ma charakter komercyjny. Firma Omnilytics dystrybuuje koktajle, np. produkt AgriPhage, który został zatwierdzony przez EPA (Agencję Ochrony Środowiska) i OMRI (Instytut Badań Materiałów Organicznych) do zwalczania bakteryjnych infekcji spowodowanych przez Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria i plamistości pomidorów wywoływanej przez Pseudomonas syringae pv. Tomatoe, jako naturalny, bezpieczny i skuteczny [46]. Ważnym wykorzystaniem fagów wydaje się ich immobilizacja na modyfikowanych matrycach celulozowych stosowanych jako materiał opakowaniowy mający na celu redukcję mikroorganizmów z powierzchni żywności [2].

Stosowanie preparatów bakteriofagowych w ochronie żywności według niektórych badaczy niesie jednak pewne zagrożenia (m.in. sekwencje moronowe) [27].

W przypadku próby zwalczania biofilmów należy liczyć się z utrudnieniem w postaci różnorodności gatunkowej bakterii wchodzących w ich skład, a tym samym z koniecznością doboru kompetentnych bakteriofagów [55]. Ogólne przekonanie dotyczące bezpieczeństwa stosowania wirusów w celu ochrony produktów spożywczych, może się stać problemem w ich komercyjnym zastosowaniu. Wprawdzie bakteriofagi są wszechobecne w środowisku i nie zakażają kręgowców, nieporozumienia podobne do tych z wykorzystania napromieniowania żywności, mogą stanowić istotny problem w powszechnym stosowaniu do konserwacji produktów spożywczych [27].

Fagi przeciwko Campylobacter

Bakteriofagi swoiste wobec gatunków znanych obecnie, jako C. coli i C. fetus wyizolowano już w latach 60 XX w. od bydła i świń [14]. W przypadku naturalnych fagów przeciw Campylobacter u drobiu i w produktach drobiowych ich izolacja możliwa jest z 3-51% przebadanych próbek [20]. Większość fagów wyizolowano przez naniesienie na murawę szczepu Campylobacter na podłożu soft agar, przefiltrowanej zawiesiny. Po inkubacji możliwa jest obserwacja łysinek. Miano bakteriofagów określa się w jednostkach tworzących łysinki – PFU (plaque forming unit) na jednostkę objętości, masy, powierzchni itd. [14].

Fagi mogą kontrolować liczebność Campylobacter, nawet przy braku wzrostu bakteryjnego gospodarza, co może być tłumaczone zdolnością adsorpcji na powierzchni komórki i replikacji dopiero w chwili wzrostu aktywno- ści metabolicznej bakterii [12]. Jednak w razie nadmiaru bakteriofagów wobec bakteryjnego gospodarza, duża liczba cząstek fagowych może doprowadzić do naruszenia ściany komórkowej, pęcznienia, a następnie dezintegracji komórki. Zjawisko to zwane jest „lizą z zewnątrz” [14]. Zastosowanie fagów w zwalczaniu zakażeń C. jejuni może być skuteczne tylko wtedy, jeśli fagi będą zdolne do infekowania różnorodnych populacji szczepów C. jejuni w jelitach drobiu oraz zanieczyszczonym mię- sie [58]. Terapeutyczne fagi, które znajdą zastosowanie u drobiu muszą mieć cechy umożliwiające im przeżycie, takie jak stabilność w wyższych temperaturach (42°C – temperatura fizjologiczna kur), czy przy niskich warto- ściach pH (w zakresie 2-4) [29]. Wrażliwość na niskie pH wynika z białkowego charakteru kapsydu, dlatego podawanie bakteriofagów kurom jest możliwe dopiero dzięki zmieszaniu z antacydem (np. CaCO3 ) [14]. Bakteriofagi mogą być podawane bezpośrednio albo jako dodatek do wody pitnej lub paszy w przypadku kontroli liczebności Campylobacter u drobiu [55].

Pojawienie się mutantów niewrażliwych na bakteriofagi długo było głównym powodem ograniczającym zastosowanie terapii fagowej [6]. Istnieją obawy, że terapia fagowa przeciw Campylobacter również przestanie być skuteczna [18]. W odróżnieniu od substancji chemioterapeutycznych (np. antybiotyki), fagi podlegają ciągłej ewolucji, aby zwalczać mechanizmy obronne ich gospodarzy [6]. Mimo że bakterie dość szybko nabywają oporności na właściwe im bakteriofagi, to cały proces osłabia ich adaptację środowiskową, co oznacza, że oporne na fagi bakterie mają zmniejszoną zdolność do kolonizowania przewodu pokarmowego [55]. Rozwój oporności na faga u C. jejuni jest związany ze zmianami w polisacharydach otoczkowych albo utratą ruchliwości, wskazując, że rzęski i polisacharydy otoczki mogą być głównymi receptorami fagów infekujących te bakterie [58]. Zjawisko można ograniczyć przez wykorzystanie preparatów zawierających koktajle z bakteriofagami, które działają na różne receptory na powierzchni bakterii [14]. Skuteczność takich mieszanin w opóźnianiu powstawania opornych szczepów wykazano w badaniach in vitro [42]. Niemniej jednak, jak do tej pory nie ma możliwości cał- kowitego zapobiegania powstawaniu opornych bakterii, w związku z tym wrażliwość na bakteriofagi powinna być ściśle monitorowana podczas każdorazowego stosowania preparatów fagowych [42].

Większość (95%) zbadanych fagów należy do jednego z trzech morfotypów: Siphoviridae (z długimi i czę- sto elastycznymi ogonkami), Podoviridae (o przysadzistych ogonkach) oraz Myoviridae (przytwierdzone do podstawki ogonki zbudowane z wewnętrznej rurki i zewnętrznego kurczliwego płaszcza) [36]. Fagi przeciw Campylobacter należą głównie do rodziny Myoviridae; charakteryzują się ikosaedralnymi główkami (penta- i heksagonalne kapsydy) oraz kurczliwymi ogonkami. Mają szyjki, lecz nie zawierają kołnierzyków i wyraźnej podstawki, a włókienka są cienkie i krótkie [18,30]. W Wielkiej Brytanii przebadano 16 fagów przeciw Campylobacter należących do rodziny Myoviridae i podzielono na trzy grupy, co stanowi podstawę ich obecnej klasyfikacji (tab.1) [51]. Największą różnicą między fagami grupy II i III jest długość ogonka, choć występują także mniej widoczne różnice (ryc.2) [30]. Doniesienia z Rosji opisują także bakteriofagi należące do Siphoviridae i Podoviridae, ale charakterystyka tych fagów jest mało znana [14].

Mimo że kilka przedsiębiorstw zadeklarowało opracowanie produktów opartych o fagi przeciw Campylobacter (wliczając w to Intralytix, GangaGen i Micreos), to do 2013 r. produkty takie nie pojawiły się jeszcze na rynku [29] i wciąż nie znajdują się w ofercie handlowej. Niemniej jednak w ostatnich latach opublikowano badania dotyczące zastosowania bakteriofagów przeciw bakteriom z rodzaju Campylobacter (zwłaszcza C. jejuni) [4,7,1 2,18,20,24,34,37,47,57,63].

Szacuje się, że redukcja Campylobacter w tuszach drobiowych o dwie jednostki logarytmiczne jest wystarczająca do 30-krotnego zmniejszenia częstości występowania kampylobakteriozy u ludzi [18]. Atterbury i wsp. stosowali fagi w celu zmniejszenia liczebności C. jejuni na skórze kurczaka w temperaturze 4 i -20°C. W badaniach tych najwyższe miano faga (107 PFU/ml) dało najbardziej obiecujące wyniki. Uzyskano redukcję bakterii o 1 jednostkę logarytmiczną w próbkach przechowywanych w temp. 4°C i o 2,5 jednostki logarytmicznej w próbkach przechowywanych przy -20°C [4]. W innych badaniach zaszczepienie skóry kurczaka C. jejuni o mianie 104 CFU/ ml i późniejsze podanie faga (106 PFU/cm2 powierzchni) spowodowało 95% redukcję liczby C. jejuni [24]. W badaniach prowadzonych przez Wagenaara i wsp., fagi podawano przez 6 dni, zaczynając od 5 dnia po kolonizacji bakteryjnej. Wstępnie wyniki wskazywały na redukcję liczby Campylobacter w jelicie ślepym o 3 jednostki logarytmiczne, która po 5 dniach ustabilizowała się do redukcji o 1 jednostkę logarytmiczną [63]. Badania prowadzone przez Loc Carrillo i wsp. opisywały redukcję liczebności C. jejuni w zawartości kątnicy w grupie brojlerów leczonych fagami przez 5 dni o 5 jednostek logarytmicznych. Wyizolowano oporne bakterie, które po przeprowadzeniu analizy powróciły do wrażliwego fenotypu [37]. El-Shibiny i wsp. zbadali działanie faga nale- żącego do grupy II. Po 24 h od podania dawki 107 PFU bakteriofagów w 1 ml zaobserwowano redukcję liczby C. jejuni w jelicie ślepym oraz dolnych i górnych jelitach prawie o 2 jednostki logarytmiczne. W celu osiągnię- cia podobnej redukcji C. coli używając tego samego faga niezbędne było zastosowanie dawki 109 PFU/ml. Częstość występowania oporności na fagi u C. jejuni po zastosowaniu dawki 109 PFU/ml oszacowano na 2% [18]. Koktajl fagowy zastosowany przez Carvalho i wsp. zmniejszył miano C. coli i C. jejuni również prawie o 2 jednostki logarytmiczne przy podawaniu przez zgłębnik i w paszy. Redukcja nastąpiła szybciej po podaniu w paszy, co wskazuje, że taki sposób podania jest skuteczniejszy. Niestety oporne szczepy, których częstość występowania wyniosła 13%, nie wykazywały zmniejszonej zdolności do kolonizowania kurzych jelit ani nie powróciły do wrażliwego fenotypu [12]. Badania dotyczące wykorzystania bakteriofagów były prowadzone nie tylko na drobiu. Bigwood i wsp. badali wpływ bakteriofagów na zanieczyszczenie gotowanej i surowej wołowiny m.in. przez C. jejuni. Mięso inkubowano w temp. 5 i 24˚C symulując w ten sposób warunki przechowywania w lodówce i temperaturze pokojowej. Po 24 h inkubacji stwierdzono redukcję bakterii o ponad 2 jednostki logarytmiczne na 1 cm2 powierzchni zarówno w mięsie gotowanym jak i surowym. Użyty przeciw C. jejuni fag miał jednak za mały zakres gospodarzy, by mógł samodzielnie znaleźć potencjalne zastosowanie do kontroli liczebności patogenów [7]. Przeprowadzono również badania z zastosowaniem bakteriofagów, które miały na celu sprawdzenie ich skuteczności w biofilmach. Stwierdzono, że zoptymalizowanie warunków umożliwia opłacalną redukcję bakterii, umożliwiając zastosowanie bakteriofagów w procesie biosanityzacji powierzchni w przemyśle spo- żywczym. Badane fagi zmniejszyły liczbę Campylobacter w warunkach mikroaerofilnych o 1-3 jednostki logarytmiczne. Jednak wśród bakterii, które przeżyły 84% wykazywało oporność na fagi zastosowane w tym badaniu [57]. Niemniej jednak nie wszystkie próby zastosowania bakteriofagów w walce z Campylobacter okazują się udane. Orquera i wsp. używali dwóch fagów przeciw Campylobacter należących odpowiednio do grupy II i III. W temperaturze 37˚C uzyskano redukcję Campylobacter o 1-2 jednostek logarytmicznych, lecz w 4˚C fagi nie zredukowały liczby bakterii [47].

Badania przeprowadzone na grupie 88 kur, którym podawano pojedynczego faga lub koktajl czterech fagów dowiodły, że zastosowanie koktajlu było tylko nieznacznie lepsze od pojedynczego faga, lecz opóźniło pojawienie się oporności. Obecność fagów w poszczególnych stadach średnio zmniejszyła liczbę Campylobacter o 1,8 jednostki logarytmicznej [20]. Pierwsze szeroko zakrojone badania w warunkach in vivo przeprowadzili Kittler i wsp. na trzech komercyjnych fermach kurzych. Koktajl fagowy podawano w wodzie pitnej. Po jednym dniu od podania fagów, liczebność Campylobacter w próbkach odchodów w jednej z grup spadła poniżej granicy wykrywalności. Po uboju uzyskano redukcję bakterii w zawartości jelita ślepego o 3,2 jednostki logarytmiczne [34]. Badania prowadzone w Wielkiej Brytanii przez grupę Iana Franka Connertona nad dezynfekcją artykułów spożywczych z wykorzystaniem bakteriofagów (CP8 i CP34) skierowanych przeciwko Campylobacter zaowocowały patentem PL/EP 1662888. Uzyskano spadek liczebności bakterii o 2-5 jednostek logarytmicznych w zależności od zastosowanego bakteriofaga, jego miana oraz analizowanego odcinka przewodu pokarmowego kur [13].

Podsumowanie

Wzrost liczby zachorowań w wyniku zakażeń bakteriami z rodzaju Campylobacter oraz ograniczenia nakładane przez Unię Europejską dotyczące masowego stosowania antybiotyków spowodowały konieczność znalezienia alternatywnej i bezpiecznej metody ograniczenia liczebności patogenów w żywności. Bakteriofagi spełniały wszystkie kryteria, jednak nastanie ery antybiotyków i wygoda ich stosowania na wiele lat wstrzymała badania nad terapią fagową. Obecnie, gdy większość antybiotyków powoduje masowe pojawianie się szczepów opornych powraca się do fagów. Fagi, jako naturalne i wszechobecne w środowisku „drapieżniki” bakterii, które charakteryzują się unikalnymi zaletami w porównaniu do antybiotyków i replikują się tylko w wybranej grupie bakterii, nie naruszają naturalnej równowagi flory jelitowej, a ich liczba ulega samoograniczeniu w zależności od liczebności bakterii. Koncepcja zwalczania patogenów w żywności za pomocą fagów może być wprowadzona na wszystkich etapach produkcji w tzw. klasycznym podejściu „od pola do stołu”. Bakteriofagi są korzystne, gdyż zapobiegają namnażaniu lub zmniejszają liczebność bakterii patogennych kolonizujących organizmy zwierząt hodowlanych. Jednak stosowanie bakteriofagów na terenie Unii Europejskiej wiąże się z koniecznością rozróżnienia schematu ich wykorzystania między niedozwolonymi dodatkami do żywności a dozwolonymi preparatami pomocnymi w procesie jej przetwarzania. Na szczególną uwagę zasługują fagi przeciw Campylobacter, ze względu na ich duże powinowactwo do przewodu pokarmowego drobiu. Bakteriofagi są wykorzystywane do odkażania tusz i innych surowych produktów, dezynfekcji powierzchni, przedłużania okresu trwałości łatwo psujących się produktów spożywczych oraz jako naturalne konserwanty. Dostępne są już komercyjne preparaty fagowe stosowane w rolnictwie i przetwórstwie żywności. Jednak mimo obiecujących wyników badań, jeszcze nie wprowadzono preparatów do zwalczania Campylobacter opartych o fagi.

Podziękowania

Dziękujemy kierownikowi Zakładu Mikrobiologii Klinicznej Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego im. NMP w Częstochowie, Pani Elżbiecie Maćkowiak za udzielone wsparcie merytoryczne.

Przypisy

• 1. Abedon S.T., Thomas-Abedon C., Thomas A., Mazure H.: Bacteriophageprehistory: is or is not Hankin, 1896, a phage reference?Bacteriophage, 2011; 1: 174-178
  Google Scholar
• 2. Anany H., Chen W., Pelton r., Griffiths M.W.: Biocontrol of Listeriamonocytogenes and Escherichia coli O157:H7 in meat by using phagesimmobilized on modified cellulose nembranes. Appl. Environ. Microbiol.,2011; 77: 6379-6387
  Google Scholar
• 3. Ashelford K.E., Day M.J., Fry J.C.: Elevated abundance of bacteriophageinfecting bacteria in soil. Appl. Environ. Microbiol., 2003;69: 285-289
  Google Scholar
• 4. Atterbury r.J., Connerton P.L., Dodd C.E., Rees C.E., Connerton I.F.:Application of host-specific bacteriophages to the surface of chickenskin leads to a reduction in recovery of Campylobacter jejuni. Appl.Environ. Microbiol., 2003; 69: 6302-6306
  Google Scholar
• 5. Atterbury r.J., Connerton P.L., Dodd C.E., Rees C.E., Connerton I.F.:Isolation and characterization of Campylobacter bacteriophages fromretail poultry. J. Appl. Microbiol., 2003; 69: 4511-4518
  Google Scholar
• 6. Atterbury r.J., Van Bergen M.A., Ortiz F., Lovell M.A., Harris J.A.,De Boer A., Wagenaar J.A., Allen V.M., Barrow P.A.: Bacteriophagetherapy to reduce Salmonella colonization of broiler chickens. Appl.Environ. Microbiol., 2007; 73: 4543-4549
  Google Scholar
• 7. Bigwood T., Hudson J.A., Billington C., Carey-Smith G.V., HeinemannJ.A.: Phage inactivation of foodborne pathogens on cookedand raw meat. Food Microbiol., 2008; 25: 400-406
  Google Scholar
• 8. Billington C., Hudson J.A., D’Sa E.: Prevention of bacterial foodbornedisease using nanobiotechnology. Nanotechnol. Sci. Appl.,2014; 7: 73-83
  Google Scholar
• 9. Boratyński J., Syper D., Weber-Dąbrowska B., Łusiak-SzelachowskaM., Poźniak G., Górski A.: Preparation of endotoxin-free bacteriophages.Cell. Mol. Biol. Lett., 2004; 9: 253-259
  Google Scholar
• 10. Branston S.D., Wright J., Keshavarz-Moore E.: A non-chromatographicmethod for the removal of endotoxins from bacteriophages.Biotechnol. Bioeng., 2015; 112: 1714-1719
  Google Scholar
• 11. Carlton r.M., Noordman W.H., Biswas B., de Meester E.D., LoessnerM.J.: Bacteriophage P100 for control of Listeria monocytogenesin foods: genome sequence, bioinformatic analyses, oral toxicitystudy, and application. Regul. Toxicol. Pharmacol., 2005; 43: 301-312
  Google Scholar
• 12. Carvalho C.M., Gannon B.W., Halfhide D.E., Santos S.B., HayesC.M., Roe J.M., Azeredo J.: The in vivo efficacy of two administrationroutes of a phage cocktail to reduce numbers of Campylobacter coliand Campylobacter jejuni in chickens. BMC Microbiol., 2010; 10: 232
  Google Scholar
• 13. Connerton I.F.: Dezynfekcja artykułów spożywczych. PL/EP 1662888. Europejski Biuletyn Patentowy 2012/35
  Google Scholar
• 14. Connerton P.L., Timms A.R., Connerton I.F.: Campylobacter bacteriophagesand bacteriophage therapy. J. Appl. Microbiol., 2011;111: 255-265
  Google Scholar
• 15. Dąbrowska K., Miernikiewicz P., Piotrowicz A., Hodyra K., OwczarekB., Lecion D., Kaźmierczak Z., Letarov A., Górski A.: Immunogenicitystudies of proteins forming the T4 phage head surface. J.Virol., 2014; 88: 12551-12557
  Google Scholar
• 16. EFSA, ECDC: The European Union summary report on trends andsources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2012 EFSA J., 2014; 12: 3547
  Google Scholar
• 17. EFSA, ECDC: The European Union summary report on trends andsources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2013 EFSA J., 2015; 13: 3991
  Google Scholar
• 18. El-Shibiny A., Scott A., Timms A., Metawea Y., Connerton P., ConnertonI.: Application of a group II Campylobacter bacteriophage toreduce strains of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli colonizingbroiler chickens. J. Food Prot., 2009; 72: 733-740
  Google Scholar
• 19. Figura G., Budynek P., Dąbrowska K.: Bakteriofag T4: molekularneaspekty infekcji komórki bakteryjnej, rola białek kapsydowych.Postępy Hig. Med. Dośw., 2010; 64: 251-261
  Google Scholar
• 20. Fischer S., Kittler S., Klein G., Glünder G.: Impact of a single phageand a phage cocktail application in broilers on reduction of Campylobacterjejuni and development of resistance. PLoS One, 2013; 8: e78543
  Google Scholar
• 21. Fortier L.C., Sekulovic O.: Importance of prophages to evolutionand virulence of bacterial pathogens. Virulence, 2013; 4: 354-365
  Google Scholar
• 22. Garcia P., Martinez B., Obeso J.M., Rodriguez A.: Bacteriophagesand their application in food safety. Lett. Appl. Microbiol., 2008;47: 479-485
  Google Scholar
• 23. Garénaux A., Jugiau F., Rama F., de Jonge r., Denis M., FederighiM., Ritz M.: Survival of Campylobacter jejuni strains from differentorigins under oxidative stress conditions: effect of temperature.Curr. Microbiol., 2008; 56: 293-297
  Google Scholar
• 24. Goode D., Allen V.M., Barrow, P.A.: Reduction of experimentalSalmonella and Campylobacter contamination of chicken skin by applicationof lytic bacteriophages. Appl. Environ. Microbiol., 2003;69: 5032-5036
  Google Scholar
• 25. Goodridge L.D.: Bacteriophage biocontrol of plant pathogens:fact or fiction? Trends Biotechnol., 2004; 22: 384-385
  Google Scholar
• 26. Hagens S., Loessner M.J.: Phages of Listeria offer novel tools fordiagnostics and biocontrol. Front. Microbiol., 2014; 5: 159
  Google Scholar
• 27. Higgins J.P., Higgins S.E., Guenther K.L., Huff W., Donoghue A.M.,Donoghue D.J., Hargis B.M.: Use of a specific bacteriophage treatmentto reduce Salmonella in poultry products. Poult. Sci., 2005;84: 1141-1145
  Google Scholar
• 28. Hodyra K., Dąbrowska K.: Molecular and chemical engineeringof bacteriophages for potential medical applications. Arch. Immunol.Ther. Exp., 2015; 63: 117-127
  Google Scholar
• 29. Janež N., Loc-Carrillo C.: Use of phages to control Campylobacterspp. J. Microbiol. Methods, 2013; 95: 68-75
  Google Scholar
• 30. Javed M.A., Ackermann H.W., Azeredo J., Carvalho C.M., ConnertonI., Evoy S., Hammerl J.A., Hertwig S., Lavigne r., Singh A., SzymanskiC.M., Timms A., Kropinski A.M.: A suggested classification for twogroups of Campylobacter myoviruses. Arch. Virol., 2014; 159: 181-190
  Google Scholar
• 31. Jordan K., Dalmasso M., Zentek J., Mader A., Bruggeman G.,Wallace J., De Medici D., Fiore A., Prukner-Radovcic E., Lukac M.,Axelsson L., Holck A., Ingmer H., Malakauskas M.: Microbes versusmicrobes: control of pathogens in the food chain. J. Sci. Food Agric.,2014; 94: 3079-3089
  Google Scholar
• 32. Kalkan S., Ünal E., Erginkaya Z.: Bio-control of some food-bornepathogenic bacteria by bacteriophage. J. Food Eng., 2001; 1: 237-244
  Google Scholar
• 33. Keener K.M., Bashor M.P., Curtis P.A., Sheldon B.W., KathariouS.: Comprehensive review of Campylobacter and poultry processing.Compr. Rev. Food Sci. Food Saf., 2004; 3: 105-116
  Google Scholar
• 34. Kittler S., Fischer S., Abdulmawjood A., Glünder G., Klein G.:Effect of bacteriophage application on Campylobacter jejuni loadsin commercial broiler flocks. Appl. Environ. Microbiol., 2013; 79:7525-7533
  Google Scholar
• 35. Koolman L., Whyte P., Meade J.. Lyng J., Bolton D.: Use of chemicaltreatments applied alone and in combination to reduce Campylobacteron raw poultry. Food Contr., 2014; 46: 299-303
  Google Scholar
• 36. Kutter E.M., Gvasalia G., Alavidze Z., Brewster E.: Phage therapy.W: Biotherapy – History, principles and practice: a practical guide tothe diagnosis and treatment of disease using living organisms, red.:M. Grassberger, Springer, 2013, 191-231
  Google Scholar
• 37. Loc Carrillo C., Atterbury r.J., el-Shibiny A., Connerton P.L., DillonE., Scott A., Connerton I.F.: Bacteriophage therapy to reduceCampylobacter jejuni colonization of broiler chickens. Appl. Environ.Microbiol., 2005; 71: 6554-6563
  Google Scholar
• 38. Lodowska J., Wolny D., Węglarz L., Dzierżewicz Z.: Heterogennośćstrukturalna lipidu A bakterii Gram-ujemnych. Postępy Hig.Med. Dośw., 2007; 61: 106-121
  Google Scholar
• 39. Małek W., Wdowiak-Wróbel S., Kalita M., Święcicka I., Studziń-ska B.: Wpływ produktów kodowanych przez sekwencje moronowefagów na wirulencję bakterii powszechnie izolowanych z materiałówklinicznych. Postępy Mikrobiol., 2005; 44: 329-339
  Google Scholar
• 40. Mandal S.M., Roy A., Ghosh A.K., Hazra T.K., Basak A., Franco O.L.:Challenges and future prospects of antibiotic therapy: from peptidesto phages utilization. Front. Pharmacol., 2014; 5: 1-12
  Google Scholar
• 41. Martinez-Castillo A., Muniesa M.: Implications of free Shigatoxin-converting bacteriophages occurring outsider bacteria forthe evolution and the detection of Shiga toxin-producing Escherichiacoli. Front. Cell. Infect. Microbiol., 2014; 4: 46
  Google Scholar
• 42. Maura D., Debarbieux L.: Bacteriophages as twenty-first centuryantibacterial tools for food and medicine. Appl. Microbiol. Biotechnol.,2011; 90: 851-859
  Google Scholar
• 43. Miernikiewicz P., Owczarek B., Piotrowicz A., Boczkowska B.,Rzewucka K., Figura G., Letarov A., Kulikov E., Kopciuch A., ŚwitałaJeleńK., Oślizło A., Hodyra K., Gubernator J., Dąbrowska K.: Recombinantexpression and purification of T4 phage Hoc, Soc, gp23, gp24proteins in native conformations with stability studies. PLoS One,2012; 7: e38902
  Google Scholar
• 44. Murphy C., Carroll C., Jordan K.N.: Environmental survival mechanismsof the foodborne pathogen Campylobacter jejuni. J. Appl. Microbiol.,2006; 100: 623-632
  Google Scholar
• 45. Nur Ilida M., Faridah M.S.: Prevalence of Campylobacter jejuniin chicken meat and chicken-based products. J. Trop. Agric. FoodSci., 2012; 40: 63-69
  Google Scholar
• 46. O’Flaherty S., Ross r.P., Coffey A.: Bacteriophage and their lysinsfor elimination of infectious bacteria. FEMS Microbiol. Rev.,2009; 33: 801-819
  Google Scholar
• 47. Orquera S., Gölz G., Hertwig S., Hammerl J., Sparborth D., JoldicA., Alter T.: Control of Campylobacter spp. and Yersinia enterocoliticaby virulent bacteriophages. J. Mol. Genet. Med., 2012; 6: 273-278
  Google Scholar
• 48. Rokosz N., Rastawicki W., Wołkowicz T.: Mikrobiologiczna diagnostykazakażeń wywoływanych przez pałeczki Campylobacter jejunii Campylobacter coli u ludzi. Postępy Hig. Med. Dośw., 2014; 68: 48-56
  Google Scholar
• 49. Rosenquist H., Nielsen N.L., Sommer H.M., Nørrung B., ChristensenB.B.: Quantitative risk assessment of human campylobacteriosisassociated with thermophilic Campylobacter species in chickens.Int. J. Food Microbiol., 2003; 83: 87-103
  Google Scholar
• 50. Roszniowski B., Łątka A., Drulis-Kawa Z.: Zastosowanie bioinformatykiw fagoterapii – jak uczynić terapię fagową bezpieczną?Laboratorium, 2015; 9-10: 50-55
  Google Scholar
• 51. Sails A.D., Wareing D.R., Bolton F.J., Fox A.J., Curry A.: Characterisationof 16 Campylobacter jejuni and C. coli typing bacteriophages. J.Med. Microbiol., 1998; 47: 123-128
  Google Scholar
• 52. Schmelcher M., Loessner M.J.: Application of bacteriophages fordetection of foodborne pathogens. Bacteriophage, 2014; 4: e28137
  Google Scholar
• 53. Scott A.E., Timms A.R., Connerton P.L., El-Shibiny A., ConnertonI.F.: Bacteriophage influence Campylobacter jejuni types populatingbroiler chickens. Environ. Microbiol., 2007; 9: 2341-2353
  Google Scholar
• 54. Sheppard S.K., Jolley K.A., Maiden M.C.: A gene-by-gene approachto bacterial population genomics: whole genome MLST ofCampylobacter. Genes, 2012; 3: 261-277
  Google Scholar
• 55. Sillankorva S.M., Oliveira H., Azeredo J.: Bacteriophages andtheir role in food safety. Int. J. Microbiol., 2012; 2012: 863945
  Google Scholar
• 56. Silva J., Leite D., Fernandes M., Mena C., Gibbs P.A., Teixeira P.:Campylobacter spp. as a foodborne pathogen: a review. Front. Microbiol.,2011; 2: 200
  Google Scholar
• 57. Siringan P., Connerton P.L., Payne r.J., Connerton I.F.: Bacteriophage-mediateddispersal of Campylobacter jejuni biofilms. Appl.Environ. Microbiol., 2011; 77: 3320-3326
  Google Scholar
• 58. Sørensen M.C., Gencay Y.E., Birk T., Baldvinsson S.B., Jäckel C.,Hammerl J.A., Vegge C.S., Neve H., Brøndsted L.: Primary isolationstrain determines both phage type and receptors recognised byCampylobacter jejuni bacteriophages. PLoS One, 2015; 10: e0116287
  Google Scholar
• 59. Sulakvelidze A., Alavidze Z., Morris J.G.Jr.: Bacteriophage therapy.Antimicrob. Agents Chemother., 2001; 45: 649-659
  Google Scholar
• 60. Szermer-Olearnik B., Boratyński J.: Bakteriofagi – nanocząstkio szerokich zastosowaniach. Chemik, 2014; 68: 761-765
  Google Scholar
• 61. Szermer-Olearnik B., Boratyński J.: Removal of endotoxins frombacteriophage preparations by extraction with organic solvents.PLoS One, 2015; 10: e0122672
  Google Scholar
• 62. Tang J.Y., Mohamad Ghazali F., Saleha A.A., Nishibuchi M., Son r.:Comparison of thermophilic Campylobacter spp. occurrence in twotypes of retail chicken samples. Int. Food Res. J., 2009; 16: 277-288
  Google Scholar
• 63. Wagenaar J.A., Van Bergen M.A., Mueller M.A., Wassenaar T.M.,Carlton r.M.: Phage therapy reduces Campylobacter jejuni colonizationin broilers. Vet. Microbiol., 2005; 109: 275-283
  Google Scholar
• 64. Whitman W.B., Coleman D.C., Wiebe W.J.: Prokaryotes: the unseenmajority. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95: 6578-6583
  Google Scholar
• 65. Woźniak A., Wieliczko A.: Tetracycline, erythromycin, and gentamicinresistance of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolatedfrom poultry in Poland. Bull. Vet. Inst. Pulawy, 2011; 55: 51-54
  Google Scholar
• 66. Yun J., Jeon B., Barton Y.W., Plummer P., Zhang Q., Ryu S.: Roleof the DksA-like protein in the pathogenesis and diverse metabolicactivity of Campylobacter jejuni. J. Bacteriol., 2008; 190: 4512-4520
  Google Scholar
• 67. Zabłotni A., Jaworski A.: Źródła antybiotyków w środowiskachnaturalnych i ich rola biologiczna. Postępy Hig. Med. Dośw., 2014;68: 1040-1049
  Google Scholar

Pełna treść artykułu