Streszczenie

Śródbłonek naczyniowy pełni ważną rolę w regulacji napięcia ścian naczyń krwionośnych poprzez syntezę i uwalnianie m.in. substancji rozszerzających, takich jak tlenek azotu (NO) i prostacyklina I2 (PGI2). Ważną, niezależną od NO i PGI2 rolę w relaksacji naczyń – zwłaszcza o małej średnicy (<300 µm), pełni hiperpolaryzacja zależna od śródbłonka (EDH – endothelium-derived hyperpolarization). Odpowiedź EDH zapoczątkowuje wzrost stężenia jonów wapnia w komórce śródbłonka w wyniku działania agonistów (np. acetylocholiny, bradykininy) lub napięcia ścinającego przepływającej krwi. Zainicjowany zostaje klasyczny szlak związany z pobudzeniem śródbłonkowych kanałów potasowych aktywowanych przez jony wapnia o małej (KCa2.3) i średniej (KCa3.1) przewodności, wypływem jonów potasowych z komórki śródbłonka i hiperpolaryzacją, która przenosi się na komórki mięśni gładkich i prowadzi do rozkurczu naczyń oporowych z udziałem wewnątrzprostowniczych kanałów potasowych (KIR) oraz pompy sodowo-potasowej (Na+/K+-ATP-aza). EDH może być kompensacyjnym mechanizmem w warunkach zmniejszonej biodostępności NO związanej z dysfunkcją śródbłonka m.in. w nadciśnieniu tętniczym, jednak jego siła działania zależy od łożyska naczyniowego, modelu patologicznego i warunków eksperymentu. W nadciśnieniu tętniczym kanały KCa2.3 i KCa3.1 mogą wykazywać zmniejszoną aktywność i/lub ekspresję, przez co osłabia się zdolność małych naczyń do rozkurczu. Obecnie trwają badania nad wykorzystaniem związków modulujących (aktywatorów i inhibitorów) aktywność kanałów potasowych KCa2.3 i KCa3.1 jako prawdopodobny punkt uchwytu działania leków w terapii chorób układu krążenia. Aktywatory KCa2.3 i KCa3.1 np. SKA-31 obiecująco poprawiają odpowiedź zależną od EDH i polepszają funkcję śródbłonka oraz obniżają ciśnienie krwi. Może to sugerować przydatność tych związków w terapii nadciśnienia tętniczego.

Znaczenie śródbłonka naczyniowego w regulacji średnicy naczyń krwionośnych

Śródbłonek naczyniowy odpowiada za wiele procesów fizjologicznych, takich jak: synteza i sekrecja substancji biologicznie czynnych, regulacja ciśnienia i przepływu krwi, uczestniczy w angiogenezie, krzepnięciu krwi, fibrynolizie oraz reakcjach zapalnych i odpornościowych. Pełni znaczącą funkcję w regulacji napięcia ścian naczyń krwionośnych. Uwalnia zarówno czynniki kurczące: endotelinę-1, tromboksan A2 oraz rozkurczające naczynia krwionośne m.in. tlenek azotu (NO), prostacyklinę I2 (PGI2). Ważną rolę w relaksacji naczyń, zwłaszcza o małej średnicy (<300 µm) pełni hiperpolaryzacja zależna od śródbłonka (EDH – endothelium-derived hyperpolarization), której klasyczny szlak jest związany z pobudzeniem kanałów potasowych aktywowanych przez jony wapnia (KCa) o małej (KCa2.3) i średniej (KCa3.1) przewodności [1]. EDH doprowadza do relaksacji naczyń krwionośnych [46, 50].

Po raz pierwszy znaczenie śródbłonka w procesie rozkurczu naczyń udowodnili w 1980 r. R. Furchgott i J. Zawadzki. W doświadczeniu przeprowadzonym na izolowanej aorcie piersiowej królika, z uszkodzonym śródbłonkiem naczyniowym, acetylocholina (Ach) nie działała wazodylatycyjnie. Na tej podstawie wywnioskowano, że w czasie niszczenia śródbłonka, nie uwalnia się czynnik relaksacyjny, który został nazwany śródbłonkowym czynnikiem rozkurczającym (EDRF – endothelium-derived relaxing factor) [30]. Ten historyczny eksperyment zmienił dotychczasowy pogląd o lokalnej kontroli napięcia naczyniowego. W późniejszych badaniach wykazano, że czynnikiem tym jest NO [39], który odgrywa główną rolę w regulacji napięcia naczyń tętniczych o funkcji transportowej [71]. Jego znaczenie maleje wraz ze zmniejszaniem średnicy naczynia (ryc. 1). Prostacyklina I2 jest wytwarzana przez komórki śródbłonka w odpowiedzi na czynniki humoralne i mechaniczne, nie bierze udziału w utrzymaniu podstawowego napięcia ścian naczyń, a pełni jedynie funkcję regulacyjną pod wpływem działających bodźców. Jej rola jest stała, bez względu na zmianę średnicy naczynia [63].

Przez wiele lat do grupy czynników wpływających na relaksację mięśni gładkich naczyń – oprócz NO i PGI2 – zaliczano śródbłonkowy czynnik hiperpolaryzujący (EDHF – endothelium-derived hyperpolarizing factor), który po raz pierwszy opisali w 1988 r. Félétou i Vanhoutte. W przeprowadzonym doświadczeniu na izolowanej tętnicy wieńcowej psa przy łącznej blokadzie syntazy tlenku azotu (eNOS) przez ester metylowy Nω-nitro-L-argininy (L-NAME) oraz cyklooksygenazy przez indometacynę, acetylocholina nadal zachowywała zdolność rozkurczową badanego naczynia. Na tej podstawie postawiono hipotezę o istnieniu dodatkowego czynnika powodującego hiperpolaryzację i relaksację naczyń, czyli EDHF [25]. Dotąd poznano wiele potencjalnych czynników, które mogłyby pełnić te rolę. Należą do nich m.in. jony potasowe (K+), kwasy epoksyeikozatrienowe (EETs), nadtlenek wodoru (H2O2), połączenia szczelinowe (gap junctions), tlenek węgla (CO), siarkowodór (H2S) [24, 47]. Jednak ze względu na mnogość czynników zaangażowanych w ten proces, a także to, że napięcie ścinające przepływającej krwi („shear stress”) także powoduje hiperpolaryzację i w następstwie relaksację naczynia, używanie określenia EDHF okazało się kłopotliwe i stało się nieaktualne, gdyż sama nazwa mylnie sugeruje istnienie tylko jednego czynnika. Od 2013 r. zaleca się, stosowanie terminu: „hiperpolaryzacja zależna od śródbłonka” do opisu całego procesu zachodzącego w naczyniach krwionośnych o małej średnicy [26].

Hiperpolaryzacja zależna od śródbłonka (EDH)

Mechanizm hiperpolaryzacji zależnej od śródbłonka odgrywa główną rolę w relaksacji naczyń oporowych (ryc. 1, 2). Reakcja EDH może być zapoczątkowana zarówno chemicznie przez związanie receptora z ligandem (m.in. Ach, bradykininą) lub mechanicznie przez działanie napięcia ścinającego płynącej krwi [2, 47]. Oba te zjawiska powodują wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia [Ca2+]i. Jony Ca2+ pochodzą z dwóch źródeł: magazynu znajdującego się w siateczce endoplazmatycznej (ER) lub ich napływu z zewnątrz przez otwarte kanały wapniowe zależne od potencjału (TRP, transient receptor potential), zwłaszcza TRPV4 [23, 28]. Wysokie stężenie [Ca2+]i w komórce endotelium, może bezpośrednio aktywować kanały potasowe KCa2.3 i KCa3.1, natomiast pośrednio kanały potasowe aktywowane przez jony wapnia o dużej przewodności – KCa1.1 w miocytach [31]. Kanały potasowe KCa2.3 i KCa3.1 znajdują się głównie na powierzchni komórek śródbłonka i to im przypisuje się znaczącą rolę w procesie EDH [44] (tabela 1). Przez otwarte kanały potasowe następuje wypływ jonów K+ z komórek śródbłonka do przestrzeni otaczającej, dochodzi do zwiększenia polarności błon, czyli ich hiperpolaryzacji. Stan ten w sposób bierny, dzięki obecności połączeń szczelinowych (gap junctions), przenoszony jest między sąsiadującymi komórkami homotypowymi (komórka śródbłonka – komórka śródbłonka) jak i heterotypowymi (komórka śródbłonka – komórka mięśni gładkich) [67]. Ponadto za rozprzestrzenianie się hiperpolaryzacji ze śródbłonka na miocyty, mogą również odpowiadać uwolnione jony K+ zwane „chmurą potasową”. Umiarkowany wzrost jonów K+ w przestrzeni międzykomórkowej (<15 mM) może wywołać hiperpolaryzację i rozkurcz mięśni gładkich przez aktywację wewnątrzprostowniczych kanałów potasowych (KIR) oraz pompy sodowo-potasowej (Na+/K+-ATP-aza) znajdujących się w błonie komórki mięśniowej [23, 47] (ryc. 2). Kanały potasowe zależne od Ca2+ o dużej przewodności (KCa1.1), które znajdują się głównie w komórkach mięśni gładkich naczyń w sposób pośredni mogą uczestniczyć w ich hiperpolaryzacji. Ich pobudzenie następuje przez dyfundujące ze śródbłonka czynniki rozkurczające, których synteza indukowana jest przez wysokie stężenie jonów Ca2+ (np. EETs, H2O2, NO) [44]. Kanały KCa1.1 mogą być aktywowane przez NO bezpośrednio lub pośrednio przez cykliczny guanozynomonofosforan (cGMP), który jest pozytywnym modulatorem tych kanałów [61]. W wyniku opisanych wyżej procesów dochodzi do rozkurczu naczyń krwionośnych (ryc. 2, tabela 1).

Ryc. 1. Zależność między średnicą naczynia krwionośnego a udziałem tlenku azotu (NO) i hiperpolaryzacji zależnej od śródbłonka (EDH) w kontroli napięcia naczyniowego (wg [63] zmodyfikowano)

Ryc. 2. Szlak hiperpolaryzacji zależnej od śródbłonka (EDH). Wzrost stężenia jonów wapnia Ca2+ w komórkach śródbłonka aktywowanych agonistą (np. bradykininą, acetylocholiną; Ach) lub napięciem ścinającym prowadzi do otwarcia kanałów potasowych o średniej i małej przewodności (odpowiednio KCa3.1 i KCa2.3) i wypływu jonów potasu (K+) do przestrzeni międzykomórkowej. Jony K+ pobudzają wewnątrzprostownicze kanały potasowe (KIR) oraz pompę sodowo-potasową (Na+/K+-ATP-aza) obecną w błonie komórki mięśniowej naczynia krwionośnego. Wzrost stężenia jonów wapnia Ca2+ w komórkach śródbłonka aktywuje również syntazę tlenku azotu (eNOS) oraz cyklooksygenazę (COX), zaangażowane w syntezę związków wazorelaksacyjnych: odpowiednio tlenku azotu (NO) i prostacykliny I2 (PGI2) działających za pośrednictwem kanałów potasowych aktywowanych przez jony wapnia o dużej przewodności (KCa1.1) i cyklicznego adenozynomonofosforanu (cAMP). Na+ – jony sodu; TRPV4 – kanały wapniowe zależne od potencjału; GC – cyklaza guanylanowa; cGMP – cykliczny guanozynomonofosforan; AC – cyklaza adenylanowa (wg [23, 34] zmodyfikowano)

Cecha	Kanały potasowe aktywowane przez jony wapnia obecne w naczyniach krwionośnych
Przewodność dla jonów potasu	mała;10 pS	średnia;20-80 pS	duża;240 pS
Podtyp	KCa2.3 (SKCa)	KCa3.1 (IKCa)	KCa1.1(BKCa)
Geny kodujące	KCNN3	KCNN4	KCNMA1 - podjednostka α;KCNMB1- podjednostka β
Rozmieszczenie w naczyniach	Komórki śródbłonkaw miejscu połączenia dwóch komórek śródbłonka, kaweole	Komórki śródbłonkaw miejscu połączeń mięśniowo-śródbłonkowych	Komórki mięśni gładkichludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej
Wrażliwość na jony wapnia	Jony Ca2+ – połączone z kalmoduliną	Jony Ca2+ – połączone z kalmoduliną	jony Ca2+
Zależność od napięcia	–	–	+
Fizjologiczne czynniki pobudzające	Wzrost [Ca2+]i	Wzrost [Ca2+]i	Wzrost [Ca2+]i; depolaryzacja; CO; NO; EETs; H2S; kinaza białkowa A; kinaza białkowa B
Fizjologiczne czynniki hamujące	Spadek [Ca2+]i	Spadek [Ca2+]i	Spadek [Ca2+]i; hiperpolaryzacja; kinaza białkowa C

Tabela 1. Charakterystyka kanałów potasowych aktywowanych przez jony wapnia znajdujące się w ścianie naczyń krwionośnych. [Ca2+]i – wewnątrzkomórkowe stężenie jonów wapnia; NO – tlenek azotu; CO – tlenek węgla; EETs – kwasy epoksyeikozatrienowe; H2S – kwas siarkowodorowy, pS – pikosimensy; na podstawie [2, 34, 49].

Mechanizm rozprzestrzeniania się hiperpolaryzacji między komórkami śródbłonka oraz komórkami śródbłonka i mięśni gładkich naczyń krwionośnych

Ściany tętniczek oporowych są zbudowane z pojedynczej warstwy komórek śródbłonka, oddzielonych błoną podstawną od warstwy mięśni gładkich. Mimo odgraniczenia warstw przez włókna kolagenowe i elastynowe, zostaje zachowana między nimi komunikacja. W błonie podstawnej znajdują się przestrzenie, w które wnikają fragmenty śródbłonka, dzięki którym komórki pozostają w bezpośrednim sąsiedztwie miocytów [76]. W takim umiejscowieniu komórki endotelium mają charakterystyczną budowę. Zawierają następujące struktury: retikulum endoplazmatyczne (ER), gap junctions, receptory trifosforanu inozytolu (IP3), KCa3.1. Na szczególną uwagę zasługuje liczne występowanie KCa3.1, w miejscu połączeń mięśniowo-śródbłonkowych, zwłaszcza w bliskim sąsiedztwie ER [3] (ryc. 3). Retikulum endoplazmatyczne jest głównym źródłem Ca2+ w komórce. Jego uwolnienie następuje pod wpływem stymulacji receptorów IP3 i/lub samych kanałów Ca2+, ma to charakter powtarzających się prądów jonowych. Jony Ca2+ uwolnione z ER otwierają kanały KCa3.1, a także aktywują Na+/K+-ATP-azę i kanały potasowe KIR obecne w błonie komórki mięśniowej. Następuje wypływ jonów K+ do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i hiperpolaryzacji komórek, która rozprzestrzeniając się lokalnie, jest mechanizmem regulacji napięcia naczyń oporowych, powodując ich rozkurcz [21, 22, 59].

Ryc. 3. Rozmieszczenie kanałów KCa3.1 w obszarze śródbłonkowo-mięśniowym i proponowany mechanizm ich aktywacji przez uwalniane prądy jonów wapnia (Ca2+) z retikulum endoplazmatycznego (ER). KCa3.1 – kanał potasowy aktywowany przez jony wapnia o średniej przewodności; KIR – wewnątrzprostowniczy kanał potasowy; IP3R – receptor dla trifosforanu inozytolu; IP3 – trifosforan inozytolu; K+ – jony potasu; gap junctions – połączenia szczelinowe (wg [3, 22, 34] zmodyfikowano)

Drugim regionem o swoistej organizacji jest obszar połączenia dwóch komórek śródbłonka. W sąsiadujących komórkach często tworzą się charakterystyczne zagłębienia nazywane kaweolami (ryc. 4). W tych miejscach występują licznie kanały KCa2.3, połączenia szczelinowe (zbudowane z koneksyn: Cx37, Cx40 i Cx43) oraz kanały TRP, zwłaszcza TRPV4 [58]. Zachodząca w tym obszarze hiperpolaryzacja zależy bezpośrednio od otwarcia kanałów KCa2.3 [65]. Warto zaznaczyć, że w naczyniach w stanie spoczynku, czyli przy braku czynników wazokonstrykcyjnych, reakcja EDH jest związana głównie z aktywacją kanałów KCa2.3 i zostaje przekazana na miocyty przez śródbłonkowo-mięśniowe połączenia szczelinowe [23], a przy pobudzeniu, czyli w naczyniach stymulowanych przez czynnik wazokonstrykcyjny, hiperpolaryzacja jest zależna zarówno od otwarcia kanału KCa2.3, jak i KCa3.1 [21].

Ryc. 4. Rozmieszczenie kanałów jonowych w błonie komórkowej sąsiadujących komórek śródbłonka. KCa2.3 – kanał potasowy aktywowany przez jony wapnia o małej przewodności; KIR – wewnątrzprostowniczy kanał potasowy; TRPV4 – kanał wapniowy zależny od potencjału; gap junctions – połączenia szczelinowe; K+ – jony potasu; Ca2+ – jony wapnia (wg [23] zmodyfikowano)

Śródbłonkowe kanały potasowe aktywowane przez jony wapnia

W tabeli 1 zestawiono cechy kanałów potasowych aktywowanych przez jony wapnia, najczęściej występujących w śródbłonku naczyniowym (KCa2.3 i KCa3.1), a dla porównania w miocytach naczyń krwionośnych (KCa1.1).

Kanały KCa2.3 oraz KCa3.1 wykazują ekspresję na komórkach śródbłonka całego łożyska naczyniowego, co potwierdzono u przedstawicieli wszystkich dotychczas zbadanych gatunków, m.in. człowieka, świni, krowy, psa, szczura [8, 18, 48, 52, 53, 60]. W warunkach fizjologicznych komórki mięśniowe nie mają na swojej powierzchni tych kanałów [24, 34]. Ten stan może ulec jednak zmianie w patologii. W odpowiedzi na uszkodzenie naczyń, spowodowane np. przezskórną śródnaczyniową angioplastyką wieńcową, pomostowaniem aortalno-wieńcowym lub w wyniku rozwijającej się miażdżycy na powierzchni miocytów tworzących nadmiernie rozrastającą się błonę wewnętrzną (tzw. neointymę) stwierdzono obecność kanałów KCa3.1 [44, 74]. Należy jednak pamiętać, że kanały potasowe KCa2.3 i KCa3.1 są nie tylko na komórkach śródbłonka. U ludzi KCa3.1 znajdują się również na krwinkach białych i czerwonych, gdzie są zaangażowane w zależną od jonów Ca2+ odpowiedź immunologiczną oraz regulują objętość erytrocytów [27, 34]. W nabłonku jelit, oskrzeli i ślinianek odpowiadają za wytwarzanie m.in. śliny czy śluzu [48]. Kanały KCa2.3 występują w neuronach dopaminergicznych ośrodkowego układu nerwowego pośredniczą w kontroli czasu refrakcji. Ich obecność stwierdzono także w mięśniach szkieletowych, w pęcherzu moczowym, rdzeniu kręgowym, zwojach korzeni grzbietowych, sercu [45].

Ryc. 5. Schemat podjednostki budującej kanały potasowe aktywowane przez jony wapnia o małej (KCa2.3) i średniej (KCa3.1) przewodności z sześcioma domenami S1-S6 i końcem karboksylowym wiążącym kalmodulinę. Szczelina oznaczona symbolem P została utworzona pomiędzy domenami S5 i S6 (wg [17] zmodyfikowano)

Kanały potasowe KCa2.3 i KCa3.1 są zbudowane z czterech jednakowych podjednostek α, kodowanych przez następujące geny: KCNN3 dla KCa2.3 oraz KCNN4 dla KCa3.1. Każda podjednostka zawiera sześć transbłonowych domen (S1-S6), z końcem NH2 i COOH zwróconym do wnętrza komórki (ryc. 5). W domenie S4 brak jest regionu bogatego w argininę, który odpowiada za wrażliwość receptora na zmiany napięcia błony [34, 45]. Właściwy otwór kanału zlokalizowano między regionem S5-S6, natomiast kalmodulina wchodzi w interakcje z C-końcem łańcucha polipeptydowego.

Farmakologia kanałów potasowych aktywowanych przez jony wapnia o małej (KCa2.3) i średniej (KCa3.1) przewodności

Związki, które aktywują lub hamują śródbłonkowe KCa są przeważnie modulatorami, które samodzielnie nie powodują otwarcia/zamknięcia kanałów, a zmieniają ich konformację przestrzenną. Jest to związane ze zwiększeniem wrażliwości na jony Ca2+, dzięki czemu niższe stężenie tych jonów jest konieczne do otwarcia kanałów KCa2.3 i KCa3.1 (modulatory pozytywne) lub dochodzi do zmniejszenia wrażliwości na jony Ca2+, co powoduje, że znacznie wyższe stężenie tych jonów jest konieczne do otwarcia kanałów potasowych (modulatory negatywne) [13, 74]. W dostępnym piśmiennictwie nomenklatura jest niejednolita [13, 36, 74], dla uproszczenia, w pracy modulatory pozytywne i negatywne będą nazywane odpowiednio aktywatorami i blokerami/inhibitorami [1].

Aktywatory

Wszystkie dotychczas poznane aktywatory kanałów KCa2.3 i KCa3.1 są pochodzenia syntetycznego (tabela 2). Pierwszym wprowadzonym do lecznictwa był riluzol, który słabo i nieselektywnie pobudza KCa2.3 oraz KCa3.1 [35]. Może również blokować kanały sodowe znajdujące się na neuronach i kanały KIR. Wykorzystany został w terapii stwardnienia zanikowego bocznego, ze względu na hamowanie procesów wywoływanych przez kwas glutaminowy, a wpływ na kanały KCa był jedynie działaniem dodatkowym [13]. Innym poznanym związkiem był 1-EBIO (1-ethyl-2-benzimidazolinone) [19], który wykazuje cechy słabego aktywatora z większym powinowactwem do KCa3.1 niż KCa2.3. Jego wykorzystanie ogranicza się jedynie do badań laboratoryjnych.

Substancje aktywne		KCa2.3	KCa3.1
Aktywatory (EC50)	Riluzol	10-20 μM	10-20 μM
	1-EBIO	87-600 μM	24-80 μM
	NS309	120-900 nM	10-27 nM
	SKA-31	3 μM	260 nM
	SKA-111	13,7 μM	111 nM
	SKA-121	4,4 μM	190 nM
Blokery/Inhibitory (IC50)	Charybdotoksyna	Brak działania przy stężeniu 1μM	2-28 nM
	TRAM-34	20 μM	10-25 nM
	Senicapoc	>10 μM	11 nM
	Apamina	1-13 nM	Brak działania przy stężeniu 1μM
	NS6180	>10 μM	11 nM
	UCL1684	6-10 nM	Brak działania przy stężeniu 1μM

Tabela 2. Porównanie siły działania aktywatorów i blokerów kanałów potasowych aktywowanych przez jony wapnia o małej (KCa2.3) i średniej (KCa3.1) przewodności. IC50 – molowe stężenie antagonisty, przy którym zahamowano efekt maksymalny o 50%; EC50 – molowe stężenie agonisty, przy którym zostało osiągnięte 50% efektu maksymalnego; nM – nanomole; μM – mikromole; na podstawie [15, 74]

Nowszymi aktywatorami o znacznie silniejszym działaniu są NS309 [69] i SKA-31 [60]. NS309 charakteryzuje się mniejszą selektywnością niż SKA-31 (tabela 2). Poza kanałami KCa aktywuje zależne od napięcia kanały potasowe (Kv11.1) i kanały wapniowe (Cav1.2) oraz receptory adenozyny A2A [6, 23]. Oba związki wykazują działanie rozkurczowe w naczyniach krwionośnych. NS309 wywoływał zależny od śródbłonka i szlaku EDH rozkurcz izolowanych tętnic płucnych człowieka i krezkowych szczura [48, 66]. Poprawiał też wyraźnie funkcję śródbłonka i reakcję zależną od EDH w małych izolowanych tętnicach krezkowych szczurów z cukrzycą typu 1 [5]. Powodował słabszą relaksację naczyń krezkowych szczurów z nadciśnieniem indukowanym octanem deoksykortykosteronu i zwiększoną podażą soli (model DOCA-salt) w porównaniu z normotensyjną kontrolą [42].

SKA-31 działa zarówno na kanały KCa3.1 jak i KCa2.3, przy czym wykazuje większą aktywność wobec KCa3.1, np. w tętnicach szyjnych myszy [36, 60]. Charakteryzuje się korzystnymi właściwościami farmakokinetycznymi, m.in. słabym wiązaniem z białkami oraz brakiem toksyczności wobec tkanek [60]. Jak dotąd wpływ SKA-31 na obniżenie ciśnienia tętniczego krwi w warunkach in vivo został wykazany u normotensyjnych myszy [56, 60], świń [52] i psów rasy beagle [18], a także u myszy z nadciśnieniem tętniczym indukowanym angiotensyną II [60] oraz wywołanym supresją genu kodującego KCa2.3 [4].

W badaniach in vitro w izolowanym bijącym sercu, podanie SKA-31 znacznie zwiększyło przepływ krwi w naczyniach wieńcowych [51]. SKA-31 powodował zależnie od wieku i płci relaksację izolowanej tętnicy krezkowej górnej myszy [46]. Ponadto w badaniach na izolowanych tętnicach krezkowych szczura wykazano, że zależne od EDH działanie relaksacyjne SKA-31 nie różniło się u zwierząt normotensyjnych WKY (Wistar Kyoto) i u zwierząt z pierwotnym nadciśnieniem tętniczym SHR (spontaneously hypertensive rat) [41, 62]. Badania te mogą wskazywać na poprawianie funkcji śródbłonka przez SKA-31.

Uzyskana odpowiedź hipotensyjna oraz korzystne działanie rozkurczowe naczyń krwionośnych pod wpływem SKA-31 może być w przyszłości wykorzystane w obniżaniu ciśnienia tętniczego. Wprawdzie spadek ciśnienia krwi u psów i świń był krótkotrwały, a to może skutecznie ograniczyć użyteczność SKA-31 w długoterminowym leczeniu chorych z nadciśnieniem. Istnieje jednak grupa pacjentów mogących odnieść potencjalną korzyść w stosowaniu krótko działających agonistów, m.in. z nadciśnieniem tętniczym opornym na konwencjonalne leczenie; nadciśnieniem tętniczym pojawiającym się podczas zabiegów chirurgicznych; u pacjentów ze skurczem naczyń niewrażliwych na donory NO bądź z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc, gdy stosowanie np. antagonistów receptorów β-adrenergicznych jest przeciwwskazane [45]. W tabeli 2 zestawiono substancje oddziaływające na kanały KCa3.1 i KCa2.3 z uwzględnieniem ich selektywności.

Blokery/inhibitory

Pierwszymi stosowanymi w badaniach blokerami kanałów KCa były toksyny pochodzenia naturalnego: charybdotoksyna i apamina (tabela 2). Charybdotoksyna jest związkiem wyizolowanym z jadu skorpiona, który blokuje kanały KCa3.1 [33]. Niestety nie jest idealnym inhibitorem, ponieważ wpływa również na kanały KCa1.1 oraz Kv1.3 [74]. Zastosowanie pochodnych klotrimazolu: TRAM-34 i ICA-17043 (syn. senicapoc) o znacznie większej selektywności wobec KCa3.1, skutecznie zastąpiło stosowaną w badaniach charybdotoksynę [75]. Najnowszym poznanym związkiem o podobnych właściwościach jest NS6180 [68].

Apamina, będąca toksyną pszczelą, wykazuje aktywność wobec kanałów potasowych KCa2.3 [40]. W przeciwieństwie do charybdotoksyny nie blokuje bezpośrednio kanału, a jej działanie jest związane z mechanizmem allosterycznym [57]. Związkiem hamującym aktywność kanału KCa2.3 jest również syntetyczny UCL1684 [10].

Znaczenie odpowiedzi zależnej od EDH w nadciśnieniu tętniczym

Nadciśnienie tętnicze jest chorobą układu sercowo-naczyniowego, w której dochodzi do zmian strukturalnych i funkcjonalnych prowadzących, m.in. do dysfunkcji endotelium, upośledzenia rozkurczu i nadmiernego skurczu naczyń krwionośnych. Zaburzenie funkcji śródbłonka zwykle przebiega z obniżeniem syntezy lub zmniejszeniem aktywności NO [17]. Zachodzące zmiany mogą również dotyczyć samej reakcji EDH, powiązanej przede wszystkim z kanałami potasowymi KCa2.3 i KCa3.1, która może się zmniejszać, pozostawać na stałym poziomie lub ulegać wzmocnieniu (tabela 3) [7].

Zmniejszenie syntezy NO przez śródbłonek w nadciśnieniu tętniczym upośledza utrzymanie odpowiedniego napięcia naczyń. Gdy jego ilość maleje, udział EDH w rozkurczu naczyń o małej średnicy, takich jak tętnice wieńcowe, nerkowe zaczyna pełnić główną rolę kompensacyjną [9, 23]. Potwierdzono to w tętnicach perfundowanych nerek szczurów z SHR, przy blokadzie NO oraz u myszy transgenicznych z ludzkim genem angiotensynogenu i reniny, u których wykazano lepszy rozkurcz zależny od EDH w porównaniu z relaksacją naczyń u zwierząt normotensyjnych [64, 72]. Całkowita kompensacja niedoboru NO, reakcją zależną od EDH u szczurów z nadciśnieniem tętniczym, wynika prawdopodobnie ze zwiększonej ekspresji kanałów potasowych KCa3.1 oraz ich większego udziału w reakcji rozkurczowej badanych naczyń [64].

W badaniach funkcjonalnych znacznie częściej wykazywano zahamowanie odpowiedzi EDH. W izolowanych tętnicach krezkowych (drugie odgałęzienie od tętnicy krezkowej górnej), pochodzących od szczurów z nadciśnieniem pierwotnym podatnych na udar (SHR-SP; stroke-prone spontaneously hypertensive rat) stwierdzono słabsze działanie relaksacyjne acetylocholiny niż w naczyniach wyizolowanych od szczurów normotensyjnych. Ponadto u szczurów SHR-SP wykazano większą ekspresję kanałów KCa3.1 oraz mniejszą ekspresję KCa2.3 niż u szczurów normotensyjnych. Obserwowana regulacja w górę (up-regulation) KCa3.1, nie mogła jednak skorygować upośledzonej relaksacji związanej ze zmniejszoną reakcją EDH u szczurów SHR-SP, a więc przeciwdziałać występującemu nadciśnieniu [32]. W badaniach przeprowadzonych na izolowanej górnej tętnicy krezkowej szczurów SHR, wykazano, że osłabiona aktywność kanałów KCa3.1 jest zaangażowana w początkowej fazie upośledzenia relaksacji zależnej od EDH [46]. Zmniejszenie reakcji EDH, zaobserwowano również w doświadczeniach przeprowadzonych na izolowanych tętnicach krezkowych szczurów SHR. Główna przyczyna osłabienia odpowiedzi rozkurczowej naczyń na acetylocholinę wynikała ze zmniejszenia ekspresji kanałów KCa2.3. Nie zaobserwowano natomiast zmian między grupą badaną, a kontrolną w relaksacji naczyń po zastosowaniu TRAM-34 blokera kanałów KCa3.1 [73]. Podobnie spadek ekspresji kanału KCa2.3 udowodniono u szczurów po nefrektomii [43] oraz u myszy z nadciśnieniem tętniczym wywołanym mutacją w genie kanału KCa2.3 [70].

Znane są przypadki, iż mimo spadku ekspresji KCa i uszkodzonego śródbłonka pod wpływem nadciśnienia tętniczego reakcja EDH pozostawała na niezmienionym poziomie u szczurów z nadciśnieniem tętniczym indukowanym angiotensyną II [38] oraz w modelu DOCA-salt [42].

Reakcja EDH zapoczątkowana w śródbłonku przez aktywację kanałów KCa2.3 i KCa3.1, przenosi się na miocyty i obecne tam białka błonowe, czyli KIR i Na+/K+-ATP-azę. Hiperpolaryzacja miocytów przez pobudzenie wymienionych białek prowadzi do rozkurczu naczyń mikrokrążenia. Sygnał z KCa2.3 przenoszony jest na KIR, a z KCa3.1 głównie na Na+/K+-ATP-azę (tzw. down stream, ryc. 2) [21]. W badaniach prowadzonych w naczyniach krezkowych szczurów SHR wykazano zmniejszenie aktywności hiperpolaryzacyjnej oraz ekspresji kanałów KCa2.3-KIR, natomiast nie zaobserwowano tych zmian w KCa3.1 – Na+/K+-ATP-azie. Ten zaburzony szlak może spowodować zwiększenie napięcia naczyniowego in vivo i może być jedną z przyczyn wzrostu ciśnienia tętniczego krwi charakterystycznego dla szczurów SHR [73].

Dotychczas nie wyjaśniono jednoznacznie przyczyn rozbieżności między wynikami prac, w których badano relaksację naczyń zależną od EDH. Nie można wykluczyć wpływu wykonywania badań na różnych gatunkach zwierząt i różnych modelach zwierzęcych nadciśnienia (pierwotne i wtórne nadciśnienie tętnicze) oraz różnic wieku i płci badanych zwierząt. Różnice budowy i właściwości funkcjonalnych badanych naczyń i ich odgałęzień również mogły się przyczynić do otrzymywania przeciwstawnych wyników [12, 23]. Przyczynę tego zjawiska upatruje się w rozmieszczeniu kanałów i ich liczbie KCa2.3 i KCa3.1 w obrębie ściany naczyń. Przykładem może być doświadczenie przeprowadzone na pierwszych i czwartych odgałęzieniach tętnicy krezkowej szczurów Sprague-Dawley w obecności L-NAME i indometacyny. W pierwszym odgałęzieniu tętnicy krezkowej zarówno apamina, jak i TRAM-34, stosowane oddzielnie nie znosiły całkowicie odpowiedzi indukowanej przez acetylocholinę, co świadczy o jednoczesnej aktywacji kanałów KCa2.3 i KCa3.1. Natomiast w czwartorzędowym odgałęzieniu tętnicy krezkowej po zastosowaniu apaminy uzyskano pełną blokadę relaksacji, co sugerowało główną rolę kanałów KCa2.3 [37]. Zmiany ekspresji poszczególnych białek zaangażowanych w reakcję EDH w modelach nadciśnienia tętniczego przedstawiono w tabeli 3.

Model nadciśnienia tętniczego		Naczynie	Ekspresja				EDH	Piśmiennictwo
			KCa3.1	KCa2.3	KIR2.1	Na+/K+ -ATP-aza
Pierwotne	SHR-SP	Drugie odgałęzienie tętnicy krezkowej	↑	↓	b.d.	b.d.	↓	[32]
	SHR+L-NAME	Perfundowane tętnice nerkowe	↑*	→*	b.d.	b.d.	↑	[64]
	SHR	Drugie i trzecie odgałęzienia tętnicy krezkowej	b.d.	↓	↓	b.d	↓	[73]
	SHR	Tętnica nerkowa	b.d	b.d.	b.d.	→*	↓	[9]
	SHR	Górna tętnica krezkowa	b.d.	b.d.	b.d.	b.d.	↓	[46]
Wtórne	Nadciśnienieindukowane Ang II	Czwarte odgałęzienie tętnicy krezkowej	↓	↓	b.d.	b.d.	→	[38]
	Nefrektomia	Tętnica szyjna	↓	↓	b.d.	b.d.	↓	[43]
	DOCA-salt(model wysokosodowy)	Trzecie odgałęzienie tętnicy krezkowej	↓	b.d.	b.d.	b.d.	→	[42]

Tabela 3. Porównanie zmian ekspresji wybranych kanałów jonowych i białek w ścianie naczyń krwionośnych oraz siły działania hiperpolaryzacji zależnej od śródbłonka (EDH) u szczurów hipertensyjnych w porównaniu do odpowiednich normotensyjnych kontroli

↓ – zmniejszenie ekspresji/reakcji; ↑ – zwiększenie ekspresji/reakcji; → – ekspresja/reakcja bez zmian; b.d. – brak danych, *- w badaniu do oceny zmian ekspresji wykorzystano metodę RT-PCR w pozostałych użyto metody Western- -blot; SHR-SP- szczury z nadciśnieniem spontanicznym podatne na udar mózgu; SHR – szczury z nadciśnieniem spontanicznym; L-NAME – inhibitor syntazy tlenku azotu; Ang II – angiotensyna II; KCa2.3 – kanały potasowe aktywowane przez jony wapnia o małej przewodności; KCa3.1 – kanały potasowe aktywowane przez jony wapnia o średniej przewodności; KIR – wewnątrzprostownicze kanały potasowe; Na+/K+-ATP-aza – pompa sodowo-potasowa

Podsumowanie

EDH pełni rolę kompensacyjną, jednak siła jego działania zależy od łożyska naczyniowego, modelu patologicznego i warunków eksperymentu. Obecnie trwają badania nad wykorzystaniem aktywatorów i blokerów/inhibitorów kanałów potasowych KCa2.3 oraz KCa3.1 jako prawdopodobny punkt uchwytu działania leków w terapii chorób układu krążenia [55]. Aktywatory tych kanałów obiecująco poprawiają odpowiedź zależną od EDH i polepszają funkcję śródbłonka w chorobach sercowo-naczyniowych, w tym nadciśnienia tętniczego. Potencjalne terapeutyczne wykorzystanie w układzie krążenia związków oddziaływających na KCa2.3 i KCa3.1 przedstawiono na ryc. 6.

Ryc. 6. Potencjalne wykorzystanie i działanie substancji farmakologicznie czynnych wpływających na kanały potasowe aktywowane przez jony wapnia o małej (KCa2.3) i średniej (KCa3.1) przewodności w układzie krążenia

Pełna treść artykułu