Abstrakt

W przebiegu cukrzycy typu 2 (diabetes mellitus type 2 DM2, non-insulin dependent diabetes mellitus, NIDDM) oraz w rozwoju guza insulinowego trzustki obserwuje się w obrębie wysp Langerhansa trzustki patologiczne depozyty, zwane amyloidem. W skład amyloidu wchodzi m.in. wytwarzany przez komórki beta polipeptyd, pełniący funkcję neurohormonu, zwany amyliną. Nieprawidłowo zwinięta, patologiczna bo fibrylująca cząsteczka amyliny, w postaci nierozpuszczalnych fibryli, powoduje dysfunkcję, niszczenie komórek wysp, ich utratę, destrukcję narządu i postęp choroby. Jest to polipeptyd wyjątkowo trudno rozpuszczalny, błyskawicznie fibrylujący, dlatego trudny do badania i wymagający szczególnej metody. Mechanizm i czynniki sprzyjające konwersji natywnej postaci amyliny do nierozpuszczalnych fibryli pozostają niewyjaśnione. W pracy przedstawiono fibrylację amyliny w kontekście stosowanej metody badań różnych postaci polipeptydu na kolejnych etapach procesu fibrylacji, a także problem cytotoksyczności formowanych struktur.

Wstęp

Złogi amyloidu, odnajdywane w obrębie wysp Langerhansa trzustki u chorych na cukrzycę zwierząt i człowieka oraz u osób chorych na endokrynny nowotwór wywodzący się z komórek beta trzustki (guz insulinowy trzustki), zawierają neurohormon, wytwarzany głównie przez komórki beta wysp trzustki, zwany amyliną. Wydaje się, że konwersja natywnej postaci amyliny do nierozpuszczalnych fibryli, w dużej mierze odpowiada za rozwój i postęp choroby. W świetle licznych badań okazało się, że najbardziej szkodliwą postacią amyliny dla komórek trzustki nie są dojrzałe, uformowane i deponowane pozakomórkowo fibryle, ale asocjaty kilku, kilkudziesięciu monomerów cząsteczek amyliny, pojawiające się na pierwszych etapach procesu fibrylacji, zwane – ze względu na swoją strukturę – helikalnymi intermediatami. Strukturalnie są postacią pośrednią między monomerami amyliny a fibrylami.

Intrygującym fenomenem przyrody jest to, że ten sam polipeptyd zachowuje się różnie u różnych organizmów, tj. formuje fibryle amyloidowe bądź nie wykazuje tej właściwości. Mimo poznania składu 37-aminokwasowego polipeptydu u różnych gatunków, problem mechanizmów i czynników wpływających i determinujących różnorodność form tworzonych depozytów amyliny, zwłaszcza w postaci fibryli, nadal oczekuje na rozwiązanie. Jest wiele przyczyn, które powodują, że amylina jest polipeptydem trudnym do badań, gdyż jest polipeptydem wyjątkowo trudno rozpuszczalnym i błyskawicznie fibrylującym w roztworze. Dlatego też, od czasu jej odkrycia, liczne prace eksperymentalne prowadzi się na amylinie syntetycznej lub jej syntetycznych fragmentach. Próbuje się znaleźć odpowiedź na pytania o polimorfizm obserwowanych postaci amyliny, na pytania dotyczące struktury polipeptydu na różnych etapach fibrylacji i związku formowanych agregatów z ich toksycznością. W pracy podjęto próbę zaprezentowania amyliny w aspekcie bogactwa jej form strukturalnych, jako cząsteczki o wielu obliczach.

Amylina jako cząsteczka agregująca

Agregacja, rozumiana jako proces łączenia się cząsteczek monomerycznych w większe skupiska, może przebiegać w sposób nieswoisty, tj. prowadzący do formowania agregatów nierozpuszczalnych, o strukturze wewnętrznie nieuporządkowanej, określanych mianem agregatów amorficznych. Może też przebiegać w sposób nadający łączącym się monomerom porządek strukturalny. Akt łączenia się monomerów może też prowadzić do tworzenia większych, ale rozpuszczalnych form oligomerycznych. Ostateczna forma utworzonego depozytu zależy od natury agregującej cząsteczki oraz od wielu czynników, składających się na środowisko zewnętrzne – czy to środowisko komórkowe, czy eksperymentalne in vitro. W przypadku form uporządkowanych, porządek strukturalny, często uwarunkowany termodynamicznie, znajduje swój wyraz w powstawaniu tworów, wyróżnianych makroskopowo, o wysoce zorganizowanej strukturze, coraz to wyższych rzędów. Przykładem takich uporządkowanych struktur mogą być fibryle, formowane przez białka lub polipeptydy o potencjale amyloidotwórczym [16,64,65].

Fibryle białkowe są odnajdywane w różnych miejscach organizmu zwierząt i człowieka, w różnych stanach patologicznych i w przebiegu licznych chorób, w tym w przebiegu procesów degeneracyjnych. Mogą też być sporadycznie identyfikowane jako depozyty, których obecności nie daje się powiązać z jawnie toczącym się procesem chorobowym, czyli u osobników potencjalnie zdrowych, ale np. starzejących się. W przypadku licznej grupy białek amyloidotwórczych, proces naśladujący formowanie fibryli białkowych w organizmie można generować i obserwować także w warunkach in vitro [16,68]. Obecnie przyjmuje się, że nawet białka, którym nie przypisywano cechy zdolności do formowania fibryli in vivo, można wprowadzić na szlak fibrylacji, narzucając stosowne warunki eksperymentalne. Przedmiotem zainteresowania są zwłaszcza te białka i peptydy, którym przypisuje się znaczenie bądź współudział w patogenezie chorób, w których przebiegu obserwuje się formowanie zewnątrzkomórkowych nierozpuszczalnych depozytów o strukturze wysoce uporządkowanej, tj. właśnie fibryli. Stanowią podstawowy składnik odkładanej w organizmie substancji, zwanej amyloidem. Wydaje się, że u podłoża tej grupy różnorodnych chorób leżą zmiany konformacyjne, specyficznego dla danej choroby peptydu, białka czy jego fragmentu, prowadzące do tworzenia uporządkowanych strukturalnie, nierozpuszczalnych w wodnym środowisku komórki, agregatów o pokroju włókienek, które, ze względu na skrętny charakter i złożoną budowę, nazwano fibrylami. Choć liczną grupę białek, różnorodnych pod względem budowy i natury chemicznej, objęto wspólną nazwą: białka amyloidogenne, to jednak nie wyróżniono łączącego je strukturalnego, uwarunkowanego składem aminokwasowym, wspólnego mianownika. Okazuje się, że fibrylują peptydy albo białka o różnorodnej budowie, tj. takie, jakie mają nadaną strukturę drugo- czy trzeciorzędową, np. białka globularne o strukturze sztywnej, a także białka, jakie takiej struktury nie ujawniają i dlatego nazwane zostały białkami niezestrukturalizowanymi lub natywnie niepofałdowanymi. Za takie uważa się cząsteczki, które w stanie oczyszczonym, w pH obojętnym nie mają przypisanej struktury drugorzędowej. Białka fibrylujące, strukturalnie uporządkowane mogą prezentować postać α–helisy (α–helix), β–helisy (β–helix), czy płaszczyzny beta (β-sheet), zwanej także strukturą harmonijkową czy pofałdowanej kartki. Mogą też stanowić postać mieszaną struktur alfa i beta [17,39]. W pracy, dla wszystkich struktur białkowych, w wielu miejscach pozostawiono terminologię anglojęzyczną, celowo nie wprowadzając dłuższych i opisowych nazw polskich.

W przypadku białek strukturalnie zdefiniowanych, o przypisanej strukturze drugorzędowej, pierwszym i niezbędnym „wydarzeniem” na szlaku procesu fibrylacji jest etap przynajmniej częściowego pozbawienia cząsteczki jej natywnej konformacji i nadanie jej cech cząsteczki niepofałdowanej (non-native partially unfolded). Proces fibrylacji różnych strukturalnie białek komplikuje to, że białka globularne mają w swej strukturze trzykrotnie więcej miejsc niż niepofałdowane, umożliwiających i ułatwiających zajście pierwszych etapów fibrylacji. Paradoksalnie, dla licznej grupy białek czy peptydów, pozbawionych w ich natywnej postaci struktury drugorzędowej, pierwszym aktem albo wydarzeniem na szlaku ich fibrylacji jest przynajmniej częściowa stabilizacja, nadanej przez warunki otoczenia struktury drugiego rzędu. Jest to warunek wstępny, ale niezbędny dla niepofałdowanej cząsteczki aby rozpocząć proces formowania fibryli [4].

Wyzwaniem eksperymentalnym jest zarówno analiza formowanych agregatów amyliny, jak i analiza następnych postaci fibrylujacego polipeptydu. Musi on zostać wprowadzony na szlak zmian konformacyjnych, strukturalnych i morfologicznych. Zwieńczeniem takich badań jest nie tylko określenie struktury fibrylotwórczego polipeptydu, ale także próba znalezienia odpowiedzi na pytanie: która z wyróżnionych postaci agregującej cząsteczki odpowiada za jej cytotoksyczność, niszczenie komórek trzustki, rozwój i postęp cukrzycy typu 2?

Czynniki środowiskowe agregacji a różnorodność depozytów amyliny. Agregaty amorficzne a fibryle

Czynniki środowiskowe odgrywają istotną rolę w procesie szeroko rozumianej agregacji. Jest nią zarówno agregacja nieswoista, która prowadzi do agregatów amorficznych, jak i agregacja wysoce swoista, prowadząca do struktur wysoce uporządkowanych, jakimi są fibryle. Można to zaobserwować i badać na przykładzie właśnie amyliny. W zależności od warunków przyjętego układu eksperymentalnego, tj. pH, stężenia i rodzaju rozpuszczalnika, składu jonowego roztworu, obserwuje się różne postaci depozytów amyliny. Jednak wielość i różnorodność zmiennych czynników eksperymentalnych sprawia, że w obrębie postaci uporządkowanych, jakimi są fibryle, także obserwuje się niezwykłą ich różnorodność. Dlatego też tworzone w warunkach eksperymentalnych fibryle amyliny cechuje niezwykłe bogactwo rozmiarów, form i kształtów. Zastosowane warunki wywierają swego rodzaju piętno na tworzących się depozytach, co wyraża się polimorfizmem obserwowanych fibryli [19,20,21].

Ze względu na obecność w cząsteczce amyliny 10 aminokwasów hydrofobowych niemożliwe jest jej rozpuszczenie w roztworze wodnym, a w roztworach o wysokim stężeniu polipeptydu np. 20 mg/ml, jego spontaniczna fibrylacja jest natychmiastowa [1,2,41]. Dlatego też do badań amyliny są stosowane roztwory fluorowanych alkoholi: trójfluoroetanolu (2,2,2-trifluoroethanol, TFE) i heksafluoroizopropanolu (1,1,1,3,3,3-hexafluoroizopropanol, HFIP), jako rozpuszczalniki wspomagające [75]. TFE działa jako rozpuszczalnik, wykorzystywany do badań struktury białek, gdyż ma wysoce elektroujemną grupę trójfluorometanową. Natomiast HFIP, mając dodatkowe atomy fluoru, staje się 34 razy bardziej kwaśny niż TFE i dlatego wykazuje wyjątkową zdolność do formowania wiązań wodorowych. HFIP, wchodząc w interakcje z ugrupowaniami, takimi jak: tlen, podwójne wiązania czy grupy aminowe, i formując wiązania wodorowe, wykazuje silne działanie rozpuszczające [61]. Alkohole stosuje się do badania agregacji białek czy peptydów w celu osłabienia wiązań hydrofobowych i wywołania w ten sposób zaburzenia ich struktury. Wpływ rozpuszczalnika na białka wiąże się z polarnością stosowanych alkoholi. Roztwory wodne alkoholi cechuje obniżona, w porównaniu z wodą, polarność i w zależności od stałej dielektrycznej, wprowadzają zaburzenia w strukturze białka czy w peptydzie natywnym. Zwłaszcza fluoroalkohole, ze względu na niższą stałą dielektryczną (TFE – 27,7 i HFIP – 20,8) od stałej dielektrycznej wody (78,3) charakteryzuje duża skuteczność takiego działania. Fluoroalkohole znacząco obniżają polarność środowiska rozpuszczalnika, sprzyjają oddziaływaniom wewnątrzcząsteczkowym, a tym samym formowaniu struktur helikalnych. Ponadto stabilizują drugorzędową strukturę białka, zwłaszcza umożliwiają zaistnienie struktur α-helikalnych, które w innym środowisku może skrywać natywna postać peptydu czy białka.

Obraz protofilamentów formowanych w środowisku bez alkoholi i w obecności HFIP bądź w środowisku z TFE jest znacząco odmienny. Różnice dotyczą stabilności, struktury i morfologii tworzonych fibryli, a tym samym odpowiadają za ich polimorfizm [5,18,50,63]. Na ogół przyjmuje się, że HFIP jest najbardziej efektywnym rozpuszczalnikiem i wpływa na agregację białka zależnie od stosowanego do badań stężenia. Wykazano jednak, że w zależności od stężenia stosowanego do badań alkoholu i od pH, obserwuje się różny wpływ na cząsteczki, czego wyrazem są obserwowane skutki w postaci odmiennych depozytów. Formowane fibryle i amorficzne agregaty są całkowicie odmiennymi tworami zarówno co do formy, jak i mechanizmów i oddziaływań odpowiedzialnych za ich powstawanie. Fibryle stanowią układ niezwykle skomplikowany i w wysokim stopniu uporządkowany. Cechuje je periodyczność budowy, a w związku z tym pewne charakterystyczne wspólne cechy fizyko-chemiczne, a także – do pewnego stopnia – wspólne cechy morfologiczne. Z kolei depozyty o charakterze amorficznym są układem stałym, ale pozbawionym jakiegokolwiek uporządkowania swej struktury wewnętrznej, a więc układem o odmiennych cechach fizyko-chemicznych. Oddziaływania międzycząsteczkowe są w nim na tyle silne, aby układ fizycznie zaistniał, ale nie są wystarczające do narzucenia mu wewnętrznego porządku. W konsekwencji układ staje się mniej stabilny gdyż jest postacią wysokoenergetyczną [1,63,64,65,75].

W procesie fibrylacji istotny jest wpływ pH na warunki, w jakich bada się fragmenty lub pełnoaminokwasową wersję amyliny. Środowisko obojętne sprawia, że interakcje hydrofobowe dominują nad interakcjami elektrostatycznymi i o charakterze polarnym, a to nie pozwala na wytworzenie wiązań wodorowych i amylina w tych warunkach występuje w postaci agregatów amorficznych. Dopiero odpowiednio wysokie stężenie HFIP (25%) promuje formowanie fibryli i w roztworze obserwowane są formy α-helikalne i struktury beta. Jednak paradoksalnie, wzrost stężenia alkoholu do 40% sprawia, że w roztworze istnieje wyłącznie postać α-helikalna. Natomiast w środowisku kwaśnym, wszystkie aminokwasy występujące w postaci naładowanej, nadają cząsteczce większy ładunek niż ich ładunek w pH obojętnym. W ten sposób wzmagają zdolność amyliny do tworzenia fibryli. W tym układzie jedynie niewielki, bo 5% dodatek HFIP, maksymalnie zwiększa fibrylację. Wydaje się, że połączenie oddziaływań hydrofobowych i elektrostatycznych narzuca ostateczną postać powstającego depozytu, którym może być kryształ, fibryla, czy agregat amorficzny [75].

Przyjmuje się, że niższe pH sprzyja szybszemu formowaniu fibryli w porównaniu do zasadowego pH, choć np. polipeptyd szczura, niezależnie od warunków pH, nigdy nie fibryluje. Pełnoaminokwasowy polipeptyd ludzki fibryluje najefektywniej w pH neutralnym i zasadowym, ale fragment rdzeniowy tej cząsteczki (20-29) w pH kwaśnym. Również w zależności od pH obraz morfologiczny powstających produktów fibrylacji, zarówno całego polipeptydu, jak i jego fragmentów jest zdecydowanie różny, a niewielka zmiana pH może prowadzić także do precypitacji badanych fragmentów. Wpływ pH zależy także od innych czynników istotnych w eksperymencie [6,9,52,53]. Złożony proces agregacji amyliny i formowanie różnych, w zależności od warunków środowiskowych, oligomerycznych form polipeptydu zmuszał do postawienie kolejnych pytań. Który z obserwowanych procesów łączenia monomerów amyliny i jaka powstająca jej postać odpowiada za procesy patologiczne, obserwowane u chorych zwierząt i ludzi oraz jaki jest mechanizm cytotoksyczności amyliny?

Poszukiwania cytotoksycznej postaci amyliny

W przebiegu cukrzycy typu 2, obserwowaną degenerację komórek beta wysp trzustki, utratę ich liczby i w konsekwencji postępujące zaburzenia w funkcjonowaniu narządu wiązano z pojawianiem się i wypełnianiem utraconej masy trzustki przez złogi zewnątrzkomórkowego amyloidowego depozytu. Obfite złogi amyloidu odnajdywano również w pobliżu nieuszkodzonych komórek trzustki chorych na cukrzycę, a także w otoczeniu komórek guza typu insulinoma [8,11,54]. Czasami u osób, u których nie stwierdzano cukrzycy, obecność amyloidu wiązano jednak z obserwowanym obniżeniem liczby komórek beta trzustki [72]. Obecność amyloidu trzustkowego u starzejących się osób zdrowych w ogóle podważała koncepcję szkodliwości fibrylarnego depozytu czyniąc związek przyczynowo-skutkowy rozwoju choroby jeszcze mniej zrozumiałym. Badania komórek transfekowanych genem fibrylującej amyliny ludzkiej bądź niefibrylującej amyliny szczura dowodziły jednak, że formowany amyloid ma związek ze śmiercią komórek trzustki i zniszczeniem narządu. Ustalono, że podniesione stężenie jedynie polipeptydu ludzkiego, a nie szczura, prowadziło do pojawienia się, a następnie do gromadzenia amyloidu wewnątrz komórek i ostatecznie do ich śmierci [55]. Okazało się także, że amyloid odnajdywano u osób chorych na cukrzyce typu 1, którym przeszczepiono komórki wysp trzustki pobrane od osób zdrowych. Komórki przygotowywane do transplantacji, wyizolowane z naturalnego środowiska, mogą być jednak zagrożone procesem formowania toksycznych fibryli amyliny. Wydaje się, że to właśnie proces fibrylacji amyliny, a nie reakcje immunologiczne, są przyczyną niepowodzeń stosowanej terapii [70,71].

Poczynione obserwacje o umiejscowianiu się złogów amyloidu w pobliżu miejsc destrukcji komórek trzustki, a następnie ubytku masy narządu, pozwalały jedynie na wysunięcie przypuszczenia o zachodzeniu związku przyczynowo-skutkowego obserwowanych zjawisk. Badania rozpoczęte w układach in vitro przyniosły nowe fakty i nową wiedzę, a tym samym i nowe pytania, gdyż coraz wyraźniej wskazywały na brak korelacji między toksycznością a stosowanymi do badań dojrzałymi fibrylami amyliny [7,28]. Co więcej, zahamowanie procesu formowania fibryli amyloidowych przedłużało żywotność komórek beta [42,49]. Następnym krokiem było wyeliminowanie z procedur eksperymentalnych wstępnego etapu formowania fibryli, który jest niemożliwy do wprowadzenia w badaniach in vivo, gdy amylina jest wytwarzana w przeszczepionych komórkach beta. Stało się to wykonalne w układzie in vitro, który pozwala na dobór zastosowanej postaci amyliny, tj. dojrzałych fibryli. Okazało się, że w miarę wzrostu fibryli ponad hipotetycznie założony wymiar krytyczny, dojrzałe, uformowane fibryle przestają być toksyczne wobec komórek beta trzustki.

Przełom stanowiła obserwacja, że u transgenicznych myszy z ekspresją ludzkiego genu amyliny, destrukcja komórek trzustki i rozwój choroby następuje zanim pojawiają się fibryle amyliny. Obecność małych, amorficznych agregatów, trudnych do rozpoznania i zbadania, związanych z wakuolami, pęcherzykami komórkowymi i cytoplazmą degradowanych i uszkodzonych komórek beta, dała podstawy do powiązania rozmiarów tworzonych fibryli z ich szkodliwością. Rysowała się koncepcja odwrotnej korelacji między wielkością postaci amyliny a ich cytotoksycznością: im mniejsza jednostka na szlaku fibrylacji, tym większa toksyczność [29]. W następnej pracy przedstawiono wyniki badań wpływu na przeżywalność komórek beta, świeżo przygotowanego preparatu amyliny ludzkiej i preparatu dojrzałych, uformowanych fibryli. Tylko preparat świeżo przygotowany, zawierający polimery nie większe niż 6 tysięcy cząsteczek amyliny, był wysoce toksyczny dla komórek beta i powodował destabilizację ich membrany. Preparat znacząco większych fibryli amyliny ludzkiej, bo zawierających 106 cząsteczek, a także preparat amyliny szczura nie prowadziły do uszkodzenia błon i do śmierci komórek. Badania te pozwoliły na wysunięcie koncepcji cytotoksyczności wczesnych, prefibrylarnych form amyliny ludzkiej, określonych w cytowanej pracy jako formy o rozmiarach pośrednich między formą monomeryczną amyliny a fibrylarną (inetmediate-sized-toxic amyloid partcles). Mechanizm ich działania wiązano z oddziaływaniem z błoną komórkową [28].

Istotny dla toksyczności amyliny okazał się więc wstępny etap formowania fibryli, któremu należało przypisać odpowiednią postać fizyko-chemiczną, w jakiej polipeptyd działał zabójczo. Wysunięto hipotezę, że amylina ludzka jest zabójcza dla komórek jeszcze w postaci rozpuszczonej, ale już strukturalnie zmienionej. Wyniki badań innych fibrylujących białek wzbogaciły tę koncepcję o niezbędny dla cytotoksyczności element strukturalny szkodliwego amyloidu, jakim było formowanie struktur typu alfa helisy, a następnie płaszczyzn beta [66].

Oddziaływania amyliny z błoną komórkową – badania modelowe

Zaobserwowane gromadzenie fibryli amyliny w otoczeniu błon komórkowych, a także badania oddziaływania mniejszych jej agregatów z błoną niszczonych komórek dały podstawy do rozważania membranowego mechanizmu szkodliwego wpływu fibryli na komórkę. Zasugerowano, że membrany mogą być katalizatorami procesu agregacji amyliny. Do badania interakcji amyliny z błoną komórkową wykorzystano układy modelowe z zastosowaniem dwuwarstw lipidowych, micelli, liposomów czy pęcherzyków komórkowych. Okazało się, że negatywnie naładowane lipidy są bardzo efektywne w akcelerowaniu procesu fibrylacji amyliny. Fosfolipidy stabilizują oddziaływania polarne i elektrostatyczne częścią hydrofilowej głowy swej cząsteczki, natomiast hydrofobowe częścią transmembranową. Przypominają pod tym względem charakter oddziaływań amyliny i fluoroalkoholi, których reszty hydrofobowe i polarne mogą brać udział w różnego typu oddziaływaniach. Fluoroalkohole, ze względu na niszczenie struktury membran, nie mogą być jednak stosowane jako rozpuszczalniki amyliny do badań interakcji z błonami [34,35].

Zbadano formowanie fibryli przez amylinę ludzką w obecności liposomów zawierających fosfolipidy, wyizolowane z trzustki pacjentów chorych na cukrzycę typu 2. Proces formowania fibryli następował 10 razy szybciej w środowisku zawierającym fosfolipidy, niż przy ich braku, a wiązanie amyliny do powierzchni błon było natychmiastowe i całkowite już na wstępnym etapie procesu fibrylacji [35]. Także fosfatydyloseryna, obecna w pęcherzykach błonowych, akcelerowała natychmiastowy proces fibrylacji amyliny ludzkiej [30]. W kolejnych badaniach stwierdzono, że dodanie amyliny ludzkiej do preparatu błon fosfolipidowych skutkowało natychmiastowymi ich zmianami: zaburzeniem dwuwarstwy, formowaniem pęcherzyków lub tubuli z fragmentów błony. Istotne było to, że zmiany następowały zanim uwidoczniono skupiska czy agregaty niezestrukturalizowanego polipeptydu. Amylina działała destrukcyjnie na błony w postaci monomerycznej [13]. W miarę upływu czasu, pojawiające się agregaty amyliny umiejscowiały się na powierzchni błony i stanowiły miejsca wyłaniania się wielokierunkowo formowanych fibryli. Z amorficznego rdzenia, zakotwiczonego do powierzchni błony, niczym promienie, odchodziło 5-20 fibryli. Wykazano, że w ich strukturę wbudowywane były lipidy, a każdej formowanej fibryli towarzyszył przynajmniej jeden lipidowy pęcherzyk błonowy. Zaobserwowano także ciekawe zjawisko izolowania formowanych fibryli od otaczających błon przez owinięcie ich warstwą lipidu. Może to mieć niezwykle istotne znaczenie w warunkach in vivo, gdyż izolacja taka może wpływać stabilizująco na fibryle i mieć znaczenie ochronne, uniemożliwiając usuwanie fibryli z otoczenia komórki [13].

Analizę interakcji amyliny człowieka i szczura z dwuwarstwą lipidową, unieruchomioną na powierzchni miki, przeprowadzono techniką mikroskopii sił atomowych (Atomic Force Microscopy, AFM). Stwierdzono, że interakcja amyliny ludzkiej z powierzchnią błony prowadzi do powstawania w niej małych, bo o głębokości około 1,5-2 nm, ale licznych defektów, rozprzestrzenionych na badanej powierzchni. Nie przypominały one form większych, np. porów błonowych, formowanych przez białka membranowe. Interakcja pęcherzyków lipidowych z amyliną powodowała ich uszkodzenia, co wyrażało się wyciekiem z ich wnętrza barwnika – kalceiny. Jednak obserwowane defekty błon były na tyle małe, że niewykrywalne ani techniką mikroskopii elektronowej (Electron Microscopy, EM) ani z zastosowaniem elektronowego mikroskopu transmisyjnego i ujawniono je dopiero techniką AFM [23].

Następnie stwierdzono, że wprowadzenie do badań czerwieni Kongo, jako inhibitora fibrylacji, prawie całkowicie znosiło defekty błon, wywołane przez amylinę człowieka, a stopień uszkodzenia błony malał kilkakrotnie w porównaniu do wartości obserwowanych przy braku inhibitora. Skuteczne działanie inhibitora fibrylacji w minimalizowaniu uszkodzeń błony, powstających na wstępnym etapie formowania fibryli, sugerowało, że wówczas powstają toksyczne dla komórek postaci amyliny ludzkiej. W toku dalszych badań potwierdzono, że istnieje korelacja między stopniem uszkodzenia błony jednowarstwowych pęcherzyków a zachodzącym procesem formowania fibryli. Postępująca permeabilizacja błony wydaje się procesem nieswoistym, następującym na skutek jej defragmentacji [14,15]. W świetle uzyskanych wyników, rysował się model interakcji cząsteczki amyliny nie tylko z powierzchnią struktur modelowych, ale i z powierzchnią i składnikami błony komórki. Istotną rolę w tym procesie wydają się odgrywać formy amyliny, pojawiające się na wstępnych etapach fibrylacji, tzw. intermediaty helikalne.

Koncepcja intermediatów helikalnych amyliny

Przypuszcza się, że uszkodzenie błony komórkowej, spowodowane przez fibrylujacą amylinę, jest jednym z podstawowych mechanizmów prowadzących do niszczenia i śmierci komórki. Mechanizm nadal pozostaje nierozpoznany, choć rolę sprawcy zniszczeń przypisuje się właśnie intermediatom helikalnym, czyli małym formom pośrednim amyliny, formowanym na wstępnych etapach fibrylacji. Tworzenie ich poprzedza pojawianie się większych, dostrzegalnych, rozpoznawalnych dostępnymi technikami detekcji, dostatecznie dużych lub dojrzałych, ostatecznie uformowanych fibryli [31]. Funkcjonuje teoria, której podstawą jest hipoteza działania toksycznych oligomerów, jako sprawców uszkodzeń komórek beta. Pod terminem tym kryje się skupisko czy połączenie pewnej dostatecznie dużej, ale nie nadmiernie licznej grupy monomerów, w oligomeryczny twór, reprezentujący jedną z morfologicznych form etapu prefibrylarnego.

Wydaje się, że amylina in vivo, czyli w roztworze wodnym, jako wolny polipeptyd, pozostaje w postaci kłębka (random coil), co sugeruje niepofałdowany charakter cząsteczki. Także pełnoaminokwasowa amylina syntetyczna, odpowiadająca amylinie ludzkiej, w roztworze wodnym również nie przyjmuje struktury uporządkowanej, lecz pozostaje w postaci kłębka, co wskazuje na monomeryczność cząsteczek [26,58,60]. Obecnie przyjmuje się, że pierwszym etapem wprowadzającym białko na szlak fibrylacji jest nadawanie mu formy α-helikalnej. Czynniki indukujące zmiany konformacyjne polipeptydu czy zmiany w strukturze samego monomeru amyliny mogą być różne. Oprócz omówionej już wcześniej roli pH i rozpuszczalnika, może to być kontakt z powierzchnią membrany modelowej, liposomu, błony komórkowej czy oddziaływanie ze składnikami błony lub macierzy zewnątrzkomórkowej, np. siarczanem heparanu. Zmiana taka może też być następstwem interakcji dwóch cząsteczek amyliny. Oddziaływanie z powierzchnią membrany stabilizuje postać helisy i w ten sposób katalizuje tworzenie form β-sheet [30,73].

Na podstawie poczynionych obserwacji zaproponowano model wzrostu fibryli polegający na łączeniu form oligomerycznych, ale o pełnych wymiarach, zwłaszcza o pełnej szerokości. Model ten nie jest sprzeczny z mechanizmem bocznej asocjacji protofibryli, ale uzupełnia obraz tzw. podwójnej nukleacji w procesie fibrylacji. W myśl modelu podwójnej nukleacji, miejscem rozpoczynającym budowę fibryli są nie tylko jądra czy ziarna nukleacji, ale mogą nim być także fibryle, zwłaszcza po przekroczeniu krytycznego stężenia w roztworze [22,56].

Najpoważniejsze trudności metodyczne, z powodu braku odpowiednich narzędzi badawczych, przedstawia właśnie etap początkowy procesu fibrylacji amyliny. Wtedy to, w następstwie generowanych zmian konformacyjnych, następuje tworzenie najmniejszych struktur rozpoczynających cały proces, zwanych ziarnami czy jądrami nukleacji. W 1999 r. Kayed i wsp. opublikowali pracę, w której przedstawili analizowane różnymi metodami etapy formowania fibryli przez amylinę ludzką [31]. Zaproponowano model zmian konformacyjnych cząsteczki postępujący od postaci rozpuszczalnej amyliny, przez formy helikalne i beta, następnie przez stadia nierozpuszczalne, pierwsze etapy formowania najmniejszych form na szlaku fibrylacji, tzw. jąder nukleacji, w wyniku polimeryzacji monomerów polipeptydu i kolejno przez formowanie protofibryli i ostatecznie fibryli. Są liczne dowody wskazujące na istotną rolę w procesie niszczenia komórek beta stosunkowo małych oligomerów amyliny i/lub protofibryli [32,38,47].

Monitorowanie procesu fibrylacji amyliny

Postępujący proces fibrylacji można monitorować techniką fluorymetryczną z zastosowaniem związków amyloidofilnych, np. tioflawiny T (ThT). Jest to barwnik należący do grupy barwników benzotiazolowych (4-(3,6-dimethyl- 1,3-benzothiazol-3-ium-2-yl)-N,N-dimethylaniline chloride), który – w przeciwieństwie do tioflawiny S – nosi ładunek pozytywny. Tioflawina T wiązanie się do struktur fibrylarnych ujawnia przesunięciem batachromowym w widmach absorpcji i emisji. Barwnik wolny, w wodzie, cechuje maksimum absorpcji przy długości fali 410 nm i maksimum fluorescencji przy długości fali 430 nm dla światła wzbudzającego o długości 342 nm. Postać związana z fibrylami wykazuje maksimum absorpcji przy długości 450 nm, a parametry widma fluorescencyjnego ulegają znaczącej zmianie, gdyż maksimum obserwowane jest przy długości 485 nm, jako zielono-niebieskawa fluorescencja, do wzbudzenia światłem o długości 450 nm. Po inkorporacji do fibryli intensywność fluoryzującego barwnika wzrasta około 1000-krotnie [24,33,37,45].

Stosując tioflawinę T, postępujący proces formowania fibryli można monitorować dopiero od chwili utworzenia pierwszych struktur fibrylarnych – protofibryli. Nieuchwytne dla tej metody pozostają wstępne etapy procesu. Następujące po sobie fazy fibrylacji obrazuje wykres w kształcie litery S (sigmoidalny). Na wykresie (ryc.1) przedstawiającym inkorporację tioflawiny T do tworzących się fibryli, etap formowania toksycznych oligomerow, zwany fazą Lag, obrazuje płasko leżący, równoległy do osi X odcinek sigmoidalnej krzywej. Jego długość zależy od stężenia polipeptydu lub białka. To faza powstawania nierozróżnialnych czy niewyróżnialnych konwencjonalnymi technikami skupisk, których ewolucję morfologiczną, czyli ich wzrost, można monitorować, ale dopiero po przekroczeniu pewnej liczby krytycznej monomerów. Następnie część wznosząca się wykresu, obrazuje etap tworzenia fibryli i ich wydłużania, co objawia się inkorporacją barwnika do struktur fibryli. Odpowiedni rozmiar tworzonej fibryli warunkuje związanie barwnika i uwidocznienie jej wzrostu.

Ostatnia faza, przedstawiona drugim, płasko leżącym odcinkiem, równoległym do osi X, ale przesuniętym ku górze, obrazuje osiągnięcie przez układ stanu równowagi między monomerami istniejącymi w roztworze, a wbudowanymi w strukturę fibryli. Metoda z zastosowaniem tioflawiny T także narzuca pewne ograniczenia metodyczne. Nie może być stosowana w obecności związków hamujących inkorporacje barwnika do fibryli, maskując w ten sposób to, że są formowane [48].

Cytotoksyczność amyliny

Syntetyczna amylina ludzka w pełnej, tj. 37-aminokwasowej wersji jest toksyczna dla komórek beta trzustki już w stężeniu 1-10 μM. Cytotoksyczne są także fibrylujące kilkunastoaminokwasowe peptydowe fragmenty amyliny oraz najkrótsze penta (23-27) i heksa (22-27) peptydy. Skrócone fragmenty, w wersji fibrylarnej są około 1000 razy mniej toksyczne niż pełen polipeptyd [40,44,51,62]. Mimo że kolejne prace przynosiły nowe dane na temat charakteru interakcji z błoną komórkową zarówno pełnej wersji amyliny, jak i jej fragmentów, nadal aktualne jest pytanie o mechanizm ich działania. Wyniki w dużej mierze zależały od dobranego środowiska badań i zastosowanej techniki.

W obrębie 37-aminokwasowej cząsteczki, po interakcji z błoną, w początkowo niezestrukturalizowanym polipeptydzie, ujawniono obecność pojawiających się, struktur α-helikalnych o różnym zasięgu i różnym umiejscowieniu [35,51,62]. W oparciu o badania wykonane techniką spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) zaproponowano model interakcji pełnoaminokwasowej cząsteczki amyliny ludzkiej z micellami SDS, imitującymi błony komórkowe. Stwierdzono, że w obecności miceli znacząco wzrasta udział struktur α-helikalnych preparatu amyliny, a struktura cząsteczki amyliny nie jest równomiernie stabilna. Istotny wydaje się odcinek 5-17, który stanowi najbardziej usztywnioną część obszaru helikalnego polipeptydu i zanurzając się poniżej powierzchni micelli stabilizuje obszar helisy. Fragment ten jest więc w środowisku hydrofobowym, a fibrylująca część cząsteczki, tzw. domena centralna 20-29, leży w fazie granicznej lipid–środowisko zewnętrzne, czyli rozpuszczalniku. Ta część polipeptydu może też stanowić miejsce kotwiczące cząsteczkę w błonie komórkowej. Wydaje się, że cząsteczka monomeru amyliny układa się równolegle do powierzchni miceli [42]. Zaproponowany model oddziaływania amyliny z błoną podkreśla znaczenie interakcji form helikalnych w przypadku tworzenia toksycznych oligomerów, czy wreszcie fibryli polipeptydu, uszkadzających membranę komórkową [58].

Badania oddziaływania amyliny ze strukturami błonowymi pozwoliły na skonstruowanie modeli ich wzajemnych interakcji. Czy tak jest też w przypadku układu bardziej złożonego, jakim jest błona komórkowa? Czy interakcje z powierzchnią błony są wyrazem „gotowości” cząsteczki amyliny do przyjęcia struktury helikalnej, a następnie do formowania jąder nukleacji i wejścia na szlak fibrylacji? Przez gotowość należy rozumieć subtelne zmiany w jej strukturze wymuszone zewnętrznymi czynnikami środowiska komórki, która jest już w stanie chorobowym. Nie można wykluczyć, że oddziaływanie ze zmienioną błoną chorej komórki wymuszą obserwowane zmiany struktury amyliny. Wiadomo bowiem, że anionowy skład błony komórek trzustki osób chorych na cukrzycę typu 2 ulega zmianie.

Mechanizmy uszkodzenia komórek beta przezfibrylującą amylinę

Nadal pozostaje do wyjaśnienia mechanizm uszkadzania błony komórkowej przez oddziałującą z jej powierzchnią, wprowadzoną na szlak fibrylacji, cząsteczką amyliny. Wysunięto różne koncepcje błonowego mechanizmu uszkadzania komórek beta. Sugerowano, że w wyniku oddziaływania fibryli z błoną komórkową i/lub na skutek ich inkorporacji w strukturę błony, mogą spowodować tworzenie szkodliwych pseudokanałów błonowych i zmieniać parametry fizykochemiczne bądź też powodować całkowitą jej dezintegrację [49]. Interakcja amyliny lub jej proformy ze składnikami błony komórkowej, np. proteoglikanem – siarczanem heparanu, jest także rozważana jako jedna z dróg prowadzących do fibrylacji polipeptydu [57,76]. Innym powodem może być stres oksydacyjny [78] i zmiany w obrębie retikulum endoplazmatycznego, które także powodują tworzenie fibryli przez amylinę [27,46]. Apoptotyczny mechanizm niszczenia komórek i aktywacja systemu wewnątrzkomórkowych kaspaz jest kolejną drogą współodpowiedzialną za formowanie fibryli przez amylinę ludzką [36,62,77].

Nie można wykluczyć zachodzenia jednoczesnego współdziałania wielu czynników i kilku mechanizmów w procesie fibrylacji amyliny, których końcowy skutek z pewnością nie jest wynikiem prostego sumowania skutków działania każdego z czynników z osobna. Czynniki te wpływają na proces formowania fibryli, będąc swego rodzaju katalizatorami fibrylacji. Co więcej, funkcjonuje tu i relacja w odwrotnym kierunku. Nie można zapominać, że formowane w komórce czy deponowane na zewnątrz fibryle wpływają na strukturę błony komórkowej i na cytoarchitektonikę uszkadzanej trzustki. Fibryle formowane w obecności liposomów wpływają na morfologię błon, powodując poważne zmiany w jej strukturze. Jednocześnie fibryle te różnią się od formowanych w środowisku bez liposomów, wskazując na wzajemność funkcjonujących relacji [35].

Mechanizm działania fibrylującej amyliny ludzkiej wiązano także z obserwowaną śmiercią apoptotyczną komórek, choć w niektórych modelach obserwowano także nekrozę komórek beta. Wykazano, że droga aktywacji kaspaz przez fibrylującą amylinę ludzką odgrywa rolę w procesie destrukcji komórek beta. Amylina, zastosowana in vitro w stężeniu odnajdywanym w komórkach osób chorych na cukrzycę, aktywuje kaspazę 3, co prowadzi do śmierci apoptotycznej mysich komórek. Jednak komórki bez ekspresji kaspazy 3, tj. pozbawione tego białka, a poddane działaniu amyliny ludzkiej nie ginęły śmiercią apoptotyczną. Zastosowanie czerwieni Kongo, jako inhibitora fibrylacji amyliny, znacząco hamowało aktywację kaspaz, a także obniżało toksyczny skutek fibrylującej amyliny ludzkiej. Współudział aktywacji szlaku kaspaz w apoptozie komórek beta wydaje się istotny dla cytotoksycznego działania fibrylującej amyliny ludzkiej [36].

Obserwacje toksycznego wpływu fibrylującej amyliny ludzkiej dotyczyły głównie komórek beta trzustki. Okazuje się, że w układzie in vitro, komórki alfa wysp trzustki także mogą ulegać destrukcji pod wpływem fibrylującego polipeptydu ludzkiego, ale w znacznie mniejszym stopniu niż komórki beta. Cechuje je większa przeżywalność niż komórki beta, przynajmniej w zakresie badanych stężeń. Zaznaczyć należy, że stężenia amyliny stosowane w badaniach in vitro zazwyczaj są rzędu μmoli i przewyższają stężenia in vivo rzędu pmoli [36]. U chorych na cukrzycę typu 2, komórek typu alfa jest więcej w porównaniu z osobnikami zdrowymi i są rozproszone w masie chorej trzustki, a nie ułożone peryferycznie jak w zdrowym narządzie [12].

Zakończenie

Amylina jest polipeptydem o wielu zmiennych, zarówno w sensie funkcjonalnym – jako hormon/neurohormon, strukturalnym – jako polipeptyd, jak i chemicznie – ze względu na skład aminokwasowy. W zależności od subtelnych zmian środowiska zmienia postać, a w ślad za tym i własności. Stawia poważne wyzwania eksperymentalne, gdyż wymaga stosowania licznych, różnorodnych metod badawczych i specjalnego traktowania, zarówno na etapie pozyskiwania jej, jak i w toku dalszych etapów badawczych. Badania cytotoksyczności amyliny doprowadziły do ujawnienia najbardziej szkodliwych form, w postaci najmniejszych i trudno uchwytnych w badaniach skupisk polipeptydu. Okazało się, że dojrzałe fibryle amyliny są stosunkowo mniej szkodliwe od oligomerycznych. Nasuwa się zatem pytanie: czy formowanie mniej toksycznych fibryli nie jest postacią unieczynniania mniejszych, ale toksycznych oligomerów przez wiązanie ich w strukturę perfekcyjnie konstruowanych przez komórkę fibryli? Rozważana jest więc i taka zaskakująca koncepcja [67].

Amylina nie jest jedynym fibrylującym hormonem wytwarzanym przez trzustkę. Insulina i glukagon to także cząsteczki fibrylujące [3,10,59,68]. Wiadomo, że insulina, kosekretowana z komórek beta z amyliną, choć sama fibryluje w układach in vitro, to jednak wpływa hamująco na proces fibrylacji amyliny w tych warunkach. Zahamowanie procesu formowania dojrzałych fibryli amyliny minimalizowało uszkodzenie błony w miejscu rozpoczynania budowy fibryli. Paradoksem wydaje się jednak odkrycie, że insulina, choć „radzi” sobie z dojrzałymi fibrylami amyliny, nie dopuszczając do ich formowania, to jednak pozostaje „bezradna” wobec wczesnych, toksycznych intermediatów helikalnych. Stwierdzono, że obecność insuliny hamuje wzrost fibryli w późnej fazie fibrylacji i w ten sposób zmniejsza uszkodzenie błony. Nie znosi jednak procesu destrukcji błony, spowodowanego obecnością form oligomerycznych amyliny. Obecność insuliny nie tylko nie hamuje tworzenia oligomerów, ale wręcz sprzyja ich gromadzeniu właśnie przez hamowanie formowania fibryli [4].

Amylina należy do najbardziej fibrylotwórczych peptydów. Wiadomo także, że mechanizm fibrylacji amyliny różni się od mechanizmu działania innych amyloidowych białek choćby tym, że jest natychmiastowy, a cytotoksyczność też następuje błyskawicznie. Nie ułatwia to prowadzonych badań. Być może teoria toksycznych intermediatów helikalnych, przyjmujących formę oligomerów, zdoła przybliżyć, a może i wyjaśnić problem toksyczności amyliny ludzkiej i przyniesie rozwiązanie w postaci środków terapeutycznych, hamujących ten proces. Dlatego też ujawnienie fibrylotwórczego potencjału amyliny stanowi wyzwanie dla nauk podstawowych i nadzieję dla medycyny.

Podziękowanie

Rycinę wykonała Pani dr Dominika Wróbel. Składam Jej wyrazy szczerej wdzięczności.

Przypisy

• 1. Abedini A., Raleigh D.P.: Incorporation of pseudoproline derivativesallows the facile synthesis of human IAPP, a highly amyloidogenicand aggregation-prone polypeptide. Org. Lett., 2005; 7: 693-696 2 Abedini A., Raleigh D.P.: A critical assessment of the role of helicalintermediates in amyloid formation by natively unfolded proteinsand polypeptides. Protein Eng. Des. Sel., 2009; 22: 453-459
  Google Scholar
• 2. diabetes, and the toxic oligomer hypothesis. Endocr. Rev., 2008;29: 303-316
  Google Scholar
• 3. Andersen C.B., Hicks M.R., Vetri V., Vandahl B., Rahbek-NielsenH., Thøgersen H., Thøgersen I.B., Enghild J.J., Serpell L.C., RischelC., Otzen D.E.: Glucagon fibril polymorphism reflects differences inprotofilament backbone structure. J. Mol. Biol., 2010; 397: 932-946
  Google Scholar
• 4. Brender J.R., Lee E.L., Hartman K., Wong P.T., Ramamoorthy A.,Steel D.G., Gafni A.: Biphasic effects of insulin on islet amyloid polypeptidemembrane disruption. Biophys. J., 2011; 100: 685-692
  Google Scholar
• 5. Buck M.: Trifluoroethanol and colleagues: cosolvents come ofage. Recent studies with peptides and proteins. Q. Rev. Biophys.,1998; 31: 297-355
  Google Scholar
• 6. Charge S.B., de Koning E.J., Clark A.: Effect of pH and insulin onfibrillogenesis of islet amyloid polypeptide in vitro. Biochemistry,1995; 34: 14588-14593
  Google Scholar
• 7. Clark A., Badman M.K., Lowndes S.A., Morris J.F.: Aggregatedhuman islet amyloid polypeptide is not cytotoxic to mouse islets invitro. Diabetologia, 1995; 38 (Suppl. 1): A91
  Google Scholar
• 8. Clark A., Nilsson M.R.: Islet amyloid: a complication of islet dysfunctionor an aetiological factor in type 2 diabetes? Diabetologia,2004; 47: 157-169
  Google Scholar
• 9. Cort J., Liu Z., Lee G., Harris S.M., Prickett K.S., Gaeta L.S., AndersenN.H.: β-structure in human amylin and 2 designer β-peptides:CD and NMR spectroscopic comparisons suggest soluble β-oligomersand the absence of significant populations of β-strand dimers. Biochem.Biophys. Res. Commun., 1994; 204: 1088-1095
  Google Scholar
• 10. de Jong K.L., Incledon B., Yip C.M., DeFelippis M.R.: Amyloidfibrils of glucagon characterized by high-resolution atomic forcemicroscopy. Biophys. J., 2006; 91: 1905-1914
  Google Scholar
• 11. de Koning E.J., Hoppener J.W., Verbeek J.S., Oosterwijk C., vanHulst K.L., Baker C.A., Lips C.J., Morris J.F., Clark A.: Human islet amyloidpolypeptide accumulates at similar sites in islets of transgenicmice and humans. Diabetes, 1994; 43: 640-644
  Google Scholar
• 12. Deng S., Vatamaniuk M., Huang X., Doliba N., Lian M.M., FrankA., Velidedeoglu E., Desai N.M., Koeberlein B., Wolf B., Barker C.F.,Naji A., Matschinsky F.M., Markmann J.F.: Structural and functionalabnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.Diabetes, 2004; 53: 624-632
  Google Scholar
• 13. Domanov Y.A., Kinnunen P.K.: Islet amyloid polypeptide formsrigid lipid-protein amyloid fibrils on supported phospholipid bilayers.J. Mol. Biol., 2008; 376: 42-54
  Google Scholar
• 14. Engel M.F., Khemtemourian L., Kleijer C.C., Meeldijk H.J., JacobsJ., Verkleij A.J., de Kruijff B., Killian J.A., Hoppener J.W.: Membranepermeabilization by islet amyloid polypeptide. Chem. Phys. Lipids,2009; 160: 1-10
  Google Scholar
• 15. Engel M.F., Khemtemourian L., Whoppener J.: Membrane damageby human islet amyloid polypeptide through fibril growthat the membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008; 105: 6033-6038
  Google Scholar
• 16. Fändrich M.: On the structural definition of amyloid fibrils andother polypeptide aggregates. Cell. Mol. Life Sci., 2007; 64: 2066-2078
  Google Scholar
• 17. Fink A.L.: Natively unfolded proteins. Curr. Opin. Struct. Biol.,2005; 15: 35-41
  Google Scholar
• 18. Gast K., Siemer A., Zirwer D., Damaschun G.: Fluoroalcohol-inducedstructural changes of proteins: some aspects of cosolvent–protein interactions. Eur. Biophys. J., 2001; 30: 273-283
  Google Scholar
• 19. Goldsbury C., Baxa U., Simon M.N., Steven A.C., Engel A., WallJ.S., Aebi U., Muller S.A.: Amyloid structure and assembly: insightsfrom scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol.,2011; 173: 1-13
  Google Scholar
• 20. Goldsbury C.S., Cooper G.J., Goldie K.N., Muller S.A., Saafi E.L.,Gruijters W.T., Misur M.P., Engel A., Aebi U., Kistler J.: Polymorphicfibrillar assembly of human amylin. J. Struct. Biol., 1997; 119: 17-27
  Google Scholar
• 21. Goldsbury C., Green J.: Time-lapse atomic force microscopy inthe characterization of amyloid-like fibril assembly and oligomericintermediates. Methods Mol. Biol., 2005; 299: 103-128
  Google Scholar
• 22. Green J.D., Goldsbury C., Kistler J., Cooper G.J., Aebi U.: Humanamylin oligomer growth and fibril elongation define two distinctphases in amyloid formation. J. Biol. Chem., 2004; 279: 12206-12212
  Google Scholar
• 23. Green J.D., Kreplak L., Goldsbury C., Li Blatter X., Stolz M., CooperG.S., Seelig A., Kistler J., Aebi U.: Atomic force microscopy revealsdefects within mica supported lipid bilayers induced by the amyloidogenichuman amylin peptide. J. Mol. Biol., 2004; 342: 877-887
  Google Scholar
• 24. Groenning M.: Binding mode of thioflavin T and other molecularprobes in the context of amyloid fibrils – current status. J. Chem.Biol., 2010; 3: 1-18
  Google Scholar
• 25. Haataja L., Gurlo T., Huang C.J., Butler P.C.: Islet amyloid in type
  Google Scholar
• 26. Higham C.E., Jaikaran E.T., Fraser P.E., Gross M., Clark A.: Preparationof synthetic human islet amyloid polypeptide (IAPP) in astable conformation to enable study of conversion to amyloid-likefibrils. FEBS Lett., 2000; 470: 55-60
  Google Scholar
• 27. Huang C.J., Lin C.Y., Haataja L., Gurlo T., Butler A.E., Rizza R.A.,Butler P.C.: High expression rates of human islet amyloid polypeptideinduce endoplasmic reticulum stress mediated β-cell apoptosis,a characteristic of humans with type 2 but not type 1 diabetes.Diabetes, 2007; 56: 2016-2027
  Google Scholar
• 28. Janson J., Ashley R.H., Harrison D., McIntyre S., Butler P.C.: Themechanism of islet amyloid polypeptide toxicity is membrane disruptionby intermediate-sized toxic amyloid particles. Diabetes,1999; 48: 491-498
  Google Scholar
• 29. Janson J., Soeller W.C., Roche P.C., Nelson R.T., Torchia A.J., KreutterD.K., Butler P.C.: Spontaneous diabetes mellitus in transgenicmice expressing human islet amyloid polypeptide. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1996; 93: 7283-7288
  Google Scholar
• 30. Jayasinghe S.A., Langen R.: Lipid membranes modulate the structureof islet amyloid polypeptide. Biochemistry, 2005; 44: 12113-12119
  Google Scholar
• 31. Kayed R., Bernhagen J., Greenfield N., Sweimeh K., Brunner H.,Voelter W., Kapurniotu A.: Conformational transitions of islet amyloidpolypeptide (IAPP) in amyloid formation in vitro. J. Mol. Biol.,1999; 287: 781-796
  Google Scholar
• 32. Kayed R., Head E., Thompson J.L., McIntire T.M., Milton S.C.,Cotman C.W., Glabe C.G.: Common structure of soluble amyloid oligomersimplies common mechanism of pathogenesis. Science, 2003;300: 486-489
  Google Scholar
• 33. Kelenyi G.: On the histochemistry of azo group-free thiazoledyes. J. Histochem. Cytochem., 1967; 15: 172-180
  Google Scholar
• 34. Knight J.D., Hebda J.A., Miranker A.D.: Conserved and cooperativeassembly of membrane-bound α-helical states of islet amyloidpolypeptide. Biochemistry, 2006; 45: 9496-9508
  Google Scholar
• 35. Knight J.D., Miranker A.D.: Phospholipid catalysis of diabeticamyloid assembly. J. Mol. Biol., 2004; 341: 1175-1187
  Google Scholar
• 36. Law E., Lu S., Kieffer T.J., Warnock G.L., Ao Z., Woo Z., MarzbanL.: Differences between amyloid toxicity in alpha and beta cells inhuman and mouse islets and the role of caspase-3. Diabetologia,2010; 53: 1415-1427
  Google Scholar
• 37. LeVine H.3rd: Quantification of β-sheet amyloid fibril structureswith thioflavin T. Methods Enzymol., 1999; 309: 274-284
  Google Scholar
• 38. Lin C.Y., Gurlo T., Kayed R., Butler A.E., Haataja L., Glabe C.G.,Butler P.C.: Toxic human islet amyloid polypeptide (h-IAPP) oligomersare intracellular, and vaccination to induce anti-toxic oligomerantibodies does not prevent h-IAPP-induced β-cell apoptosis in h–IAPP transgenic mice. Diabetes, 2007; 56: 1324-1332
  Google Scholar
• 39. Linding R., Schymkowitz J., Rousseau F., Diella F., Serrano L.: Acomparative study of the relationship between protein structureand β-aggregation in globular and intrinsically disordered proteins.J. Mol. Biol., 2004; 342: 345-353
  Google Scholar
• 40. Lorenzo A., Razzaboni B., Weir G.C., Yankner B.A.: Pancreaticislet cell toxicity of amylin associated with type-2 diabetes mellitus.Nature, 1994; 368: 756-760
  Google Scholar
• 41. Makin O.S., Serpell L.C.: Structural characterisation of islet amyloidpolypeptide fibrils. J. Mol. Biol., 2004; 335: 1279-1288
  Google Scholar
• 42. Marzban L., Rhodes C.J., Steiner D.F., Haataja L., Halban P.A.,Verchere C.B.: Impaired NH2-terminal processing of human proisletamyloid polypeptide by the prohormone convertase PC2 leadsto amyloid formation and cell death. Diabetes, 2006; 55: 2192-2201
  Google Scholar
• 43. Marzban L., Tomas A., Becker T.C., Rosenberg L., Oberholzer J.,Fraser P.E., Halban P.A., Verchere C.B.: Small interfering RNA-mediatedsuppression of proislet amyloid polypeptide expression inhibitsislet amyloid formation and enhances survival of human islets inculture. Diabetes, 2008; 57: 3045-3055
  Google Scholar
• 44. Mascioni A., Porcelli F., Ilangovan U., Ramamoorthy A., VegliaG.: Conformational preferences of the amylin nucleation site in SDSmicelles: an NMR study. Biopolymers, 2003; 69: 29-41
  Google Scholar
• 45. Maskevich A.A., Stsiapura V.I., Kuzmitsky V.A., Kuznetsova I.M.,Povarova O.I., Uversky V.N., Turoverov K.K.: Spectral properties ofthioflavin T in solvents with different dielectric properties and in afibril-incorporated form. J. Proteome Res., 2007; 6: 1392-1401
  Google Scholar
• 46. Matveyenko A.V., Gurlo T., Daval M., Butler A.E., Butler P.C.:Successful versus failed adaptation to high-fat diet-induced insulinresistance; the role of IAPP-induced β-cell endoplasmic reticulumstress. Diabetes, 2009; 58: 906-916
  Google Scholar
• 47. Meier J.J., Kayed R., Lin C.Y., Gurlo T., Haataja L., Jayasinghe S.,Langen R., Glabe C.G., Butler P.C.: Inhibition of human IAPP fibril formationdoes not prevent β-cell death: evidence for distinct actionsof oligomers and fibrils of human IAPP. Am. J. Physiol. Endocrinol.Metab., 2006; 291: E1317-E1324
  Google Scholar
• 48. Meng F., Marek P., Potter K.J., Verchere C.B., Raleigh D.P.: Rifampicindoes not prevent amyloid fibril formation by human isletamyloid polypeptide but does inhibit fibril thioflavin-T interactions:implications for mechanistic studies of β-cell death. Biochemistry,2008; 47: 6016-6024
  Google Scholar
• 49. Mirzabekov T.A., Lin M.C., Kagan B.L.: Pore formation by the cytotoxicislet amyloid peptide amylin. J. Biol. Chem., 1996; 271: 1988-1992
  Google Scholar
• 50. Munishkina L.A., Phelan C., Uversky V.N., Fink A.L.: Conformationalbehavior and aggregation of α-synuclein in organic solvents: modelingthe effects of membranes. Biochemistry, 2003; 42: 2720-2730
  Google Scholar
• 51. Nanga R.P., Brender J.R., Xu J., Veglia G., Ramamoorthy A.: Structuresof rat and human islet amyloid polypeptide IAPP1–19 in micellesby NMR spectroscopy. Biochemistry, 2008; 47: 12689-12697
  Google Scholar
• 52. Nilsson M.R.: Techniques to study amyloid fibril formation invitro. Methods, 2004; 34: 151-160
  Google Scholar
• 53. Nilsson M.R., Raleigh D.P.: Analysis of amylin cleavage productsprovides new insights into the amyloidogenic region of human amylin.J. Mol. Biol., 1999; 294: 1375-1385
  Google Scholar
• 54. O’Brien T.D., Butler A.E., Roche P.C., Johnson K.H., Butler P.C.:Islet amyloid polypeptide in human insulinomas: evidence for intracellularamyloidogenesis. Diabetes, 1994; 43: 329-336
  Google Scholar
• 55. O’Brien T.D., Butler P.C., Kreutter D.K., Kane L.A., EberhardtN.L.: Human islet amyloid polypeptide expression in COS-1 cells.A model of intracellular amyloidogenesis. Am. J. Pathol., 1995;147: 609-616
  Google Scholar
• 56. Padrick S.B., Miranker A.D.: Islet amyloid: phase partitioningand secondary nucleation are central to the mechanism of fibrillogenesis.Biochemistry, 2002; 41: 4694-4703
  Google Scholar
• 57. Park K., Verchere C.B.: Identification of a heparin binding domainin the N-terminal cleavage site of pro-islet amyloid polypeptide.Implications for islet amyloid formation. J. Biol. Chem., 2001;276: 16611-16616
  Google Scholar
• 58. Patil S.M., Xu S., Sheftic S.R., Alexandrescu A.T.: Dynamic α-helixstructure of micelle-bound human amylin. J. Biol. Chem., 2009; 284:11982-11991
  Google Scholar
• 59. Pedersen J.S.: The nature of amyloid-like glucagon fibrils. J.Diabetes Sci. Technol., 2010; 4: 1357-1367
  Google Scholar
• 60. Plaxco K.W., Gross M.: Cell biology. The importance of beingunfolded. Nature, 1997; 386: 657-659
  Google Scholar
• 61. Purcell K.F., Stikeleather J.A., Brunk S.D.: Spectroscopic studiesof hydrogen bonding: hexafluoroisopropanol. J. Mol. Spectrosc.,1969; 32: 202-213
  Google Scholar
• 62. Rumora L., Hadzija M., Barisic K., Maysinger D., Grubiic T.Z.:Amylin-induced cytotoxicity is associated with activation of caspase-3and MAP kinases. Biol. Chem., 2002; 383: 1751-1758
  Google Scholar
• 63. Sekhar A., Udgaonkar J.B.: Fluoroalcohol-induced modulationof the pathway of amyloid protofibril formation by barstar. Biochemistry,2011; 50: 805-819
  Google Scholar
• 64. Serpell L.C., Sunde M., Benson M.D., Tennent G.A., Pepys M.B.,Fraser P.E.: The protofilament substructure of amyloid fibrils. J. Mol.Biol., 2000; 300: 1033-1039
  Google Scholar
• 65. Serpell L.C., Sunde M., Blake C.C.: The molecular basis of amyloidosis.Cell. Mol. Life Sci., 1997; 53: 871-887
  Google Scholar
• 66. Tenidis K., Waldner M., Bernhagen J., Fischle W., Bergmann M.,Weber M., Merkle M.L., Voelter W., Brunner H., Kapurniotu A.: Identificationof a penta- and hexapeptide of islet amyloid polypeptide(IAPP) with amyloidogenic and cytotoxic properties. J. Mol. Biol.,2000; 295: 1055-1071
  Google Scholar
• 67. Treusch S., Cyr D.M., Lindquist S.: Amyloid deposits: protectionagainst toxic protein species? Cell Cycle, 2009; 8: 1668-1674
  Google Scholar
• 68. Uversky V.N., Fink A.L.: Conformational constraints for amyloidfibrillation: the importance of being unfolded. Biochim. Biophys.Acta, 2004; 1698: 131-153
  Google Scholar
• 69. Waugh D.F.: A fibrous modification of insulin. I. The heat precipitateof insulin. J. Am. Chem. Soc., 1946; 68: 247-250
  Google Scholar
• 70. Westermark G.T., Westermark P., Berne C., Korsgren O., NordicNetwork for Clinical Islet Transplantation: Widespread amyloid depositionin transplanted human pancreatic islets. N. Engl. J. Med.,2008; 359: 977-979
  Google Scholar
• 71. Westermark P., Andersson A., Westermark G.T.: Is aggregatedIAPP a cause of beta-cell failure in transplanted human pancreaticislets? Curr. Diab. Rep., 2005; 5: 184-188
  Google Scholar
• 72. Westermark P., Grimelius L.: The pancreatic islet cells in insularamyloidosis in human diabetic and non-diabetic adults. Acta Pathol.Microbiol. Scand. Sect A, 1973; 81: 291-300
  Google Scholar
• 73. Williamson J.A., Loria J.P., Miranker A.D.: Helix stabilization precedesaqueous and bilayer catalyzed fiber formation in islet amyloidpolypeptide. J. Mol. Biol., 2009; 393: 383-396
  Google Scholar
• 74. Williamson J.A., Miranker A.D.: Direct detection of transientα-helical states in islet amyloid polypeptide. Protein Sci., 2007; 16:110-117
  Google Scholar
• 75. Yanagi K., Ashizaki M., Yagi H., Sakurai K., Lee Y.H., Goto Y.: Hexafluoroisopropanolinduces amyloid fibrils of islet amyloid polypeptideby enhancing both hydrophobic and electrostatic interactions.J. Biol. Chem., 2011; 286: 23959-23966
  Google Scholar
• 76. Young I.D., Ailles L., Narindrasorasak S., Tan R., Kisilevsky R.: Localizationof the basement membrane heparan sulfate proteoglycanin islet amyloid deposits in type II diabetes mellitus. Arch. Pathol.Lab. Med., 1992; 116: 951-954
  Google Scholar
• 77. Zhang S., Liu J., Dragunow M., Cooper G.J.: Fibrillogenic amylinevokes islet β-cell apoptosis through linked activation of a caspasecascade and JNK1. J. Biol. Chem., 2003; 278: 52810-52819
  Google Scholar
• 78. Zraika S., Hull R.L., Udayasankar J., Aston-Mourney K., SubramanianS.L., Kisilevsky R., Szarek W.A., Kahn S.E.: Oxidative stress isinduced by islet amyloid formation and time-dependently mediatesamyloid-induced beta cell apoptosis. Diabetologia, 2009; 52: 626-635
  Google Scholar
• 79. Zraika S., Hull R.L., Verchere C.B., Clark A., Potter K.J., FraserP.E., Raleigh D.P., Kahn S.E.: Toxic oligomers and islet beta cell death:guilty by association or convicted by circumstantial evidence?Diabetologia, 2010; 53: 1046-1056
  Google Scholar

Pełna treść artykułu