Streszczenie

Nadciśnienie płucne (PH) jest chorobą rzadką o ciężkim przebiegu, mimo dużego postępu w diagnostyce i terapii, pozostaje chorobą nieuleczalną i jest obarczone dużą śmiertelnością. Stosowana farmakoterapia poprawia jakość życia pacjentów i wydłuża czas przeżycia, ale nie powoduje całkowitego odwrócenia zmian patomorfologicznych i hemodynamicznych. Przyczyną może być wieloczynnikowy patomechanizm choroby, który obejmuje wiele szlaków sygnałowych. Dlatego poszukuje się nowych możliwości terapeutycznych. Służą temu badania przedkliniczne prowadzone m.in. na modelach zwierzęcych. O trafności identyfikacji potencjalnie skutecznych substancji do dalszej oceny w próbach klinicznych decyduje wiele czynników, w tym dobór właściwego modelu badawczego. Obecnie nie jest znany idealny model zwierzęcy, który w pełni odzwierciedla „ludzką” postać nadciśnienia płucnego. Badania są najczęściej prowadzone na modelach klasycznych, do których zalicza się model przewlekłej ekspozycji na niedotlenienie (CH) oraz model monokrotaliny (MCT). W artykule omówiono wybrane modele zwierzęce nadciśnienia płucnego, które są wykorzystywane w badaniach nad skutecznością potencjalnych substancji terapeutycznych. Przedstawiono mechanizm działania poszczególnych czynników indukujących PH oraz zakres wywoływanych zmian hemodynamicznych i histopatologicznych charakteryzujących poszczególne modele. Omówiono technikę i warunki indukcji nadciśnienia płucnego wybranych metod. Zwrócono uwagę na różnice międzygatunkowe zwierząt doświadczalnych. Podsumowano potencjalne korzyści i ograniczenia omawianych modeli zwierzęcych nadciśnienia płucnego w badaniach przedklinicznych, ze zwróceniem szczególnej uwagi na powtarzalność otrzymywanych wyników, toksyczność czynników indukujących oraz zakres zmian wywoływanych u zwierząt w porównaniu do zmian w obrazie klinicznym nadciśnienia płucnego u ludzi czy koszty eksperymentów.

Wstęp

Badania przedkliniczne są istotnym etapem rozwoju każdego leku. Są podstawowym sposobem oceny efektywności i bezpieczeństwa nowych substancji o potencjalnym działaniu terapeutycznym. W zależności od uzyskanych wyników podejmuje się decyzję o dalszych próbach klinicznych. Próby przedkliniczne pozwalają m.in. na określenie właściwości farmakologicznych, farmakokinetycznych oraz toksyczności badanych związków. Takie eksperymenty są prowadzone w warunkach in vitro na modelach komórkowych lub in vivo na modelach zwierzęcych. Badania z zakresu farmakologii eksperymentalnej oparte na wykorzystaniu zwierząt doświadczalnych służą ocenie skuteczności terapeutycznej substancji. Są także użytecznym narzędziem w poszukiwaniu nowych szlaków sygnałowych, co przyczynia się do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw rozwoju chorób. Pozwala to na określenie nowych punktów uchwytu dla potencjalnych leków. Modele zwierzęce cieszą się dużym zainteresowaniem wśród badaczy; niejednokrotnie oparte na inwazyjnych procedurach pozwalają na prowadzenie badań w sposób, który byłby niemożliwy u ludzi. Wśród nich wymienia się modele genetycznie modyfikowane jak i modele niegenetyczne. W tych ostatnich fenotyp przypominający badany proces chorobowy rozwija się po ingerencji chirurgicznej (np. zwężenie/zamknięcie naczynia krwionośnego), wdrożenia odpowiedniego sposobu żywienia (np. pokarm z dużą zawartością cholesterolu) czy warunków utrzymywania (np. przewlekłe niedotlenienie). W przypadku tzw. modeli spontanicznych do rozwoju danej choroby u wybranych szczepów zwierząt dochodzi samoistnie w wyniku określonych mutacji. Na przykład w badaniach przedklinicznych dotyczących cukrzycy i otyłości stosuje się myszy z upośledzonym wydzielaniem leptyny (ob/ob) lub brakiem czynnych receptorów leptyny (db/db), do programowania zespołu metabolicznego – myszy Agouti, a w nadciśnieniu tętniczym szczury SHR (spontaneously hypertensive rat) bądź Dahl SS (salt-sensitive). Ogólnie, od modeli zwierzęcych oczekuje się aby przyczyna i objawy (fenotyp) choroby były odwzorowaniem jej „ludzkiego” obrazu. Złożoność patomechanizmów i brak pełnego zrozumienia przebiegu wielu schorzeń sprzyja wyborom bardziej uproszczonych systemów, w których dochodzi do wywołania jedynie pewnych składowych procesu patologicznego [63]. Kierowanie się w wyborze modelu łatwością jego użycia, a nie stopniem odzwierciedlenia procesu patofizjologicznego, podobnie jak brak standaryzacji czy też wykorzystywanie różnych modeli zwierzęcych do badania patogenezy, zapobiegania lub leczenia tej samej choroby może przesądzać o trudnościach interpretacyjnych otrzymanych wyników. Do chorób cieszących się rosnącym zainteresowaniem badaczy, prowadzących poszukiwania z zakresu farmakologii eksperymentalnej jak i klinicystów, zalicza się nadciśnienie płucne (PH, pulmonary hypertension). Definiuje się je jako podwyższenie średniego ciśnienia w tętnicy płucnej (mPAP) ≥ 25 mmHg w spoczynku, oznaczone za pomocą cewnikowania prawego serca [29]. Pierwsze leki działające swoiście na tętniczki płucne w ramach tzw. farmakoterapii celowanej zarejestrowano w 1995 r. (FDA). Od tego czasu przeprowadzono ponad 600 badań interwencyjnych na modelach zwierzęcych [76]. Służyły zarówno poszukiwaniu nowych możliwości terapeutycznych, jak i wyjaśnieniu mechanizmów rozwoju tego schorzenia obejmujących liczne szlaki biochemiczne. Przyczyniał się do tego ciężki przebieg, wieloczynnikowy patomechanizm oraz – jak dotąd – brak możliwości pełnego wyleczenia. O trafności identyfikacji potencjalnie skutecznych substancji do dalszej oceny w próbach klinicznych decyduje wiele czynników, w tym dobór właściwego modelu badawczego. Obecnie nie jest znany model, który w pełni odzwierciedlałby obraz kliniczny „ludzkiej” postaci choroby. Od modelu zwierzęcego oczekuje się powtarzalności uzyskiwanych wyników, braku działań niepożądanych, niewielkiej inwazyjności oraz stosunkowo niskich kosztów prowadzonych eksperymentów. Przykładowy zakres zmian hemodynamicznych i histopatologicznych, które powinien obrazować eksperymentalny model tętniczego nadciśnienia płucnego w „ludzkiej” postaci choroby podsumowano w tabeli 1.

Zmiany hemodynamiczne

Podwyższenie średniego ciśnienia w tętnicy płucnej (mPAP) oraz ciśnienia skurczowego w prawej komorze serca (RVSP)

Obniżenie pojemności minutowej serca (CO)

Zmiany histopatologiczne

Przerost mięśnia prawej komory serca

Przebudowa tętnic płucnych

Faza wczesna

Przerost błony środkowej oraz wewnętrznej tętnic płucnych

Faza późna

Koncentryczne warstwowe włóknienie błony wewnętrznej tętnic płucnych

Zmiany splotowate

Poszerzenie tętnic płucnych

Zakrzepica miejscowa (in situ)

Rozwój zapalenia okołonaczyniowego

Tabela 1. Przykładowy zakres zmian hemodynamicznych i histopatologicznych, które powinien obrazować eksperymentalny model tętniczego nadciśnienia płucnego „ludzkiej” postaci choroby [19, 74]

Modele zwierzęce PH są zróżnicowane, różnice dotyczą zarówno metodyki wywołania schorzenia (modele genetyczne i niegenetyczne), jak i mechanizmu działania poszczególnych czynników indukujących i wynikających z niego zakresu zmian hemodynamicznych i histopatologicznych w obrębie krążenia płucnego (serce i naczynia płucne). Znajomość indukowanych zmian, przy jednoczesnym krytycznym porównaniu ich podobieństwa do zmian jakie rozwijają się u ludzi w przebiegu choroby, zwiększa szansę na przełożenie wyników poszukiwań przedklinicznych na badania kliniczne. Brak takiego przełożenia może spowodować to, że potencjalne korzyści terapeutyczne, jakie w ciągu ponad 20 lat wykazano w badaniach zwierzęcych dla wielu testowanych substancji w PH, nie znalazły potwierdzenia w próbach klinicznych. Na przykład w badaniach eksperymentalnych wykazano wpływ inhibitorów reduktazy HMG-CoA (statyn) na odwrócenie/prewencję schorzenia przez: obniżenie parametrów hemodynamicznych (ciśnienie w tętnicy płucnej – PAP i prawej komorze serca – RVP), a także ograniczenie przerostu RV, remodelingu naczyń płucnych i pogrubienia mięśniówki gładkiej przez zmniejszenie procesów proliferacji, a nasilenie apoptozy komórek mięśni gładkich (SMC) [79]. Wyniki nie znalazły pełnego potwierdzenia w próbach klinicznych, a odnotowane korzyści obejmowały wprawdzie redukcję przerostu prawej komory mięśnia sercowego i obniżenie poziomu markerów związanych z PAH (NTproBNP, P-selektyna), ale miały charakter przemijający [33, 93, 94].

W artykule opisano najczęściej wykorzystywane i najlepiej poznane modele zwierzęce w PH. Przedstawiona analiza ma na celu ocenę ich przydatności w poszukiwaniu nowych leków w nadciśnieniu płucnym oraz w badaniu patomechanizmu choroby. Po krótkim omówieniu postaci klinicznych oraz patomechanizmu nadciśnienia płucnego w artykule opisano: modele klasyczne, ich modyfikacje (modele alternatywne), model Sugenu w połączeniu z ekspozycją na przewlekłe niedotlenienie, modele indukcji PH związanego z wrodzonymi chorobami serca oraz modele genetyczne. Przedstawiono mechanizm działania poszczególnych czynników indukujących PH oraz zakres wywoływanych zmian charakteryzujący poszczególne modele. Odniesiono się do związanego z rozwojem PH stopnia pogorszenia wybranych parametrów hemodynamicznych (ciśnienie w prawej komorze serca i w tętnicy płucnej), jak i przerostu prawej komory mięśnia sercowego oraz przebudowy tętnic płucnych. Omówiono technikę i warunki indukcji nadciśnienia płucnego dla wybranych metod. Zwrócono uwagę na różnice międzygatunkowe wykorzystywanych zwierząt doświadczalnych. Podsumowano potencjalne korzyści i ograniczenia omawianych modeli zwierzęcych nadciśnienia płucnego w badaniach przedklinicznych.

Klasyfikacja kliniczna i zarys patomechanizmu nadciśnienia płucnego

Klasyfikacja kliniczna PH (V Światowe Sympozjum Nadciśnienia Płucnego, Nicea, 2013) różnicuje pięć głównych grup schorzenia: 1 – tętnicze nadciśnienie płucne (PAH), 2 – PH spowodowane chorobami lewej części serca, 3 – PH w przebiegu chorób płuc i/lub hipoksji, 4 – przewlekłe PH zakrzepowo-zatorowe (CTEPH), 5 – PH o niewyjaśnionym i/lub wieloczynnikowym patomechanizmie [18, 70]. Grupy te różnią się etiologią, epidemiologią, histopatologią, rokowaniem oraz podejściem terapeutycznym. Szczególnie ciężką i postępującą postacią jest tętnicze nadciśnienie płucne, nazywane również „złośliwym”, w którym może dojść do rozwoju płucnej pleksogennej arteriopatii  [61, 74]. Zróżnicowanie kliniczne nadciśnienia płucnego utrudnia właściwy dobór modelu zwierzęcego w badaniach przedklinicznych. Obecnie większość wykorzystywanych modeli zwierzęcych odzwierciedla zmiany charakterystyczne dla tętniczego nadciśnienia płucnego. Zastosowanie opisanych modeli zwierzęcych w badaniach przedklinicznych PH w klasyfikacji klinicznej schorzenia podsumowano w tabeli 2.

Model zwierzęcy	Gatunek/szczep	Postać kliniczna PH
Modele klasyczne
Ekspozycja na przewlekłe niedotlenienie (hipoksję) (CH)	myszy*, szczury*, cielęta, owce, świnie	grupa 1/3
Ekspozycja na przewlekłe niedotlenienie szczurów Fawn-hooded (FH)	szczury FH	grupa 1/3
Model monokrotaliny (MCT)	szczury*, owce, psy, świnie	grupa 1
Modele alternatywne
Ekspozycja na MCT w połączeniu z usunięciem lewego płuca (LP)	szczury	grupa 1
Ekspozycja na MCT w połączeniu z przewlekłym niedotlenieniem (CH)	szczury	grupa 1/3
Sugen w połączeniu z ekspozycją na przewlekłe niedotlenienie
Sugen w połączeniu z ekspozycją na przewlekłe niedotlenienie (CH)	myszy, szczury	grupa 1/3
Modele indukcji PH związanego z wrodzonymi chorobami serca
Banding tętnicy płucnej (PAB)	myszy*, szczury*, kozy	grupa 1/2
Wytworzenie przecieku pomiędzy krążeniem systemowym i płucnym (left-to-right shunt)	szczury*, owce, psy, świnie	grupa 1
Modele genetyczne
Delecja genu BMPR2	myszy	grupa 1
Delecja genu receptora ET-B	szczury
Delecja genu VIP	myszy
Delecja genu NEP	myszy
Delecja genu ApoE	myszy
Nadekspresja genu Ang-1	szczury
Nadekspresja genu IL-6	myszy
Nadekspresja genu białka S100A4/Mst1	myszy
Nadekspresja genu SERT	myszy

Tabela 2. Zastosowanie modeli zwierzęcych nadciśnienia płucnego w badaniach przedklinicznych do klasyfikacji klinicznej PH [57, 74]

* – gatunki najczęściej wykorzystywane w badaniach przedklinicznych nadciśnienia płucnego; Ang-1 – angiopoetyna-1; ApoE – apolipoproteina E; BMPR2 – receptor białka morfogenetycznego kości typu 2; CH – przewlekłe niedotlenienie; ET-B – receptor typu B dla endoteliny 1; FH – szczury szczepu Fawn-hooded; IL-6 – interleukina 6; LP – usunięcie lewego płuca; MCT – monokrotalina; NEP – neprylizyna; PAB – banding tętnicy płucnej; PH – nadciśnienie płucne; SERT – transporter serotoniny; VIP – wazoaktywny peptyd jelitowy.

Mimo dużego postępu w diagnostyce, farmakoterapii oraz rozwoju leczenia operacyjnego, nadciśnienie płucne nadal pozostaje chorobą nieuleczalną i jest obarczone dużą śmiertelnością. Obecnie stosowane leki łagodzą objawy kliniczne PH, poprawiają jakość życia pacjentów i wydłużają czas przeżycia, ale nie powodują całkowitego wyleczenia [17, 33]. Przyczyną może być wieloczynnikowy patomechanizm choroby, który obejmuje wiele szlaków biochemicznych oraz różne typy komórek i geny. Dotychczas wykazano, że w przebiegu nadciśnienia płucnego dochodzi do dysfunkcji śródbłonka tętnic płucnych z zaburzeniem równowagi między szlakami sygnałowymi z udziałem substancji o działaniu wazodylatacyjnym, antymitotycznym i antyproliferacyjnym (tlenku azotu, prostacykliny – PGI2) a substancjami o działaniu prozapalnym, mitogennym i wazokonstrykcyjnym (endotelina-1, tromboksan A2). Zaburzenia powodują przebudowę tętnic płucnych oraz wzrost płucnego oporu naczyniowego (PVR). Dochodzi do obciążenia następczego prawej komory serca i przerostu jej ścian. Zmiany powodują rozwój niewydolności prawokomorowej serca. Tym niemniej wciąż poszukuje się nowych mechanizmów zaangażowanych w patogenezę nadciśnienia płucnego, które pozwolą na optymalizację obecnej farmakoterapii i odkrycie nowych punktów uchwytu leków. W tym celu wykorzystuje się modele zwierzęce. Wśród obecnie badanych ścieżek sygnałowych znajduje się szlak płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF), czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), czynnika wzrostu naskórka (EGF) oraz szlak RhoA i jej kinaz. Zainteresowanie badaczy wzbudzają również szlaki związane z przekaźnictwem serotoninergicznym, beta-adrenergicznym, układem renina-angiotensyna-aldosteron (RAAS), szlaki pobudzenia receptorów aktywowanych proliferatorami peroksysomów (PPAR) oraz szlak aktywacji kanałów potasowych [33].

Modele klasyczne

Model ekspozycji na przewlekłe niedotlenienie (hipoksję, CH)

Przewlekłe niedotlenienie (CH, chronic hypoxia) jest jedną z najczęściej wykorzystywanych metod indukcji nadciśnienia płucnego u zwierząt doświadczalnych. Badania wykorzystujące tę metodę zapoczątkowano w latach 70 XX w. [48]. Sugeruje się zastosowanie tego modelu w badaniach dotyczących nadciśnienia płucnego, które rozwija się w przebiegu chorób układu oddechowego i/lub hipoksji (grupa 3). Zalicza się do nich m.in. przewlekłą obturacyjną chorobę płuc, obturacyjny bezdech senny oraz śródmiąższową chorobę płuc. Natomiast, jak podkreślają eksperci, zastosowanie modelu CH do badań innych postaci schorzenia, w tym tętniczego nadciśnienia płucnego, może być obarczone błędem [65].

W omawianym modelu przewlekła hipoksja powoduje przebudowę naczyń płucnych. Dochodzi do maskularyzacji małych tętniczek płucnych przy jednoczesnym wzroście ekspresji α-aktyny komórek mięśni gładkich (SMC) oraz maskularyzacji tętnic mięśniowych przedwłośniczkowych. Przewlekłe niedotlenienie powoduje przerost i zesztywnienie tętnic proksymalnych [74]. Opisane zmiany zachodzą głównie w warstwie błony zewnętrznej oraz błony środkowej tętnic płucnych. Są spowodowane migracją i proliferacją komórek mięśni gładkich, akumulacją fibroblastów, miofibroblastów oraz akumulacją składowych macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak: kolagen, elastyna, fibronektyna i tenascyna. W wyniku przebudowy tętnic płucnych dochodzi do wzrostu płucnego oporu naczyniowego (PVR), średniego ciśnienia w tętnicy płucnej (mPAP), a także do wzrostu ciśnienia skurczowego w prawej komorze serca (RVSP) oraz jej przerostu. Mało jest jednak doniesień potwierdzających rozwój niewydolności prawokomorowej serca w tym modelu [47, 69, 73, 83].

Ten powszechnie wykorzystywany w badaniach przedklinicznych model, opiera się na wywołaniu przewlekłego niedotlenienia przez umieszczenie zwierząt laboratoryjnych (myszy lub szczury) w komorze normobarycznej w warunkach hipoksji (stężenie tlenu około 10%) lub w komorze hipobarycznej na 2-5 tygodni [30, 60, 80, 81]. Wskazuje się na pewne różnice międzygatunkowe oraz różnice między szczepami w odpowiedzi na przewlekłe niedotlenienie. Przykładowo, u myszy może dochodzić do mniejszej przebudowy naczyń płucnych, co wynika z ograniczonej proliferacji komórek mięśni gładkich tętnic płucnych (PASMCs). Najbardziej podatnym szczepem na indukcję PH w tym modelu są myszy C57BL6 [69]. Natomiast ekspozycja nowo narodzonych cieląt na przewlekłe niedotlenienie powoduje rozwój cięższej postaci nadciśnienia płucnego w porównaniu do myszy i szczurów. Inne gatunki zwierząt, takie jak: owce, świnie, cielęta są rzadziej wykorzystywane do badań nad PH, ze względu na ich rozmiar, większe koszty prowadzonych eksperymentów i względy etyczne. Odpowiedź na przewlekłe niedotlenienie może być również uwarunkowana wiekiem i płcią zwierząt. Wykazano, że młodsze osobniki są bardziej podatne na działanie przewlekłej hipoksji. Natomiast u wszystkich gatunków zwierząt obserwuje się stopniową redukcję i normalizację powstałych zmian hemodynamicznych oraz histopatologicznych w wyniku przerwania ekspozycji na przewlekłe niedotlenienie [48, 65, 74]. Opisane różnice międzygatunkowe w odpowiedzi na przewlekłą hipoksję, ograniczają wykorzystanie tego modelu w badaniach przedklinicznych [57, 65].

Model przewlekłego niedotlenienia charakteryzuje się powtarzalnością oraz przewidywalnością wyników otrzymanych z użyciem wybranego szczepu zwierząt. Jest to zaletą modelu, podobnie jak prosta technika wywołania nadciśnienia płucnego oraz relatywnie niskie koszty [8]. Ograniczeniem jest to, że przewlekłe niedotlenienie powoduje rozwój nadciśnienia płucnego o umiarkowanym stopniu ciężkości. W dotychczasowych badaniach eksperymentalnych nie udało się wywołać postaci przetrwałego PH; przerwanie ekspozycji na niedotlenienie zwykle normalizuje zaindukowane zmiany hemodynamiczne i histopatologiczne [2]. W próbach przedklinicznych nie zaobserwowano również charakterystycznych dla tętniczego nadciśnienia płucnego zmian, takich jak: hiperplazja warstwy wewnętrznej tętnic płucnych, jej zwłóknienie oraz rozwój zmian splotowatych. Wyjątkiem jest model przewlekłej hipoksji stosowany u szczurów Fawn-hooded-FH (Fawn-hooded rat pulmonary hypertension).

Model przewlekłego niedotlenienia szczurów Fawn –hooded (FH)

Szczep ‘Fawn-hooded’ uzyskano w wyniku połączenia szczepów ‘German brown’, szczurów ‘Albino’ oraz ‘Long Evan’s’ [65]. Poddanie tego szczepu warunkom przewlekłego niedotlenienia pozwala na wywołanie najcięższej postaci nadciśnienia płucnego spośród wszystkich gatunków gryzoni wykorzystywanych w tym modelu [74]. Jest to, jak na razie, jedyny model PH, w którym w wyniku niedotlenienia spontanicznie rozwija się postać tętniczego nadciśnienia płucnego.

Spontaniczny rozwój nadciśnienia płucnego u szczurów FH może wynikać z wrodzonego upośledzenia wychwytu serotoniny w płytkach krwi oraz zmniejszonej liczby pęcherzyków płucnych [74]. W mechanizmie indukcji PH wskazuje się również na udział czynnika HIF-1α, odpowiedzialnego za proliferację komórek mięśni gładkich, jak i kanałów potasowych oraz mitochondrialnych reaktywnych form tlenu [5]. Ekspozycja szczurów FH na umiarkowaną hipoksję przyspiesza rozwój nadciśnienia płucnego, co może spowodować rozwój ciężkiej postaci choroby. Obserwuje się wzrost średniego ciśnienia w tętnicy płucnej, ciśnienia skurczowego w prawej komorze serca i jej przerost oraz przebudowę naczyń płucnych. To ostatnie wynika z przerostu warstwy środkowej oraz hiperplazji warstwy wewnętrznej tętnic płucnych. Jednocześnie dochodzi do rozwoju nadciśnienia tętniczego systemowego, co jest ograniczeniem tego modelu [65, 68]. Opisywany model jest wykorzystywany głównie w badaniach nad czynnikami genetycznymi, które predysponują do rozwoju tętniczego nadciśnienia płucnego.

Model monokrotaliny (MCT)

Metoda indukcji nadciśnienia płucnego z użyciem monokrotaliny(MCT) została opisana po raz pierwszy w 1967 r. [37]. Obecnie modele oparte na iniekcji monokrotaliny należą, oprócz przewlekłej hipoksji, do najczęściej wykorzystywanych w badaniach eksperymentalnych nad PH. Na przykład, w ostatnich 15 latach ponad 60% modeli doświadczalnych tego schorzenia, użytych w poszukiwaniach nowych związków o potencjalnym zastosowaniu terapeutycznym w nadciśnieniu płucnym, opierało się na przewlekłej ekspozycji na MCT [76]. Na modelu MCT prowadzono również próby eksperymentalne, poprzedzające zakończone sukcesem badania kliniczne, oceniające skuteczność substancji później zarejestrowanych w terapii swoistej tętniczego nadciśnienia płucnego, takich jak: antagoniści receptora endoteliny, inhibitory fosfodiesterazy-5, analogi prostacykliny oraz najnowszy lek – seleksypag (EMA, 2016) [40, 55, 58].

Monokrotalina (MCT) jest toksycznym alkaloidem pirolizydynowym, otrzymywanym z nasion rośliny z gatunku Crotalaria spectabilis. Za toksyczne działanie MCT odpowiada jej aktywny metabolit – dehydromonokrotalina (MCTP), który powstaje w wątrobie w wyniku dehydratacji MCT z udziałem izoenzymu cytochromu P-450 (CYP 3A4) [20]. Dokładny mechanizm indukcji nadciśnienia płucnego nie jest w pełni poznany. Wiadomo, że dehydromonokrotalina uszkadza śródbłonek naczyń płucnych. Mechanizm działania MCTP jest również związany z rozwojem stanu zapalnego w wyniku akumulacji komórek tucznych, makrofagów w naczyniach płucnych oraz prozapalnych cytokin (m.in. IL-1β, IL-6) w obrębie płuc [71, 74, 77]. W modelu MCT obserwuje się wzmożoną proliferację komórek mięśni gładkich w ścianach tętnic płucnych, przy wzroście ich oporności na apoptozę oraz nasilenie apoptozy komórek śródbłonka. Następstwem wyżej opisanych procesów jest przebudowa naczyń płucnych; dochodzi do maskularyzacji ścian tętnic płucnych, zwłaszcza małych naczyń. Obserwuje się także przerost i hiperplazję warstwy środkowej oraz przerost tkanki łącznej w warstwie zewnętrznej i wewnętrznej tętnic płucnych. Zmiany patomorfologiczne w tętnicach płucnych prowadzą do podwyższenia średniego ciśnienia w tętnicy płucnej, ciśnienia skurczowego w prawej komorze mięśnia sercowego i jej przerostu, a w konsekwencji do rozwoju niewydolności prawokomorowej serca [20, 58].

Technika wywołania nadciśnienia płucnego w tym modelu polega na pojedynczym, podskórnym (s.c.) lub dootrzewnowym (i.p.) wstrzyknięciu monokrotaliny w dawkach 40-80 mg/kg masy ciała (m.c.). Najczęściej stosowaną jest dawka 60 mg/kg m.c., czas wywołania PH wynosi zwykle 3-4 tygodnie [13, 27]. Zarówno wielkość zastosowanej dawki MCT, jak i czas indukcji, może wpływać na intensywność wywołanych zmian [58]. Gatunkiem preferowanym w modelu monokrotaliny jest szczur. Pozostałe gatunki wykorzystywane w badaniach nad PH, takie jak myszy lub psy, nie metabolizują MCT do jej aktywnej postaci ze względu na odmienne szlaki zaangażowane w metabolizm wątrobowy związku. W takim przypadku, w celu wywołania PH sugeruje się podanie aktywnej MCTP [69, 74]. Wywołane nadciśnienie płucne charakteryzuje jednak mniejszy przerost mięśnia prawej komory serca oraz przebudowa naczyń płucnych w porównaniu do szczurów. Większe ssaki, np. psy czy świnie, są rzadziej wykorzystywane w modelu MCT [57, 58].

Modelowi MCT przypisuje się przewidywalność i powtarzalność otrzymywanych wyników w odniesieniu do wybranego szczepu zwierząt oraz prostą technikę indukcji w połączeniu z relatywnie niskimi kosztami. Podanie monokrotaliny umożliwia wywołanie wielu zmian odzwierciedlających obraz kliniczny schorzenia u ludzi. W przeciwieństwie do modelu przewlekłego niedotlenienia, MCT indukuje ciężką postać nadciśnienia płucnego. Ograniczenia zastosowania tego modelu w badaniach przedklinicznych wynikają z różnic międzygatunkowych zwierząt doświadczalnych oraz braku rozwoju zmian splotowatych. Nie bez znaczenia pozostaje znaczna toksyczność monokrotaliny i związana z tym duża śmiertelność zwierząt. Dotyczy to zwłaszcza zastosowania wysokich dawek związku czy długiego, tj. powyżej 35 dni czasu indukcji. Monokrotalina może powodować niekorzystne uszkodzenie wątroby, nerek oraz serca. Zmiany opisywane w literaturze jako „syndrom MCT”, nie występują w przebiegu rozwoju nadciśnienia płucnego u ludzi [20, 58].

Modyfikacje modeli klasycznych (modele alternatywne) – modele łączące ekspozycję na monokrotalinę (MCT) z usunięciem lewego płuca (LP) lub przewlekłą hipoksją (CH)

Brak idealnego modelu zwierzęcego, który odzwierciedlałby nadciśnienie płucne w ciężkości i obrazie klinicznym odpowiadającym „ludzkiej” postaci tego schorzenia, skłonił badaczy do dalszych prac nad metodami wywołania PH. Zaproponowano wiele modyfikacji modeli klasycznych i określono je wspólnym mianem modeli alternatywnych. Dotychczasowe doświadczenia z modelami alternatywnymi potwierdzają zakładane korzyści związane z wywołaniem cięższej i nieodwracalnej postaci nadciśnienia płucnego. Obserwuje się przebudowę naczyń płucnych z charakterystycznymi zmianami splotowatymi oraz warstwą neointima, co stanowi o przewadze powyższych modeli nad metodami klasycznymi [74].

Modyfikacje modelu monokrotaliny przez usunięcie lewego płuca (LP, left pneumonectomy) (LP+MCT) lub przewlekłej ekspozycji na niedotlenienie (MCT+CH) wywołują ciężką postać nadciśnienia płucnego. W porównaniu do metod klasycznych uzyskano dalsze pogorszenie parametrów hemodynamicznych (mPAP, RVSP) oraz większy przerost prawej komory serca, co prowadzi do rozwoju niewydolności prawokomorowej serca. Opisany w modelach alternatywnych obraz patomorfologiczny tętnic płucnych, w tym: koncentryczne zwłóknienia warstwy neointima, zmiany splotowate oraz okluzja naczyń z obecnymi skrzeplinami fibryny [54, 89] nie był obserwowany w modelach CH i MCT [57, 59].

Metoda eksperymentalna łącząca monokrotalinę z usunięciem lewego płuca została po raz pierwszy zastosowana w latach 90. ub.w. Dowiedziono, że usunięcie lewego płuca wywołuje zaburzenia hemodynamiczne, w tym podwyższenie ciśnienia tętniczego krwi oraz płucnego przepływu krwi, co w połączeniu z toksycznym działaniem monokrotaliny indukuje ciężką postać PH. MCT (60 mg/kg m.c., s.c. lub i.p.) podaje się 7 dni po usunięciu lewego płuca. Okres wywołania PH wynosi zwykle 4 tygodnie od podania monokrotaliny. Gatunkiem z wyboru jest szczur [15, 44, 45]. W modelach łączących MCT z przewlekłą ekspozycją na hipoksję, zwierzęta umieszcza się w komorze normobarycznej lub hipobarycznej, a następnie poddaje jednorazowej iniekcji monokrotaliny (60 mg/kg m.c., s.c. lub i.p.). Okres wywołania wynosi zwykle 2-4 tygodnie od podania monokrotaliny, gatunkiem z wyboru jest szczur [41].

Jak wynika z przeglądu literatury [48], opisane wyżej metody, choć lepiej odzwierciedlają patomorfologię naczyń płucnych, nie są tak powszechnie wykorzystywane w badaniach przedklinicznych nad nowymi lekami w PH jak modele klasyczne. W ostatnich 15 latach w mniej niż 5% eksperymentach na zwierzętach zastosowano modyfikacje metody monokrotalinowej [76]. Prawdopodobnie może to być związane z pozostającym na razie znacznym ryzykiem toksyczności i śmiertelnością zwierząt. Nie bez znaczenia pozostają także wyższe koszty prowadzonych badań [57, 68].

Po raz pierwszy model oparty na połączeniu Sugenu z ekspozycją na przewlekłe niedotlenienie został opisany przez Taraseviciene-Stewart i wsp. w 2001 r. Badanie przeprowadzono na szczurach [78].

Sugen (SU-5416, semaxinib) początkowo badano pod kątem jego potencjalnej aktywności przeciwnowotworowej. Jako inhibitor receptora typu 2 (VEGF-R2) czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), należącego do rodziny receptorów kinazy tyrozynowej, SU-5416 powoduje apoptozę komórek śródbłonka naczyń krwionośnych [65, 67]. W wyniku ekspozycji na Sugen w połączeniu z przewlekłym niedotlenieniem dochodzi do proliferacji komórek śródbłonka odpornych na proces apoptozy. Obserwuje się również rozrost warstwy śródbłonkowej wraz z okluzją naczyń przedwłośniczkowych i rozwój zmian splotowatych [35, 57, 74]. Dochodzi do zmian o charakterze przerostowym w obrębie warstwy środkowej tętniczek płucnych, spowodowanych proliferacją komórek mięśni gładkich, ich maskularyzacji, a także rozwoju warstwy neointimy. Na przykład zmiany splotowate w małych tętnicach płucnych pojawiają się u szczurów w późnym etapie rozwoju nadciśnienia płucnego, tj. ≥10 tygodni po zakończonej ekspozycji na przewlekłe niedotlenienie [1, 9, 19, 68].

Technika indukcji nadciśnienia płucnego polega na pojedynczym podaniu Sugenu (20 mg/kg m.c., s.c.), a następnie umieszczeniu zwierząt w komorze normo- lub hipobarycznej na 3-4 tygodnie. Opcjonalnie po zakończonej ekspozycji na przewlekłe niedotlenienie, zwierzęta laboratoryjne utrzymuje się w warunkach normoksji przez kilka tygodni [56]. Brak redukcji bądź normalizacji wywołanych wcześniej zmian, świadczą o przetrwałym i nieodwracalnym charakterze PH. Metodykę indukcji PH w tym modelu przedstawiono na ryc. 1; do badań wybrano szczura. Wykazano pewne różnice w odpowiedzi na wywołanie schorzenia w wykorzystywanych szczepach zwierząt. Jak dotąd, szczep Sprague-Dawley okazał się najbardziej podatny na rozwój zmian związanych z PH w opisywanym modelu doświadczalnym [34].

Ciuclan i wsp. w 2011 r. zaproponowali modyfikację modelu z przeznaczeniem dla myszy. W tym przypadku, Sugen (20 mg/kg m.c., s.c.) podaje się co 7 dni przez 3-4 tygodnie. W tym czasie myszy są umieszczone w komorze normo- lub hipobarycznej. Okazało się jednak, że u myszy rozwija się „lżejsza” postać choroby; przebudowa naczyń płucnych jest mniejsza, bez charakterystycznych zmian splotowatych, a parametry hemodynamiczne (RVSP, mPAP) osiągają mniejsze wartości. W wyniku przerwania ekspozycji na hipoksję, dochodzi do poprawy hemodynamiki prawej komory mięśnia sercowego wraz z ograniczeniem jej zmian przerostowych. Dlatego też w dalszym ciągu prowadzi się badania nad uzyskaniem „mysiej” nieodwracalnej postaci nadciśnienia płucnego z wykorzystaniem Sugenu jako czynnika indukującego [5, 69, 82, 85].

Model Su+CH jest coraz częściej wykorzystywany w badaniach przedklinicznych nadciśnienia płucnego, a zwłaszcza tętniczego nadciśnienia płucnego. Przypisuje mu się duże znaczenie praktyczne ze względu na indukcję ciężkiej postaci nadciśnienia płucnego oraz odzwierciedlenie pleksogennej arteriopatii płucnej charakterystycznej dla PAH. Wskazuje się również na mniejszą toksyczność oraz większą przeżywalność zwierząt laboratoryjnych w porównaniu do obecnie najczęściej wykorzystywanego modelu MCT [65]. Potencjalne ograniczenia modelu Su+CH wynikają z braku rozwoju zapalenia okołonaczyniowego oraz różnic w obrazie histopatologicznym zmian splotowatych u zwierząt doświadczalnych i ludzi [7, 57, 74].

Ekspozycja na przewlekłe niedotlenienie nie jest konieczna do wywołania ciężkiej postaci nadciśnienia płucnego. Podobny zakres zmian hemodynamicznych i histopatologicznych uzyskuje się wskutek połączenia SU-5416 z usunięciem lewego płuca lub z podaniem albuminy jaja kurzego (ovalbumin) [25, 52].

Zwierzęce modele indukcji PH związanego z wrodzonymi chorobami serca

Jak wynika z przedstawionej wcześniej klasyfikacji, nadciśnienie płucne może być następstwem wrodzonych wad serca, w przebiegu których dochodzi do przeciążenia prawej komory serca (RV), jej przebudowy oraz dysfunkcji [18]. Dla odzwierciedlenia patomorfologii i dysfunkcji RV zaprojektowano modele bazujące na zwężeniu tętnicy płucnej, tzw. bandingu (PAB, pulmonary artery banding) [46, 84] oraz wytworzeniu przecieku między krążeniem systemowym i płucnym (left-to-right shunt) [65]. Modele te są także wykorzystywane w badaniach nad nowymi cząsteczkami mającymi odwracać lub zapobiegać zmianom związanymi z przebudową i dysfunkcją RV [4, 42].

Model indukcji PH oparty na technice bandingu tętnicy płucnej lub wytworzeniu przecieku left-to-right shunt powoduje obciążenie prawej komory serca, co skutkuje jej dalszym włóknieniem oraz przerostem. Zaobserwowano także przebudowę i zwłóknienie tętnic płucnych, w tym zmiany splotowate [4, 57, 68].

Metodę opartą na bandingu tętnicy płucnej zaproponowano dla celów farmakologii doświadczalnej na początku XXI w. [12, 48]. W badaniach wykorzystuje się głównie szczury i myszy. Początkowo zwierzęta poddawano lewej torakotomii, a następnie przez umieszczenie igły wzdłuż tętnicy płucnej, uzyskiwano zwężenie światła tętnicy płucnej do średnicy odpowiadającej średnicy igły [14, 28]. Obecnie opracowano nową metodę polegającą na wykorzystaniu specjalnych półzamkniętych klipsów, które umieszcza się wokół tętnicy płucnej, powodując zwężenie jej światła. Zmodyfikowana technika jest mniej skomplikowana i lepiej odzwierciedla dysfunkcję prawej komory serca. Zapewnia także lepszą przeżywalność okołooperacyjną zwierząt [26, 51, 57].

Model PH oparty na wytworzeniu przecieku między krążeniem systemowym i płucnym polega najczęściej na połączeniu aorty oraz żyły głównej górnej. W badaniach eksperymentalnych wykorzystuje się zwierzęta doświadczalne, takie jak psy, świnie, owce, szczury, cielęta [43, 64].

Wskazuje się na przydatność opisanych modeli w badaniach nad tętniczym nadciśnieniem płucnym, którego rozwój jest spowodowany wrodzonymi chorobami serca oraz nadciśnieniem płucnym spowodowanym chorobami lewej części serca. Potencjalne ograniczenia wynikają z wysokiej śmiertelności zwierząt doświadczalnych oraz techniki indukcji PH opartej na ingerencji chirurgicznej, która wymaga dodatkowych umiejętności [57].

Modele genetyczne

W ostatnich latach wraz z rozwojem możliwości inżynierii genetycznej obserwuje się rosnące zainteresowanie modelami zwierzęcymi genetycznie modyfikowanymi. Dotyczy to także badań nadciśnienia płucnego; w patogenezie tego schorzenia duże znaczenie przypisuje się mutacjom genów kodujących cząsteczki lub białka receptorów uczestniczących w szlakach sygnałowych związanych z rozwojem PH. U niektórych osób chorych na tętnicze nadciśnienie płucne dochodzi do mutacji genu kodującego receptor typu 2 dla białka morfogenetycznego kości (BMPR2) oraz mutacji i genów kodujących kinazę podobną do receptora aktywiny-1 i endogliny. Wykazano także rzadkie mutacje heterozygotyczne w genach kodujących białka, takie jak kaweolina-1 (CAV1) i białka kanału potasowego kodowanego przez gen KCNK3 [18]. Dotychczasowe badania eksperymentalne nad patogenezą PH wskazują na udział w rozwoju schorzenia mutacji genów kodujących takie białka jak: endotelina-1 (ET-1), neprylizyna (NEP), serotonina czy wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP). Było to punktem wyjścia do opracowania nowych modeli modyfikowanych genetycznie. Są obecnie częstą alternatywą dla klasycznych modeli opartych na iniekcji monokrotaliny lub wywołaniu przewlekłej hipoksji. Proponowane modyfikacje genetyczne mają zapewnić wywołanie pewnej cechy lub choroby przez wstawienie do genomu fragmentu DNA lub jego usunięcie (knock-out). W przypadku nadciśnienia płucnego dotyczą one genów kodujących białka uczestniczących w szlakach sygnałowych związanych z patomechanizmem PH. Modelom genetycznym przypisuje się dużą rolę w badaniach nad etiologią oraz molekularnym i fizjologicznym podłożem tego schorzenia. Ze względu na stosunkowo łatwą ingerencję genetyczną, gatunkiem najczęściej wykorzystywanym są myszy, a ograniczeniem tego typu modeli – wysokie koszty eksperymentów [57].

W jednym z najczęściej stosowanych modeli genetycznych nadciśnienia płucnego wykorzystuje się mutację genu BMPR2. Gen ten koduje receptor typu 2 białka morfogenetycznego kości (BMP), który odpowiada za prawidłową proliferację komórek naczyń krwionośnych. Heterozygotyczne mutacje genu BMPR2 wykryto u około 75% chorych na dziedziczne PAH i u 25 % chorych na postać idiopatyczną schorzenia. Do mutacji dochodzi w śródbłonku i mięśniówce gładkiej tętnic płucnych [17, 48]. W badaniach przedklinicznych wykorzystuje się modele na myszach. Model oparty na delecji eksonów 4 i 5 genu BMPR2 okazał się niewystarczający. Homozygoty cechowała wysoka śmiertelność już w fazie rozwoju zarodkowego. Heterozygoty rozwijały łagodną postać PH pozbawioną wielu zmian związanych z rozwojem PH u ludzi, w tym przerostu prawej komory mięśnia sercowego [3, 57, 87]. Rozwiązaniem okazał się model związany z mutacją dominującą negatywną genu BMPR2 w komórkach mięśni gładkich tętnic płucnych. Mutacja powoduje rozwój nadciśnienia płucnego z pogorszeniem parametrów hemodynamicznych (RVSP, mPAP), przerost prawej komory serca oraz maskularyzację małych tętniczek. W badaniach obserwowano także rozwój zmian splotowatych [87, 92].

Wiedzą o udziale endoteliny-1 (ET-1) w patomechanizmie nadciśnienia płucnego wykorzystano zarówno w badaniach nad zastosowaniem terapeutycznym jej inhibitorów, jak i opracowaniem zwierzęcych modeli doświadczalnych. Endotelina-1 działa poprzez dwa typy receptorów: ET-A oraz ET-B, które należą do rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G. Receptory typu ET-A i ET-B występują głównie w komórkach mięśni gładkich tętnic płucnych, a receptory typu ET-B są także liczne w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych. Aktywacja receptorów ET-A i ET-B w komórkach mięśni gładkich prowadzi do skurczu tętnic płucnych i może powodować nadmierną proliferację oraz przebudowę naczyń krwionośnych. Aktywacja receptorów ET-B w komórkach śródbłonka powoduje rozkurcz tętnic płucnych, w wyniku uwalniania tlenku azotu (NO) oraz prostaglandyn. U osób cierpiących na nadciśnienie płucne dochodzi do podwyższenia poziomów endoteliny-1 wynikających prawdopodobnie z zaburzenia równowagi między aktywnością receptorów ET-A oraz ET-B [68]. W badaniach przedklinicznych wykorzystuje się modyfikowane genetycznie szczury z niedoborem receptorów ET-B, które poddaje się dodatkowo działaniu MCT lub przewlekłej hipoksji. Dodatkowa ekspozycja szczurów na monokrotalinę przyczynia się do wywołania ciężkiej postaci nadciśnienia płucnego, z rozwojem warstwy neointima i zapaleniem okołonaczyniowym w płucach [31, 32]. Jednak szlak sygnałowy związany z ET-1 stał się jednym z trzech głównych punktów uchwytu dla zarejestrowanych leków – selektywnych (ambrisentan) bądź nieselektywnych (bozentan, macytentan) antagonistów receptorów endoteliny ET-A i ET-B stosowanych w celu odwrócenia niekorzystnych zmian w nadciśnieniu płucnym.

Inna modyfikacja genetyczna wykorzystywana do badań nad PH ukierunkowana jest na wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP). Punktem uchwytu jest ograniczenie ekspresji genu tego neuropeptydu o działaniu przeciwzapalnym i antyproliferacyjnym na komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz wazodylatacyjnym na mięśnie gładkie dróg oddechowych [10, 91]. U osób cierpiących na nadciśnienie płucne może dochodzić do zmniejszenia ekspresji VIP w płucach. Wykorzystano to do opracowania modelu eksperymentalnego, w którym poprzez delecję genu VIP u myszy, wywołuje się umiarkowaną lub ciężką postać nadciśnienia płucnego. Dochodzi wówczas do wzrostu ciśnienia skurczowego w prawej komorze serca i jej przerostu. Tętnice płucne ulegają przebudowie wraz z przerostem mięśniówki gładkiej tętnic i małych tętniczek, a także rozwojem zapalenia okołonaczyniowego w płucach. Model charakteryzuje jednak wysoka śmiertelność wśród zwierząt doświadczalnych [66].

Neprylizyna (NEP) to transbłonowa metaloendopeptydaza, która katalizuje rozkład wielu peptydów, rozpowszechnionych w fibroblastach, komórkach śródbłonka oraz mięśni gładkich tętnic płucnych, takich jak: przedsionkowy peptyd natriuretyczny (ANP), bradykinina, endotelina-1 czy angiotensyna II. Jak wykazano, ograniczenie ekspresji NEP może wzmagać migrację i proliferację tych komórek, co prowadzi do przebudowy tętnic płucnych i rozwoju nadciśnienia płucnego [36, 90]. Takie ograniczenie syntezy białka NEP stwierdza się u osób z PH. Stało się to punktem wyjścia do opracowania modelu, w którym przez delecję genu NEP u myszy, poddanym dodatkowo hipoksji przez kilka tygodni, dochodzi do rozwoju ciężkiej postaci schorzenia z pogorszeniem parametrów hemodynamicznych, przerostem prawej komory serca oraz maskularyzacją tętnic płucnych [57].

Powszechnie wiadomo, że apolipoproteina E (ApoE) bierze udział w redukcji utlenowanych lipidów o niskiej gęstości i tym samym zapobiega rozwojowi miażdżycy tętnic [21]. Tę właściwość wykorzystano do opracowania innego zwierzęcego modelu nadciśnienia płucnego. U transgenicznych myszy z deficytem genu ApoE, otrzymujących dietę wysoko tłuszczową, rozwija się spontanicznie nadciśnienie płucne z opisywanymi wcześniej charakterystycznymi zmianami w hemodynamice i przebudową w obrębie krążenia płucnego [24]. Jak się okazało, zmianom tym towarzyszy obniżona ekspresja adiponektyny (APN), hormonu polipeptydowego o działaniu przeciwzapalnym, który reguluje wrażliwość tkanek na insulinę. Hipoteza o udziale samej adiponektyny w patomechanizmie PH znalazła potwierdzenie w zaproponowanym modelu zwierzęcym, opartym na braku genu adiponektyny APN. Opisane tu skrótowo modele są obecnie wykorzystywane m.in. w badaniach nad powiązaniem rozwoju nadciśnienia płucnego z insulinoopornością i otyłością [48, 62, 75, 86].

W patomechanizmie rozwoju PH niewątpliwie istotną rolę odgrywa proces zapalny. W przebiegu tego schorzenia dochodzi do podwyższenia poziomu wielu czynników prozapalnych, a jednym z nich jest interleukina-6 (IL-6). Ta prozapalna cytokina, jest wytwarzana głównie przez limfocyty T i makrofagi, komórki mięśni gładkich oraz w zewnętrznej błonie naczyń krwionośnych. Jej poziom w surowicy u osób chorych na tętnicze nadciśnienie płucne może korelować z ciężkością choroby i przeżywalnością pacjentów [16, 23]. Do celów farmakologii eksperymentalnej wykorzystuje się myszy, u których przez modyfikację genetyczną uzyskano nadekspresję IL-6 i w następstwie – rozwój nadciśnienia płucnego. Dodatkowa ekspozycja zwierząt na przewlekłe niedotlenienie indukuje cięższą postać PH. Model charakteryzuje się podwyższeniem ciśnienia skurczowego w prawej komorze serca, przerostem mięśnia prawej komory serca, maskularyzacją tętnic płucnych, rozwojem pleksogennej arteriopatii płucnej oraz zapaleniem okołonaczyniowym. Jak zaobserwowano w opisywanym modelu, nadekspresji IL-6 towarzyszy zwiększenie aktywności czynników proangiogennych, proproliferacyjnych i antyapoptycznych, co tłumaczy mechanizm wywołania przebudowy naczyń krwionośnych, a zarazem podkreśla rolę samej IL-6 w rozwoju nadciśnienia płucnego [72, 74].

W modelu genetycznym, wykorzystywanym w badaniach nad patomechanizmem PH, wywołuje się nadekspresję angiopoetyny-1 (Ang-1). Angiopoetyna-1 to ligand glikoproteinowy wydzielany przez komórki mięśni gładkich, który działa przez receptor TIE-2 związany z kinazą tyrozynową. Będąc agonistą TIE-2, Ang-1 bierze udział w procesach angiogenezy i stabilizuje sieć naczyń krwionośnych, działając synergistycznie z VEGF. Wykazano, że w wyniku wzmożonej ekspresji Ang-1 może dochodzić do rozwoju nadciśnienia płucnego. W badaniach na szczurach obserwowano podwyższenie ciśnienia skurczowego w prawej komorze serca oraz maskularyzację małych tętniczek płucnych, ale bez towarzyszącego zapalenia okołonaczyniowego. Dalsze zastosowanie tego modelu do badań przedklinicznych wymaga jednak potwierdzenia ze względu na jeszcze niewyjaśniony związek między podwyższeniem Ang-1 a rozwojem PH u ludzi [39, 65].

Innym czynnikiem mającym uczestniczyć w rozwoju choroby jest serotonina [38]. Hipotezę tę potwierdzają podwyższone poziomy serotoniny we krwi oraz w tkankach płuc pobranych od osób z idiopatycznym PAH oraz zwiększona ekspresja błonowego transportera serotoniny (SERT). Serotonina bierze udział w przebudowie płucnych naczyń krwionośnych przez indukcję proliferacji i migracji komórek mięśni gładkich tętnic płucnych i fibroblastów [13, 50, 53]. Działając przez receptory 5-HT1B oraz 5-HT2A powoduje skurcz naczyń krwionośnych. Obecnie w badaniach przedklinicznych wykorzystuje się model myszy, u których za pośrednictwem modyfikacji genetycznych uzyskano nadekspresję błonowego SERT. Powyższe zabiegi pozwoliły na podwyższenie poziomu ciśnienia skurczowego w prawej komorze serca, wywołanie jej zmian przerostowych oraz na maskularyzację małych tętnic płucnych. Jak obserwowano, dodatkowa, kilkutygodniowa ekspozycja zwierząt na przewlekłe niedotlenienie potęguje opisane zmiany hemodynamiczne i patomorfologiczne [49, 69, 88].

Białko S100A4/Mst1 należy do rodziny białek wiążących wapń, które są zaangażowane w procesy proliferacji, różnicowania i apoptozy komórek [57]. U około 5% myszy z nadekspresją białka S100A4/Mst1 dochodzi do przebudowy naczyń płucnych z charakterystycznymi dla „ludzkiej” postaci PAH zmianami splotowatymi i rozwojem warstwy neointima, rzadko obserwowanymi w modelach zwierzęcych. Oprócz przebudowy tętnic płucnych, obserwuje się także u zwierząt doświadczalnych pogorszenie parametrów hemodynamicznych (RVSP, mPAP). Dodatkowa ekspozycja myszy na przewlekłe niedotlenienie powoduje rozwój cięższej postaci PH z towarzyszącym rozwojem zapalenia okołonaczyniowego. Opisane zmiany obserwuje się głównie u samic myszy, co umożliwia dodatkowe zastosowanie tego modelu w badaniach nad wpływem płci w patogenezie nadciśnienia płucnego [11, 22, 48].

Podsumowanie

Wieloczynnikowa etiologia nadciśnienia płucnego oraz nieuleczalność choroby skłaniają do poszukiwań nowych punktów uchwytu dla potencjalnych leków o działaniu terapeutycznym. Próba analizy dotychczas opracowanych modeli zwierzęcych nadciśnienia płucnego potwierdza ich duże znaczenie w badaniach przedklinicznych. Prowadzone szeroko badania z udziałem zwierząt doświadczalnych poszerzają dotychczasową wiedzę o szlakach sygnałowych zaangażowanych w patomechanizm nadciśnienia płucnego. Ma to ułatwić pełne wyjaśnienie molekularnego podłoża schorzenia i zapewnić optymalizację dotychczasowej terapii. Modele zwierzęce są także wykorzystywane w badaniach nad zastosowaniem nowych cząsteczek działających swoiście na PH. W przeciągu ostatnich kilku lat przebadano ponad 200 takich substancji. Można je zaklasyfikować do wielu grup terapeutycznych, takich jak: inhibitory reduktazy HMG-CoA (np. simwastatyna, rozuwastatyna, atorwastatyna); inhibitory kinazy tyrozynowej (imatynib), inhibitory kinazy RhoA (fasudil, Y-27632), leki działające na układ RAAS (adenozyna, enalapril, losartan), na przekaźnictwo serotoninergiczne (fluoksetyna, tergurid, citalopram), dichlorooctan czy też wiele związków o działaniu przeciwzapalnym (infliximab, deksametazon, rapamycyna), antyoksydacyjnym (erdosteina, N-acetylocysteina) i antyproliferacyjnym (metformina, batimastat). W kręgu zainteresowań badaczy znalazły się też związki pochodzenia roślinnego (np. resweratrol, kwercetyna, ruskogenina). Jak wcześniej wspomniano, mimo obiecujących wyników uzyskanych na zwierzętach dla większości z wyżej wymienionych substancji, badania kliniczne nie potwierdzają spodziewanych korzyści. Wielokrotnie podkreślano, że przy wielu próbach nie opracowano dotychczas idealnego modelu zwierzęcego nadciśnienia płucnego. Obecnie wykorzystywane, cechuje duża różnorodność w odniesieniu do czynników indukujących PH i mechanizmów ich działania oraz zakresu wywoływanych zmian hemodynamicznych i histopatologicznych, a także kosztów eksperymentów, powtarzalności i przewidywalności otrzymywanych wyników. Tym niemniej, wiedza o korzyściach i potencjalnych ograniczeniach modeli PH, a zwłaszcza o stopniu porównywalności indukowanych zmian u zwierząt do zmian w obrazie klinicznym nadciśnienia płucnego u ludzi, może być pomocna w doborze właściwej metodyki badawczej i zwiększa trafność identyfikacji potencjalnie nowych leków w PH.

Pełna treść artykułu