Abstrakt

Białka Ago są przedstawicielami wyspecjalizowanej i konserwatywnej rodziny Argonaute, odpowiedzialnej przede wszystkim za regulację ekspresji genów przez mechanizm interferencji RNA. Ago wchodzące w skład kompleksu RISC (RNA-induced silencing complex) odpowiadają za wiązanie krótkiego RNA i trawienie lub hamowanie translacji docelowego mRNA. Przełącznikiem między tymi funkcjami jest prawdopodobnie fosforylacja, chociaż nie wyklucza się również roli stężenia jonów magnezu. Najnowsze doniesienia wskazują, że w pewnych sytuacjach Ago mogą się łączyć z mRNA i spowodować zahamowanie translacji również bez udziału krótkiego RNA. Białka te biorą także udział w naprawie dwuniciowych pęknięć DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej, w modyfikacjach chromatyny i alternatywnym splicingu, analizowany jest też ich wpływ na cykl komórkowy i senescencję. Ekspresja białek Ago jest tkankowo swoista, co potencjalnie może być wykorzystane w celach diagnostycznych. Poznanie struktury mechanizmów funkcjonowania Ago jest więc podstawowe dla zrozumienia wielu procesów komórkowych. W artykule skoncentrowano się na budowie białek Ago z uwzględnieniem modyfikacji potranslacyjnych, przedstawiono dane i hipotezy dotyczące oddziaływań z krótkimi RNA i mRNA w tym mechanizmów sortowania siRNA/miRNA do poszczególnych przedstawicieli podrodziny Ago oraz ich rolę w komórkach eukariotycznych. Opisano również najnowszą, opartą na badaniach ewolucyjnych klasyfikację Ago w obrębie rodziny Argonaute oraz interakcje z DNA.

Wstęp

Interferencja RNA (RNAi) to postać potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów, a jej odkrycie otworzyło wiele możliwości w nauce i medycynie. Mechanizm zjawiska polega na indukowaniu degradacji mRNA lub blokowaniu jego translacji przez krótkie, skompleksowane z białkami, niekodujące cząsteczki RNA. W mechanizmie interferencji głównym elementem, oprócz krótkiego RNA, jest wielobiałkowy kompleks RISC (RNA-induced silencing complex) odpowiadający za wiele etapówod dojrzewania krótkiego RNA powstającego z dwuniciowych prekursorów, po oddziaływanie z docelowym mRNA i blokowanie jego funkcji. Przebieg interferencji zależy w dużym stopniu od budowy RISC, a zwłaszcza od białka Argonaute, które jest głównym składnikiem kompleksu niezbędnym do zajścia procesu.

Poznanie struktury i funkcji białek Argonaute to jedno z głównych wyzwań od czasu odkrycia zjawiska interferencji RNA. Białka Argonaute występują u bakterii, archebakterii i eukariontów. Pierwsze analizy ich struktury dotyczyły głównie organizmów prokariotycznych oraz drożdży i dostarczyły wstępnych informacji o strukturze, aktywności katalitycznej oraz mechanizmie wiązania krótkich RNA [59]. Najnowsze badania przedstawicieli Argonaute u wyższych eukariota dostarczyły nowych danych dotyczących ewolucji tej grupy białek. Obecnie w rodzinie białek Argonaute wyróżnia się cztery główne podrodziny: Ago, PIWI, WAGO i Trypanosoma Ago. W komórkach ludzkich występują cztery białka z podrodziny Ago (Ago1, Ago2, Ago3 i Ago4) i cztery białka z podrodziny PIWI (HIWI1, HIWI2, HIWI3 i HILI) przy czym Ago1-4 są głównymi wykonawcami mechanizmu interferencji RNA w odniesieniu do większości mRNA i większości typów komórek, podczas gdy białka podrodziny PIWI uczestniczą przede wszystkim w wygaszaniu RNA transpozonów w procesie spermatogenezy [51].

Wiązanie krótkiego RNA przez białka Argonaute oraz mechanizmy oddziaływania kompleksu RISC z docelowym mRNA to zagadnienia, których wyjaśnienie jest podstawowe dla zrozumienia mechanizmu regulacji ekspresji genów w wyniku interferencji RNA.

Rodzina białek Argonaute – aktualny podział oparty na różnicach w funkcjonowaniu i badaniach ewolucyjnych

Pierwotne białka Argonaute u prokaryota miały aktywność nukleolityczną, którą wielu znanych dzisiaj przedstawicieli tej rodziny utraciło w toku ewolucji w wyniku niezależnych procesów [84]. Topologia drzewa filogenetycznego prokariotycznych Argonaute sugeruje intensywny horyzontalny transfer kodujących je genów, podobny do schematu ewolucji większości genów zwią- zanych z obroną u prokariontów, co pokrywa się z wynikami badań nad rolą Argonaute w obronie gospodarza [84]. U T.thermophilus i E.coli wykazano, że białka Argonaute obniżają wydajność transformacji i liczbę cząsteczek plazmidu w komórkach [65,82].

W eukariotycznej rodzinie Argonaute wyróżniano początkowo dwie podrodziny: Ago oraz PIWI. Podział oparty jest na homologii sekwencji odpowiednio wzglę- dem Ago1 Arabidopsis thaliana i PIWI Drosophila melanogaster [66]. W późniejszych pracach zaproponowano wyodrębnienie, ze względu na różnice w budowie i funkcjach, podrodziny WAGO występującej u C.elegans i Ago zidentyfikowanej u świdrowca Trypanosoma.brucei [6,24]. Podział uzasadniają dane z drzewa filogenetycznego białek Argonaute przedstawionego przez Swartsa i wsp. [szczegółowo w: 84].

Wykryta u T. brucei podrodzina białek TbAgo, podobnie jak prokariotyczne białka Argonaute, jest powiązana z regulacją aktywności transpozonów [84]. Klasyfikację opisanych białek jako osobnej podrodziny zaproponowano w oparciu o badania ewolucyjne oraz różnice w budowie. Chociaż białka Argonaute charakteryzują się bardzo konserwatywną budową u wszystkich badanych organizmów, u T. brucei wykryto duże zmiany w obrę- bie domeny PAZ, w tym przypadki braku tej domeny, z jednoczesnym zachowaniem domeny PIWI i analogicznym fałdowaniem, jak u białek występujących u wyż- szych eukariontów [24,104]. Prekursorem krótkiego RNA wiązanego przez TbAgo1 jest długi dwuniciowy RNA powstający z retrotranspozonów [13] lub powtórzeń tandemowych CIR147 (147 bp chromosome internal repeats) umiejscowionych w  nietelomerowych regionach chromosomów 4, 5 i 8 [89]. Dojrzewanie transkryptu odbywa się z udziałem enzymów TbDcl1 lub TbDcl2 (T. brunei Dicer-like enzyme) różniącego się od występują- cego u wyższych eukariontów białka Dicer organizacją domen. W TbDcl domeny o aktywności RNAzowej znajdują się blisko końca aminowego (RNAzaIIIa) i w centrum cząsteczki (RNAzaIIIb), a nie przy końcu karboksylowym jak w przypadku białka Dicer [77]. WAGO (Worm specific Argonaute) to podrodzina bia- łek Argonaute swoista dla nicieni (Nematoda). Wiążą się z  RNA w odpowiedzi na aktywność innego białka Ago [27,84]. Białka WAGO uczestniczą w regulacji ekspresji genów przez destabilizację docelowego mRNA lub podczas fazy elongacji, a więc równolegle do procesu transkrypcji [27]. Przypuszczalnie WAGO mogą działać hamująco na inne białka z tej samej podrodziny, zapobiegając wyciszeniu niektórych genów. Przykładem może być białko Argonaute CSR-1 z podrodziny WAGO, które przez interakcję z RNA antysensowymi względem genów zarodkowych zapobiega ich wyciszeniu przez kompleksy innych WAGO-piRNA [96].

Funkcja enzymatycznego cięcia mRNA jest najbardziej rozpowszechniona w  podrodzinie PIWI. Najczęściej opisywaną rolą białek PIWI jest kontrola aktywno- ści transpozonów w komórkach rozrodczych i liniach zarodkowych zwierząt [17,54]. Wykazano, że u myszy wszystkie białka PIWI są istotne dla prawidłowej spermatogenezy, natomiast u Drosophila mutacje w obrębie genów kodujących opisywane białka zaburzają oogenezę i  zmniejszają liczbę komórek rozrodczych [3]. U prymitywnych zwierząt jakimi są płazińce zaobserwowano ekspresję białek PIWI w totipotencjalnych komórkach neoblastów zdolnych do różnicowania w dowolne komórki somatyczne lub rozrodcze [59]. PIWI ulegają metylacji katalizowanej m.in. przez metylotransferazę argininową PRMT5, w  wyniku czego możliwa jest ich interakcja z  białkami zawierającymi domenę Tudor (tzw. białka TDRD), które przypuszczalnie odgrywają rolę w biogenezie piRNA i różnicowaniu komórek zarodkowych [33,41,70]. Niektóre białka z podrodziny PIWI wykazują silną preferencję względem RNA zawierającego uracyl na końcu 5’ [84], co jest również cechą roślinnych Ago [56]. Po  związaniu takiego RNA jego koniec 3’ jest cięty przez egzonukleazę po czym ulega 2’-O-metylacji [51,56]. Mechanizm pełni prawdopodobnie funkcję ochronną, ponieważ podczas wiązania kompleksu PIWI-piRNA z docelowym mRNA dochodzi często do uwolnienie końca 3’ piRNA z domeny PAZ, co naraża cząsteczkę na  niekontrolowaną addycję urydyny lub adenozyny i trawienie [1,51,56].

Czwartą podgrupą białek Argonaute są Ago, ich funkcjonowaniu poświęcono dalszą część artykułu.

Białka Ago

Białka z podrodziny Ago należą do  najpowszechniej występujących Argonaute i są zaangażowane w interferencję RNA u większości znanych organizmów [14,30]. Liczba przedstawicieli podrodziny Ago różni się w zależ- ności od organizmu: Drosophila melanogaster ma 5 białek Ago, podczas gdy u Arabidopsis thaliana zidentyfikowano 10 [30,64]. Ludzkie białka Ago obejmują czterech przedstawicieli. Gen kodujący białko Ago2 znajduje się na chromosomie 8, natomiast geny kodujące białka Ago1, Ago3 i Ago4 są umiejscowione na chromosomie 1. Nie wiadomo czy skupienie genów na chromosomie 1 wiąże się z podobieństwem funkcji [30]. Ekspresja Ago u ssaków jest swoista tkankowo (różne profile ekspresji w róż- nych organach), co potencjalnie może być wykorzystane w celach diagnostycznych [90]. Według Smiberta i wsp. ekspresja Ago jest regulowana przez poziom dojrzałego miRNA na zasadzie homeostazy [79].

Do krótkich RNA wiązanych przez Ago zalicza się głównie siRNA i miRNA. Cząsteczki siRNA powstają z długich, dwuniciowych cząsteczek RNA (dsRNA) pochodzenia egzo- lub  endogennego [25]. Mogą działać zarówno w układzie cis jak i trans, czyli kierując się do RNA z których pochodzą (cis) lub do docelowego mRNA (trans) [9,25]. MikroRNA (miRNA) to cząsteczki regulatorowe pochodzenia endogennego działające najczęściej w układzie trans [48,98]. Istnieją dowody na wiązanie ludzkiego Ago 2 z nowo powstającymi tRNA i 5S rRNA oraz loci, z których te RNA powstają. Proces jest niezależny od siRNA oraz białka Dicer i może być ważnym mechanizmem regulacji w komórkach ludzkich [101]. Krótkie RNA powstające ze snoRNA również mogą być wiązane przez Ago i pełnić funkcję identyczną jak miRNA [87].

Domeny strukturalne w białkach Ago i ich funkcje

Pierwsze informacje o strukturze białek Argonaute, w tym Ago, pochodziły z analiz krystalograficznych białek organizmów prokariotycznych: Pyrococcus furiosus, Aquifex aeolicus, Archaeoglobus fulgidus i Thermus thermophilus [80,84,93,105]. Z białek eukariotycznych udało się jak dotąd przeprowadzić krystalizację Ago z drożdży Kluyveromyces polyspora oraz ludzkich Ago1 i Ago2, związanych z pojedynczą nicią krótkiego RNA [16,18,59,76].

Badania białek prokariotycznych wykazały, że w budowie przedstawicieli rodziny Argonaute można wyróżnić dwa obszary zbudowane łącznie z czterech domen [53,57]. Pierwszy obszar obejmuje domeny N oraz PAZ, natomiast drugi domeny PIWI i MID [54,76]. Funkcje łączników speł- niają region L1 łączący domeny N i PAZ oraz region L2 stanowiący łącznik między domeną PAZ i MID [30,105]. Dalsze prace wykazały, że funkcje wszystkich czterech domen są wysoce konserwatywne zarówno u organizmów prokariotycznych jak i eukariotycznych [84].

Struktura domeny MID ludzkiego Ago2 wykazuje fał- dowanie typu Rossmanna (drugorzędowa struktura łańcuch β-helisa α-łańcuch β) [20]. Domena MID wiąże koniec 5’ siRNA lub miRNA dzięki obecności kieszeni wiążącej nukleotydy, zawierającej aminokwasy wchodzące w  interakcję (stabilizowaną przez jon dwuwartościowy magnezu) z  resztą fosforanową występującą na końcu 5’ siRNA/miRNA i  wiązaniu reszty cukrowej terminalnego nukleotydu na tym końcu [36,37,84]. Ponadto, w niektórych Ago (np. ludzkim Ago2) występują pętle (nucleotide specificity loop) swoiście rozpoznające zasady azotowe w nukleotydach znajdujących się na końcu 5’ krótkiego RNA [19,20]. Mutacje w obrębie aminokwasów tworzących kieszeń w ludzkim Ago2 powodują obniżenie aktywności katalitycznej tego białka polegającej na cięciu nukleolitycznym docelowego mRNA [49,108]. Dodatkową funkcją domeny MID jest utrzymywanie właściwej, ułatwiającej wiązanie z docelowym mRNA, konformacji tzw. rejonu „seed” w miRNA [42].

Wiedza o roli domeny N oparta jest głównie o wyniki badań Hauptmann i wsp. wykazujące, że ludzkie białko Ago3, które nie ma zdolności do cięcia katalitycznego, może uzyskać ją w wyniku zamiany jego domeny N na odpowiednik pochodzący z Ago2 [28]. Podobne rezultaty uzyskano dla Ago1, nie wiadomo jednak w jaki sposób domena N umożliwia aktywność nukleolityczną [18]. Domena N odgrywa również rolę w rozplataniu dupleksu RNA i selekcji nici o mniej stabilnym końcu 5’ [44,94].

Badania krystalograficzne i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego domen PAZ u różnych organizmów wykazały obecność kieszeni kotwiczącej charakterystyczny dwunukleotydowy wystający koniec 3’ krótkiego RNA powstający w wyniku trawienia przez RNAzę III [49,52]. Wiązanie końca 3’ chroni krótki RNA przed degradacją, a jego brak lub zmiana wpływa na wiązanie regulowanego mRNA i wynik działania białka Ago [36].

Miejsce aktywne umożliwiające niektórym Ago trawienie mRNA jest zlokalizowane w domenie PIWI. Struktura domeny przypomina budową RNAzę H, a aktywność katalityczna jest związana z motywem DDX, gdzie X to zazwyczaj kwas asparaginowy lub lizyna [39]. Motyw DDX może być uzupełniany przez kwas glutaminowy tworząc tetraedryczne centrum katalitycznego DEDX [55,84]. Ludzkie Ago3, mimo obecności motywu DDH w domenie PIWI, nie ma aktywności nukleolitycznej, a przyczyna nie została dotąd wyjaśniona [28].

Modyfikacje potranslacyjne białek Ago

Jak większość białek, Ago ulegają modyfikacjom potranslacyjnym wpływającym na ich funkcje, a najbardziej podatnym na modyfikacje jest region łącznikowy L2 [75]. Analiza widm masowych wykazała, że ludzkie Ago2 jest hydroksylowane przez hydroksylazę 4-prolilową, co wpływa na jego stabilność [69]. Pozostałe ludzkie Ago również ulegają hydroksylacji (dotyczy to głównie proliny), przy czym wydaje się, że w większym stopniu dotyczy ona Ago2 i Ago4 niż pozostałych dwóch protein [69]. W warunkach stresu komórkowego ludzkie Ago ulegają też poli-ADP-rybozylacji, co powoduje hamowanie interferencji RNA zależnej od miRNA [45]. Wskazywa- łoby to na poli-ADP-rybozylację jako główny czynnik regulujący interferencję RNA w cytoplazmie (szczegóły w [45]).

Białka Ago podlegają ubikwitynacji, która stanowi sygnał do ich degradacji. W literaturze opisano białko TRIM71 jako potencjalną ligazę ubikwitynową oddziałującą na białka Ago u ssaków [74]. Interesujące jest, że białko TRIM71 może też, bezpośrednio przez wiązanie z mRNA, doprowadzić do blokowania jego translacji lub degradacji (niezależnie od białek Argonaute) [50]. Lizyna-402 umiejscowiona w regionie L2 łączącym domeny PAZ i PIWI białka Ago ulega często sumoilacji. Kowalencyjne przyłączanie białek SUMO1 i SUMO2/3 obniża stabilność ludzkiego Ago2 [75].

Fosforylacja białka Ago2 zachodzi zwykle w obrębie seryny-387 [107]. Shane i wsp. wykazali, że katalizowana przez białkową kinazę B (PKBγ/Akt3) fosforylacja hamuje cięcie i zwiększa blokowanie translacji mRNA związanego z  miRNA, wskazując na fosforylację jako rodzaj przełącznika między tymi funkcjami [32]. Mutacja polegająca na zamianie ulegającej fosforylacji seryny-387 na alaninę prowadzi do zmniejszenia ilości Ago2 obserwowanego w cytoplazmie w tzw. ciałkach P (processing bodies), w których regulowany mRNA jest gromadzony i może być degradowany z udziałem róż- nych mechanizmów [73,107].

Wiązanie miRNA/siRNA do kompleksu RI

Długie dwuniciowe RNA (dsRNA lub pre-miRNa) prekursory siRNA lub miRNA są wiązane przez białko Dicer, które dzięki obecności dwóch domen o charakterze RNAzy III, przecina obie nici generując fragmenty o  długości 20-24 nukleotydów [54]. Powstałe krótkie RNA oddysocjowują, a następnie ponownie wiążą się z Dicer w innym miejscu [54]. Na tym etapie białko TRBP rozpoznaje mniej stabilny termodynamicznie koniec 5’ dwuniciowej cząsteczki miRNA/siRNA i ustawia ją we właściwej pozycji umożliwiającej prawidłową selekcję i wiązanie z Ago [62].

Proces związania siRNA/miRNA z białkiem Ago wymaga utrzymania Ago w otwartej konformacji uzyskiwanej z udziałem białka szoku termicznego HSP90 (proces wymaga ATP) [40]. Na podstawie spektometrii masowej ustalono, że w komórkach mysich podobną funkcję mogą pełnić inne białka opiekuńcze (białko FKBP5 i PTGES), nie stwierdzono jednak czy obecność białek opiekuńczych jest niezbędna do funkcjonowania kompleksu RISC [22]. Badania Schizosaccharomyces pombe wskazują na udział kompleksu białek opiekuńczych ARC (Argonaute small interfering RNA chaperone complex) w ładowaniu krótkiego RNA do Ago1 [31].

Po związaniu RNA i usunięciu jednej nici konformacja białka Ago zmienia się, a HSP90 (i białka opiekuń- cze) odłączają się od kompleksu [40,54]. Regulacja przez HSP90 jest procesem ewolucyjnie konserwatywnym, który pojawił się prawdopodobnie w tym samym czasie co interferencja RNA [95]. Nie jest pewne czy Dicer jest stałym elementem kompleksu RISC czy też oddysocjowuje po związaniu dupleksu krótkiego RNA z białkiem Ago [43]. Rozplatanie dupleksu krótkiego RNA odbywa się przez zmiany w konformacji domeny N  białka Ago, która przesuwając się między nićmi powoduje ich rozdzielenie [47,91]. Nie wykluczono jednak udziału helikaz [55]. Ludzkie białka Ago1 i Ago2 są zdolne do samodzielnego usuwania z kompleksu nici pasażerskiej, przy czym Ago2 może ją również szybciej usuwać przez trawienie w okolicy 10 nukleotydu [47,91]. Według jednej z hipotez usuwanie nici pasażerskiej u  ssaków wymaga obecności kompleksu C3PO (component 3 promoter of RISC) zawierającego białka TB-RBP i TRAX [103]. Procesy związane z usunięciem nici z kompleksu RISC nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione i wymagają dalszych badań. Dodatkowych analiz wymaga również mechanizm funkcjonowania krótkich RNA powstających niezależnie od Dicer, takich jak miR-451, za którego dojrzewanie odpowiedzialne jest prawdopodobnie Ago2 [10,15,22,29,85].

Nić pasażerska nie zawsze ulega degradacji. Znane są wyniki badań świadczące o możliwości włączenia jej do aktywnego kompleksu RISC, gdzie pełni rolę identyczną jak nić wiodąca [63,100]. Analizy danych mikromacierzowych wskazują, że często dotyczy to miRNA związanych z onkogenezą: mir-17, mir-34a, mir-19, mir-29c oraz mir- 378 i musi być uwzględniane w badaniach nad funkcjonowaniem i rolą miRNA [102]. Buroughs i wsp. szacują, że około 1% sekwencji wiązanych przez Ago u ssaków to nici pasażerskie, sugerując, że może to świadczyć zarówno o istnieniu istotnego mechanizmu, jak i wynikać z błędów w selekcji nici i jej ”ładowaniu” [7].

Ciekawym zjawiskiem jest „efekt Ago3” opisany przez Winter i Diederichsa dotyczący wysoce specyficznej relacji między nicią pasażerską let-7a i ludzkim biał- kiem Ago3. Ekspresja i aktywność dojrzałej nici pasa- żerskiej określanej jako let-7a-3p znacznie zwiększa się pod wpływem nadekspresji Ago3. Skutek jest taki sam dla różnych konstruktów generowanych z różnych loci, a reakcja qRT-PCR potwierdza związek nadekspresji Ago3 ze  zmianą równowagi między nicią wiodącą i pasażerską (let-7a-5p: let-7a-3p). Żadne inne białko nie wywołuje takiej zmiany, nie jest to również zjawisko swoiste dla jednego typu komórek (analogiczne wyniki uzyskano dla linii komórkowych HEK293 i HeLa). Włą- czanie nici pasażerskiej do Ago-3 jest niezależne od stabilności końca 5’ [100].

Sortowanie miRNA/siRNA do różnych białek Ago

Sortowanie i wiązanie krótkich RNA przez poszczególne białka Ago u Eukariontów jest procesem, którego mechanizm nie został jeszcze w pełni zbadany. U Drosphila melanogaster wskazuje się na stopień komplementarności prekursora siRNA/miRNA jako podstawowy dla wiązania przez konkretne Ago. Długie dsRNA wykazujące niemal idealną komplementarność, po cięciu przez enzym Dcr2 wiązane są przez Ago2, natomiast pre-miRNA o większej liczbie niesparowanych nukleotydów po obróbce przez Dcr1 wiążą się z Ago1 [11,88]. Istnieją jednak wyjątki od tej reguły: miR-27 będące produktem obróbki katalizowanej przez Dcr1 wiązane jest przez Ago2, a etapem pośrednim jest prawdopodobnie wiązanie przez Dcr2, które odpowiada za „załadowanie” miRNA do Ago. Opisano też endogenne siRNA wywodzące się z prekursorów o dużej liczbie niesparowań związane z Ago2 [54]. Sugeruje to istnienie dodatkowego mechanizmu sortowania krótkich RNA u D.melanogaster.

Według Franka i wsp. u Arabidopsis thaliana to nukleotyd na końcu 5’ dojrzałego miRNA decyduje o sortowaniu małych RNA do odpowiednich białek Ago [19,71]. Ze względu na możliwość wystąpienia w tym miejscu jednego z czterech nukleotydów, przy 10 białkach Ago występujących u A. thaliana nie wydaje się by mechanizm oparty wyłącznie na  rozpoznawaniu terminalnej zasady z końca 5’ krótkiego RNA był decydujący. W odpowiedzi na te wątpliwości Thieme i wsp. zaprezentowali interesujące wyniki, według których dodatkową rolę w sortowaniu mogą odgrywać nukleotydy występujące w pozycjach 2, 6, 9 i 13, wykazując jednocześnie, że sortowanie do Ago2 i Ago5 u A. thaliana jest zależne od wystąpienia na tych pozycjach uracylu [86]. Potwierdzono również niezależność sortowania od długości miRNA i sparowania dupleksu [86]. Dla komórek ssaczych długo obowiązującą hipotezą była zależność sortowania od  komplementarności dupleksu (mechanizm analogiczny do występującego u Drosphila), nie  znalazła jednak jak dotąd pełnego potwierdzenia. Głębokie sekwencjonowanie krótkich RNA związanych z ludzkimi Ago przeprowadzone przez zespół Burroughsa wykazało, że  w  większości są w podobnym stopniu (33%) wiązane przez Ago 1-3 (badania nie obejmowały Ago4). Zaobserwowano kilka wyjątków (miR-182, miR-222 i miR223*), jednak analiza wszystkich wyników wskazuje na brak mechanizmu sortowania [7].

Badania zespołu Wanga potwierdzają hipotezę o losowym wiązaniu miRNA przez białka Ago w komórkach ssaków. Analizy in vivo i in silico przeprowadzone przez tę grupę wykazały, że w mysich komórkach skóry pozbawionych Ago1 i Ago2, dzięki wzrostowi aktywności Ago3 pula wiązanego miRNA jest na podobnym poziomie co w komórkach kontrolnych [92].

Równocześnie rozpatrywaną teorią jest zależność mię- dzy termodynamiczną stabilnością prekursora miRNA/ siRNA a ich wiązaniem przez Ago. Gu i wsp. wskazują, że krótkie RNA, powstające z prekursora shRNA o mniejszej termostabilności są wydajniej wiązane przez Ago pozbawione właściwości nukleolitycznych (Ago 1, Ago 3 i zmodyfikowane Ago2), co wskazuje, że może być to właściwy kierunek badań. Uzyskane wyniki dotyczą jednak shRNA, natomiast w przypadku siRNA zależność nie jest tak wyraźna [26]. Przeprowadzona przez nasz zespół analiza sekwencji nukleotydowej prekursorów miRNA występujących w kompleksie z białkami Ago1 i Ago2 po immunoprecypitacji [90] wykazała preferencyjne wiązanie przez Ago1 tych miRNA, których prekursory zawierały niesparowania w obrębie sekwencji [5].

Wiązanie z docelową sekwencją mRN

Białka Ago związane z krótkim RNA mogą się umiejscawiać i przyłączać do docelowego mRNA według jednego z dwóch schematów. Pierwszy określany jako miRNA- -zależny, opiera się na bezpośrednim odnajdywaniu i wiązaniu mikro RNA z komplementarną sekwencją nici mRNA [54]. Do przebiegu tego i kolejnych etapów niezbędna jest obecność białek GW, które koordynują cały proces [38]. U D.melanogaster zidentyfikowano jedno białko GW określane jako GW182, natomiast komórki ssaków zawierają trzy białka nazywane TNRC6A, TNRC6B, TNRC6C (trinucleotide repeat containing 6) [67]. Charakterystyczną cechą tej rodziny białek jest obecność licznych powtórzeń motywów glicynowo-tryptofanowych w domenie N, oddziałującej z dwoma kieszeniami domeny PIWI białka Ago [109]. Prawdopodobnie jedno białko GW może jednocześnie wiązać więcej niż jedno białko Ago [54]. Glicyna obecna w opisywanym motywie nie jest niezbędna do przebiegu procesu i może być zastąpiona dowolnym aminokwasem o krótkim łań- cuchu bocznym (seryna, alanina, cysteina i inne) [67]. Białko TNRC6A paralog GW182 prawdopodobnie odpowiada za kierowanie Ago do jądra [61].

Koniec karboksylowy białka GW zawiera rozpoznający RNA motyw RRM (RNA recognition motif) i motyw PAM2 (poly(A)-binding protein-interacting motif-2) zdolne do oddziaływania z białkiem wiążącym się do ogona poliA (PABPC) mRNA. Następstwem takiego wiązania może być inhibicja reakcji PABPC z kompleksem wiążącym czapeczkę, uniemożliwiająca cyrkularyzację mRNA i inicjację translacji [106]. Bardziej popularna jest jednak koncepcja, że PABPC i ogon poliA odpowiadają przede wszystkim za stymulację oddziaływań między białkami Ago i GW, ponieważ długość ogona poliA i liczba zwią- zanych z nim PABPC koreluje z wydajnością wyciszania ekspresji genu [58]. Huntzinger i wsp. sugerują że PABPC jest bezpośrednio odpowiedzialne za wiązanie kompleksu RISC z mRNA i wraz z kompleksami deadenylaz PAN2-PAN3 i CCR4-NOT jest konieczne do hamowania translacji i degradacji mRNA [35].

Analizy in silico wskazują, że oddziaływania miRNA- -mRNA mogą silnie zależeć od stężenia jonów magnezu. Nam i wsp. wykazali zmianę konformacji dupleksu RNA w Ago2 pod wpływem zmiany stężenia Mg2+ oraz preferencję aktywności nukleolitycznej nad blokowaniem translacji przy niskich stężeniach jonów [60].

Białka Ago mogą się łączyć z mRNA i spowodować zahamowanie translacji również bez udziału krótkiego RNA. Takie zjawisko potwierdzono dla komórek ludzkich i mysich, w których nie było dojrzałych miRNA mogących się wiązać z kompleksem RISC pozbawionym krótkiego RNA (blokowanie translacji zachodzi mimo braku krótkiego RNA w kompleksie). W tego typu oddziaływaniach Ago-mRNA pośredniczą białka wią- żące RNA (RBP), ale prawdopodobny jest również ich udział w wiązaniu mRNA i Ago zawierającego miRNA [21,46,54].

Funkcje białek Ago

Główne funkcje białek Ago wiążą się z ich rolą w procesie interferencji RNA, w którym przez oddziaływnie z siRNA/miRNA uczestniczą w regulacji ekspresji genów. Proces RNAi zachodzi w cytoplazmie, a regulacja ekspresji odbywa się na poziomie potranskrypcyjnym lub podczas translacji. Rola białek Ago jest jednak bardziej złożona niż początkowo przypuszczano.

W komórkach ludzkiego raka szyjki macicy (HeLa) białko Ago2 wiąże krótkie RNA powstające w sąsiedztwie dwuniciowych pęknięć DNA (diRNA, double-strand breaks-induced small RNAs) [54,97]. Najnowsze badania wskazują, że Ago 2 związane z diRNA gromadzi się w miejscu wystąpienia takiego uszkodzenia i może aktywnie wpływać na wydajność jego naprawy, oddziałując z Rad51 [23,97]. Białko Ago2 wspiera wiązanie i akumulację Rad51 w obszarze pęknięcia, przyspieszając rekombinację homologiczną. Inne białka zaangażowane w procesy naprawy (Mdc1, RPA, 53BP1) i pozostali przedstawiciele ludzkich Ago nie wykazują podobnej aktywności. Ago2 może brać udział w naprawie dwuniciowych pęknięć również wtedy, gdy nie jest związane z diRNA, jeśli nie jest zachowana jego aktywność katalityczna [23].

Białka Ago są przypuszczalnie zaangażowane w modyfikacje chromatyny i alternatywny splicing przez oddzia- ływanie z polimerazą RNA II i zdolność do kierowania spliceosomów do miejsc splicingowych [2,4]. Carissimi i wsp. przedstawili dowody na współdziałanie Ago2 z kompleksem SWI/SNF (odpowiedzialnym za zmiany struktury chromatyny) w  regulacji rozmieszczenia nukleosomów w komórkach ludzkich [9]. Mechanizm opiera się na nieznanej wcześniej klasie krótkich RNA nazwanych swiRNA [9]. Analizowana była również rola białek Ago w procesie senescencji. Ago2 akumulowane jest w jądrach komórek wchodzących w stan senescencji, a obniżenie jego poziomu opóźnia proces [72]. Ludzkie Ago 1 oddziałuje z polimerazą II RNA i wiąże się z promotorami aktywnie transkrybowanych genów (Ago 2 nie wykazało podobnych zdolności). Geny, do których wiąże się Ago1 kodują w większości białka uczestniczące w stymulacji wzrostu komórki, cyklu komórkowym i apoptozie, wiele z nich jest zaangażowanych w procesy nowotworzenia. Ten rodzaj regulacji ekspresji zachodzący w jądrze może, ale nie musi być zależny od miRNA [34]. Wyciszenie ekspresji Ago1 w komórkach raka stercza PC-3 powoduje zatrzymanie ich w fazie G0/G1 cyklu komórkowego [34].

Rolę białek Ago w cyklu komórkowym analizowano również w komórkach drożdży Schizosaccharomyces pombe, u których nadekspresja Ago2 powoduje zatrzymanie cyklu w  fazie G2, opóźnienie wejścia w mitozę oraz inhibicję importu fosfatazy Cdc25. Stoic i wsp. potwierdzili również zdolność Ago2 do interakcji z białkami 14-3-3 [81]. Natomiast badania nad rozwojem muszki owocówki wykazały, że Ago1 kontroluje cyklinę B i reguluje przebieg cyklu komórkowego. Mutacja Ago1 powoduje wzrost aktywności cykliny B-Cdk1 i obniżenie poziomu białka P53, Grp, Mei-41 i Wee1. Sreerangam i wsp. dowodzą na tej podstawie, że Ago1 jest niezbędne do prawidłowych podziałów mitotycznych, zwłaszcza do tworzenia wrzeciona i segregacji chromosomów w czasie wczesnego rozwoju embrionalnego [68].

Interakcje Ago z DNA

U prokariontów wykazano, że białka Argonaute biorą udział w interferencji DNA, w której krótkie interferujące DNA wiażąc się z białkiem Argonaute prowadzi do cięcia zarówno pojedynczej jak i podwójnej nici DNA [83,99].

Interakcje Ago-DNA u ssaków to nowe zagadnienie, któremu nie poświęcono dotąd większej uwagi. Wstępne badania wskazują na możliwość związania krótkiego DNA przez domenę MID ludzkiego Ago2, ponieważ nie wykazuje silnych preferencji względem cukru w  kwasie nukleinowym [za: 12]. Białko Ago2 Drosophila melanogaster ma podobne powinowactwo do ssDNA i ssRNA o długości 21 nukleotydów i tej samej sekwencji, natomiast Ago1 może związać 26-nukleotydowy fragment ssDNA, ale ze znacznie mniejszą wydajnością niż jego jednoniciowy odpowiednik RNA [za: 78]. Smalheiser i Gomes sugerują, że o ile interferencja RNA indukowana przez DNA powinna być brana pod uwagę, o tyle interferencja DNA indukowana przez DNA jest raczej nieprawdopodobna w komórkach eukariotycznych [za: 78].

Podsumowanie

Białka Ago są niezbędne do regulacji ekspresji genów opartej na krótkich RNA. Mimo wielu nowych danych wiele kwestii związanych z ich funkcjonowaniem pozostaje niewyjaśniona. Pełne zrozumienie procesu interferencji RNA oraz roli Ago wymaga lepszego poznania mechanizmów interakcji Ago – krótki RNA – mRNA. Dostępne dane i hipotezy często wykluczają się wzajemnie, dotyczy to szczególnie mechanizmów selekcji i usuwania nici z dupleksu oraz sortowania siRNA/miRNA do poszczególnych Ago.

Przypisy

• 1. Ameres S.L., Horwich M.D., Hung J.H., Xu J., Ghildiyal M., WengZ., Zamore P.D.: Target RNA-directed trimming and tailing of smallsilencing RNAs. Science, 2010; 328: 1534-1539
  Google Scholar
• 2. Ameyar-Zazoua M., Rachez C., Souidi M., Robin P., Fritsch L.,Young R., Morozova N., Fenouil R., Descostes N., Andrau J., MathieuJ., Hamiche A., Ait-Si-Ali S., Muchardt C., Batsche E., Harel-BellanA.: Argonaute proteins couple chromatin silencing to alternativesplicing. Nat. Struct. Mol. Biol., 2012; 19: 998-1004
  Google Scholar
• 3. Aravin A.A., Hannon G.J.: Small RNA silencing pathways in germand stem cells. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology,2008; 73: 283-290
  Google Scholar
• 4. Batsche E., Ameyar-Zazoua M.: The influence of Argonaute proteinson alternative RNA splicing. Wiley Interdiscip. Rev. RNA, 2015;6: 141-156
  Google Scholar
• 5. Biernacki K.: Analiza wpływu struktury miRNA na regulacjęekspresji genów. http://www.zis.ia.polsl.pl/images/dokumenty/ProgramistreszczeniaIISlaskieSpotkaniaNaukowe2015v2.pdfPiśmiennictwo(25.05.2015)
  Google Scholar
• 6. Buck A.H., Blaxter M.: Functional diversification of Argonautesin nematodes: an expanding universe. Biochem. Soc. Trans., 2013;41: 881-886
  Google Scholar
• 7. Burroughs A.M., Ando Y., de Hoon M.J., Tomaru Y., Suzuki H.,Hayashizaki Y., Daub C.O.: Deep-sequencing of human argonauteassociatedsmall RNAs provides insight into miRNA sorting and revealsArgonaute association with RNA fragments of diverse origin.RNA Biol., 2011; 8: 158-177
  Google Scholar
• 8. Carissimi C., Laudadio I., Cipolletta E., Gioiosa S., Mihailovich M.,Bonaldi T., Macino G., Fulci V.: Argonaute2 cooperates with SWI/SNFcomplex to determine nucleosome occupancy at human transcriptionstart sites. Nucleic Acids Res., 2015; 43: 1498-1512
  Google Scholar
• 9. Carthew R.W., Sontheimer E.J.: Origins and mechanisms of miRNAsand siRNAs. Cell, 2009; 136: 642-655
  Google Scholar
• 10. Cheloufi S., Dos Santos C.O., Chong M.M., Hannon G.J.: A Dicerindependent miRNA biogenesis pathway that requires Ago catalysis.Nature, 2010; 465: 584-589
  Google Scholar
• 11. Czech B., Zhou R., Erlich Y., Brennecke J., Binari R., Villalta C.,Gordon A., Perrimon N., Hannon G.J.: Hierarchical rules for Argonauteloading in Drosophila. Mol. Cell, 2009; 36: 445-456
  Google Scholar
• 12. Deleavey G.F., Frank F., Hassler M., Wisnovsky S., Nagar B. DamhaM.J.: The 5’binding MID domain of human Argonaute2 tolerateschemically modified nucleotide analogues. Nucleic Acid Ther.,2013; 23: 81-87
  Google Scholar
• 13. Djikeng A., Shi H., Tschudi C., Ullu E.: RNA interference in Trypanosomabrucei: cloning of small interfering RNAs provides evidencefor retroposon-derived 24-26 nucleotide RNAs. RNA, 2001;7: 1522-1530
  Google Scholar
• 14. Drinnenberg I.A., Weinberg D.E., Xie K.T., Mower J.P., WolfeK.H., Fink G.R., Bartel D.P.: RNAi in budding yeasts. Science, 2009;326: 544-550
  Google Scholar
• 15. Dueck A., Ziegler C., Eichner A., Berezikov E., Meister G.: microRNAsassociated with the different human Argonaute proteins.Nucleic Acids Res., 2012; 40: 9850-9862
  Google Scholar
• 16. Elkayam E., Kuhn C.D., Tocilj A., Haase A.D., Greene E.M., HannonG.J., Joshua-Tor L.: The structure of human argonaute-2 in complexwith miR-20a. Cell, 2012; 150: 100-110
  Google Scholar
• 17. Ender C., Meister G.: Argonaute proteins at a glance. J. Cell Sci.,2010; 123: 1819-1823
  Google Scholar
• 18. Faehnle C., Elkayam E., Haase A.D., Hannon G.J., Joshua-Tor L.:The making of a slicer: activation of human Argonaute-1. Cell Rep.,2013; 3: 1901-1909
  Google Scholar
• 19. Frank F., Hauver J., Sonenberg N., Nagar B.: Arabidopsis ArgonauteMID domains use their nucleotide specificity loop to sort small RNAs.EMBO J., 2012; 31: 3588-3595
  Google Scholar
• 20. Frank F., Sonenberg N., Nagar B.: Structural basis for 5’-nucleotidebase-specific recognition of guide RNA by human AGO2. Nature,2010; 465: 818-822
  Google Scholar
• 21. Friend K.F., Campbell Z.T., Cooke A., Kroll-Conner P., Wickens M.,Kimble J.: A conserved PUF-Ago-eEF1A complex attenuates translationelongation. Nat. Struct. Mol. Biol., 2012; 19: 176-183
  Google Scholar
• 22. Frohn A., Eberl H.C., Stohr J., Glasmacher E., Rudel S., HeissmeyerV., Mann M., Meister G.: Dicer-dependent and independentArgonaute protein interaction networks in mammalian cells. Mol.Cell. Proteomics, 2012; 11: 1442-1456
  Google Scholar
• 23. Gao M., Wei W., Li M.M., Wu Y.S., Ba Z., Jin KY.., Li M.M., LiaoY.Q, Adhikari S., Chong Z., Zhang T., Guo C.X., Tang T.S., Zhu B.T.,Hu X.Z. i wsp.: Ago2 facilitates Rad51 recruiment and DNA doublestrandbreak repair by homologous recombination. Cell Res., 2014;24: 532-541
  Google Scholar
• 24. Garcia Silva M.R., Tosar J.P., Frugier M., Pantano S., Bonilla B.,Esteban L., Serra E., Rovira C., Robello C., Cayota A.: Cloning, characterization,and subcellular localization of a Trypanosoma cruzi argonauteprotein defining a new subfamily distinctive of trypanosomatids.Gene, 2010; 466: 26-35
  Google Scholar
• 25. Ghildiyal M., Zamore P.D.: Small silencing RNAs: an expandinguniverse. Nat. Rev. Genet., 2009; 10: 94-108
  Google Scholar
• 26. Gu S., Jin L., Zhang F., Huang Y., Grimm D., Rossi J.J., Kay M.A.:Thermodynamic stability of small hairpin RNAs highly influencesthe loading process of different mammalian Argonautes. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 2011; 108: 9208-9213
  Google Scholar
• 27. Guang S., Bochner A. F., Burkhart K.B., Burton N., Pavelec D.M.,Kennedy S.: Small regulatory RNAs inhibit RNA polymerase II duringthe elongation phase of transcription. Nature, 2010; 465: 1097-1101
  Google Scholar
• 28. Hauptmann J., Dueck A., Harlander S., Pfaff J., Merkl R., MeisterG.: Turning catalytically inactive human Argonaute proteinsinto active slicer enzymes. Nat. Struct. Mol. Biol., 2013; 20: 814-817
  Google Scholar
• 29. Haussecker D., Huang Y., Lau A., Parameswaran P., Fire A.Z., KayM.A.: Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation ofRNA silencing. RNA, 2010; 16: 673-695
  Google Scholar
• 30. Hock J., Meister G.: The Argonaute protein family. Genome Biol.,2008; 9: 2102-2108
  Google Scholar
• 31. Holoch D., Moazed D.: Small-RNA loading licenses Argonautefor assembly into a transcriptional silencing complex. Nat. Struct.Mol. Biol., 2015; 22: 328-335
  Google Scholar
• 32. Horman S. R., Janas M. M., Litterst C., Wang B., MacRae I. J., SeverM. J., Morrissey D. V., Graves P., Luo B., Umesalma S., Qi H. H., MiragliaL. J., Novina C. D., Orth A. P.: Akt-mediated phosphorylation ofArgonaute 2 downregulates cleavage and upregulates translationalrepression of microRNA targets. Mol. Cell, 2013; 50: 356-367
  Google Scholar
• 33. Hosokawa M., Shoji M., Kitamura K., Tanaka T., Noce T., ChumaS., Nakatsuji N.: Tudor-related proteins TDRD1/MTR-1, TDRD6 andTDRD7/TRAP: domain composition, intracellular localization, andfunction in male germ cells in mice. Dev. Biol., 2007, 301: 38-52
  Google Scholar
• 34. Huang V., Zheng J., Qi Z., Wang J., Place R.F., Yu J., Li H., Li L.C.:Ago1 interacts with RNA polymerase II and binds to the promotersof actively transcribed genes in human cancer cells. PLoS Gen.,2013; 9: e1003821
  Google Scholar
• 35. Huntzinger E., Kuzuoglu-Öztürk D., Braun J. E., Eulalio A., WohlboldL., Izaurralde E.: The interactions of GW182 proteins with PABPand deadenylases are required for both translational repression anddegradation of miRNA targets. Nucleic Acids Res., 2013; 41: 978-994
  Google Scholar
• 36. Hur J.K., Zinchenko M.K., Djuranovic S., Green R.: Regulation ofArgonaute slicer activity by guide RNA 3’ end interactions with theN-terminal lobe. J. Biol. Chem., 2013; 288: 7829-7840
  Google Scholar
• 37. Hutvagner G., Simard M.J.: Argonaute proteins: key players inRNA silencing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2008; 9: 22-32
  Google Scholar
• 38. Jakymiw A., Lian S., Eystathioy T., Li S., Satoh M., Hamel J.C.,Fritzler M.J., Chan E.K.: Disruption of GW bodies impairs mammalianRNA interference. Nat. Cell Biol., 2005; 7: 1267-1274
  Google Scholar
• 39. Jinek M., Doudna J.A.: A three-dimensional view of the molecularmachinery of RNA interference. Nature, 2009; 457: 405-412
  Google Scholar
• 40. Johnston M., Geoffroy M.C., Sobala A., Hay R., Hutvagner G.:HSP90 protein stabilizes unloaded argonaute complexes and microscopicP-bodies in human cells. Mol. Biol. Cell, 2010; 21: 1462-1469
  Google Scholar
• 41. Kirino Y., Kim N., de Planell-Saquer M., Khandros E., Chiorean S.,Klein P.S., Rigoutsos J., Jongens T.A,. Mourelatos Z.: Arginine methylationof Piwi proteins catalysed by dPRMT5 is required for Ago3and Aub stability. Nat. Cell Biol., 2009; 11: 652-658
  Google Scholar
• 42. Künne T., Swarts D.C., Brouns S.J.: Planting the seed: teargetrecognition of short guide RNAs. Trends Microbiol., 2014; 22: 74-83
  Google Scholar
• 43. Kurzynska-Kokorniak A., Koralewska N., Pokornowska M., UrbanowiczA., Tworak A., Mickiewicz A., Figlerowicz M.: The manyfaces of Dicer: the complexity of the mechanisms regulating Dicergene expression and enzyme activities. Nucleic Acids Res., 2015; 9:4365-4380
  Google Scholar
• 44. Kwak P.B., Tomari Y.: The N domain of Argonaute drives duplexunwinding during RISC assembly. Nat. Struct. Mol. Biol., 2012;19: 145-151
  Google Scholar
• 45. Leung A.K., Vyas S., Rood J.E., Bhutkar A., Sharp P.A., Chang P.:Poly(ADP-ribose) regulates stress responses and microRNA activityin the cytoplasm. Mol. Cell, 2011; 42: 489-499
  Google Scholar
• 46. Leung A.K., Young A.G., Bhutkar A., Zheng G.X., Bosson A.D.,Nielsen C.B., Sharp P.A.: Genome-wide identification of Ago2 bindingsites from mouse embryonic stem cells with and without maturemicroRNAs. Nat. Struct. Mol. Biol., 2011; 18: 237-244
  Google Scholar
• 47. Leushner P.J., Ameres S.L., Kueng S., Martinez J.: Cleavage ofthe siRNA passenger strand during RISC assembly in human cells.EMBO Rep., 2006; 7: 314-320
  Google Scholar
• 48. Li S.C., Tang P., Lin W.C.: Intronic micro-RNA: discovery and biologicalimplications. DNA Cell Biol., 2007; 26: 195-207
  Google Scholar
• 49. Lingel A., Simon B., Izaurralde E., Sattler M.: Nucleic acid 3’-endrecognition by the Argonaute2 PAZ domain. Nat. Struct. Mol. Biol.,2004; 11: 576-577
  Google Scholar
• 50. Loedige I., Gaidatzis D., Sack R., Meister G., Filipowicz W.: Themammalian TRIM-NHL protein TRIM71/LIN-41 is a repressor ofmRNA function. Nucleid Acids Res., 2013; 41: 518-532
  Google Scholar
• 51. Luteijn M.J., Ketting R.F.: PIWI-interacting RNAs: from generationto transgenerational epigenetics. Nat. Rev. Genet., 2013;14: 523-534
  Google Scholar
• 52. Ma J.B., Ye K., Patel D.J.: Structural basis for overhang-specificsmall interfering RNA recognition by the PAZ domain. Nature, 2004;429: 318-322
  Google Scholar
• 53. Ma J.B., Yuan Y.R., Meister G., Pei Y., Tuschl T., Patel D.J.: Structuralbasis for 5’-end-specific recognition of guide RNA by the A.fulgidus Piwi protein. Nature, 2005; 434: 666-670
  Google Scholar
• 54. Meister G.: Argonaute proteins: functional insights and emergingroles. Nat. Rev., 2013; 14: 447-459
  Google Scholar
• 55. Meister G., Landthaler M., Peters L., Chen P. Y., Urlaub H., LührmannR., Tuschl T.: Identification of novel Argonaute-associatedproteins. Curr. Biol., 2005; 15: 2149-2155
  Google Scholar
• 56. Mi S., Cai T., Hu Y., Chen Y., Hodges E., Ni F., Wu L., Li S., ZhouH., Long C., Chen S., Hannon G.J., Qi Y.: Sorting of small RNAs intoArabidopsis Argonaute complexes is directed by the 5’ terminal nucleotide.Cell, 2008; 133: 116-127
  Google Scholar
• 57. Mochizuki K., Gorovsky M.A.: A Dicer-like protein in Tetrahymenahas distinct functions in genome rearrangement, chromosome segregation,and meiotic prophase. Gene. Dev., 2005; 19: 77-89
  Google Scholar
• 58. Moretti F., Kaiser C., Zdanowicz-Specht A., Hentze M.: PABP andthe poly(A) tail augment microRNA repression by facilitated miRISCbinding. Nat. Struct. Mol. Biol., 2012; 19: 603-608
  Google Scholar
• 59. Nakanishi K., Weinberg D.E., Bartel D.P., Patel D.J.: Structure ofyeast Argonaute with guide RNA. Nature, 2012; 486: 368-374
  Google Scholar
• 60. Nam S., Ryu H., Son W.J., Kim Y.H., Kim K.T., Balch C., NephewK.P., Lee J.: Mg2+ effect on argonaute and RNA duplex by moleculardynamics and bioinformatics implications. PLoS One, 2014; 9:e109745
  Google Scholar
• 61. Nishi K., Nishi A., Nagasawa T., Ui-Tei K.: Human TNRC6A is anArgonaute-navigator protein for microRNA-mediated gene silencingin the nucleus. RNA, 2013; 19: 17-35
  Google Scholar
• 62. Noland C.L., Ma E., Doudna J.A.: siRNA repositioning for guidestrand selection by human Dicer complexes. Mol. Cell, 2011; 43:110-121
  Google Scholar
• 64. Oliver C., Santos J.L., Pradillo M.: On the role of some Argonauteproteins in meiosis and DNA repair in Arabidopsis thaliana. Front.Plant Sci., 2014; 5: 1-10
  Google Scholar
• 65. Olovnikow I., Chan K., Sachidanandam R., Newman D.K., AravinA.A.: Bacterial argonaute samples the transcriptome to identify foreignDNA. Mol. Cell, 2013; 51: 594-605
  Google Scholar
• 66. Peters L., Meister G.: Argonaute proteins: mediators of RNA silencing.Mol. Cell, 2007; 26: 611-623
  Google Scholar
• 67. Pfaff J., Hennig J., Herzog F., Aebersold R., Sattler M., Niessing D.,Meister G.: Structural features of Argonaute GW182 protein interactions.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013; 110: E3770-E3779
  Google Scholar
• 68. Pushpavalli S.N., Sarkar A., Bag I., Hunt C.R., Ramaiah M.J., PanditaT.K., Bhadra U., Pal-Bhadra M.: Argonaute-1 functions as a mitotic regulator by controlling Cyclin B during Drosophila early embryogenesis.FASEB J., 2014; 28: 655-666
  Google Scholar
• 69. Qi H., Ongusaha P.P., Myllyharju J., Cheng D., Pakkanen O., Shi Y.,Lee S.W., Peng J., Shi Y.: Prolyl-4-hydroxylation regulates Argonaute 2 stability. Nature, 2008; 455: 421-424
  Google Scholar
• 70. Reuter M., Chuma S., Tanaka T., Franz T., Stark A., Pillai R.S.: Lossof the Mili-interacting Tudor domain-containing protein-1 activatestransposons and alters the Mili-associated small RNA profile. Nat.Struct. Mol. Biol., 2009; 16: 639-646
  Google Scholar
• 71. Rogers K., Chen X.: Biogenesis, turnover, and mode of action ofplant microRNAs. Plant Cell, 2013; 25: 2383-2399
  Google Scholar
• 72. Ross J.P., Kassir Z.: The varied roles of nuclear argonaute-smallRNA complexes and avenues for therapy. Mol. Ther. Nucleic Acids,2014; 3: e203
  Google Scholar
• 73. Rüdel S., Meister G.: Phosphorylation of Argonaute proteins:regulating gene regulators. Biochem. J., 2008; 413: e7-e9
  Google Scholar
• 74. Rybak A., Fuchs H., Hadian K., Smirnova L., Wulczyn E.A., MichelG., Nitsch R., Krappmann D., Wulczyn F.G.: The let-7 target genemouse lin-41 is a stem cell specific E3 ubiquitin ligase for the miRNApathway protein Ago2. Nat. Cell Biol., 2009; 11: 1411-1420
  Google Scholar
• 75. Sahin U., Lapaquette P., Andrieux A., Faure G., Dejean A.: Sumoylationof human Argonaute 2 at lysine-402 regulates its stability.PLoS One, 2014; 9: e102957
  Google Scholar
• 76. Schirle N.T., MacRae I.J.: The crystal structure of human Argonaute2.Science, 2012; 336: 1037-1040
  Google Scholar
• 77. Shi H., Tschudi C., Ullu E.: An unusual Dicer-like 1 protein fuelsthe RNA interference pathway in Trypanosoma brucei. RNA, 2006;12: 2063-2072
  Google Scholar
• 78. Smalheiser N.R., Gomes O.L.: Mammalian Argonaute-DNA binding?Biol. Direct, Biol. Direct, 2014; 9: 27
  Google Scholar
• 79. Smibert P., Yang S.Jr., Azzam G., Liu J.L., Lai E.C.: Homeostaticcontrol of Argonaute stability by microRNA availability. Nat. Struct.Mol. Biol., 2013; 20: 789-795
  Google Scholar
• 80. Song J.J., Smith S.K., Hannon G.J., Joshua-Tor L.: Crystal structureof Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science,2004; 305: 1434-1437
  Google Scholar
• 81. Stoica C., Carmichael J.B., Parker H., Pare J., Hobman T.C.: Interactionsbetween the RNA interference effector protein Ago1 and 14-3-3 proteins: consequences for cell cycle progression. J. Biol. Chem.,2006; 281: 37646-37651
  Google Scholar
• 82. Swarts D.C., Jore M.M., Westra E.R., Zhu Y., Janssen J.H., SnijdersA.P., Wang Y., Patel D.J., Berenguer J., Brouns S.J., van der Oost J.:DNA-guided DNA interference by prokaryotic Argonaute. Nature,2014; 507: 258-261
  Google Scholar
• 83. Swarts D.C., Koehorst J.J., Westra E.R., Schaap P.J., van der OostJ.: Effects of Argonaute on gene expression in Thermus thermophilus.PLoS One, 2015; 10: e0124880
  Google Scholar
• 84. Swarts D.C., Makarova K., Wanyg Y., Nakanishi K., Ketting R.F.,Koonin E.V., Patel D.J., van der Oost J.: The evolutionary journey ofArgonaute proteins. Nat. Struct. Mol. Biol., 2014; 21: 743-753
  Google Scholar
• 85. Taft R.J., Glazov E.A., Lassmann T., Hayashizaki Y., Carninci P.,Mattick J.S.: Small RNAs derived from snoRNAs. RNA, 2009; 15: 1233-1240
  Google Scholar
• 86. Thieme C.J., Schudoma C., May P., Walther D.: Give it AGO: thesearch for miRNA-Argonaute sorting signals in Arabidopsis thalianaindicates a relevance of sequence positions other than the 5’-positionalone. Front. Plant Sci., 2012; 3: 1-15
  Google Scholar
• 87. Thomson D.W., Pillman K.A., Anderson M.L., Lawrence D.M.,Toubia J., Goodall G.J., Bracken C.P.: Assessing the gene regulatoryproperties of Argonaute-bound small RNAs of diverse genomic origin.Nucleic Acids Res., 2015; 43: 470-481
  Google Scholar
• 88. Tomari Y., Du T., Zamore P.D.: Sorting of Drosophila small silencingRNAs. Cell, 2007; 130: 299-308
  Google Scholar
• 89. Tschudi C., Shi H., Franklin J.B., Ullu E.: Small interfering RNAproducingloci in the ancient parasitic eukaryote Trypanosoma brucei.BMC Genomics, 2012; 13: 427
  Google Scholar
• 90. Turchinovich A., Burwinkel B.: Distinct Ago1 and Ago2 associatedmiRNA profiles in human cells and blood plasma. RNA Biol.,2012; 9: 1066-1075
  Google Scholar
• 91. Wang B., Li S., Qi H.H., Chowdhury D., Shi Y., Novina C.D.: Distinctpassenger strand and mRNA cleavage activities of human Argonauteproteins. Nat. Struct. Mol. Biol., 2009; 16: 1259-1266
  Google Scholar
• 92. Wang D., Zhang Z., O’Loughlin E., Lee T., Houel S., O’Carroll D.,Tarakhovsky A., Ahn N.G., Yi R.: Quantitative functions of Argonauteproteins in mammalian development. Genes Dev., 2012; 26: 693-704
  Google Scholar
• 93. Wang Y., Juranek S., Li H., Sheng G., Tuschl T., Patel D.J.: Structureof an argonaute silencing complex with a seed-containing guideDNA and target RNA duplex. Nature, 2008; 456: 921-926
  Google Scholar
• 94. Wang Y., Juranek S., Li H., Sheng G., Wardle G.S., Tuschl T., PatelD.J.: Nucleation, propagation and cleavage of target RNAs in Agosilencing complexes. Nature, 2009; 461: 754-761
  Google Scholar
• 95. Wang Y., Mercier R., Hobman T.C., LaPointe P.: Regulation ofRNA interference by Hsp90 is an evolutionarily conserved process.Biochim. Biophys. Acta, 2013; 1833: 2673-2681
  Google Scholar
• 96. Wedeles C., Wu M.Z., Claycomb J.M.: Protection of germlinegene expression by the C. elegans Argonaute CSR-1. Dev. Cell, 2013;27: 664-671
  Google Scholar
• 97. Wei W., Ba Z., Gao M., Wu Y., Ma Y., Amiard S., White C.I., RendtlewDanielsen J.M., Yang Y.G., Qi Y.: A role for small RNAs in DNAdouble-strand break repair. Cell, 2012; 149: 101-112
  Google Scholar
• 98. Williams A.E.: Functional aspect of animal microRNAs. Cell. Mol.Life Sci., 2008; 65: 545-562
  Google Scholar
• 99. Willkomm S., Zander A., Gust A., Grohmann D.: A prokaryotictwist on Argonaute function. Life, 2015; 5: 538-553
  Google Scholar
• 100. Winter J., Diederichs S.: Argonaute-3 activates the let-7a passengerstrand microRNA. RNA Biol., 2013; 10: 1631-1643
  Google Scholar
• 101. Woolnough J.L., Atwood B.L., Giles K.E.: Argonaute2 binds directlyto tRNA genes and promotes gene repression in cis. Moll. Cell.Biol., 2015; 35: 2278-2294
  Google Scholar
• 103. Ye X., Huang N., Liu Y., Paroo Z., Huerta C., Li P., Chen S., LiuQ., Zhang H.: Structure of C3PO and mechanism of HUMAN RISCactivation. Nat. Struct. Mol. Biol., 2011; 18: 650-657
  Google Scholar
• 104. Yigit E., Batista P.J., Bei Y., Pang K.M., Chen C.C., Tolia N.H.,Joshua-Tor L., Mitani S., Simard M.J., Mello C.C.: Analysis of the C.elegans Argonaute family reveals that distinct Argonaute family actsequentially during RNAi. Cell, 2006; 127: 747-757
  Google Scholar
• 105. Yuan Y.R., Pei Y., Ma J.B., Kuryavyi V., Zhadina M., MeisterG., Chen H.Y., Dauter Z., Tuschl T., Patel D.J.: Crystal structure of A.aeolicus argonaute, a site-specific DNA-guided endoribonuclease,provides insights into RISC-mediated mRNA cleavage. Mol. Cell,2005; 19: 405-419
  Google Scholar
• 106. Zekri L., Huntzinger E., Heimstädt S., Izaurralde E.: The silencingdomain of GW182 interacts with PABPC1 to promote translationalrepression and degradation of microRNA targets and is requiredfor target release. Mol. Cell. Biol., 2009; 29: 6220-6231
  Google Scholar
• 107. Zeng Y., Sankala H., Zhang X., Graves P.R.: Phosphorylation ofArgonaute 2 at serine-387 facilitates its localization to processingbodies. Biochem J., 2008; 413: 429-436
  Google Scholar
• 108. Zhu L., Masaki Y., Tatsuke T., Li Z., Mon H., Xu J., Lee J.M., KusakabeT.: A MC motif in silkworm Argonaute 1 is indispensible fortranslation repression. Insect Mol. Biol., 2013; 10: 1-11
  Google Scholar
• 109. Zisoulis D.G., Lovci M.T., Wilbert M.L., Hutt K.R., Liang T.Y.,Pasquinelli A.E., Yeo G.W.: Comprehensive discovery of endogenousArgonaute binding sites in Caenorhabditis elegans. Nat. Struct. Mol.Biol., 2010; 17: 173-179
  Google Scholar

Pełna treść artykułu