Abstrakt

Główne źródła reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach to: mitochondrialny łańcuch oddechowy i wybuch oddechowy fagocytów z udziałem oksydazy NADPH. ROS są wytwarzane również w retikulum endoplazmatycznym, peroksysomach, z udziałem oksydazy ksantynowej i oksydazy śródbłonkowej oraz w procesie autooksydacji małych molekuł.W warunkach prawidłowych ROS powstają jako produkt uboczny wieloetapowego procesu fosforylacji oksydacyjnej prowadzącej do syntezy ATP. Wytwarzanie ROS w czasie aktywowanego (np. zakażeniem) wybuchu oddechowego fagocytów odbywa się również wieloetapowo. Głównym enzymem odpowiedzialnym za to zjawisko jest oksydaza NADPH, a powstające ROS są wykorzystywane do walki organizmu z infekcjami.W opracowaniu omówiono aktualny stan wiedzy o budowie i funkcji mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, w którym produktem ubocznym są ROS oraz o budowie oksydazy NADPH, a także funkcji poszczególnych jej elementów w wybuchu oddechowym fagocytów.

Tekst

Reaktywne formy tlenu (reactive oxygen species, ROS) to określenie powszechnie stosowane do opisu wysoko reaktywnych molekuł, które są pochodnymi tlenu czą- steczkowego. ROS mają na powłoce walencyjnej co najmniej jeden niesparowany elektron, który warunkuje ich wysoką reaktywność, a w następstwie destrukcyjne dzia- łanie na komponenty komórkowe, są więc zagrożeniem dla prawidłowego funkcjonowania organizmu.

Organizmy mają układ antyoksydacyjny, do którego należą enzymy antyoksydacyjne oraz antyoksydanty nieenzymatyczne, który redukuje niekorzystne dzia- łanie ROS. Umożliwia on zachowanie stanu równowagi między prooksydantami i antyoksydantami, tak zwanej „redox – homeostazy”. Zachwianie tego stanu równowagi na rzecz oksydantów nosi nazwę „stresu oksydacyjnego” [41,78]. Wykazano jednak, że obecność ROS w niewielkich stężeniach jest niezbędna do prawidłowego przebiegu wielu procesów fizjologicznych [41]. Pozorny paradoks okre- ślający rolę ROS jako związków regulatorowych, a z drugiej strony jako toksycznych produktów metabolizmu komórkowego, można wyjaśnić tym, iż sposób ich dzia- łania zależy głównie od ich stężenia.

Nadmierne wytwarzanie ROS jest uważane za główny czynnik odpowiedzialny za patogenezę wielu chorób, między innymi: nowotworów, chorób serca i układu krą- żenia, chorób niedokrwiennych, cukrzycy, zwłóknienia płuc, reumatoidalnego zapalenia stawów, bezdechu nocnego, chorób neurodegeneracyjnych (Alzheimera, Parkinsona) oraz za proces starzenia się organizmu [13,78,85].

Celem pracy jest przedstawienie głównych miejsc wytwarzania ROS w komórkach oraz aktualnego stanu wiedzy o wewnątrzkomórkowych mechanizmach ich powstawania w warunkach fizjologicznych i w czasie wybuchu oddechowego fagocytów.

Główne źródła reaktywnych form tlenu w organizmie

Wybuch oddechowy fagocytów jest procesem, w któ- rym główną rolę w walce organizmu z infekcjami bakteryjnymi i wirusowymi odgrywa oksydaza NADPH. Enzym ten jest odpowiedzialny za zjawisko zwane „wybuchem oddechowym” fagocytów, którego pierwotnym efektem jest anionorodnik ponadtlenkowy – O2 ˙ˉ, powstający w wyniku transferu elektronów z NADPH, znajdującego się po wewnętrznej stronie błony plazmatycznej, na tlen cząsteczkowy. Aktywacja oksydazy NADPH jest poddana procesom regulacji, które mają na celu ograniczenie nadmiernego, niekontrolowanego wytwarzania ROS, prowadzącego do niebezpiecznego dla funkcjonowania organizmu zjawiska zwanego „stresem oksydacyjnym”. Następujące po sobie procesy fosforylacji, translokacji i zmiany konformacyjne poszczególnych komponentów enzymu, umożliwiają osiągnięcie przez ten kompleks enzymatyczny zdolności do wytwarzania O2 [45,80]

Mitochondrialny łańcuch oddechowy, a właściwie proces fosforylacji oksydacyjnej, który dostarcza ponad 90% adenozynotrifosforanu – ATP, głównego nośnika energii w organizmie, jest równocześnie podstawowym źródłem ROS w komórkach.

Tlen cząsteczkowy jest akceptorem elektronów dla mitochondrialnej oksydazy cytochromowej, enzymatycznego kompleksu kończącego łańcuch transportu elektronów w mitochondriach i katalizującego reakcję czteroelektronowej redukcji O2 do H2 O. Podczas transportu elektronów wzdłuż łańcucha oddechowego dochodzi do niekontrolowanego „wycieku” części elektronów. Jest to wynik pewnej niesprawności mitochondrialnego systemu enzymatycznego. Około 1-4% tlenu zużywanego przez mitochondria ulega jednoelektronowej redukcji do anionorodnika ponadtlenkowego [15,79,91].

Retikulum endoplazmatyczne (RE) – organellum komórkowe, jego podstawową rolą jest biosynteza lipidów i białek, ma również enzymy katalizujące reakcje detoksykacji wielu leków, pestycydów oraz szkodliwych produktów przemiany materii. Do najlepiej poznanych należy cytochrom P-450 i cytochrom b5 (wchodzące w skład tzw. mikrosomalnego łańcucha transportu elektronów), które mogą utleniać nienasycone kwasy tłuszczowe i ksenobiotyki, redukując tlen molekularny do O2 ˙ˉ i H2 O2 [16,92].

Podobny do mikrosomalnego łańcucha transportu elektronów układ enzymatyczny znajduje się w błonach jądra komórkowego, jednak jego funkcja nie jest do końca poznana. Przypuszcza się, że przeciek elektronów z tego łańcucha transportu elektronów może być źró- dłem ROS, które stanowią zagrożenie dla DNA w jądrze komórkowym in vivo [16].

W retikulum endoplazmatycznym w nowo utworzonych białkach dochodzi do utleniania grup tiolowych SH i tworzenia mostków disulfonidowych S-S pomię- dzy cząsteczkami cysteiny. Reakcje te są katalizowane przez obecną w RE oksydoreduktazę ERO1 (Endoplazmatic Reticulum Oxidoreductin) i izomerazę PDI (protein disulfide isomerase) czemu towarzyszy transfer elektronów za pośrednictwem cząsteczki FAD na tlen czą- steczkowy i powstanie H2 O2 [18,20]. Stres oksydacyjny związany z RE może przyczyniać się do inicjacji apoptozy, a także wielu chorób metabolicznych i neurodegeneracyjnych [84].

Peroksysomy mogą zarówno wytwarzać, jak i rozkładać H2 O2 , gdyż zawierają liczne oksydazy flawinowe, katalizujace reakcje, których produktem ubocznym jest H2 O2 [22,51,91]. W zależności od rodzaju tkanek mamy do czynienia z: oksydazą glikolanową, oksydazą D-aminokwasową, oksydazą L-α-hydroksykwasową, oksydazą acylokoenzymu A i oksydazą moczanową [16]. Reakcje oksydacyjne są szczególnie ważne w komórkach wątroby i nerek, gdzie peroksysomy unieszkodliwiają wiele toksycznych związków (np. etanol). Kolejną ważną funkcją reakcji oksydacyjnych, które zachodzą w peroksysomach jest β oksydacja kwasów tłuszczowych. Większość powstającego H2 O2 jest utylizowana przez katalazę znajdującą się w peroksysomach [16,92].

Peroksysomy są również źródłem anionorodnika ponadtlenkowego, wytwarzanego przez oksydazę ksantynową oraz obecny w błonach tych organelli łańcuch transportu elektronów, który składa się z reduktazy NADH i cytochromu b5 . Reduktaza NADH jest akceptorem elektronów wewnątrz peroksysomu, następnie przekazuje elektrony cytochromowi b5 , który zużywa je do redukcji różnych substaratów lub przekazuje je na tlen cząsteczkowy, co prowadzi do produkcji anionorodniaka ponadtlenkowego [15].

Oksydaza ksantynowa wraz z innymi rozpuszczalnymi enzymami, takimi jak: oksydaza aldehydowa, dehydrogenaza dihydroorotanowa, dioksygenaza tryptofanowa mogą katalizować reakcje, w których powstają ROS [16]. Oksydaza ksantynowa jest enzymem, który nie tylko katalizuje reakcje utleniania ksantyny do kwasu moczowego, lecz również reakcje utleniania puryny do hipoksantyny i hipoksantyny do ksantyny. Katalizuje również reakcje utleniania aldehydów do kwasów karboksylowych. Akceptorem elektronów w wymienionych reakcjach jest tlen cząsteczkowy, ulegający jedno- lub dwuelektronowej redukcji do O2 ˙ˉ i H2 O2 [15,92].

Autooksydacja małych molekuł: dopaminy, noradrenaliny, flawin, tioli i hydrochinonów może prowadzić do produkcji ROS (w większości przypadków do uwalniania O2 ˙ [16,92]. Sugeruje się, że samoutlenianie dopaminy do melaniny, przyczynia się do postępującego obumierania neuronów substancji czarnej mózgu w chorobie Parkinsona, a także w procesach starzenia się organizmu [3,21,38].

Oksydazy śródbłonowe Nox redukujące tlen czą- steczkowy do O2 ˙ˉ, podobne, jednak nieidentyczne z katalityczną podjednostką gp91phox/NOX2 fagocytarnej oksydazy NADPH, występują m.in. w komórkach płuc, nerek, okrężnicy i tarczycy, a także w komórkach nabłonka, śródbłonka, fibroblastach, chondrocytach, a także w mięśniach gładkich naczyń krwionośnych [16,45,111]. W ostatnich latach odkryto 6 homologów cytochromowej podjednostki NOX2: NOX1, NOX3, NOX4, NOX5, DUOX1 i DUOX2 [17,75]. Są to flawocytochromy, które przenoszą elektrony głównie z NADPH na O2 .

Funkcja niefagocytarnych oksydaz NADPH należących do rodziny NOX, pomimo wielu podobieństw w budowie, różni się znacząco od roli oksydazy występującej w komórkach fagocytów. ROS generowane w komórkach niefagocytujących są zaangażowane głównie w procesy komunikacji wewnątrzkomórkowej, jak również międzykomórkowej. Sugeruje się, że oksydazy NOX zapewniają warunki umożliwiające transport kationów skutkujący zmianami pH, co umożliwia przepływ sygnału i prawidłowe funkcjonowanie komórek [16].

Pierwszym zidentyfikowanym homologiem podjednostki gp91phox w komórkach ssaków była niefagocytarna oksydaza NADPH – NOX1 występująca w komórkach śródbłonka i komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych, a także w macicy, gruczole krokowym i w żołądku [108]. Podjednostka NOX1 występuje również we wszystkich komórkach okrężnicy, a szczególnie w komórkach nabłonkowych, jednak jej fizjologiczna rola w jelicie grubym nie jest do końca poznana [53,71]. Wykazano natomiast, iż oksydaza NOX1 przeciwdziała nadciśnieniu tętniczemu indukowanemu angiotensyną II [39,87].

Niefagocytarna oksydaza NOX1 tworzy heterodimer z jednostką p22phox [5,60,72]. Aktywacja NOX1 wymaga obecności białek regulatorowych Noxo1 (Nox organizer 1) i Noxa1 (Nox activator 1), homologów jednostek p47phox i p67phox [14,28,54]. Podobnie jak w fagocytarnej oksydazie ważną rolę w aktywacji NOX1 odgrywa drobnocząsteczkowe białko Rac. Usprawnia ono interakcję NOX1 z aktywatorem Noxa 1 [90]. W komórkach ssaków występują trzy homologi tego białka: wszechobecne Rac1, Rac2 – głównie w komórkach mieloidalnych i Rac3 w komórkach nerwowych [16].

Wytwarzanie ROS w wybuchu oddechowym fagocytów

Aktywacja komórek fagocytujących (granulocytów, monocytów, makrofagów), która jest wynikiem zakażenia ciała gospodarza przez bakterie, grzyby i pasożyty, prowadzi do produkcji anionorodnika ponadtlenkowego – O2 ˙ˉ. Anionorodnik ponadtlenkowy jest prekursorem innych, bardziej efektywnych ROS, które są wykorzystywane przez fagocyty do zabijania, atakujących komórki gospodarza, mikroorganizmów [58,77,93,96,100].

W 1933 r. po raz pierwszy Baldridge i Gerard zaobserwowali, że komórki fagocytujące, a w szczególności granulocyty obojętnochłonne, w czasie fagocytozy zużywają zwiększoną ilość tlenu [13]. Pierwotnie sugerowano, że zjawisko to wiąże się ze wzrostem zapotrzebowania energetycznego związanego z przebiegiem fagocytozy, a w związku z tym ze wzrostem intensywności oddychania miochondrialnego. Dopiero w 1961 r. Iyer, Islami Quastel wskazali, że zwiększone pobieranie tlenu w czasie fagocytozy jest związane z produkcją nadtlenku wodoru – H2 O2 , który wykazuje właściwości bakteriobójcze [70]. Powstający H2 O2 już wtedy nie był uważany za jedyny czynnik w pełni odpowiedzialny za walkę z mikroorganizmami, a jedynie stanowił jeden z wielu związków należących do arsenału wykorzystywanego przez fagocyty do zabijania bakterii i grzybów. Zjawisko związane ze wzmożoną konsumpcją tlenu towarzyszącą fagocytozie, jest ściśle związane z przekształcaniem większości pochłanianego przez neutrofile i monocyty tlenu. Zostało to opisane w 1984 r. przez Babiora i nazwane „wybuchem oddechowym” [10].

Anionorodnik ponadtlenkowy – O2 ˙ˉ jest pierwotnym, mało toksycznym produktem „wybuchu oddechowego” fagocytów, przez co nie jest wykorzystywany do zabijania mikroorganizmów, lecz ulega spontanicznej dysmutacji do nadtlenku wodoru – H2 O2 . Enzymem katalizującym reakcję dysmutacji jest dysmutaza ponadtlenkowa – SOD, dzięki której efektywność tego procesu jest niezwykle wysoka (wzrasta ponad 104 razy) [45,57,96].

2O2 ˙ˉ + 2H+ → H2 O2 + O2

SOD─Cu+ + O2 ˙ˉ+2H+ → SOD─Cu2+ + H2 O2 .

Nadtlenek wodoru nie jest wolnym rodnikiem, jest jednak związkiem bardziej stabilnym niż O2 ˙ˉ, mającym zdolność migracji przez błony komórkowe. Podobnie jak anionorodnik ponadtlenkowy, nie należy do związków bardzo toksycznych i jedynie w dużych stężeniach wykazuje właściwości bakteriobójcze [68]. Większość H2 O2 produkowanego przez neutrofile jest zużywana przez mieloperoksydazę – MPO. Mieloperoksydaza jest enzymem stanowiącym podstawowy składnik azurochłonnych ziarnistości neutrofila. W procesie degranulacji dochodzi do uwalniania MPO do wnętrza fagosomu, gdzie wraz z nadtlenkiem wodoru i jonami Clˉ tworzy układ odpowiedzialny za produkcję bardzo efektywnego arsenału związków silnie bakteriobójczych, do którego należą: kwas podchlorawy, chloroaminy, rodnik hydroksylowy, tlen singletowy oraz ozon. Pierwotnym produktem reakcji utleniania jonów chlorkowych Clˉ przez H2 O2 , w reakcji katalizowanej przez MPO, jest bardzo silny oksydant (najbardziej bakteriobójczy związek produkowany przez neutrofile) kwas podchlorawy – HOCl [73,118].

MPO

H2 O2 + Clˉ + H+ → HOCl + H2 O.

Kwas podchlorawy oprócz swoich wyjątkowo silnych właściwości bakteriobójczych jest prekursorem dla chloramin. Może reagować z wieloma związkami zawierającymi grupy aminowe R-NH2 , tworząc pochodne azotowo-chlorowe typu monochloramin R-NHCl i dichloramin R-NCl2 , które są trwalsze od podchlorynów i silnie bakteriobójcze [74,97].

OClˉ + R-NH2 → R-NHCl + OH ˉ

2OClˉ + R-NH2 → R-NCl2 + 2OH ˉ

Kolejnym produktem aktywowanych fagocytów jest rodnik hydroksylowy – OH˙ , silny oksydant, który powstaje w reakcji Habera-Weissa między anionorodnikiem ponadtlenkowym i nadtlenkiem wodoru [73,118].

O2 ˙ˉ + H2 O2 → OH˙ + OHˉ + O2.

Bardziej skuteczna w wytwarzaniu rodnika hydroksylowego jest reakcja Fentona, zachodząca przy katalitycznym udziale jonów żelaza Fe2+/Fe3+ [36].

Mechanizm powstawania OH˙ w układach biologicznych zakłada istnienie cyklu dwóch reakcji: jedna z nich jest właściwą reakcją Fenona:

H2 O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH ˉ +OH˙,

druga natomiast to reakcja regenerująca jony Fe2+, drogą redukcji przez anionorodnik ponadtlenkowy jonu żelaza Fe3+, powstającego w wyniku pierwszej reakcji:

O2 ˙ˉ + Fe3+ → O2 + Fe2+.

Sumując oba równania, otrzymujemy prezentowaną wcześniej reakcję Habera-Weissa katalizowaną przez jony żelaza:

Fe2+/Fe3+

O2 ˙ˉ + H2 O2 → OH˙ + OHˉ + O2 .

Reakcję tę mogą katalizować nie tylko jony żelaza, również jony miedzi (Cu+ /Cu2+), a także innych metali przejściowych. Występowanie nawet w bardzo małych stężeniach jonów Fe lub Cu w płynach ustrojowych jest wystarczające do produkcji rodnika hydroksylowego [15].

Wytwarzanie rodnika hydroksylowego przez aktywowane neutrofile zachodzi również dzięki mechanizmowi zależnemu od MPO, które katalizuje powstawanie HOCl w reakcji utleniania jonów Clˉ przez H2 O2 , a następnie kwas podchlorawy reaguje z anionorodnikiem ponadtlenkowym, tworząc rodnik hydroksylowy OH [102], zgodnie z reakcją:

HOCl + 2O2 ˙ˉ → OH˙ + O2 + Clˉ

Wytwarzanie OH˙ jest hamowane w wyniku działania dysmutazy ponadtlenkowej – SOD, przekształcają- cej anionorodnik ponadtlenkowy w nadtlenek wodoru, a także w wyniku działania katalazy rozkładającej nadtlenek wodoru oraz w wyniku działania azydków, które są inhibitorami mieloperoksydazy [73].

Dzięki systemowi zależnemu od MPO w neutrofilach dochodzi również do powstania tlenu singletowego (1 O2 ), wysoce energetycznej formy tlenu, której dwa niesparowane elektrony na zewnętrznej orbicie posiadają przeciwny spin i dzięki temu mogą bardzo szybko reagować z innymi parami elektronów. Tlen singletowy powstaje w reakcji kwasu podchlorawego z nadtlenkiem wodoru [45,106]:

HOCl + H2 O2 → 1 O2 + H2 O + Clˉ + H+ .

W ostatnim czasie również ozon – O3 jest uważany za produkt wybuchu oddechowego neutrofili. Do syntezy ozonu jest wykorzystywany 1 O2 (tworzony przez system zależny od MPO). Ozon posiada właściwości bakteriobójcze, jednak jego toksyczność w stosunku do mikroorganizmów w powiązaniu z nadtlenkiem wodoru, jest wyraźnie wyższa niż w przypadku działania tych związków oddzielnie [11,116].

Oksydaza NADPH

W 1964 r. Rossi i Zatti po raz pierwszy zasugerowali, że enzymem odpowiedzialnym za wybuch oddechowy fagocytów jest oksydaza NADPH, a w 1973 r. Babior, Kipnes i Curnutte ogłosili, że pierwotnym produktem oksydazy NADPH jest anionorodnik ponadtlenkowy, powstający zgodnie z reakcją [8,98]:

NADPH + O2 → O2 ˙ˉ + NADP+ + H+

Oksydaza NADPH jest śródbłonowym enzymem, dzięki któremu dochodzi do przeniesienia elektronu ze zredukowanej formy fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego – NADPH powstającego w cyklu pentozowym i znajdującego się po wewnętrznej stronie błony plazmatycznej, na tlen cząsteczkowy, znajdujący się w płynie zewnątrzkomórkowym lub we wnętrzu tworzącego się fagosomu, powodując jednoelektronową redukcję cząsteczki tlenu do anionorodnika ponadtlenkowego O2 ˙ˉ[15,17]. Oksydaza NADPH to enzym składający się z 5 podjednostek: p40phox, p47phox, p67phox, p22phox i gp91phox (zwanej również NOX2).

Nazewnictwo poszczególnych jednostek oksydazy NADPH jest związane z ich budową chemiczną, gdzie: p – protein, gp – glycoprotein, natomiast liczba występująca po p lub gp – oznacza masę cząsteczkową podjednostki. Symbol phox – jest związany z przynależnością komórkową i pochodzi od phagocyte oxidase [11,45].

W komórkach fagocytów będących w stanie spoczynku 3 z 5 podjednostek: p40phox, p47phox i p67phox znajdują się w cytosolu, gdzie tworzą kompleks zawierający po jednej kopii każdej podjednostki [80,88,89]. Dwie pozostałe jednostki: p22phox i gp91phox występują w postaci heterodimeru, zawierającego również po jednej kopii każdej podjednostki i są zlokalizowane w nieaktywnych fagocytach w 85% w błonach ziarnistości swoistych – wtórnych i w błonach pęcherzyków wydzielniczych [45]. Natomiast pozostałe 15% znajduje się w błonie plazmatycznej, gdzie wraz z jedną cząsteczką dinukleotydu flawinoadeninowego – FAD i dwoma różnymi ugrupowaniami hemowymi tworzą cytochrom b558 [11,56,102]. Cząsteczka FAD w cytochromie b558 pełni rolę miejsca wiążącego cząsteczkę NADPH, a grupy hemowe biorą udział w transporcie elektronów na tlen. Jedna z grup hemowych selektywnie wiąże się z podjednostką gp91phox, a druga łączy gp91phoxz p22phox, przez co mogą być niezbędne w czasie łączenia się oksydazy NADPHw aktywny kompleks enzymatyczny [1,37,55,56].

Aktywacja oksydazy NADPH powoduje przemieszczenie całej puli cytochromu b558 do błon plazmatycznych lub fagosomalnych, gdzie dochodzi do połączenia się jednostek cytosolowych z cytochromem b558 i prawdopodobnie białkiem Rap1A [17,74,101]. Translokacja jednostek cytosolowych jest poprzedzona fosforylacją niektórych białkowych elementów oksydazy [23]. Utrzymanie oksydazy NADPH w stanie aktywnym wymaga stałego przemieszczania się podjednostek cytosolowych do błony fagosomalnej lub plazmatycznej, natomiast rozdzielenie jednostek cytosolowych od cytochromu b558 gwarantuje, że oksydaza NADPH jest nieaktywna w komórkach fagocytów będących w stanie spoczynku [11,113].

Oprócz wymienionych białkowych podjednostek cytosolowych, w cytoplazmie występują również drobnocząsteczkowe białka Rac2 i Rac1 niezbędne w procesie aktywacji oksydazy NADPH [47]. Białka Rac nie są uwa- żane za podjednostki oksydazy NADPH, ponieważ odpowiadają też za regulację innych funkcji komórkowych, a w szczególności organizację cytoszkieletu i proces chemotaksji [17,72]. Białko Rac2 należy do rodziny Rho bia- łek G i jest dominującym białkiem wiążącym nukleotydy guaninowe w ludzkich neutrofilach [47,55,77].

W fagocytach będących w stanie spoczynku Rac2 wystę- puje w kompleksie z cząsteczką GDI (dissociation inhibitor, GDP), która jest inhibitorem dysocjacji białka Rac2 i cząsteczki GDP. Aktywacja zaś komórek fagocytujących prowadzi do rozpadu kompleksu Rac2 – GDP-disociation inhibitor, czemu towarzyszy przekształcenie cząsteczki GDP w GTP. Białko Rac2 związane z GTP migruje do błony fagosomalnej lub plazmatycznej, co w konsekwencji umożliwia transfer cytochromu b558, znajdującego się w błonach pęcherzyków wydzielniczych do błony plazmatycznej [1,11,77,99,105]. W błonie plazmatycznej Rac2 wiąże się bezpośrednio z p67phox, nie łączy się natomiast z jednostkami p40phox i p47phox [55,83].

Interakcja między aktywnym (związanym z GTP) biał- kiem Rac i p67phox jest podstawowa dla aktywacji oksydazy NADPH, gdyż stanowi swego rodzaju rusztowanie umożliwiające dokładne zakotwiczenie białka p67phox w cytochromie b558 [55]. Prawidłowe oddziaływanie między tymi jednostkami prowadzi do zmian konformacyjnych w podjednostce p67phox,, co wpływa na jej aktywację [99].

W białku Rac2 zidentyfikowano dwa ważne dla aktywności oksydazy NADPH regiony: „effector region” odpowiedzialny za wiązanie p67phox i „insert region”, który prawdopodobnie odpowiada za interakcję z cytochromem b558 [93].

W cytochromie b558 cząsteczka FAD i 2 grupy hemowe stanowią ścieżkę redox, umożliwiającą transport elektronów ze zredukowanego NADPH znajdującego się w cytosolu, poprzez błonę plazmatyczną na tlen cząsteczkowy [17,34,55,99,115].

Transfer elektronów jest wieloetapowy. Początkowo elektrony z NADPH są przenoszone na cząsteczkę FAD, a proces jest regulowany przez podjednostkę p67phox. Następnie pojedynczy elektron ze zredukowanego FADH2 przechodzi na cząsteczkę hemu znajdującą się po wewnętrznej stronie membrany. Ponieważ atom żelaza w grupie hemowej może przyjąć tylko pojedynczy elektron, konieczne jest przed przyjęciem drugiego elektronu z częściowo zredukowanej cząsteczki FADH dalsze przeniesienie elektronu na drugi (zewnętrzny) hem, a następnie na tlen, co prowadzi do utworzenia anionorodnika ponadtlenkowego [30,32,104]. Cząsteczka FAD jest uważna za element niezbędny w transporcie elektronów. Aktywność oksydazy NADPH zostaje utracona, gdy cytochrom b558 zostaje pozbawiony cząsteczki FAD (co wynika z zablokowania ścieżki transportu elektronów) i przywrócona powtórnie, kiedy nastąpi rekonstytucja cytochromu b558 cząsteczką FAD. Poza tym aktywność oksydazy zostaje utracona w wyniku działania antagonistów FAD, takich jak: deaza-FAD i DPI (jodonian dwufenylowy) [30,55,61,102]. W komórkach będących w stanie spoczynku FAD znajduje się w stanie równowagi między formą związaną i niezwiązaną z cytochromem b558. Najprawdopodobniej dzięki tak luźnemu i niedokładnemu powiązaniu cząsteczki FAD w cytochromie b558, przypadkowe powstawanie ROS jest ograniczone, gdyż mało prawdopodobny wydaje się przepływ elektronów w tak niedoskonałym układzie, chociaż dalsze badania wydają się konieczne, by określić mechanizm, dzięki któremu FAD może działać jako regulator aktywności oksydazy NADPH [30,61].

Pod wpływem działania czynników aktywujących komórki fagocytów, struktura miejsca wiązania czą- steczki FAD w cytochromie b558 ulega modyfikacji, co skutkuje ścisłym połączeniem, wcześniej wolnego FAD z cytochromem b558. Następstwem tego ścisłego powią- zania jest przyłączenie białkowych podjednostek cytosolowych, które odgrywają znaczącą rolę w utrzymaniu cząsteczki FAD w cytochromie b558 w aktywnej oksydazie. Maskowanie wiązania cząsteczki FAD w cytochromie przez jednostki cytosolowe gwarantuje wysoką stabilność aktywnej oksydazy, między innymi przez osłanianie miejsca wiązania FAD i grup hemowych przed działaniem licznych związków chemicznych, powszechnie uważnych za inhibitory transportu elektronów, do których należą: cyjanki, azydki, tlenek węgla i pirydyna [30,69,86].

Ważnym czynnikiem umożliwiającym poznanie fizjologicznego znaczenia poszczególnych jednostek białkowych dla aktywności oksydazy NADPH było odkrycie przewlekłej choroby ziarniakowej – CGD (chronic granulomatous disease), objawiającej się bardzo ciężkimi i nawracającymi infekcjami bakteryjnymi i grzybiczymi. Choroba charakteryzuje się brakiem lub znaczącym ograniczeniem aktywności enzymatycznej oksydazy NADPH, a w związku z tym zahamowaniem „wybuchu oddechowego” w komórkach fagocytów. Przyczyną jest całkowita nieobecność, niedobór lub zmiany strukturalne w budowie białek, będących elementami składowymi oksydazy NADPH [7,64,89].

Białkowa podjednostka cytosolowa p67phox przez interakcję z białkiem Rac i cytochromem b558 wpływa na aktywność oksydazy NADPH [34,44,99]. Jest ona niezbędnym elementem, gdyż umożliwia transport elektronów do cząsteczki FAD w cytochromie b558, nawet w przypadku braku podjednostki p47phox [30,58,88,90]. Stwierdzono również, że w tej jednostce znajduje się miejsce wiązania dla NADPH, aczkolwiek miejsca takie występują również w cytochromie b558 [28,33,82,105]. Podjednostka p67phox w komórkach w stanie spoczynku stale ulega procesom fosforylacji i defosforylacji [35,102]. Aktywacja neutrofili wiąże się również z procesem fosforylacji p67phox, jednak jej znaczenie dla aktywacji oksydazy NADPH nadal pozostaje niejasne [34,89]. Na podstawie obserwacji pacjentów z CGD, którzy posiadają mutację w jednostce p67phox stwierdzono, że nie ma ona zdolności wiązania z białkiem Rac2, a ponadto nie dochodzi u nich do przemieszczania się jednostek cytosolowych do błony plazmatycznej w wyniku aktywacji oksydazy [8]. Dane te nie są jednak jednoznaczne, gdyż według innych źró- deł brak p67phox uniemożliwia tylko przemieszczanie się białka p40phox, a translokacja i fosforylacja p47phox pozostaje niezmieniona [12,30,88,94,104,114].

Jednostka p47phox w głównej mierze jest odpowiedzialna za transport kompleksu cytosolowego do błon plazmatycznych w czasie aktywacji oksydazy NADPH i jest swego rodzaju łącznikiem między cytchromem b558 i podjednostkami cytosolowymi [17,75]. Pierwszym etapem aktywacji jest fosforylacja trzech reszt serynowych w autoinhibitorowym regionie w podjednostce p47phox prowadząca do zmian konformacyjnych, odsłaniających domenę PX odpowiedzialną za wiązanie z difosforanem fosfatydyloinozytolu, przez co możliwe jest połączenie z p22phox [6,81,99,114]. Proces fosforylacji p47phox to mechanizm umożliwiający kontrolę tworzenia aktywnego kompleksu enzymatycznego oraz zapobiegający niezamierzonej aktywacji enzymu. Po przyłączeniu grup fosforanowych do reszt serynowych następuje przemieszczenie podjednostki p47phx połączonej z p67phox i p40phox do błony plazmatycznej, w celu współdziałania z elementami błonowymi [6,44].

Brak podjednostki p47phox jest przyczyną występowania jednej z form CGD. U osób pozbawionych podjednostki p47phox białka p67phox, p40phox i Rac2 tracą zdolność do przemieszczania się z cytosolu do błony plazmatycznej w wyniku aktywacji drogą receptorową chemotaktycznym peptydem bakteryjnym – fMLP i estrem forbolu – PMA, który jest bezpośrednim aktywatorem kinazy białkowej C [43,103]. Jednak w doświadczalnych układach bezkomórkowych, zawierających wyizolowany cytochrom b558 i podjednostki cytosolowe stwierdzono, że obecność podjednostki p47phox nie jest konieczna do aktywacji oksydazy pod warunkiem, że w układach tych podjednostka p67phox i białko Rac2 występują w wysokich stężeniach. Obecność p47phox powoduje jednak prawie 100-krotny wzrost siły wiązania poszczególnych podjednostek w aktywnej oksydazie [4,41,52,76,83].

Rola podjednostki 40phox w aktywacji oksydazy NADPH jest słabo poznana [25,88]. Przypuszczano, iż najprawdopodobniej pełni ona rolę regulatorową, jednak wyniki badań nie są jednoznaczne. Z jednej strony ufosforylowana podjednostka p40phox hamuje aktywność oksydazy, natomiast według innych doniesień fosforylacja tej jednostki przez kinazę białkową C (PKCδ) jest niezbędna dla przemieszczenia się podjednostki p47phox do błon fagosomu i osiągnięcie pełnej aktywacji oksydazy w komórkach neutrofili myszy [29,61,63,82].

Do niedawna nie było informacji o przypadku braku jednostki p40phox ani ważnych pod względem funkcjonalnym zmian w budowie tego elementu oksydazy NADPH w jakiejkolwiek postaci CGD [19,102]. Jednak ostatnio opisano przypadek pacjenta z CGD, u którego stwierdzono mutację w podjednostce p40phox. Przypadek ten potwierdza, iż p40phox poprzez wiązanie trifosforanu fosfatydyloinozytolu (IP3) odgrywa ważną rolę w aktywacji oksydazy NADPH w czasie fagocytozy, umożliwiając połączenie podjednostek cytosolowych z membraną plazmatyczną [29,56,95,99].

Lipidy błony plazmatycznej, oprócz fosforylacji cytosolowych podjednostek, biorą udział w regulacji aktywności oksydazy NADPH [23,69]. Wytwarzanie diacyloglicerolu i inozytolotrifosforanu – IP3 (odpowiadającego za uwalnianie Ca2+ z magazynów wewnątrzkomórkowych) przez fosfolipazę C prowadzi do aktywacji kinazy białkowej C i fosforylacji podjednostki p47phox oraz innych elementów oksydazy [2,83].

Mitochondria – główne źródło reaktywnych form tlenu

Mitochondria to główne źródło reaktywnych form tlenu (ROS) w organizmach aerobowych. Zdecydowaną większość komórkowej produkcji ROS, szacowaną nawet na 90%, przypisuje się właśnie mitochondriom [12,65,91]. W warunkach prawidłowych wytwarzanie ROS jest nieuniknione i może przyczyniać się do narastania „stresu oksydacyjnego”, ale cząsteczki te mogą pełnić istotną rolę w redox-zależnych procesach przepływu informacji [16,26,41,94,112].

W warunkach patologicznych powstawanie ROS jest wyraźnie wzmożone. Nadmierna ich ilość poprzez oksydację białek, lipidów i DNA przyczynia się do uszkodzenia komórek, co prowadzi do zaburzeń ich funkcji biologicznych, a w konsekwencji do licznych chorób dotykających niemal wszystkich części ludzkiego organizmu, a w szczególności dwóch najważniejszych narządów, tj.: serca i mózgu [6,46,48,67,81,103]. Ponadto, ROS u ludzi zdrowych przyczyniają się do procesów starzenia się organizmu [42,108]. Dotychczasowe wyniki badań śledzących proces produkcji ROS w mitochondriach nie pozwalają jednoznacznie stwierdzić czy w warunkach patologicznych akumulacja ROS uwalnianych podczas fosforylacji oksydacyjnej jest pierwotnym czynnikiem, czy też konsekwencją innych dysfunkcji komórkowych.

W mitochondriach jest kontynuowany proces katabolizmu związków (węglowodanów, białek i lipidów) będących źródłem energii w organizmie. Obejmuje on przemiany reszt acetylowych w cyklu kwasów trikarboksylowych (cykl Krebsa, cykl kwasu cytrynowego). Wynikiem jest powstanie wysokoenergetycznych związków NADH i FADH2 (tzw. równoważników wodorowych), będących donorami elektronów, które są przenoszone za pośrednictwem mitochondrialnego łańcucha oddechowego na tlen cząsteczkowy. Wieloetapowa, czteroelektronowa redukcja tlenu prowadzi do powstania H2 O [79]. Jednak niewielka część elektronów przedwcześnie „wycieka” z łańcucha oddechowego, powodując jednoelektronową redukcję tlenu i powstanie anionorodnika ponadtlenkowego [4,15,49,91].

Budowa mitochondrialnego łańcucha oddechowego

W budowie mitochondrialnego łańcucha oddechowego strukturalnie i funkcjonalnie wyróżnić można 4 złożone, związane z wewnętrzną błoną mitochondrialną kompleksy białkowe:

kompleks I – oksydoreduktaza NADH: ubichinon (dehydrogenaza NADH),

kompleks II – oksydoreduktaza bursztynian: ubichinon (dehydrogenaza bursztynianowa),

kompleks III – oksydoreduktaza ubichinon: utleniony cytochrom c (kompleks cytochromów b – c1 ),

kompleks IV – oksydaza cytochromowa (oksydoreduktaza zredukowany cytochrom c: tlen).

Poszczególne ogniwa łańcucha oddechowego nie kontaktują się ze sobą bezpośrednio. Elementami spinającymi poszczególne kompleksy są: zakotwiczony w wewnętrznej membranie mitochondrialnej wysoce hydrofobowy ubichinon (Q) i rezydujący w przestrzeni międzymembranowej hydrofilowy cytochrom c [79].

Kompleks I (oksydoreduktaza NADH: ubichinon) jest pierwszym ogniwem mitochondrialnego łańcucha oddechowego, katalizującym pierwszy etap fosforylacji oksydacyjnej zachodzącej w mitochondriach. Enzym ten katalizuje utlenianie NADH w matriks i przeniesienie 2 elektronów z NADH za pośrednictwem mononukleotydu flawinowego FMN i serii centrów żelazowo-siarkowych na ubichinon, znajdujący się w wewnętrznej membranie mitochondrialnej [25,66]. Cząsteczka FMN ulega redukcji do FMNH2 , następnie elektrony przechodzą na centra żelazowo-siarkowe, które jednorazowo mogą przyjąć tylko jeden elektron, czemu towarzyszy redukcja jonów żelaza: Fe3+→Fe2+. Utlenianie cząsteczki FMNH2 jest moż- liwe jedynie dzięki dwom jednoelektronowym reakcjom, zachodzącym po sobie i prowadzącym do wytworzenia produktu przejściowego semichinonu – Q˙ (będącego wolnym rodnikiem), którego dalsza redukcja prowadzi do powstania cząsteczki hydrochinonu (ubichinolu) – QH2 . Przeniesieniu 2 elektronów z NADH na ubichinon towarzyszy przeniesienie 4 protonów z matriks do przestrzeni międzybłonowej, skutkujące wytworzeniem w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej elektrochemicznego gradientu protonowego, tzw. siły protonomotorycznej (∆p). Siła protonomotoryczna jest komponentą dwóch składników: gradientu pH (gradientu chemicznego) oraz elektrycznego potencjału transbłonowego (∆Ψ), wynikającego z różnicy rozmieszczenia ładunków elektrycznych po obu stronach błony. Elektrochemiczny gradient protonowy jest formą tymczasowego magazynowania energii, stopniowo uwalnianej w czasie przepływu elektronów wzdłuż łańcucha oddechowego, który następnie jest wykorzystywany do napędzania syntazy ATP (transportującej H+ ) i tworzenia w obecności ADP i Pi wysokoenergetycznego adenozynotrifosforanu – ATP. Kompleks I generuje około 40% całkowitego gradientu protonowego, jaki jest tworzony w wyniku utleniania NADH przez cały łańcuch oddechowy [62,98].

Kompleks I jest największym kompleksem proteinowym zakotwiczonym w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Jest multikompleksem zbudowanym z 45 polipeptydów, o całkowitej masie cząsteczkowej ok. 1 MDa (980 kDa), niekowalencyjnie związanych z mononukleotydem flawinowym FMN oraz centrami żelazowo-siarkowymi [24,62,65]. Kompleks ma kształt litery L, z jednym hydrofobowym łańcuchem, zakotwiczonym w błonie mitochondrialnej i drugim ramieniem hydrofilowym, skierowanym w kierunku mitochondrialnej matriks [19,63,66,92,117].

7 spośród 45 subkompleksów jest kodowane przez mitochondrialne DNA, a pozostałe 38 to produkty jądrowego genomu, które z cytoplazmy są przenoszone do mitochondrium. Podjednostki kodowane przez mitochondrialne DNA i 7 podjednostek kodowanych przez jądrowe DNA, tworzą tzw. „core subunits” i stanowią katalityczny rdzeń enzymu. Wymienione podjednostki wiążą się z FMN, 8 lub 9 centrami żelazowo-siarkowymi i jedną lub więcej cząsteczkami ubichinonu [62,98].

Pozostałe 31 podjednostek polipeptydowych, które są określane jako tzw. ”supernumerary”, nie bierze bezpośrednio udziału w transporcie elektronów, jak również w generowaniu gradientu protonowego. Najprawdopodobniej odgrywają one ważną rolę w utrzymaniu stabilności kompleksu, jednak funkcja większości z nich nie została do tej pory poznana [63,66]. Dzięki dysocjacji kompleksu I odkryto, że miejsce wiązania cząsteczki NADH i wszystkich centrów redoks (tzn. FMN oraz centrów żelazowo-siarkowych) znajdują się w peryferyjnym ramieniu, natomiast struktury uczestniczące w mechanizmie „pompowania” protonów do przestrzeni międzymembranowej, najprawdopodobniej są usytuowane w hydrofobowym łańcuchu ściśle zwią- zanym z błoną mitochondrialną.

W kompleksie I występuje 8-9 centrów żelazowo-siarkowych: N1a, N1b – [2Fe-2S)] i N2, N3, N4, N5, N6a, N6b i N7 – [4Fe-4S]. U wielu gatunków w dehydrogenazie NADH kompleks N7 nie występuje, stąd najprawdopodobniej nie jest on częścią ścieżki przepływu elektronów [95,98].

Kompleks II – oksydoreduktaza bursztynian: ubichinon pełni w komórkach podwójną funkcję, gdyż jest to enzym katalizujący reakcję utleniania bursztynianu do fumaranu w przemianach cyklu kwasu cytrynowego (cykl Krebsa), jest również częścią mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, gdzie katalizuje reakcję utleniania bursztynianu do fumaranu, połączoną z redukcją ubichinonu (Q) do hydrochinonu (ubichinolu – QH2 ).

W kompleksie II wyróżnić można 2 części składowe: podjednostkę hydrofilową składającą się z flawoproteiny – SdhA, w której kowalencyjnie związana cząsteczka dinukleotydu flawinoadeninowego FAD jest częścią katalitycznego centrum enzymu oraz białko żelazowo- -siarkowe – SdhB, w którym znajdują się trzy centra żelazowo-siarkowe: [2Fe-2S]2+1+, [4Fe-4S] 2+1+, [3Fe-4S]1+0, stanowiące ścieżkę transportu elektronów z cząsteczki FAD na związany z błoną mitochondrialną ubichinon.

Budowa cząsteczki flawoproteinowej i białka żelazowo- -siarkowego w podjednostce hydrofilowej kompleksu II charakteryzuje się dużym stopniem podobieństwa u róż- nych gatunków. Część hydrofilowa kompleksu wiąże się z błoną mitochondrialną dzięki interakcji białka SdhB z dwiema hydrofobowymi podjednostkami SdhC i SdhD, które tworzą w komórkach ssaków cytochrom b, zawierający cząsteczkę hemu i kotwiczą cały enzym w błonie mitochondrialnej [2,65]. W czasie utleniania bursztynianu do fumaranu, nastę- puje odłączenie 2 elektronów i 2 protonów, a kowalencyjnie związany kofaktor flawinowy FAD ulega redukcji do FADH2 , następnie ww. elektrony są pojedynczo przenoszone za pośrednictwem trzech centrów żelazowo- -siarkowych na cząsteczkę ubichinonu, zakotwiczoną w błonie mitochondrialnej i umożliwiającą ich wejście i dalszy przepływ wzdłuż łańcucha oddechowego, zaś 2 protony pochodzące z oksydacji bursztynianu są wykorzystywane do redukcji ubichinonu.

Kompleks II nie generuje gradientu protonowego, gdyż nie dochodzi tutaj do pompowania protonów do przestrzeni międzymembranowej [28].

Cząsteczka ubichinonu jest elementem spinającym kompleks I i kompleks II z resztą mitochondrialnego łań- cucha oddechowego.

Kompleks III – (kompleks cytochromów b-c1 ) w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym katalizuje reakcję przeniesienia elektronów z cząsteczki hydrochinonu (ubichinolu) na cytochrom c, połączoną z przemieszczeniem protonów w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej.

W organizmach eukariotycznych kompleks III jest homodimerem o masie ok. 480 kDa. Każdy monomer składa się z 10 lub 11 podjednostek rozdystrybuowanych w trzech regionach: w mitochondrialnej matriks, w przestrzeni międzymembranowej i w wewnętrznej błonie mitochondrialnej [48]. Do funkcjonowania enzymu są niezbędne 3 podjednostki związane z wewnętrzną błoną mitochondrialną, stanowiące katalityczny rdzeń enzymu. Pierwszą z nich jest cytochrom b z 2 różnymi cząsteczkami hemu typu b: bL (o niskim potencjale) i bH (o wysokim potencjale). Druga to cytochrom c1 , w którym znajduje się cząsteczka hemu typu c. Trzecia to białko żelazowo-siarkowe IPS, z centrum żelazowo-siarkowym 2Fe-2S. Rola pozostałych podjednostek nie jest dokładnie poznana. Cytochrom b jest kodowany przez genom mitochondrialny, a pozostałe podjednostki mają swe źródło w genomie jądrowym [46]. W kompleksie III, a dokładniej w cytochromie b, wystę- pują dwa różne miejsca wiążące cząsteczkę ubichinonu, usytuowane po przeciwnych stronach błony i połączone wewnątrzmembranową ścieżką transferu elektronów. Pierwsze z nich to miejsce utlenienia hydrochinonu, tzw. centrum P (lub Q0 ), znajdujące się po dodatniej stronie membrany i drugie miejsce, w którym dochodzi do redukcji ubichinonu, tzw. centrum N (lub Q1 ), zlokalizowane po ujemnej stronie błony mitochondrialnej.

Pierwsza faza przemian obejmuje reakcję utleniania hydrochinonu, w czasie której dochodzi do odłączenia w miejscu Q0 dwóch elektronów z cząsteczki hydrochinonu i przeniesienie jednego z nich na cytochrom c za pośrednictwem białka żelazowo-siarkowego IPS i cytochromu c1 . Drugi elektron przechodzi w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej za pośrednictwem cząsteczki hemu bL , a następnie hemu bH, koń- cząc swą wędrówkę w miejscu Q1 , gdzie dochodzi do redukcji cząsteczki ubichinonu, z przejściowym wytworzeniem rodnika semichinonowego – Q˙ , występującego w formie anionowej lub neutralnej, w zależności od kolejności transferu elektronów i protonów. Oksydacja kolejnej cząsteczki hydrochinonu w centrum P i przeniesienie następnego elektronu za pośrednictwem cytochromu b, prowadzi do dalszej redukcji rodnika semichinonowego i powstania cząsteczki hydrochinonu, czemu towarzyszy pobranie dwóch protonów z mitochondrialnej matriks w centrum N (Q1 ). W ciągu całego cyklu przemian w kompleksie III mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów dwie cząsteczki hydrochinonu ulegają utlenieniu w centrum P (Q0 ), zaś w centrum N dochodzi do regeneracji jednej czą- steczki hydrochinonu. Cały wyżej opisany proces wiąże się z przeniesieniem czterech protonów do przestrzeni międzymembranowej, co skutkuje wytworzeniem siły protonomotorycznej [46,67].

Kompleks IV – (oksydaza cytochromowa) jest końcowym ogniwem mitochondrialnego łańcucha oddechowego. W komórkach ssaków jest to heterooligomeryczny kompleks o masie ok. 200 kDa, składający się z 13 zakotwiczonych w wewnętrznej błonie mitochondrialnej podjednostek białkowych, kodowanych przez genom mitochondrialny i jądrowy. Katalityczny rdzeń enzymu stanowią 3 podjednostki Cox 1, Cox 2 i Cox 3 (kodowane przez mDNA) [10,11,49].

Podjednostka Cox 1 jest największym, silnie hydrofobowym ogniwem oksydazy cytochromowej, w którym zachodzi właściwa reakcja redukcji tlenu. W podjednostce tej, relatywnie głęboko, znajdują się dwa centra redox: pierwsze to cząsteczka hemu a, natomiast drugie to heterobimetaliczny kompleks cytochromu a3 i jonu miedzi CuB (hem a3 -CuB). Podjednostka Cox 2 jest najmniejszym i najmniej hydrofobowym elementem katalitycznego rdzenia enzymu, w której w tzw. centrum CuA znajdują się dwa jony miedzi Cu(I) i Cu(II). W centrum CuA dochodzi do wiązania cząsteczki cytochromu c. Jony miedzi CuA są pierwotnym akceptorem elektronów przepływających przez końcowy fragment łańcucha oddechowego. Elektrony uwalniane z cząsteczki cytochromu c przechodzą na centrum CuA, następnie dochodzi do redukcji hemu a, a stąd elektrony dalej są przenoszone do centrum hem a3 -CuB (jest to tzw. faza redukcyjna). Redukcja kompleksu hem a3 -CuB umożliwia wiązanie cząsteczki tlenu, która ulega czteroelektronowej redukcji do wody (jest to tzw. faza utleniania) [10,11,24].

Transfer każdego elektronu wiąże się z translokacją do przestrzeni międzybłonowej dwóch protonów. Protony niezbędne do redukcji tlenu cząsteczkowego, jak również protony wykorzystywane przez oksydazę do generowania gradientu protonowego są pobierane z mitochondrialnej matriks i transportowane w sąsiedztwo centrum hem a3 -CuB. W podjednostce Cox 1 są zlokalizowane dwie ścieżki transferu protonów: tzw. K-pathway i D-pathway. Pierwsza z nich odpowiada za dostarczenie jednego lub dwóch protonów w fazie redukcyjnej, natomiast przez D-pathway są przenoszone pozostałe dwa lub trzy protony niezbędne do wytworzenia cząsteczki wody. Tą samą drogą „pompowane” są również protony do przestrzeni międzymembranowej w czasie generowania gradientu protonowego [118]. Podjednostka Cox 3, podobnie jak Cox 1 jest również białkiem wysoce hydrofobowym rozciągającym się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. W podjednostce tej nie ma żadnej grupy prostetycznej. Przypuszcza się, iż podjednostka ta zapewnia stabilność całego enzymu, moduluje transfer protonów przez podjednostki Cox 1 i Cox 2, a także reguluje dostęp tlenu do centrum hem a3 -CuB [66].

Pozostałe podjednostki oksydazy cytochromowej kodowane przez genom jądrowy są syntetyzowane w cytoplazmie, a następnie przenoszone do mitochondrium, gdzie otaczają katalityczne centrum enzymu i prawdopodobnie są zaangażowane w stabilizację i proces dimeryzacji enzymu. Ponadto odgrywają one istotną rolę w ochronie katalitycznego rdzenia enzymu przed działaniem reaktywnych form tlenu, a także regulują katalityczną aktywność enzymu [49]. Pomimo braku danych dających uzasadnienie funkcjonalnej roli dimeryzacji oksydazy cytochromowej, uważa się, że katalitycznie aktywny enzym jest dimerem utrzymywanym przez oddziaływanie między podjednostkami Cox 6a i Cox 6b [91]. Obok grup prostetycznych (3 jonów Cu, hemu a i a3 ) niezbędnych do funkcjonowania enzymu w podjednostce Cox 5b znajduje się jon Zn(II), a na powierzchni podjednostek Cox 1 i Cox 2 są zlokalizowane jony Mg(II). Dodatkowo w Cox 1 znajduje się pojedynczy jon Na(I) [10,11]. Znaczenie tych trzech dodatkowych kofaktorów nie jest do końca wyjaśnione.

Podsumowanie

Głównymi miejscami endogennej produkcji ROS są mitochondria, które wytwarzają ROS w każdej komórce w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym w warunkach prawidłowych oraz oksydaza NADPH występująca w komórkach fagocytujących, w których zwiększone wytwarzanie ROS jest wykorzystywane do zabijania atakujących mikroorganizmów w mechanizmie „wybuchu oddechowego”. Oba układy transportu elektronów są wieloetapowymi skomplikowanymi układami enzymatycznymi, stąd wiele możliwości wycieku elektronów, co stwarza trudności w diagnozowaniu miejsca wycieku. Od wielu lat trwają badania nad mechanizmami prowadzącymi do wytwarzania ROS, ale wciąż są one nie w pełni poznane.

Przypisy

• 1. Abo A., Webb M.R., Grogan A., Segal A.W.: Activation of NADPHoxidase involves the dissociation of p21rac from its inhibitory GDP/GTP exchange protein (rhoGDI) followed by its translocation to theplasma membrane. Biochem. J., 1994, 298: 585-591
  Google Scholar
• 2. Ackrell B.A.: Progress in understanding structure-function relationshipsin respiratory chain complex II. FEBS Lett., 2000; 466: 1-5
  Google Scholar
• 3. Adams J.D. Jr, Chang M.L., Klaidman L.: Parkinson’s disease – redoxmechanisms. Curr. Med. Chem., 2001; 8: 809-814
  Google Scholar
• 4. Adam-Vizi V., Chinopoulos C.: Bioenergetics and the formationof mitochondrial reactive oxygen species. Trends Pharmacol. Sci.,2006; 27: 639-645
  Google Scholar
• 5. Ambasta R.K., Kumar P., Griendling K.K., Schmidt H.H., BusseR.,Brandes R.P.: Direct interaction of the novel Nox proteins withp22phox is required for the formation of a functionally active NADPHoxidase. J. Biol. Chem., 2004, 279: 45935-45941
  Google Scholar
• 6. Andersen J.K.: Oxidative stress in neurodegeneration: cause orconsequence? Nat. Med., 2004; 10: 18-25
  Google Scholar
• 7. Assari T.: Chronic granulomatous disease; fundamental stages inour understanding of CGD. Med. Immunol., 2006; 21: 5:4
  Google Scholar
• 8. Babior B.M.: NADPH oxidase: an update. Blood. 1999; 93: 1464-1476
  Google Scholar
• 9. Babior B.M.: The respiratory burst of phagocytes. J. Clin. Invest.,1984; 73: 599-601
  Google Scholar
• 10. Babior B.M., Kipnes R.S., Curnutte J.T.: Biological defense mechanisms.Theproduction by leukocytes of superoxide, a potentialbactericidal agent. J. Clin. Invest., 1973; 52: 741-744
  Google Scholar
• 11. Babior B.M., Takeuchi C., Ruedi J., Gutierrez A., Wentworth P.Jr.:Investigating antibody-catalyzed ozone generation by human neutrophils.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100: 3031-3034
  Google Scholar
• 12. Balaban R.S., Nemoto S., Finkel T.: Mitochondria, oxidants, andaging. Cell, 2005; 120: 483-495
  Google Scholar
• 13. Baldridge C.W., Gerard R.W.: The extra respiration of phagocytosis.Am. J. Physiol., 1933; 103: 235-236
  Google Scholar
• 14. Bánfi B., Clark R.A., Steger K., Krause K.H.: Two novel proteinsactivate superoxide generation by the NADPH oxidase NOX1. J. Biol.Chem., 2003; 278: 3510-3513
  Google Scholar
• 15. Bartosz G.: Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. Wydawnictwonaukowe PWN, 2008
  Google Scholar
• 16. Bartosz G.: Reactive oxygen species: destroyers or messengers?Biochem Pharmacol., 2009; 77: 1303-1315
  Google Scholar
• 17. Bedard K., Krause K.H.: The NOX family of ROS-generatingNADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev.,2007; 87: 245-313
  Google Scholar
• 18. Benham A.M, van Lith M., Sitia R., Braakman I.: Ero1-PDI interactions,the response to redox flux and the implications for disulfidebond formation in the mammalian endoplasmic reticulum. Philos.Trans R Soc. Lond. B Biol. Sci., 2013; 368: 20110403
  Google Scholar
• 19. Berrisford J.M., Sazanov L.A.: Structural basis for the mechanismof respiratory complex I. J. Biol. Chem., 2009; 284: 29773-29783
  Google Scholar
• 20. Bhandary B., Marahatta A., Kim H.R., Chae H.J.: An involvementof oxidative stress in endoplasmic reticulum stress and its associateddiseases. Int. J. Mol. Sci., 2012; 14: 434-456
  Google Scholar
• 21. Blum D., Torch S., Lamberg N., Nissou M.F., Benabid A.L., SadoulR., Verna J.M.: Molecular pathways involved in the neurotoxicity of6-OHDA, dopamine and MPTP: contribution to the apoptotic theoryin Parkinson’s disease. Prog Neurobiol., 2001; 65: 135-172
  Google Scholar
• 22. Bonekamp N.A., Völkl A., Fahimi H.D., Schrader M.: Reactiveoxygen species and peroxisomes: struggling for balance. Biofactors,2009; 35: 346-355
  Google Scholar
• 23. Bréchard S., Plançon S., Tschirhart E.J.: New insights into theregulation of neutrophil NADPH oxidase activity in the phagosome:a focus on the role of lipid and Ca2+ signaling. Antioxid RedoxSignal., 2013; 18: 661-676
  Google Scholar
• 24. Brunori M., Giuffrè A., Sarti P.: Cytochrome c oxidase, ligandsand electrons. J. Inorg. Biochem., 2005; 99: 324-336
  Google Scholar
• 25. Carroll J., Fearnley I.M., Skehel J.M., Shannon R.J., Hirst J., WalkerJ.E.: Bovine complex I is a complex of 45 different subunits., J.Biol. Chem., 2006; 281: 32724-32727
  Google Scholar
• 26. Cecchini G., Maklashina E., Yankovskaya V., Iverson T.M., IwataS.: Variationin proton donor/acceptor pathways in succinate:quinoneoxidoreductases. FEBS Lett., 2003; 545: 31-38
  Google Scholar
• 27. Champe P.C., Harvey R.A.: Lippicott’s Illustrated Reviews: Biochemistry3rd edition. Lippincott, Williams & Wilkins, 2005
  Google Scholar
• 28. Cheng G., Lambeth J.D.: NOXO1, regulation of lipid binding, localization,and activation of Nox1 by the Phox homology (PX) domain.J. Biol. Chem., 2004; 279: 4737-4742
  Google Scholar
• 29. Cross A.R.: p40phox participates in the activation of NADPH oxidaseby increasing the affinity of p47phox for flavocytochrome b558.Biochem. J., 2000, 349: 113-117
  Google Scholar
• 30. Cross A.R., Curnutte J.T.: The cytosolic activating factor p47phoxand p67phox have distinct roles in the regulation of electron flow inNADPH oxidase. J. Biol. Chem., 1995; 270: 6543-6548
  Google Scholar
• 31. Cross A.R, Segal A.W.: The NADPH oxidase of professional phagocytes- prototype of the NOX electron transport chain systems.Biochim. Biophys. Acta, 2004; 1657: 1-22
  Google Scholar
• 32. Dang P.M., Babior B.M., Smith R.M.: NADPH dehydrogenase activityof p67PHOX, a cytosolic subunit of the leukocyte NADPH oxidase.Biochemistry, 1999; 38: 5746-5753
  Google Scholar
• 33. Dang P.M., Morel F., Gougerot-Pocidalo M.A., El Benna J.: Phosphorylationof the NADPH oxidase component p67PHOX by ERK2and P38MAPK: selectivity of phosphorylated sites and existence ofan intramolecular regulatory domain in the tetratricopeptide-richregion. Biochemistry, 2003; 42: 4520-4526
  Google Scholar
• 34. Dang P.M., Raad H., Derkawi R.A., Boussetta T., Paclet M.H., BelambriS.A., Makni-Maalej K., Kroviarski Y., Morel F., Gougerot-PocidaloM.A., El-Benna J.: The NADPH oxidase cytosolic componentp67phox is constitutively phosphorylated in human neutrophils:Regulation by a protein tyrosine kinase, MEK1/2 and phosphatases1/2A. Biochem Pharmacol., 2011; 82: 1145-1152
  Google Scholar
• 35. Davis W.B., Mohammed B.S., Mays D.C., She Z.W., MohammedJ.R., Husney R.M., Sagone A.L.: Hydroxylation of salicylate by activatedneutrophils. Biochem. Pharmacol., 1989, 38: 4013-4019
  Google Scholar
• 36. DeLeo F.R., Burritt J.B., Yu L., Jesaitis A.J., Dinauer M.C., NauseefW.M.: Processing and maturation of flavocytochrome b558 includeincorporation of heme as a prerequisite for heterodimer assembly.J. Biol. Chem., 2000; 275: 13986-13993
  Google Scholar
• 37. Dexter D.T, Jenner P.: Parkinson disease: from pathology to moleculardisease mechanisms. Free Radic. Biol. Med., 2013; 62: 132-144
  Google Scholar
• 38. Dikalova A., Clempus R., Lassègue B., Cheng G., McCoy J., DikalovS., San Martin A., Lyle A., Weber, D.S., Weiss D., Taylor W.R., SchmidtH.H., Owens G. K., Lambeth J.D., Griendling K.K.: Nox1 overexpressionpotentiates angiotensin II-induced hypertension and vascularsmooth muscle hypertrophy in transgenic mice circulation. Circulation,2005; 112: 2668-2676
  Google Scholar
• 39. Dinauer M.C.: Chronic granulomatous disease and other disordersof phagocyte function. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ.Program, 2005; 2005: 89-95
  Google Scholar
• 40. Dröge W.: Free radicals in the physiological control of cell function.Physiol. Rev., 2002: 82: 47-95
  Google Scholar
• 41. Dröge W.: Oxidative stress and aging. Adv. Exp. Med. Biol., 2003;543: 191-200
  Google Scholar
• 42. Dusi S., Donini M., Rossi F.: Mechanisms of NADPH oxidase activation:translocation of p40phox, Rac1 and Rac2 from the cytosolto the membranes in human neutrophils lacking p47phox or p67phox.Biochem. J., 1996; 314: 409-412
  Google Scholar
• 43. El-Benna J., Dang P.M., Gougerot-Pocidalo M.A., Marie J.C., Braut–Boucher F.: p47phox, the phagocyte NADPH oxidase/NOX2 organizer:structure, phosphorylation and implication in diseases. Exp.Mol. Med., 2009; 41: 217-225
  Google Scholar
• 44. El-Benna J., Dang P.M., Périanin A.: Peptide-based inhibitorsof the phagocyte NADPH oxidase. Biochem. Pharmacol., 2010; 80:778-785
  Google Scholar
• 45. Esser L., Quinn B., Li Y.F., Zhang M., Elberry M., Yu L., Yu C.A.,Xia D.: Crystallographic studies of quinol oxidation site inhibitors:a modified classification of inhibitors for the cytochrome bc1 complex.J. Mol. Biol., 2004; 341: 281-302
  Google Scholar
• 46. Ferro E., Goitre L., Retta S.F., Trabalzini L.: The interplay betweenROS and Ras GTPases: physiological and pathological implications.J. Signal Transduct., 2012; 2012: 365769
  Google Scholar
• 47. Fisher N., Meunier B.: Molecular basis of resistance to cytochromebc1 inhibitors. FEMS Yeast Res., 2008; 8: 183-192
  Google Scholar
• 48. Fontanesi F., Soto I.C., Horn D., Barrientos A.: Assembly of mitochondrialcytochrome c-oxidase, a complicated and highly regulatedcellular process. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2006; 291: C1129-C1147
  Google Scholar
• 49. Foubert T.R., Bleazard J.B., Burritt J.B., Gripentrog J.M., BaniulisD.,Taylor R.M., Jesaitis A.J.: Identification of a spectrally stable proteolyticfragment of human neutrophil flavocytochrome b composedof the NH2-terminal regions of gp91phox and p22phox. J. Biol. Chem.,2001; 276: 38852-38861
  Google Scholar
• 50. Fransen M., Nordgren M., Wang B., Apanasets O.: Role of peroxisomesin ROS/RNS-metabolism: implications for human disease.Biochim. Biophys. Acta, 2012; 1822: 1363-1373
  Google Scholar
• 51. Freeman J.L., Abo A., Lambeth J.D.: Rac “insert region” is a noveleffector region that is implicated in the activation of NADPH oxidase,but not PAK65. J. Biol. Chem., 1996; 271: 19794-19801
  Google Scholar
• 52. Geiszt M., Lekstrom K., Brenner S., Hewitt S.M., Dana R., MalechH.L., Leto T.L.: NAD(P)H oxidase 1, a product of differentiatedcolon epithelial cells, can partially replace glycoprotein 91phox inthe regulated production of superoxide by phagocytes. J. Immunol.,2003; 171: 299-306
  Google Scholar
• 53. Geiszt M., Lekstrom K., Witta J., Leto T.L.: Proteins homologous top47phox and p67phox support superoxide production by NAD(P)H oxidase 1 in colon epithelial cells. J. Biol. Chem., 2003, 278: 20006-20012
  Google Scholar
• 54. Gorzalczany Y., Sigal N., Itan M., Lotan O., Pick E.: Targetingof Rac1 to the phagocyte membrane is sufficient for the inductionof NADPH oxidase assembly. J. Biol. Chem., 2000; 275: 40073-40081
  Google Scholar
• 55. Groemping Y., Rittinger K.: Activation and assembly of theNADPH oxidase:a structural perspective. Biochem. J., 2005; 386:401-416
  Google Scholar
• 56. Gutteridge J.M., Halliwell B.: Antioxidants: molecules, medicines,and myths. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2010; 393: 561-564
  Google Scholar
• 57. Halliwell B.: Phagocyte-derived reactive species: salvation orsuicide? Trends Biochem. Sci., 2006; 31: 509-515
  Google Scholar
• 58. Han C.H., Lee M.H.: Activation domain in P67phox regulates thesteady state reduction of FAD in gp91phox. J. Vet. Sci., 2000; 1: 27-31
  Google Scholar
• 59. Hanna I.R., Hilenski L.L., Dikalova A., Taniyama Y., Dikalov S., LyleA., Quinn M.T., Lassègue B., Griendling K.K.: Functional associationof nox1 with p22phox in vascular smooth muscle cells. Free Radic.Biol. Med., 2004; 37: 1542-1549
  Google Scholar
• 60. Hashida S., Yuzawa S., Suzuki N.N., Fujioka Y., Takikawa T., SumimotoH., Inagaki F., Fujii H.: Binding of FAD to cytochrome b558 is facilitatedduring activation of the phagocyte NADPH oxidase, leadingto superoxide production. J. Biol. Chem., 2004; 279: 26378-26386
  Google Scholar
• 61. Hinchliffe P., Sazanov L.A.: Organization of iron-sulfur clustersin respiratory complex I. Science, 2005; 309: 771-774
  Google Scholar
• 62. Hirst J., Carroll J, Fearnley I.M., Shannon R.J., Walker J.E.: The nuclear encoded subunits of complex I from bovine heart mitochondria.Biochim. Biophys. Acta, 2003; 1604: 135-150
  Google Scholar
• 63. Holland S.M.: Chronic granulomatous disease. Hematol. Oncol.Clin. North Am., 2013; 27: 89-99
  Google Scholar
• 64. Horsefield R., Yankovskaya V., Sexton G., Whittingham W., ShiomiK., Omura S., Byrne B., Cecchini G., Iwata S.: Structural and computationalanalysis of the quinone-binding site of complex II (succinate-ubiquinoneoxidoreductase): a mechanism of electron transferand proton conduction during ubiquinone reduction. J. Biol. Chem.,2006; 281: 7309-7316
  Google Scholar
• 65. Hosler J.P.: The influence of subunit III of cytochrome c oxidaseon the D pathway, the proton exit pathway and mechanism-basedinactivation in subunit I. Biochim. Biophys. Acta, 2004; 1655: 332-339
  Google Scholar
• 66. Hunte C., Palsdottir H., Trumpower B.L.: Protonmotive pathwaysand mechanisms in the cytochrome bc1 complex. FEBS Lett.,2003; 545: 39-46
  Google Scholar
• 67. Hyslop P.A., Hinshaw D.B., Scraufstatter I.U., Cochrane C.G.,Kunz S.,Vosbeck K.: Hydrogen peroxide as a potent bacteriostaticantibiotic: implications for host defense. Free Radic. Biol. Med.,1995; 19: 31-37
  Google Scholar
• 68. Isogai Y., Iizuka T., Makino R., Iyanagi T., Orii Y.: Superoxide–producing cytochrome b. Enzymatic and electron paramagneticresonance properties of cytochrome b558 purified from neutrophils.J. Biol. Chem., 1993; 268: 4025-4031
  Google Scholar
• 69. Iyer G.Y., Islam D.M., Quastel J.H.: Biochemical aspects of phagocytosis.Nature, 1961, 192: 535-541
  Google Scholar
• 70. Kawahara T., Kuwano Y., Teshima-Kondo S., Takeya R., SumimotoH., Kishi K., Tsunawaki S., Hirayama T., Rokutan K.: Role of nicotinamideadenine dinucleotide phosphate oxidase 1 in oxidativeburst response to Toll-like receptor 5 signaling in large intestinalepithelial cells. J. Immunol., 2004; 172: 3051-3058
  Google Scholar
• 71. Kawahara T., Ritsick D., Cheng G., Lambeth J.D.: Point mutationsin the proline-rich region of p22phox are dominant inhibitorsof Nox1- and Nox2-dependent reactive oxygen generation. J. Biol.Chem., 2005; 280: 31859-31869
  Google Scholar
• 72. Klebanoff S.J.: Myeloperoxidase: friend and foe. J. Leukoc. Biol.,2005; 77: 598-625
  Google Scholar
• 73. Klebanoff S.J., Kettle A.J., Rosen H., Winterbourn C.C., NauseefW.M.: Myeloperoxidase: a front-line defender against phagocytosedmicroorganisms. J. Leukoc. Biol., 2013; 93:185-198
  Google Scholar
• 74. Kleniewska P., Piechota A., Skibska B., Gorąca A.: The NADPHoxidase family and its inhibitors. Arch. Immunol. Ther. Exp., 2012;60: 277-294
  Google Scholar
• 75. Koshkin V., Lotan O., Pick E.: The cytosolic component p47phox isnot a sine qua non participant in the activation of NADPH oxidasebut is required for optimal superoxide production. J. Biol. Chem.,1996; 271: 30326-30329
  Google Scholar
• 76. Lam G.Y., Huang J., Brumell J.H.: The many roles of NOX2 NADPHoxidase-derived ROS in immunity. Semin. Immunopathol., 2010;32: 415-430
  Google Scholar
• 77. Lambeth J.D.: Nox enzymes, ROS, and chronic disease: an exampleof antagonistic pleiotropy. Free Radic. Biol. Med., 2007; 43: 332-347
  Google Scholar
• 78. Lanza I.R., Nair K.S.: Mitochondrial function as a determinantof life span. Pflugers Arch., 2010; 459: 277-289
  Google Scholar
• 79. Lapouge K., Smith S.J., Groemping Y. Rittinger K.: Architectureof the p40-p47-p67phox complex in the resting state of the NADPHoxidase. J. Biol. Chem., 2002; 277: 10121-10128
  Google Scholar
• 80. Lefer D.J., Granger D.N.: Oxidative stress and cardiac disease.Am. J. Med., 2000; 109: 315-323
  Google Scholar
• 81. Lopes L.R., Dagher M.C., Gutierrez A., Young B., Bouin A.P., Fuchs A., Babior B.M.: Phosphorylated p40PHOX as a negative regulator ofNADPH oxidase. Biochemistry, 2004; 43: 3723-3730
  Google Scholar
• 82. Madani S., Hichami A., Legrand A., Belleville J., Khan N.A.: Implicationof acyl chain of diacylglycerols in activation of differentisoforms of protein kinase C. FASEB J., 2001; 15: 2595-2601
  Google Scholar
• 83. Malhotra J.D., Kaufman R.J.: Endoplasmic reticulum stress andoxidative stress:a vicious cycle or a double-edged sword? Antioxid.Redox Signal., 2007; 9: 2277-2293
  Google Scholar
• 84. Manivannan S., Scheckhuber C.Q., Veenhuis M., van der KleiI.J.: The impact of peroxisomes on cellular aging and death. FrontOncol., 2012; 2: 50
  Google Scholar
• 85. Marcoux J., Man P., Petit-Haertlein I., Vivès C., Forest E., FieschiF.: p47phox molecular activation for assembly of the neutrophil NADPHoxidase complex. J. Biol. Chem., 2010; 285: 28980-28990
  Google Scholar
• 86. Matsuno K., Yamada H., Iwata K., Jin, D., Katsuyama M., MatsukiM., Takai S., Yamanishi K., Miyazaki M., Matsubara H., Yabe-NishimuraC.: Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension:a study in Nox1-deficient mice. Circulation, 2005; 112: 2677-2685
  Google Scholar
• 87. Matute J.D., Arias A.A., Dinauer M.C., Patiño P.J.: p40phox: thelast NADPH oxidase subunit. Blood Cells Mol. Dis., 2005; 35: 291-302
  Google Scholar
• 88. Matute J.D., Arias A.A., Wright N.A., Wrobel I., Waterhouse C.C.,Li X.J., Marchal C.C., Stull N.D., Lewis D.B., Steele M., Kellner J.D., YuW., Meroueh S.O., Nauseef W.M., Dinauer M.C.: A new genetic subgroupof chronic granulomatous disease with autosomal recessivemutations in p40phox and selective defectsin neutrophil NADPH oxidaseactivity. Blood, 2009; 114: 3309-3315
  Google Scholar
• 89. Miyano K., Ueno N., Takeya R., Sumimoto H.: Direct involvementof the small GTPase Rac in activation of the superoxide-producingNADPH oxidase Nox1. J. Biol. Chem., 2006; 281: 21857-21868
  Google Scholar
• 90. Murphy M.P.: How mitochondria produce reactive oxygen species.Biochem. J., 2009; 417: 1-13
  Google Scholar
• 91. Musatov A., Robinson N.C.: Cholate-induced dimerization of detergent-orphospholipid-solubilized bovine cytochrome C oxidase.Biochemistry, 2002; 41: 4371-4376
  Google Scholar
• 92. Nauseef W.M.: Assembly of the phagocyte NADPH oxidase. HistochemCell Biol., 2004; 122: 277-291
  Google Scholar
• 93. Nemoto S., Takeda K., Yu Z.X., Ferrans V.J., Finkel T.: Role formitochondrial oxidants as regulators of cellular metabolism. Mol.Cell. Biol., 2000; 20: 7311-7318
  Google Scholar
• 94. Pohl T., Bauer T., Dörner K., Stolpe S., Sell P., Zocher G., FriedrichT.: Iron-sulfur cluster N7 of the NADH:ubiquinone oxidoreductase(complex I) is essential for stability but not involved in electrontransfer. Biochemistry, 2007; 46: 6588-6596
  Google Scholar
• 95. Rada B. Hably C., Meczner A., Timár C., Lakatos G., Enyedi P.,Ligeti E.: Role of Nox2 in elimination of microorganisms. Semin.Immunopathol., 2008; 30: 237-253
  Google Scholar
• 96. Rees M.D., Pattison D.I., Davies M.J.: Oxidation of heparan sulphateby hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependentfragmentation. Biochem. J., 2005; 391: 125-134
  Google Scholar
• 97. Rossi F., Zatti M.: Biochemical aspects of phagocytosis in polymorphonuclearleucocytes. NADH and NADPH oxidation by the granulesof resting and phagocytizing cells. Experientia, 1964; 20: 21-23
  Google Scholar
• 98. Sarfstein R., Gorzalczany Y., Mizrahi A., Berdichevsky Y., Molshanski-MorS., Weinbaum C., Hirshberg M., Dagher M.C., Pick E.:Dual role of Rac in the assembly of NADPH oxidase, tethering to themembrane and activation of p67phox: a study based on mutagenesisof p67phox-Rac1 chimeras. J. Biol. Chem., 2004; 279: 16007-16016
  Google Scholar
• 99. Segal A.W.: How neutrophils kill microbes. Annu. Rev. Immunol.,2005; 23: 197-223
  Google Scholar
• 100. Seguchi H., Kobayashi T.: Study of NADPH oxidase-activatedsites in human neutrophils. J. Electron Microsc., 2002; 51: 87-91
  Google Scholar
• 101. Shen Z., Wu W., Hazen S.L.: Activated leukocytes oxidativelydamage DNA, RNA, and the nucleotide pool through halide-dependentformation of hydroxyl radical. Biochemistry, 2000; 39: 5474-5482
  Google Scholar
• 102. Sheppard F.R., Kelher M.R., Moore E.E., McLaughlin N.J., BanerjeeA., Silliman C.C.: Structural organization of the neutrophilNADPH oxidase: phosphorylation and translocation during primingand activation. J. Leukoc. Biol., 2005; 78: 1025-1042
  Google Scholar
• 103. Shukla V., Mishra S.K., Pant H.C.: Oxidative stress in neurodegeneration.Adv. Pharmacol. Sci., 2011; 2011: 572634
  Google Scholar
• 104. Sigal N., Gorzalczany Y., Pick E.: Two pathways of activationof the superoxide-generating NADPH oxidase of phagocytes in vitro- distinctive effects of inhibitors. Inflammation, 2003; 27: 147-159
  Google Scholar
• 105. Smith R.M., Connor J.A., Chen L.M., Babior B.M.: The cytosolicsubunit p67phox contains an NADPH-binding site that participatesin catalysis by the leukocyte NADPH oxidase. J. Clin. Invest., 1996;98: 977-983
  Google Scholar
• 106. Steinbeck M.J., Khan A.U., Karnovsky M.J: Intracellular singletoxygen generation by phagocytosing neutrophils in responseto particles coated with a chemical trap. J. Biol. Chem., 1992; 267:13425-13433
  Google Scholar
• 107. Stiburek L., Hansikova H., Tesarova M., Cerna L., Zeman J.:Biogenesis of eukaryotic cytochrome c oxidase. Physiol. Res., 2006;55, Suppl. 2: S27-S41
  Google Scholar
• 108. Suh Y.A., Arnold R.S., Lassegue B., Shi J., Xu X., Sorescu D.,Chun A.B., Griendling K.K., Lambeth J.D.: Cell transformation bythe superoxide-generating oxidase Mox1. Nature, 1999; 401: 79-82
  Google Scholar
• 109. Takeya R., Ueno N., Kami K., Taura M., Kohjima M., Izaki T.,Nunoi H., Sumimoto H.: Novel human homologues of p47phox andp67phox participate in activation of superoxide-producing NADPHoxidases J. Biol. Chem., 2003; 278: 25234-25246
  Google Scholar
• 110. Terlecky S.R., Terlecky L.J., Giordano C.R.: Peroxisomes, oxidativestress, and inflammation. World J. Biol. Chem., 2012; 3: 93-97
  Google Scholar
• 111. Thannickal V.J., Fanburg B.L.: Reactive oxygen species in cell signaling.Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 2000: 279: L1005-L1028
  Google Scholar
• 112. Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Cronin M.T., Mazur M., TelserJ.: Free radicals and antioxidants in normal physiological functionsand human disease. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2007; 39: 44-84
  Google Scholar
• 113. van Bruggen R., Anthony E., Fernandez-Borja M., Roos D.: Continuoustranslocation of Rac2 and the NADPH oxidase componentp67phox during phagocytosis. J. Biol. Chem., 2004; 279: 9097-9102
  Google Scholar
• 114. Vergnaud S., Paclet M.H., El Benna J., Pocidalo M.A., Morel F.:Complementation of NADPH oxidase in p67-phox-deficient CGDpatients p67-phox/p40-phox interaction Eur. J. Biochem., 2000; 267:1059-1067
  Google Scholar
• 115. Vignais P.V. The superoxide-generating NADPH oxidase: structuralaspects and activation mechanism. Cell. Mol. Life Sci., 2002;59: 1428-1459
  Google Scholar
• 116. Wentworth P. Jr, McDunn J.E., Wentworth A.D., Takeuchi C.,Nieva J., Jones T., Bautista C., Ruedi J.M., Gutierrez A., Janda K.D.,Babior B.M., Eschenmoser A., Lerner R.A.: Evidence for antibody–catalyzed ozone formation in bacterial killing and inflammation.Science, 2002; 298: 2195-2199
  Google Scholar
• 117. Wikström M.: Proton translocation by cytochrome c oxidase:a rejoinder to recent criticism. Biochemistry, 2000; 39: 3515-3519
  Google Scholar
• 118. Winterbourn C.C.: Biological reactivity and biomarkers of theneutrophil oxidant, hypochlorous acid. Toxicology, 2002; 181-182:223-227
  Google Scholar

Pełna treść artykułu