Abstrakt

W ostatnich latach, w krajach o wysokim poziomie zaszczepienia przeciw krztuścowi wyizolowano szczepy Bordetella pertussis, które utraciły zdolność do wytwarzania niektórych antygenów: pertaktyny – Prn, toksyny krztuścowej – Ptx, hemaglutyniny włókienkowej – FHA, fimbrii typu 2 i 3 – Fim 2 i 3, czynnika kolonizacji tchawicy – TcfA. Pojawienie się takich izolatów może być wynikiem naturalnej ewolucji B. pertussis lub stanowić mechanizm adaptacyjny, umożliwiający zwiększone krążenie patogenu wśród osób zaszczepionych przeciw krztuścowi. Większość dotychczas opisanych mutacji decydujących o braku ekspresji dotyczyła utraty zdolności wytwarzania Prn. Zmutowane szczepy Prn¯ wyizolowano od osób chorych w krajach stosujących do powszechnych szczepień bezkomórkowe szczepionki przeciw krztuścowi (aP). Zwiększającą się częstość izolacji mutantów Prn¯ skorelowano z czasem stosowania szczepionek aP. W większości przypadków, rozprzestrzenianie się izolatów Prn¯ powiązano z powstaniem niezależnych mutacji, a nie ekspansją pojedynczego klonu. Mutanty Prn¯ dotychczas izolowano od osób chorych wykazujących typowe kliniczne objawy krztuśca, które nie różniły się od objawów zakażenia szczepami dzikimi. Wyniki badań przeprowadzonych zarówno in vitro, jak i in vivo wykazały, że izolaty Prn¯, Ptx¯, FHA¯ zachowały właściwości cytotoksyczne, a poza izolatami Ptx¯, zachowały cechy pełnej zjadliwości wyrażonej efektem letalnym u myszy eksperymentalnie zakażanych donosowo. Wyjaśnienie znaczenia wykrytych mutacji w poziomie zjadliwości oraz transmisji B. pertussis w związku ze stałym wzrostem zachorowań na krztusiec na świecie jest niezbędne w celu opracowania nowych, zoptymalizowanych strategii poprawy profilaktyki krztuśca.

Wykaz skrótów

aP – szczepionka bezkomórkowa przeciw krztuścowi (acellular pertussis vaccine), BvgAS – dwuskładnikowy system regulacji ekspresji genów kodujących czynniki zjadliwości Bordetella (Bordetella virulence genes activator/sensor regulation system), FHA – hemaglutynina włókienkowa (filamentous hemagglutinin), Fim – fimbrie (fimbriae), Prn – pertaktyna (pertactin), Ptx – toksyna krztuścowa (pertussis toxin), PtxA – podjednostka S1 toksyny krztuścowej (pertussis toxin S1 subunit), TcfA – czynnik kolonizacji tchawicy A (tracheal colonization factor A), LOS – lipooligosacharyd, wP – szczepionka całokomórkowa przeciw krztuścowi (whole-cell pertussis vaccine)

Wstęp

Krztusiec jest zakaźną chorobą układu oddechowego, występującą zarówno u dzieci jak i osób dorosłych [42,86]. Przebieg kliniczny krztuśca zależy od wielu czynników, w tym: wieku chorego, występowania innych chorób towarzyszących (zwłaszcza układu oddechowego) oraz poziomu odporności na krztusiec – naturalnej lub poszczepiennej. Typowym objawem klinicznym krztuśca, występującym najczęściej u niezaszczepionych lub nie w pełni zaszczepionych dzieci, jest długotrwały kaszel napadowy, któremu często towarzyszy odkrztuszanie lepkiej, śluzowatej plwociny, a niekiedy wymioty i duszności [6]. U osób dorosłych i starszych dzieci, które w przeszłości przebyły chorobę lub zostały zaszczepione, a także u dzieci, które nie zostały zaszczepione zgodnie z obowiązującym schematem szczepień, choroba może występować w postaci atypowej z łagodnymi napadami kaszlu lub ich całkowitym brakiem.

Czynnikiem etiologicznym krztuśca są małe, Gram- ujemne pałeczki Bordetella pertussis przenoszone drogą powietrzno-kropelkową przez bezpośredni kontakt z osobą chorą. Po zakażeniu, pałeczki krztuśca wytwarzają wiele czynników zjadliwości, które można podzielić na toksyny i adhezyny. Do najlepiej poznanych adhezyn należą: aglutynogeny (AGGs; w tym fimbrie – Fim), hemaglutynina włókienkowa (FHA), pertaktyna (Prn), czynnik kolonizacji tchawicy (TcfA). Wsród toksyn istotnych w etiopatogenezie krztuśca najlepiej scharakteryzowano: toksynę krztuścową (Ptx), cyklazę adenylową (ACT), toksynę dermonekrotyczną (DNT), cytotoksynę tchawiczą (TCT), lipooligosacharyd (LOS), system wydzielniczy typu III (T3SS). Czynniki zjadliwości B. pertussis umożliwiają bakteriom adhezję do nabłonka błony śluzowej dróg oddechowych (FHA, Prn, Fim), bezpośrednią inwazję komórek nabłonka (Prn, FHA), niszczenie rzęsek układu oddechowego (TCT, LOS), tworzenie biofilmu (FHA, polisacharyd Bps) oraz modulowanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza (Ptx, ACT, FHA, Fim, BrkA, Prn, TCT, LOS) [22,25,58]. Wytwarzanie większości czynników zjadliwości oraz wielu innych białek umożliwiających m.in. przeżycie bakterii poza organizmem, uczestniczących w metabolizmie komórkowym oraz jego regulacji jest kontrolowane przez dwuskładnikowy system regulacji BvgAS (Bordetella virulence genes activator/sensor regulation system) [58]. W wyniku zmian warunków środowiska zewnętrznego następuje zależna od BvgAS aktywacja jednej z trzech tzw. faz B. pertussis (Bvg⁺ , Bvg¯ , Bvgⁱ). Skuteczna kolonizacja i rozwój zakażenia dróg oddechowych jest uwarunkowany indukcją fazy Bvg⁺, w której m.in. dochodzi do ekspresji genów kodujących czynniki zjadliwości.

Według najnowszych szacunków WHO, rocznie na świecie na krztusiec zapada 16 mln ludzi, z czego około 195000 umiera [98]. W ostatnich dwóch dekadach, mimo stosowania powszechnych szczepień, w wielu krajach rozwiniętych zaobserwowano wzrost zapadalności i umieralności na krztusiec [17,20,42,95]. Wzrost ten powiązano z wieloma różnymi czynnikami, tj. zwiększeniem się świadomości społeczeństwa na temat występowania krztuśca, poprawą nadzoru epidemiologicznego i diagnostyki krztuśca (wprowadzenie metody PCR), spadkiem jakości szczepionek przeciw krztuścowi, zastą- pieniem szczepionek całokomórkowych (wP – whole-cell pertussis vaccine) szczepionkami bezkomórkowymi (aP – acellular pertussis vaccine) w ramach szczepienia podstawowego lub uzupełniającego, wygasaniem ochronnej odpowiedzi immunologicznej wraz z upływem czasu od podania ostatniej dawki szczepionki przeciw krztuścowi oraz zmianami adaptacyjnymi Bordetella pertussis [18,32,63]. Innym istotnym czynnikiem, który wpływa na pojawianie się nowych ognisk epidemii nie tylko krztuśca, lecz także innych chorób zakaźnych, którym można zapobiegać szczepieniami, jest zaniechanie szczepień dzieci przez rodziców w wyniku negatywnej działalności ruchów antyszczepionkowych [24]. Odmowa szczepień dzieci przez rodziców z powodów pozamedycznych mogła być jedną z przyczyn epidemii krztuśca w Kalifornii w 2010 r., podczas której zarejestrowano ponad 9 tys. zachorowań, a więc najwięcej od 1947 r. [56].

Badania genetyczne wykazały, że krążące w populacji szczepy B. pertussis różnią się od szczepów stosowanych do produkcji szczepionek przeciw krztuścowi [2,61,63,64,65,91] (ryc. 1). Wśród obecnie krążących pałeczek krztuśca coraz częściej pojawiają się szczepy o odmiennych w stosunku do szczepów szczepionkowych profilach PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis), allelach kodujących istotne z punktu widzenia immunogenności czynniki zjadliwości: podjednostkę S1 toksyny krztuścowej (ptxA), pertaktynę (prn), fimbrie typu 2 i 3 (fim2, fim3), czy też szczepy zawierające swoistą mutację w promotorze toksyny krztuścowej (ptxP3), predysponującą do jej zwiększonej ekspresji [62]. Wyniki badań epidemiologicznych oraz z użyciem zwierząt doświadczalnych potwierdzają, że obserwowane zmiany adaptacyjne mogą wpływać na obniżenie efektywności szczepień oraz wzrost zachorowań na krztusiec [2,31,44,61,62].

Ryc. 1.

Różnice w profilu PFGE, ptxP oraz wariantach antygenów szczepionkowych pomiędzy krążącymi szczepami B. pertussis a szczepami stosowanymi do produkcji szczepionek wP i aP. Opracowano na podstawie [2,63,64,65,91]; pogrubiona czcionka – szczepy występujące w nadal stosowanej w Polsce szczepionce wP; a – tylko w szwedzkiej szczepionce wP, która w 1996 r. została zastąpiona szczepionką aP; b – tylko w holenderskiej szczepionce wP, która w 2005 r. została zastąpiona szczepionką aP

W ostatnim czasie, niepokój środowiska naukowego skupia się na rosnącej liczbie przypadków izolacji szczepów B. pertussis niewytwarzających pertaktyny (Prn) oraz rzadziej – szczepów niewytwarzających innych antygenów wchodzących w skład powszechnie stosowanych szczepionek przeciw krztuścowi. Przypuszcza się, że pojawienie się tego rodzaju fenotypów B. pertussis może być kolejnym mechanizmem adaptacyjnym bakterii. Nowy mechanizm może mieć szczególne znaczenie w przypadku stosowania szczepionek bezkomórkowych (aP – acellular pertussis vaccine), które w przeciwieństwie do szczepionek całokomórkowych (wP – whole-cell pertussis vaccine), zawierają zaledwie kilka antygenów i indukują węższy zakres odporności. W zależności od preparatu, szczepionki aP zawierają 1-5 antygenów: monowalentne zawierają Ptx, diwalentne – Ptx i FHA, triwalentne – Ptx, FHA i Prn, pentawalentne – Ptx, FHA, Prn, Fim2 i Fim3 (tabela 1).

Tabela 1. Charakterystyka jakościowa i ilościowa aktualnie stosowanych szczepionek przeciw krztuścowi

Szczepionki wP, z powodu tego, że są zawiesinami zabitych komórek B. pertussis – zawierają wszystkie poznane i dotychczas niezidentyfikowane antygeny. Antygeny znajdujące się w szczepionkach wP są, w porównaniu do antygenów szczepionek aP, słabiej oczyszczone i wystę- pują w mniejszym stężeniu. Za pomocą elektroforezy 2D i Western-blot w szczepionkach wP zidentyfikowano około 30 białek immunogennych dla ludzi, w tym: Prn, BrkA (serum resistance protein), białko opiekuńcze GroEL, poryny OmpP i OmpQ, białka o immunogenno- ści wykazanej wcześniej u innych patogenów oraz nowe białka, dla których immunogenność wykazano po raz pierwszy [100]. Istotnym składnikiem szczepionek wP jest LOS, którego obecność, choć wiąże się z reaktogennością szczepionek wP, decyduje w dużym stopniu o ich właściwościach immunogennych i adiuwantowych.

Jak dotąd, wśród opisanych izolatów niewytwarzają- cych czynników zjadliwości zidentyfikowano szczepy B. pertussis niezdolne do wytwarzania antygenów stosowanych w szczepionkach aP i wP: pertaktyny (Prn), toksyny krztuścowej (Ptx), hemaglutyniny włókienkowej (FHA), fimbrii (Fim) oraz czynnika kolonizacji tchawicy (TcfA) – antygenu wchodzącego w skład szczepionek wP (tabela 2).

Tabela 2. Charakterystyka izolatów niewytwarzających antygenów szczepionkowych

W artykule, na podstawie piśmiennictwa z ostatnich dwóch dekad, przedstawiono charakterystykę izolatów B. pertussis, które nie są zdolne do wytwarzania ww. czynników zjadliwości oraz ich potencjalne znaczenie w epidemiologii krztuśca.

Izolaty niewytwarzające pertaktyny

Zdecydowana większość mutantów niewytwarzających antygenów szczepionkowych dotyczy izolatów pertaktynoujemnych (Prn¯). Pertaktyna jest białkiem strukturalnym zewnętrznej błony komórkowej B. pertussis należącym do rodziny autotransporterów. Prawdopodobnie pełni funkcję adhezyny, na co wskazuje obecność motywu RGD (Arg-Gly-Asp), który w innych białkach pozwala na wiązanie integryn komórek gospodarza [49,55]. Ponadto, Prn ma właściwości immunomodulacyjne, umożliwiające obniżenie zdolności neutrofili do skutecznego zniszczenia bakterii [40,85]. Prn ze względu na wysoko immunogenne właściwości wchodzi w skład większości powszechnie stosowanych w krajach rozwiniętych szczepionek aP. Wykazano, że szczepionki aP, które zawierają Prn, w porównaniu do szczepionek pozbawionych tego antygenu, są skuteczniejsze w klinicznej ochronie przed zachorowaniem [59,67]. Przeciwciała przeciw- -Prn odgrywają główną rolę w procesie fagocytozy B. pertussis [39], a ich poziom w niektórych badaniach z udziałem ludzi korelował z ochroną przed zachorowaniem na krztusiec [30].

O istotnym znaczeniu Prn w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej przeciw pałeczkom krztuśca świadczy również wykryty w latach 90 ub.w. polimorfizm pertaktyny – zjawiska uznawanego za potencjalny mechanizm ucieczki drobnoustroju przed poszczepienną odpowiedzią immunologiczną [63]. Polimorfizm Prn dotyczy głównie insercji/delecji powtarzających się motywów (GGXXP)n, (PQP)n zlokalizowanych, odpowiednio: w regionie R1 i R2 białka [63]. Dotąd wykryto 13 wariantów Prn [63]. Badania przeprowadzone na modelu mysim wykazały, że zmienność w obrębie pertaktyny może obniżać skuteczność szczepień przeciw krztuścowi [45] oraz zwiększać zdolność bakterii do kolonizacji układu oddechowego [93].

W najnowszych badaniach wykazano pojawienie się szczepów B. pertussis niewytwarzających Prn we Francji [7,37], Finlandii [4,99], Holandii [99], Norwegii [99], Szwecji [99], Włoszech [54], Wielkiej Brytanii [79], Izraelu [3], Kanadzie [90], USA [11,71,72,73,88], Australii [48] oraz Japonii [60,68] (tabela 2). W większości zidentyfikowanych izolatów, brak ekspresji Prn nie był wynikiem ekspansji pojedynczego klonu, lecz konsekwencją powstania niezależnych mutacji. Dotychczas opisano następujące mechanizmy mutacji determinujących fenotyp Prn¯:

• insercja fragmentu IS481 lub IS1002 w genie kodującym pertaktynę [7,11,37,48,68,72,73,88,90,99];
• delecja całego genu prn lub jego różnej długości fragmentów, w tym sekwencji sygnałowej Prn [4,7,11,48,68,79,88,99];
• pojawienie się kodonu STOP w miejscu powodującym przedwczesne zakończenie syntezy białka [48,71,72,73,88,90,99];
• insercja guaniny do homopolimerycznego fragmentu poliG prowadząca do odwracalnego przesunięcia ramki odczytu w mechanizmie zmienności fazowej [48,71];
• inwersja części promotora prn [11,71,99];
• tranzycja G->A w pozycji -162 promotora uniemożliwiająca transkrypcję prn [90];
• dotychczas niezidentyfikowane mutacje, występujące poza promotorem oraz fragmentem kodującym prn [71,90].

Wpływ utraty zdolności syntezy Prn na transmisję, patogenezę B. pertussis oraz skuteczność szczepień przeciw krztuścowi pozostaje nadal nie do końca wyjaśniony. Infekcje wywoływane przez izolaty Prn¯ u noworodków oraz dzieci <6 miesiąca życia, przebiegały z typowymi objawami kaszlu napadowego i nie różniły się od infekcji powodowanych przez szczepy Prn+ [5]. Podobnie w retrospektywnych badaniach przeprowadzonych w USA nie wykazano wyraźnych różnic w przebiegu klinicznym krztuśca u dzieci <6 miesiąca życia oraz w starszych grupach wiekowych, poza częstszym bezdechem u chorych zakażonych izolatami Prn⁺ [53]. Jednak wyniki badań efektywności zakażenia izolatami Prn¯ na modelu mysim mogą wskazywać na ich obniżoną zjadliwość u osobników dorosłych. Szczepy Prn¯ charakteryzowały się brakiem zdolności skutecznego namnażania się w płucach myszy dorosłych, w porównaniu do osobników młodych. Wyniki tych badań sugerują możliwość występowania zwiększonej liczby przypadków zakażeń bezobjawowych u osób dorosłych, tak trudnych do identyfikacji w nadzorze epidemiologicznym [7]. Mimo że pertaktyna jest uznawana za jedną z głównych adhezyn B. pertussis, w większości dotychczas przeprowadzonych badań, jej utrata nie została powiązana z obniżeniem zdolności bakterii do adhezji i wewnątrzkomórkowego zakażania komórek ssaków [25,85]. Badania in vitro na liniach komórkowych J774-A1 i HTE oraz in vivo na modelu mysim wykazały, że izolaty Prn¯ B. pertussis, w stosunku do Prn⁺, charakteryzowały się zwiększoną zdolnością do wewnątrzkomórkowego zakażania, podobną cytotoksycznością oraz letalnością LD50 [7,37,85]. Jednak należy zaznaczyć, że fenotyp Prn¯, prawdopodobnie, nie jest jedynym czynnikiem predysponującym do zwiększonej inwazyjności bakterii, ponieważ wykazywały ją również aktualnie krążące we Francji szczepy o fenotypie Prn⁺ [10]. Stosunkowo wysoki odsetek izolatów Prn¯ wśród francuskiej [37], norweskiej [99], kanadyjskiej [90], australijskiej [48], izraelskiej [3], japońskiej [68] i amerykańskiej [71] populacji szczepów B. pertussis, jak również francuskiej populacji szczepów B. parapertussis [8] sugeruje, że brak syntezy Prn nie wpłynął negatywnie na przeżywalność bakterii w populacjach o wysokim poziomie zaszczepienia przeciw krztuścowi. Izolaty Prn¯ zachowały zdolność do transmisji wśród ludzi, o czym świadczą dane epidemiologiczne z: 1) Francji, gdzie w 2005 r. wśród wyizolowanych szczepów B. pertussis zidentyfikowano 2% mutantów, podczas gdy siedem lat później aż 13% [37]; 2) Australii, gdzie w 2 stanach, w okresie 2008-2012, częstość występowania mutantów wzrosła z około 10% do 78% [48]; 3) Stanach Zjednoczonych, gdzie izolaty Prn¯ w 2012 r. stanowiły 53% wszystkich izolatów B. pertussis zgromadzonych przez CDC (Centers for Disease Control and Prevention) [71]; 4) Izraelu, gdzie w latach 2005-2006 wykryto 6,6% izolatów Prn¯, a w latach 2013-2014 już pięć razy wię- cej [3]. W badaniach retrospektywnych przeprowadzonych we Francji, potwierdzono skuteczną transmisję izolatów Prn¯ wśród osób z pojedynczego gospodarstwa domowego [5]. Zwiększanie się częstości występowania mutantów Prn¯ wśród aktualnie izolowanych szczepów B. pertussis, może wynikać z wytwarzania przez pałeczki krztuśca innych białek, które mogą rekompensować utratę ekspresji prn [37].

Izolaty niewytwarzające toksyny krztuścowej

Toksyna krztuścowa (Ptx) jest uważana za jeden z głównych czynników zjadliwości B. pertussis, należy do toksyn o budowie typu AB. Podjednostka enzymatyczna S1 toksyny krztuścowej jest ADP-rybozylotransferazą, która inaktywując białka Gi/o doprowadza do niekontrolowanego wzrostu stężenia wewnątrzkomórkowego cAMP i tym samym do zakłóceń przekaźnictwa sygnałów w komórkach gospodarza [25,55]. Następstwa fizjologiczne aktywności Ptx są uzależnione od typu komórek eukariotycznych i mogą się objawiać m.in. uczuleniem na histaminę, wzrostem sekrecji insuliny czy limfocytozą [51]. Ponadto, Ptx może wykazywać działanie immunosupresyjne wobec określonych szlaków indukcji odporności wrodzonej i nabytej [12,13,15,16,84].

Toksyna krztuścowa jest uznawana za podstawowy i najważniejszy składnik szczepionek aP. Ptx jest silnym immunogenem, który przy braku innych antygenów, może indukować powstawanie odpowiedzi immunologicznej zdolnej do ochrony przed zachorowaniem na krztusiec [89]. W badaniach na modelu mysim przeciwciała przeciw-Ptx zapewniały zwierzętom odporność na eksperymentalne zakażenie B. pertussis drogą domózgową i oddechową [76,77]. Antygen ten ma także właściwości adiuwantowe [55]. Najbardziej immunogenną a zarazem polimorficzną podjednostką Ptx jest podjednostka enzymatyczna S1 (PtxA). Dotychczas, opisano 5 wariantów PtxA, z których PtxA1 i PtxA2 charakteryzują się zwiększoną częstością występowania [63]. Badania na modelu mysim wskazują, że zmienność w obrębie PtxA może być jedną z przyczyn obniżenia skuteczności szczepień przeciw krztuścowi prowadzącej do wzrostu światowych zachorowań na krztusiec [31,46].

Dotychczas szczepy niewytwarzające Ptx, w porównaniu ze szczepami Prn¯, były izolowane sporadycznie (tabela 2). W ciągu ostatniej dekady, opisano jedynie dwa przypadki zakażeń wywołanych przez szczepy o fenotypie Ptx¯ oraz jeden przypadek zakażenia szczepem o fenotypie Ptx¯Prn¯ [7,37,97]. Szczepy Ptx¯ zostały wyizolowane we Francji, 7 i 9 lat po wprowadzeniu dawki przypominającej szczepienia szczepionką aP, natomiast szczep Ptx¯Prn¯ – w USA, około 20 lat po wprowadzeniu szczepionek aP. Jak dotąd, mechanizm mutacji odpowiedzialny za brak syntezy Ptx został wyjaśniony u dwóch szczepów – w obu przypadkach jego podstawą była delecja operonu ptx-ptl, zawierającego m.in. geny kodujące wszystkie pięć podjednostek Ptx oraz geny odpowiedzialne za sekrecję antygenu [7,97]. Oba szczepy wyizolowano od niezaszczepionych niemowląt, wykazujących charakterystyczne dla krztuśca objawy kliniczne. Opisane wyżej obserwacje objawów klinicznych wraz z obserwacjami obrazów klinicznych zakażeń wywoływanych szczepami B. parapertussis, po raz kolejny potwierdzają, że toksyna krztuścowa nie jest jedynym czynnikiem odpowiedzialnym za powstanie kaszlu napadowego. Dodatkowe badania izolatów Ptx¯ wykazały, że nie utraciły zdolności do indukowania apoptozy makrofagów i wnikania do ludzkich komórek nabłonka tchawicy [7,37]. Jednak mutanty Ptx¯ były niezdolne do namnażania się w płucach myszy i wywoływania efektu letalnego u myszy eksperymentalnie zakażonych drogą donosową [7].

Izolaty niewytwarzające hemaglutyniny włókienkowej

Hemaglutynina włókienkowa (FHA) jest wielkocząsteczkowym białkiem odgrywającym istotną rolę zarówno w patogenezie bakterii, jak i indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciw B. pertussis. Zawiera trzy rodzaje domen (HBD – Heparin Binding Domain; CRD – Carbohydrate Recognition Domain; RGD – Arg-Gly-Asp), które wiążą bakterie do różnych typów komórek eukariotycznych oraz zewnątrzkomórkowych struktur nabłonka układu oddechowego [52]. Poza adhezją, FHA uczestniczy we wnikaniu bakterii do wnętrza makrofagów i komórek nabłonka [41], wykazuje właściwości immunomodulujące (wpływa na sekrecję pro-, przeciwzapalnych cytokin i aktywację NF_-κB) oraz pełni istotną rolę w procesie tworzenia biofilmu [1,15,80]. Hemaglutynina włókienkowa, po toksynie krztuścowej, jest najczęściej występującym składnikiem szczepionek aP. Wykazano, że przeciwciała przeciw-FHA chronią przed zachorowaniem na krztusiec ludzi oraz skutecznie eliminują zakażenie pałeczkami krztuśca u eksperymentalnie zakażanych myszy [14,33,81]. Jednak znane są również wyniki badań, które nie potwierdzają związku między poziomem przeciwciał przeciw-FHA a ochroną przeciw B. pertussis u ludzi i zwierząt [19,76,87].

Dotychczas na świecie zidentyfikowano dwa mutanty niewytwarzające hemaglutyniny włókienkowej (tabela 2). Oba zidentyfikowano we Francji – jeden przed wprowadzeniem szczepień przeciw krztuścowi, drugi po wprowadzeniu szczepień z zastosowaniem szczepionek aP [37]. W przypadku pierwszego szczepu, przyczyną utraty zdolności wytwarzania FHA było pojawienie się kodonu STOP w obrębie genu fhaB, w przypadku drugiego – prawdopodobnie, pojawienie się sekwencji insercyjnej w genie fhaB [10]. Szczep pochodzący z okresu po wprowadzeniu szczepień z zastosowaniem szczepionek aP był podwójnym mutantem, który utracił możliwość wytwarzania zarówno FHA, jak i Prn. Badania przeprowadzone in vitro na liniach komórkowych oraz in vivo u zwierząt wykazały, że oba izolaty pozostały cytotoksyczne dla makrofagów oraz letalne dla myszy po eksperymentalnym zakażeniu donosowym [37]. Wykazano także, że szczep FHA¯Prn¯ charakteryzował się mniejszą inwazyjnością wobec komórek HTE w porównaniu z inwazyjnością szczepu referencyjnego Tohama [10]. Badania B. pertussis z doświadczalnie wyłączonym genem fhaC, zaangażowanym w sekrecję FHA, wykazały, że fenotyp FHA¯ miał obniżoną zdolność do kolonizacji tchawicy, lecz nie płuc u myszy [27,96]. Interesujących danych dotyczących szczepów FHA¯ dostarczyła analiza transkryptomów różnych izolatów B. pertussis, według której bakterie o fenotypie FHA¯ w przeciwieństwie do szczepów FHA⁺ cechowały się zwiększoną ekspresją genów kodujących podstawowe czynniki zjadliwości (PtxA, Prn, ACT) [10]. Natomiast tego typu różnic nie zaobserwowano między szczepami Prn¯ i Prn⁺.

Izolaty niewytwarzające fimbri

Fimbrie, zwane również pili typu I, są zbudowane ze spolimeryzowanych podjednostek głównych Fim2 lub Fim3 oraz znajdującej się na ich szczycie podjednostki mniejszej FimD [55]. Wiele szczepów Bordetella zawiera również geny kodujące inne podjednostki główne (FimX, FimN, FimA), jednak ich produkty dotychczas nie zostały zidentyfikowane [78]. Typ podjednostki głównej fimbrii określa serotyp B. pertussis: Fim2, Fim3 albo Fim2,3. Obecnie, w wielu krajach o wysokim poziomie zaszczepienia przeciw krztuścowi dominuje serotyp Fim3. Podjednostki główne fimbrii są kodowane przez geny fim2 i fim3, podlegające regulacji przez system BvgAS oraz mechanizm zmienności fazowej, polegający na zmianie długości homopolimerycznych powtórzeń poliC w promotorach obu genów [55]. Oba geny kodujące Fim2 i Fim3 wykazują niewielki polimorfizm. Dotychczas zidentyfikowano 2 allele fim2 i 5 alleli fim3 [63,83]. Fimbrie prawdopodobnie uczestniczą w kolonizacji nabłonka oddechowego oraz modulowaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Podjednostki główne oraz podjednostka mniejsza Fim zawierają regiony wiążące heparynę, które przyłączają się do zewnątrzkomórkowej macierzy nabłonka oddechowego oraz fibronektyny [27,28]. Ponadto, podjednostka FimD przyłącza się do VLA-5 makrofagów, co stymuluje wytwarzanie integryn CR3 – receptorów FHA [55]. Fimbrie wykazują właściwości przeciwzapalne i hamują zabijanie bakterii przez makrofagi w płucach [55]. Ze względu na właściwości immunogenne fimbrie są istotnym składnikiem szczepionek wP i niektórych szczepionek aP [19,57,74,87]. Badania kliniczne wykazały, że obecność Fim2 oraz Fim3 w szczepionkach aP, zwiększa ich skuteczność w porównaniu ze szczepionkami niezawierającymi fimbrii [67].

Dotychczas opisano trzy izolaty o fenotypie Fim¯, niewytwarzające Fim2 i Fim3, dwa z nich pochodziły z Japonii, jeden z Kanady [60,83]. Bakterie wyizolowano w okresie powszechnego stosowania szczepień aP. Przyczyny występowania fenotypu Fim¯ nie zostały dotychczas wyjaśnione. Nie wiadomo, czy brak wytwarzania fimbrii wynikał z czasowego wyłączenia ekspresji genów w mechanizmie zmienności fazowej, czy też był konsekwencją mutacji powodujących stałą inaktywację ekspresji fim2 i fim3. Uwzględniając to, że fimbrie uczestniczą w kolonizacji dróg oddechowych i modulowaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza, zagadkowy pozostaje także wpływ fenotypu Fim¯ na transmisję i patogenzę B. pertussis. Badania in vivo z użyciem szczepów B. pertussis z doświadczalnie wyłączoną syntezą fimbrii wskazują na utratę zdolności bakterii do efektywnej kolonizacji tchawicy i nosogardzieli [27,55] oraz nasiloną w porównaniu do szczepów dzikich reakcję zapalną gospodarza na zakażenie [96].

Izolaty niewytwarzające czynnika kolonizacji tchawicy

Czynnik kolonizacji tchawicy jest unikatowym autotransporterem B. pertussis, który nie występuje u blisko spokrewnionych gatunków B. parapertussis i Bordetella bronchiseptica [26]. Cechą charakterystyczną TcfA jest duża zawartość proliny w łańcuchu polipeptydowym oraz obecność motywu RGD. Podczas zakażenia,TcfA uczestniczy w kolonizacji nabłonka tchawicy [51]. Prawdopodobnie, TcfA jest antygenem zaangażowanym w powstawanie ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciw pałeczkom krztuśca, za czym może przemawiać wysoki stopień polimorfizmu kodującego go genu – tcfA [61].

Izolaty B. pertussis, które nie wytwarzały czynnika kolonizacji tchawicy opisano w Belgii, Wielkiej Brytanii, Holandii i USA, a więc w krajach z długą historią szczepień wP [69,92,91] (tabela 2). Ich występowanie, podobnie jak w przypadku izolatów Prn¯, nie było spowodowane rozpowszechnieniem się klonów TcfA¯, lecz pojawieniem się mutacji w obrębie różnych linii B. pertussis [92]. Do mutacji odpowiedzialnych za fenotyp TcfA¯ zalicza się: delecję genu tcfA oraz insercję/delecję pojedynczego nukleotydu G w obrębie homopolimerycznej sekwencji poliG, co powoduje przesunięcie ramki odczytu tcfA i przedwczesne zakończenie syntezy białka [92,95]. Drugi typ mutacji jest związany z występowaniem zmienności fazowej B. pertussis, czyli może, przez włączanie/wyłączanie ekspresji genów, łatwo ulec rewersji [29]. Wpływ utraty zdolności wytwarzania TcfA na wirulencję B. pertussis nie został jeszcze poznany, jednak wyniki badań in vivo z udziałem zwierząt sugerują, że synteza tego antygenu może mieć znaczenie dla przeżywalności bakterii. Finn i Stevens [26] wykazali, że mutant tcfA 10 razy słabiej kolonizował tchawicę w porównaniu ze szczepem dzikim, natomiast był równie efektywny w kolonizacji płuc. Jednak brak syntezy TcfA przez blisko spokrewnione gatunki B. parapertussis i B. bronchiseptica, może świadczyć o tym, że jego utrata u B. pertussis może być kompensowana przez inne białka [92].

Presja szczepień a występowanie izolatów niewytwarzających antygenów szczepionkowych

B. pertussis, podobnie jak B. parapertussis, jest patogenem, który wyewoluował z Bordetella bronchiseptica. Ewolucja B. pertussis była związana z utratą dużej części materiału genetycznego (ponad 1Mpz) oraz powstaniem wielu pseudogenów (9,4%) [23,70]. W obrębie usuniętych lub inaktywowanych genów znalazły się m.in. loci odpowiedzialne za transport błonowy, metabolizm niskocząsteczkowych substancji, regulację ekspresji genów oraz syntezę struktur powierzchniowych. Utrata wielu genów mogła być następstwem adaptacji bakterii do nowego gospodarza lub braku skutecznej presji korzystnej dla ich zachowania. Przyczyną utraty wielu genów była aktywność sekwencji insercyjnych (IS). IS są obecne w genomie B. pertussis w dużej liczbie, przy czym najbardziej ekspansywną jest IS481 – sekwencja, która w referencyjnym szczepie B. pertussis Tohama I, występuje 238 razy [70]. Badania genomów bakterii wyizolowanych na przestrzeni kilku ostatnich dziesięcioleci wykazały, że utrata materiału genetycznego była procesem ciągłym, obejmującym także współczesną populację B. pertussis [9,38,45]. Krążące obecnie izolaty zawierają więcej sekwencji insercyjnych niż izolaty pochodzące z okresu przed wprowadzeniem szczepień przeciw krztuścowi [9,43]. Wskazuje to, że gatunek ten nieustannie ewoluuje i stale podlega zmianom adaptacyjnym. Utrata materiału genetycznego u B. pertussis zdarza się niezależnie od regionu pochodzenia izolatów oraz poziomu zaszczepienia przeciw krztuścowi badanej populacji [45]. Jednak w krajach o wysokim poziomie zaszczepienia przeciw krztuścowi, obecność presji selekcyjnej w postaci odpowiedzi immunologicznej wzbudzanej szczepieniami może być istotnym czynnikiem wpływającym na kierunek obserwowanych zmian genetycznych. Przypuszcza się, że wieloletnie, masowo prowadzone szczepienia doprowadziły do pojawienia się nowych szczepów B. pertussis o obniżonej wrażliwości na działanie odpowiedzi immunologicznej indukowanej przez stosowanie szczepień (tzw. escape mutants). Przemawiają za tym szeroko opisywane zmiany, jakie zaszły w ciągu dwóch ostatnich dekad w strukturze genetycznej B. pertussis, a które obejmowały nasilenie się istotnego z punktu widzenia odpowiedzi immunologicznej polimorfizmu alleli genów kodujących wiele białek oraz mutację promotora toksyny krztuścowej, prowadzącą do zwiększenia jej syntezy [31,46,61,62,64,93]. Podobne znaczenie mogą mieć mutacje prowadzące do zahamowania syntezy antygenów wchodzących w skład stosowanych szczepionek przeciw krztuścowi.

Utrata zdolności ekspresji pewnych immunogenów szczepionkowych wydaje się mieć szczególne znaczenie dla adaptacji bakterii do odpowiedzi immunologicznej wzbudzanej w populacji przez stosowanie szczepionek bezkomórkowych. Ze względu na to, że szczepionki całokomórkowe indukują odpowiedź immunologiczną przeciw wielu antygenom, wyłączenie ekspresji jednego z nich może mieć niewielki wpływ na wzrost przeżywalności bakterii. W przypadku presji selekcyjnej w postaci powszechnego stosowania szczepionek aP, które zawierając 1-5 antygenów indukują wąski zakres odpowiedzi immunologicznej, utrata ekspresji choćby jednego z antygenów szczepionkowych może znacząco zwiększyć przeżywalność bakterii. Pojawienie się izolatów niewytwarzających antygenów szczepionkowych może być wynikiem zastąpienia szczepionek wP szczepionkami aP.

Hipotezę potwierdzają dane na temat częstości izolacji bakterii niewytwarzających pertaktyny na świecie [4,7,37,68,72]. Większość opisanych mutantów Prnˉ została wyizolowana w okresie, w którym rutynowo stosowano szczepionki aP zamiast wP. Zaobserwowano, że wraz z wydłużaniem się czasu powszechnego stosowania szczepionek aP, tj. presji indukowanej z ich udziałem, wzrósł udział izolatów Prnˉ w populacji B. pertussis [3,37,48,68,71]. Za przedstawioną hipotezą przemawia również to, że w Rosji [47] i Senegalu [66], krajach nadal powszechnie stosujących szczepionki wP oraz w Danii [99], kraju stosującym szczepionkę aP zawierającą jedynie Ptx, dotychczas nie zidentyfikowano izolatów Prnˉ. Jednak, wzrost częstości występowania izolatów Prnˉ również wśród pałeczek B. parapertussis, teoretycznie niepodlegających presji selekcyjnej szczepionek aP, zaobserwowany we Francji, może sugerować, że mutacje Prnˉ mogą być skutkiem naturalnej ewolucji bakterii, która może być wzmacniana przez aktualny status immunologiczny populacji bardziej niż przez samą presję selekcyjną związaną ze stosowaniem szczepionek aP [36]. Ponadto, najnowsze dane z ostatniej epidemii krztuśca w Japonii [60] oraz z 2014 r. z Francji wykazały spadek częstości występowania izolatów Prnˉ w stosunku do lat poprzednich [36]. Jest to zastanawiające, jeśli przyjmiemy, że brak wytwarzania tego antygenu w warunkach powszechnego stosowania szczepień zwiększa przewagę selekcyjną mutantów Prnˉ nad szczepami dzikimi. Aby w pełni zrozumieć związek między szczepionkami aP a powstaniem izolatów Prnˉ należy przeprowadzić szersze badania obejmujące izolaty pochodzące z krajów stosujących różne strategie szczepień, pochodzące sprzed okresu stosowania szczepionek aP oraz obserwować aktualne trendy dotyczące występowania mutantów Prnˉ.

W przeciwieństwie do izolatów Prnˉ, pałeczki krztuśca niewytwarzające pozostałych antygenów wchodzących w skład szczepionek aP (Ptx, FHA lub Fim) były izolowane sporadycznie. Według Hegerle i Guiso [36] przyczyny tego stanu rzeczy mogą być następujące:

• antygeny strukturalne błony komórkowej, tj. Prn i Fim, podlegają silniejszej presji immunologicznej niż antygeny wydzielane na zewnątrz komórki (Ptx, FHA);
• szczepienia z udziałem aP wywierają silniejszą presję selekcyjną na Prn niż Fim, ponieważ: (i) Prn występuje w szczepionkach aP 3- i 5-walentnych, podczas gdy Fim – jedynie w 5-walentnych; (ii) większość krążących obecnie izolatów B. pertussis ma Fim3, przeciw którym pentawalentne szczepionki aP indukują słabszą, w porównaniu do Fim2, odpowiedź immunologiczną.

Mimo rzadkiego występowania izolatów FHAˉ, Ptxˉ lub Fimˉ w krążącej populacji B. pertussis monitorowanie obecności tych antygenów wśród nowo izolowanych pałeczek krztuśca jest uzasadnione ze względu na rosnącą liczbę izolacji szczepów Prnˉ.

Wśród szczepów B. pertussis zidentyfikowano mutanty, które nie wytwarzały czynnika kolonizacji tchawicy. Antygen ten nie występuje w szczepionkach aP, co wyklucza ich rolę w zahamowaniu syntezy TcfA, a sugeruje możliwość wpływu presji z udziałem szczepionek wP lub też stale postępującą redukcję genomu B. pertussis. W krajach, w których wyizolowano szczepy TcfAˉ przez ponad 40 lat stosowano szczepionki wP [92]. Ponadto czynnik kolonizacji tchawicy charakteryzuje się polimorficznością, co sugeruje, że odpowiedź immunologiczna na TcfA może wpływać na przeżywalność bakterii. W takim wypadku zahamowanie ekspresji TcfA, stałe (delecja genu tcfA) lub tymczasowe (mutacje homopolimerycznej sekwencji poliG), może być dla bakterii korzystne [92]. Ze względu na to, że w ostatnim czasie, większość rozwiniętych krajów, z wyjątkiem Polski, wprowadziła do powszechnych programów szczepień zamiast szczepionek wP szczepionki aP jest prawdopodobne, że częstość izolacji szczepów TcfAˉ wśród krążą- cych szczepów może się zmniejszać.

Izolaty niewytwarzające antygenów szczepionkowych a epidemiologia krztuśca

W krajach o wysokim poziomie zaszczepienia przeciw krztuścowi znajdują się dwie grupy osób o dużej podatności na zakażenie B. pertussis:

• niezaszczepione noworodki lub nie w pełni zaszczepione niemowlęta i dzieci oraz
• młodzież, osoby dorosłe i starsze z wygasającą poszczepienną odpowiedzią ochronną przeciw krztuścowi.

Ze względu na rosnącą liczbę doniesień na temat izolacji mutantów niewytwarzających pertaktyny szczególnie aktualne wydaje się postawienie pytania o ich znaczenie w epidemiologii krztuśca w grupach wiekowych obarczonych dużym ryzykiem zachorowania. W wielu rozwiniętych krajach w ostatnich latach występowały epidemie krztuśca, w których doszło do wzrostu występowania izolatów Prnˉ w porównaniu do lat poprzednich.

Pojawienie się izolatów niewytwarzających pertaktyny może stanowić mechanizm adaptacyjny bakterii umożliwiający skuteczniejsze zakażanie osób z wygasającą ochroną poszczepienną. Potencjalnie zwiększone krążenie tych mutantów wśród osób dorosłych z wygasającą ochroną poszczepienną może być źródłem zakażeń dla innych grup wiekowych, szczególnie noworodków i niemowląt. Możliwe, że utrata zdolności syntezy Prn, pozwala bakteriom na wcześniejsze zakażenie osób zaszczepionych. Może być to o tyle niebezpieczne, że odporność po szczepieniu szczepionkami aP jest zdecydowanie krótsza w porównaniu do odporności po szczepieniu szczepionkami wP. Badania kohortowe dzieci wykazały, że ryzyko zachorowania na krztusiec w ciągu całego ich życia było większe, kiedy pierwszą dawką szczepienia była szczepionka aP, a nie wP [50,82]. W ostatnich latach, we Francji i Japonii odsetek mutantów Prnˉ wśród wszystkich izolatów B. pertussis wynosił, odpowiednio 13 i 26% [37,60], natomiast w Australii i Stanach Zjednoczonych 78 i 53% [48,71]. Tak częste występowanie izolatów Prnˉ oraz wyniki badania retrospektywnego przeprowadzonego we Francji [5] sugerują, że mutanty te mogą być zdolne do skutecznej transmisji. Co więcej, wywołane przez nie objawy kliniczne krztuśca były podobne do objawów spowodowanych przez izolaty Prn+ [5,21,53], co sugeruje, że utrata zdolności syntezy Prn nie wpłynęła negatywnie na zjadliwość B. pertussis. Badania in vitro wykazały, że mutanty Prnˉ były cytotoksyczne dla makrofagów w obecności przeciwciał przeciw-Prn [35] oraz efektywniej kolonizowały płuca myszy immunizowanych szczepionką aP [34,75]. Osoby zaszczepione przynajmniej jedną dawką szczepionki aP miały istotnie większe szanse zakażenia się izolatami Prnˉ niż szczepami Prn+ [53].

Inną istotną kwestią wynikającą z występowania izolatów niewytwarzających antygenów szczepionkowych jest ich znaczenie w diagnostyce zakażeń krztuśca. W państwach, w których podstawą potwierdzeń przypadków podejrzanych o zachorowanie na krztusiec są badania serologiczne, oparte na oznaczaniu miana przeciwciał przeciw-Ptx, ewentualne rozprzestrzenienie się szczepów niewytwarzających toksyny krztuścowej może prowadzić do nieprawidłowego potwierdzania diagnozy klinicznej i do nieprawidłowej oceny zapadalności na krztusiec [7]. Podobnie identyfikacja molekularna B. pertussis obejmująca m.in. wykrywanie promotora Ptx, w wyżej wymienionej sytuacji, może się przyczyniać do błędów w nadzorze. Ze względu na rosnącą liczbę izolatów Prnˉ uzasadnione jest stałe monitorowanie częstości występowania mutacji w obrębie innych antygenów oraz tych fragmentów genomu B. pertussis, które są celem diagnostyki molekularnej.

Podsumowanie

Pojawienie się izolatów B. pertussis niewytwarzających Prn, Ptx, FHA, Fim lub TcfA, wywołało w środowisku naukowym debatę na temat ich znaczenia w epidemiologii oraz profilaktyce krztuśca na świecie. Cztery pierwsze białka są silnymi immunogenami wchodzą- cymi w skład szczepionek aP, natomiast TcfA jest jednym z wielu antygenów B. pertussis w sposób naturalny obecnych w szczepionkach wP. Przypuszcza się, że pojawienie się zmutowanych szczepów może być wynikiem działania presji odpowiedzi immunologicznej wzbudzanej szczepieniami przeciw krztuścowi. Bakterie, które utraciły zdolność do syntezy, co najmniej jednego z immunogenów szczepionkowych mogłyby, zatem potencjalnie wykazywać obniżoną wrażliwość na poszczepienną odpowiedź immunologiczną (tzw. escape mutants). Zwiększone krążenie takich mutantów może stanowić niekorzystną prognozę celowości kontynuacji szczepień z udziałem szczepionek aP, które zawierają jedynie 1-5 antygenów B. pertussis i indukują węższy zakres odpowiedzi immunologicznej niż szczepionki wP. Inne wyjaśnienie ich obecności w populacji B. pertussis zakłada, że utrata zdolności wytwarzania tych antygenów może być skutkiem naturalnej ewolucji bakterii.

Wśród wyizolowanych mutantów dotychczas dominował fenotyp Prn¯. Częstość izolacji bakterii o fenotypie Prn¯ w niektórych krajach skorelowano z długością okresu stosowania szczepionek aP. Objawy kliniczne krztuśca wywołanego przez izolaty Prn¯ nie różniły się od objawów wywołanych przez izolaty Prn⁺.

Dokładne poznanie wpływu fenotypu Prn¯ na wirulencję, patogenność, skuteczność transmisji bakterii oraz efektywność prowadzonych szczepień wymaga przeprowadzenia dalszych badań. Poznanie tych zagadnień może być istotne dla zrozumienia przyczyn wzrostu zachorowań na krztusiec na świecie i doprowadzić do opracowania zoptymalizowanych strategii poprawy profilaktyki krztuśca.

---

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Przypisy

• 1. Abramson T., Kedem H., Relman D.A.: Proinflammatory and proapoptoticactivities associated with Bordetella pertussis filamentoushemagglutinin. Infect. Immun., 2001; 69: 2650-2658
  Google Scholar
• 2. Advani A., Hallander H.O., Dalby T., Krogfelt K.A., Guiso N., NjamkepoE., von Könnig C.H., Riffelmann M., Mooi F.R., Sandven P., LutynskaA., Fry N.K., Mertsola J., He Q.: Pulsed-field gel electrophoresisanalysis of Bordetella pertussis isolates circulating in Europe from 1998to 2009. J. Clin. Microbiol., 2013; 51: 422-428
  Google Scholar
• 3. Bamberger E., Abu Raya B., Cohen L., Golan-Shany O., DavidsonS., Geffen Y., Srugo I.: Pertussis resurgence associated with pertactin-deficientand genetically divergent Bordetella pertussis isolates inIsrael. Pediatr. Infect. Dis. J., 2015; 34: 898-900
  Google Scholar
• 4. Barkoff A.M., Mertsola J., Guillot S., Guiso N., Berbers G., He Q.:Appearance of Bordetella pertussis strains not expressing the vaccineantigen pertactin in Finland. Clin. Vaccine Immunol., 2012; 19:1703-1704
  Google Scholar
• 5. Bodilis H., Guiso N.: Virulence of pertactin-negative Bordetellapertussis isolates from infants, France. Emerg. Infect. Dis., 2013; 19:471-474
  Google Scholar
• 6. Bogdanowicz J.: Krztusiec. Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich,Warszawa 1954
  Google Scholar
• 7. Bouchez V., Brun D., Cantinelli T., Dore G., Njamkepo E., Guiso N.:First report and detailed characterization of B. pertussis isolates notexpressing pertussis toxin or pertactin. Vaccine, 2009; 27: 6034-6041
  Google Scholar
• 8. Bouchez V., Brun D., Dore G., Njamkepo E., Guiso N.: Bordetellaparapertussis isolates not expressing pertactin circulating in France.Clin. Microbiol. Infect., 2011; 17: 675-682
  Google Scholar
• 9. Bouchez V., Caro V., Levillain E., Guigon G., Guiso N.: Genomiccontent of Bordetella pertussis clinical isolates circulating in areas ofintensive children vaccination. PLoS One, 2008; 3: e2437
  Google Scholar
• 10. Bouchez V., Hegerle N., Strati F., Njamkepo E., Guiso N.: Newdata on vaccine antigen deficient Bordetella pertussis isolates. Vaccines,2015; 3: 751-770
  Google Scholar
• 11. Bowden K.E., Williams M.M., Cassiday P.K., Milton A., PawloskiL., Harrison M., Martin S.W., Meyer S., Qin X., DeBolt C., Tasslimi A.,Syed N., Sorrell R., Tran M., Hiatt B., Tondella M.L.: Molecular epidemiologyof the pertussis epidemic in Washington State in 2012. J.Clin. Microbiol., 2014; 52: 3549-3557
  Google Scholar
• 12. Bradford P.G., Rubin R.P.: Pertussis toxin inhibits chemotacticfactor-induced phospholipase C stimulation and lysosomal enzymesecretion in rabbit neutrophils. FEBS Lett., 1985; 183: 317-320
  Google Scholar
• 13. Brandt S.J., Dougherty R.W., Lapetina E.G., Niedel J.E.: Pertussistoxin inhibits chemotactic peptide-stimulated generation of inositolphosphates and lysosomal enzyme secretion in human leukemic(HL-60) cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985; 82: 3277-3280
  Google Scholar
• 14. Cahill E.S., O’Hagan D.T., Illum L., Redhead K.: Mice are protectedagainst Bordetella pertussis infection by intra-nasal immunizationwith filamentous haemagglutinin. FEMS Microbiol. Lett.,1993; 107: 211-216
  Google Scholar
• 15. Carbonetti N.H.: Immunomodulation in the pathogenesis ofBordetella pertussis infection and disease. Curr. Opin. Pharmacol.,2007; 7: 272-278
  Google Scholar
• 16. Carbonetti N.H., Artamonova G.V., Andreasen C., Dudley E., MaysR.M., Worthington Z.E.: Suppression of serum antibody responsesby pertussis toxin after respiratory tract colonization by Bordetellapertussis and identification of an immunodominant lipoprotein. Infect.Immun., 2004; 72: 3350-3358
  Google Scholar
• 17. Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Pertussisepidemic-Washington, 2012. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep., 2012;61: 517-522
  Google Scholar
• 18. Cherry J.D.: Pertussis: challenges today and for the future. PLoSPathog., 2013; 9: e1003418
  Google Scholar
• 19. Cherry J.D., Gornbein J., Heininger U., Stehr K.: A search for serologiccorrelates of immunity to Bordetella pertussis cough illnesses.Vaccine, 1998; 16: 1901-1906
  Google Scholar
• 20. Chiappini E., Stival A., Galli L., de Martino M.: Pertussis re-emergencein the post-vaccination era. BMC Infect. Dis., 2013; 13: 151
  Google Scholar
• 21. Clarke M., McIntyre P.B., Blyth C.C., Wood N., Octavia S., SintchenkoV., Giles L., Quinn H., Hill V., Hanly G., Lan R., Marshall H.S.: Therelationship between Bordetella pertussis genotype and clinical severityin Australian children with pertussis. J. Infect., 2016; 72: 171-178
  Google Scholar
• 22. de Gouw D., Diavatopoulos D.A., Bootsma H.J., Hermans P.W.,Mooi F.R.: Pertussis: a matter of immune modulation. FEMS Microbiol.Rev., 2011; 35: 441-474
  Google Scholar
• 23. Diavatopoulos D.A., Cummings C.A., Schouls L.M., Brinig M.M.,Relman D.A., Mooi F.R.: Bordetella pertussis, the causative agent ofwhooping cough, evolved from a distinct, human-associated lineageof B. bronchiseptica. PLoS Pathog., 2005; 1: e45
  Google Scholar
• 24. Dubé E., Vivion M., MacDonald N.E.: Vaccine hesitancy, vaccinerefusal and the anti-vaccine movement: influence, impact and implications.Expert Rev. Vaccines, 2015; 14: 99-117
  Google Scholar
• 25. Fedele G., Bianco M., Ausiello C.M.: The virulence factors ofBordetella pertussis: talented modulators of host immune response.Arch. Immunol. Ther. Exp., 2013; 61: 445-457
  Google Scholar
• 26. Finn T.M., Stevens L.A.: Tracheal colonization factor: a Bordetellapertussis secreted virulence determinant. Mol. Microbiol., 1995;16: 625-634
  Google Scholar
• 27. Geuijen C.A., Willems R.J., Bongaerts M., Top J., Gielen H., MooiF.R.: Role of the Bordetella pertussis minor fimbrial subunit, FimD, incolonization of the mouse respiratory tract. Infect. Immun., 1997;65: 4222-4228
  Google Scholar
• 28. Geuijen C.A., Willems R.J., Mooi F.R.: The major fimbrial subunitof Bordetella pertussis binds to sulfated sugars. Infect. Immun.,1996; 64: 2657-2665
  Google Scholar
• 29. Gogol E.B., Cummings C.A., Burns R.C., Relman D.A.: Phase variationand microevolution at homopolymeric tracts in Bordetellapertussis. BMC Genomics, 2007; 8: 122
  Google Scholar
• 30. Gustafsson L., Hallander H.O., Olin P., Reizenstein E., StorsaeterJ.: A controlled trial of a two-component acellular, a five-componentacellular, and a whole-cell pertussis vaccine. N. Engl. J. Med.,1996; 334: 349-355
  Google Scholar
• 31. Gzyl A., Augustynowicz E., Gniadek G., Rabczenko D., Dulny G.,Slusarczyk J.: Sequence variation in pertussis S1 subunit toxin andpertussis genes in Bordetella pertussis strains used for the whole-cellpertussis vaccine produced in Poland since 1960: efficiency of theDTwP vaccine-induced immunity against currently circulating B.pertussis isolates. Vaccine, 2004; 22: 2122-2128
  Google Scholar
• 32. He Q., Mertsola J.: Factors contributing to pertussis resurgence.Future Microbiol., 2008; 3: 329-339
  Google Scholar
• 33. He Q., Viljanen M.K., Olander R.M., Bogaerts H., De Grave D.,Ruuskanen O, Mertsola J.: Antibodies to filamentous hemagglutininof Bordetella pertussis and protection against whooping coughin schoolchildren. J. Infect. Dis., 1994; 170: 705-708
  Google Scholar
• 34. Hegerle N., Dore G., Guiso N.: Pertactin deficient Bordetella pertussispresent a better fitness in mice immunized with an acellularpertussis vaccine. Vaccine, 2014; 32: 6597-6600
  Google Scholar
• 35. Hegerle N., Guiso N.: Antibody-mediated inhibition of Bordetellapertussis adenylate cyclase-haemolysin-induced macrophagecytotoxicity is influenced by variations in the bacterial population.Microbiology, 2014; 160: 962-969
  Google Scholar
• 36. Hegerle N., Guiso N.: Bordetella pertussis and pertactin-deficientclinical isolates: lessons for pertussis vaccines. Expert Rev. Vaccines,2014; 13: 1135-1146
  Google Scholar
• 37. Hegerle N., Paris A.S., Brun D., Dore G., Njamkepo E., Guillot S.,Guiso N.: Evolution of French Bordetella pertussis and Bordetella parapertussisisolates: increase of Bordetellae not expressing pertactin.Clin. Microbiol. Infect., 2012; 18: E340-E346
  Google Scholar
• 38. Heikkinen E., Kallonen T., Saarinen L., Sara R., King A.J., MooiF.R., Soini J.T., Mertsola J., He Q.: Comparative genomics of Bordetellapertussis reveals progressive gene loss in Finnish strains. PLoSOne, 2007; 2: e904
  Google Scholar
• 39. Hellwig S.M., Rodriguez M.E., Berbers G.A., van de Winkel J.G.,Mooi F.R.: Crucial role of antibodies to pertactin in Bordetella pertussisimmunity. J. Infect. Dis., 2003; 188: 738-742
  Google Scholar
• 40. Inatsuka C.S., Xu Q., Vujkovic-Cvijin I., Wong S., Stibitz S., MillerJ.F., Cotter P.A.: Pertactin is required for Bordetella species to resistneutrophil-mediated clearance. Infect. Immun., 2010; 78: 2901-2909
  Google Scholar
• 41. Ishibashi Y., Relman D.A., Nishikawa A.: Invasion of human respiratoryepithelial cells by Bordetella pertussis: possible role for a filamentoushemagglutinin Arg-Gly-Asp sequence and α5β1 integrin.Microb. Pathog., 2001; 30: 279-288
  Google Scholar
• 42. Jakinovich A., Sood S.K.: Pertussis: still a cause of death, sevendecades into vaccination. Curr. Opin. Pediatr., 2014; 26: 597-604
  Google Scholar
• 43. Kallonen T., Gröndahl-Yli-Hannuksela K., Elomaa A., LutyńskaA., Fry N.K., Mertsola J., He Q.: Differences in the genomic contentof Bordetella pertussis isolates before and after introduction of pertussisvaccines in four European countries. Infect. Genet. Evol., 2011;11: 2034-2042
  Google Scholar
• 44. King A.J., Berbers G., van Oirschot H.F., Hoogerhout P., KnippingK., Mooi F.R.: Role of the polymorphic region 1 of the Bordetella pertussisprotein pertactin in immunity. Microbiology, 2001; 147: 2885-2895
  Google Scholar
• 45. King A.J., van Gorkom T., van der Heide H.G., Advani A., vander Lee S.: Changes in the genomic content of circulating Bordetellapertussis strains isolated from the Netherlands, Sweden, Japan andAustralia: adaptive evolution or drift? BMC Genomics, 2010; 11: 64
  Google Scholar
• 46. Komatsu E., Yamaguchi F., Abe A., Weiss A.A., Watanabe M.: Synergiceffect of genotype changes in pertussis toxin and pertactinon adaptation to an acellular pertussis vaccine in the murine intranasalchallenge model. Clin. Vaccine. Immunol., 2010; 17: 807-812
  Google Scholar
• 47. Kurova N., Njamkepo E., Brun D., Tseneva G., Guiso N.: Monitoringof Bordetella isolates circulating in Saint Petersburg, Russiabetween 2001 and 2009. Res. Microbiol., 2010; 161: 810-815
  Google Scholar
• 48. Lam C., Octavia S., Ricafort L., Sintchenko V., Gilbert G.L., WoodN., McIntyre P., Marshall H., Guiso N., Keil A.D., Lawrence A., RobsonJ., Hogg G., Lan R.: Rapid Increase in pertactin-deficient Bordetellapertussis isolates, Australia. Emerg. Infect. Dis., 2014; 20: 626-633
  Google Scholar
• 49. Leininger E., Roberts M., Kenimer J.G., Charles I.G., FairweatherN., Novotny P., Brennan M.J.: Pertactin, an Arg-Gly-Asp-containingBordetella pertussis surface protein that promotes adherence of mammaliancells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991; 88: 345-349
  Google Scholar
• 50. Liko J., Robison S.G., Cieslak P.R.: Priming with whole-cell versusacellular pertussis vaccine. N. Engl. J. Med., 2013; 368: 581-582
  Google Scholar
• 51. Locht C.: Molecular aspects of Bordetella pertussis pathogenesis.Int. Microbiol., 1999; 2: 137-144
  Google Scholar
• 52. Locht C., Bertin P., Menozzi F.D., Renauld G.: The filamentoushaemagglutinin, a multifaceted adhesion produced by virulent Bordetellaspp. Mol. Microbiol., 1993; 9: 653-660
  Google Scholar
• 53. Martin S.W., Pawloski L., Williams M., Weening K., DeBolt C., QinX., Reynolds L., Kenyon C., Giambrone G., Kudish K., Miller L., SelvageD., Lee A., Skoff T.H., Kamiya H. i wsp.: Pertactin-negative Bordetellapertussis strains: evidence for a possible selective advantage. Clin.Infect. Dis., 2015; 60: 223-227
  Google Scholar
• 54. Mastrantonio P., Spigaglia P., van Oirschot H., van der Heide H.G.,Heuvelman K., Stefanelli P., Mooi F.R.: Antigenic variants in Bordetellapertussis strains isolated from vaccinated and unvaccinated children.Microbiology, 1999; 145: 2069-2075
  Google Scholar
• 55. Mattoo S., Cherry J.D.: Molecular pathogenesis, epidemiology,and clinical manifestations of respiratory infections due to Bordetellapertussis and other Bordetella subspecies. Clin. Microbiol Rev.,2005; 18: 326-382
  Google Scholar
• 56. McCarthy M.: Vaccine refusal may have contributed to California’s 2010 pertussis outbreak, study finds. Br. Med. J., 2013; 347: f6109
  Google Scholar
• 57. Medical Research Council 1956: VACCINATION against whooping-cough;relation between protection in children and resultsof laboratory tests; a report to the Whooping-cough ImmunizationCommittee of the Medical Research Council and to the medical officersof health for Cardiff, Leeds, Leyton, Manchester, Middlesex,Oxford, Poole, Tottenham, Walthamstow, and Wembley. Br. Med. J.,1956; 2: 454-462
  Google Scholar
• 58. Melvin J.A., Scheller E.V., Miller J.F., Cotter P.A.: Bordetella pertussispathogenesis: current and future challenges. Nat Rev Microbiol.,2014; 12: 274-288
  Google Scholar
• 59. Mills K.H., Ryan M., Ryan E., Mahon B.P.: A murine model inwhich protection correlates with pertussis vaccine efficacy in childrenreveals complementary roles for humoral and cell-mediatedimmunity in protection against Bordetella pertussis. Infect. Immun.,1998; 66: 594-602
  Google Scholar
• 60. Miyaji Y., Otsuka N., Toyoizumi-Ajisaka H., Shibayama K., KamachiK.: Genetic analysis of Bordetella pertussis isolates from the2008-2010 pertussis epidemic in Japan. PLoS One, 2013; 8: e77165
  Google Scholar
• 61. Mooi F.R.: Bordetella pertussis and vaccination: the persistenceof a genetically monomorphic pathogen. Infect. Genet. Evol., 2010;10: 36-49
  Google Scholar
• 62. Mooi F.R., van Loo I.H., van Gent M., He Q., Bart M.J., HeuvelmanK.J., de Greeff S.C., Diavatopoulos D., Teunis P., Nagelkerke N.,Mertsola J.: Bordetella pertussis strains with increased toxin productionassociated with pertussis resurgence. Emerg. Infect. Dis., 2009;15: 1206-1213
  Google Scholar
• 63. Mooi F.R., van der Maas N.A., de Melker H.E.: Pertussis resurgence:waning immunity and pathogen adaptation – two sides of thesame coin. Epidemiol. Infect., 2014; 142: 685-694
  Google Scholar
• 64. Mosiej E., Augustynowicz E., Zawadka M., Dabrowski W., Lutyń-ska A.: Strain variation among Bordetella pertussis isolates circulatingin Poland after 50 years of whole-cell pertussis vaccine use. J. Clin.Microbiol., 2011; 49: 1452-1457
  Google Scholar
• 65. Mosiej E., Zawadka M., Krysztopa-Grzybowska K., Polak M., AugustynowiczE., Piekarska K., Lutyńska A.: Sequence variation in virulence-relatedgenes of Bordetella pertussis isolates from Poland in theperiod 1959-2013. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2015; 34: 147-152
  Google Scholar
• 66. Njamkepo E., Cantinelli T., Guigon G., Guiso N.: Genomic analysisand comparison of Bordetella pertussis isolates circulating in low andhigh vaccine coverage areas. Microbes. Infect., 2008; 10: 1582-1586
  Google Scholar
• 67. Olin P., Rasmussen F., Gustafsson L., Hallander H.O., Heijbel H.:Randomised controlled trial of two-component, three-component,and five-component acellular pertussis vaccines compared withwhole-cell pertussis vaccine. Ad Hoc Group for the Study of PertussisVaccines. Lancet, 1997; 350: 1569-1577
  Google Scholar
• 68. Otsuka N., Han H.J., Toyoizumi-Ajisaka H., Nakamura Y., ArakawaY., Shibayama K., Kamachi K.: Prevalence and genetic characterizationof pertactin-deficient Bordetella pertussis in Japan. PLoSOne, 2012; 7: e31985
  Google Scholar
• 69. Packard E.R., Parton R., Coote J.G., Fry N.K.: Sequence variationand conservation in virulence-related genes of Bordetella pertussisisolates from the UK. J. Med. Microbiol., 2004; 53: 355-365
  Google Scholar
• 70. Parkhill J., Sebaihia M., Preston A., Murphy L.D., Thomson N., Harris D.E., Holden M.T., Churcher C.M., Bentley S.D., Mungall K.L.,Cerdeño-Tárraga A.M., Temple L., James K., Harris B., Quail M.A.i wsp.: Comparative analysis of the genome sequences of Bordetellapertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica. Nat.Genet., 2003; 35: 32-40
  Google Scholar
• 71. Pawloski L.C., Queenan A.M., Cassiday P.K., Lynch A.S., HarrisonM.J., Shang W., Williams M.M., Bowden K.E., Burgos-Rivera B., Qin X.,Messonnier N., Tondella M.L.: Prevalence and molecular characterizationof pertactin-deficient Bordetella pertussis in the United States.Clin. Vaccine Immunol., 2014; 21: 119-125
  Google Scholar
• 72. Queenan A.M., Cassiday P.K., Evangelista A.: Pertactin-negativevariants of Bordetella pertussis in the United States. N. Engl. J. Med.,2013; 368: 583-584
  Google Scholar
• 73. Quinlan T., Musser K.A., Currenti S.A., Zansky S.M., Halse T.A.:Pertactin-negative variants of Bordetella pertussis in New York State:A retrospective analysis, 2004-2013. Mol. Cell. Probes, 2014; 28:138-140
  Google Scholar
• 74. Rodríguez M.E., Hellwig S.M., Pérez Vidakovics M.L., BerbersG.A., van de Winkel J.G.: Bordetella pertussis attachment to respiratoryepithelial cells can be impaired by fimbriae-specific antibodies.FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2006; 46: 39-47
  Google Scholar
• 75. Safarchi A., Octavia S., Luu L.D., Tay C.Y., Sintchenko V., Wood N,Marshall H., McIntyre P., Lan R.: Pertactin negative Bordetella pertussisdemonstrates higher fitness under vaccine selection pressure ina mixed infection model. Vaccine, 2015; 33: 6277-6281
  Google Scholar
• 76. Sato H., Sato Y.: Bordetella pertussis infection in mice: correlationof specific antibodies against two antigens, pertussis toxin, and filamentoushemagglutinin with mouse protectivity in an intracerebralor aerosol challenge system. Infect. Immun., 1984; 46: 415-421
  Google Scholar
• 77. Sato H., Sato Y.: Relationship between structure and biologicaland protective activities of pertussis toxin. Dev. Biol. Stand., 1991;73: 121-132
  Google Scholar
• 78. Scheller E.V., Cotter P.A.: Bordetella filamentous hemagglutininand fimbriae: critical adhesins with unrealized vaccine potential.Pathog. Dis., 2015; 73: ftv079
  Google Scholar
• 79. Sealey K.L., Harris S.R., Fry N.K., Hurst L.D., Gorringe A.R., ParkhillJ., Preston A.: Genomic analysis of isolates from the United Kingdom 2012 pertussis outbreak reveals that vaccine antigen genes areunusually fast evolving. J. Infect. Dis., 2015; 212: 294-301
  Google Scholar
• 80. Serra D.O., Conover M.S., Arnal L., Sloan G.P., Rodriguez M.E.,Yantorno O.M., Deora R.: FHA-mediated cell-substrate and cell-celladhesions are critical for Bordetella pertussis biofilm formation onabiotic surfaces and in the mouse nose and the trachea. PLoS One,2011; 6: e28811
  Google Scholar
• 81. Shahin R.D., Amsbaugh D.F., Leef M.F.: Mucosal immunizationwith filamentous hemagglutinin protects against Bordetella pertussisrespiratory infection. Infect. Immun., 1992; 60: 1482-1488
  Google Scholar
• 82. Sheridan S.L., Ware R.S., Grimwood K., Lambert S.B.: Numberand order of whole cell pertussis vaccines in infancy and diseaseprotection. JAMA, 2012; 308: 454-456
  Google Scholar
• 83. Shuel M., Jamieson F.B., Tang P., Brown S., Farrell D., Martin I.,Stoltz J., Tsang R.S.: Genetic analysis of Bordetella pertussis in Ontario,Canada reveals one predominant clone. Int. J. Infect. Dis., 2013;17: e413-417
  Google Scholar
• 84. Spangrude G.J., Sacchi F., Hill H.R., van Epps D.E., Daynes R.A.:Inhibition of lymphocyte and neutrophil chemotaxis by pertussistoxin. J. Immunol., 1985; 135: 4135-4143
  Google Scholar
• 85. Stefanelli P., Fazio C., Fedele G., Spensieri F., Ausiello C.M., MastrantonioP.: A natural pertactin deficient strain of Bordetella pertussisshows improved entry in human monocyte-derived dendriticcells. New Microbiol., 2009; 32: 159-166
  Google Scholar
• 86. Stefanoff P., Paradowska-Stankiewicz I.A., Lipke M., KarasekE., Rastawicki W., Zasada A., Samuels S., Czajka H., Pebody R.G.: Incidence of pertussis in patients of general practitioners in Poland.Epidemiol. Infect., 2014; 142: 714-723
  Google Scholar
• 87. Storsaeter J., Hallander H.O., Gustafsson L., Olin P.: Levels of anti–pertussis antibodies related to protection after household exposureto Bordetella pertussis. Vaccine, 1998; 16: 1907-1916
  Google Scholar
• 88. Theofiles A.G., Cunningham S.A., Chia N., Jeraldo P.R., Quest D.J.,Mandrekar J.N., Patel R.: Pertussis outbreak, Southeastern Minnesota, 2012 Mayo Clin. Proc., 2014; 89: 1378-1388
  Google Scholar
• 89. Thierry-Carstensen B., Dalby T., Stevner M.A., Robbins J.B.,Schneerson R., Trollfors B.: Experience with monocomponent acellularpertussis combination vaccines for infants, children, adolescentsand adults – a review of safety, immunogenicity, efficacy andeffectiveness studies and 15 years of field experience. Vaccine, 2013;31: 5178-5191
  Google Scholar
• 90. Tsang R.S., Shuel M., Jamieson F.B., Drews S., Hoang L., HorsmanG., Lefebvre B., Desai S., St-Laurent M.: Pertactin-negative Bordetellapertussis strains in Canada: characterization of a dozen isolates basedon a survey of 224 samples collected in different parts of the countryover the last 20 years. Int. J. Infect. Dis., 2014; 28: 65-69
  Google Scholar
• 91. van Gent M., Heuvelman C.J., van der Heide H.G., Hallander H.O.,Advani A., Guiso N., Wirsing von Kőnig C.H., Vestrheim D.F., DalbyT., Fry N.K., Pierard D., Detemmerman L., Zavadilova J., FabianovaK., Logan C. i wsp.: Analysis of Bordetella pertussis clinical isolatescirculating in European countries during the period 1998-2012. Eur.J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2015; 34: 821-830
  Google Scholar
• 92. van Gent M., Pierard D., Lauwers S., van der Heide H.G., KingA.J., Mooi F.R.: Characterization of Bordetella pertussis clinical isolatesthat do not express the tracheal colonization factor. FEMS Immunol.Med. Microbiol., 2007; 51: 149-154
  Google Scholar
• 93. van Gent M., van Loo I.H., Heuvelman K.J., de Neeling A.J., TeunisP., Mooi F.R.: Studies on Prn variation in the mouse model andcomparison with epidemiological data. PLoS One, 2011; 6: e18014
  Google Scholar
• 94. van Hoek A.J., Campbell H., Amirthalingam G., Andrews N., MillerE.: The number of deaths among infants under one year of age inEngland with pertussis: results of a capture/recapture analysis forthe period 2001 to 2011. Euro Surveill., 2013; 18: 20414
  Google Scholar
• 95. van Loo I.H., Heuvelman K.J., King A.J., Mooi F.R.: Multilocussequence typing of Bordetella pertussis based on surface proteingenes. J. Clin. Microbiol., 2002; 40: 1994-2001
  Google Scholar
• 96. Vandebriel R.J., Hellwig S.M., Vermeulen J.P., Hoekman J.H.,Dormans J.A., Roholl P.J., Mooi F.R.: Association of Bordetella pertussiswith host immune cells in the mouse lung. Microb. Pathog.,2003; 35: 19-29
  Google Scholar
• 97. Williams M.M., Sen K., Weigand M.R., Skoff T.H., CunninghamV.A., Halse T.A., Tondella M.L., CDC Pertussis Working Group: Bordetellapertussis strain lacking pertactin and pertussis toxin. Emerg.Infect. Dis., 2016; 22: 319-322
  Google Scholar
• 98. World Health Organization: WHO – Immunization, Vaccines andBiologicals, Pertussis. http://www.who.int/immunization/topics/pertussis/en/(12.12.2015)
  Google Scholar
• 99. Zeddeman A., van Gent M., Heuvelman C.J., van der Heide H.G.,Bart M.J., Advani A., Hallander H.O., Wirsing von Konig C.H., RiffelmanM., Storsaeter J., Vestrheim D.F., Dalby T., Krogfelt K.A., Fry N.K.,Barkoff A.M. i wsp.: Investigations into the emergence of pertactin–deficient Bordetella pertussis isolates in six European countries, 1996to 2012. Euro Surveill., 2014; 19: 20881
  Google Scholar
• 100. Zhu Y.Z., Cai C.S., Zhang W., Guo H.X., Zhang J.P., Ji Y.Y., Ma G.Y.,Wu J.L., Li Q.T., Lu C.P., Guo X.K.: Immunoproteomic analysis of humanserological antibody responses to vaccination with whole-cellpertussis vaccine (WCV). PLoS One, 2010; 5: e13915
  Google Scholar

Pełna treść artykułu