Astrocyty w udarze niedokrwiennym mózgu – potencjalny cel strategii neuroprotekcyjnych
Bożena Gabryel 1 , Daniela Kasprowska 1 , Alicja Kost 1 , Krzysztof Łabuzek 2 , Tomasz Urbanek 3Abstrakt
Udary niedokrwienne mózgu stanowią jedną z głównych przyczyn śmierci i niepełnosprawności osób dorosłych na świecie. Obecnie stosowane postępowania terapeutyczne w udarze niedokrwiennym nie dają zadowalających wyników. Coraz częściej zwraca się uwagę, że działania farmakologiczne zmierzające do ograniczenia strefy uszkodzenia powinny uwzględniać utrzymanie funkcji protekcyjnych astrocytów, które tworzą wraz z neuronami i komórkami śródbłonka naczyń jednostkę neurowaskularną. Astrocyty pełnią główne funkcje warunkujące prawidłowe działanie neuronów, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W zawale mózgu regulują równowagę wodno-elektrolitową, mózgowy przepływ krwi, uczestniczą w utrzymaniu integralności bariery krew-mózg, kontrolują zewnątrzkomórkowe stężenie glutaminianu i wydzielają substancje neuroprotekcyjne. Jednak astrocyty mogą się przyczyniać do powiększenia strefy niedokrwienia ponieważ biorą udział w procesach zapalnych i wydzielają substancje neurotoksyczne. W pracy omówiono badania eksperymentalne i kliniczne dotyczące adaptacyjnej i patologicznej roli astrocytów we wczesnej i późnej fazie udaru niedokrwiennego mózgu. Zwrócono szczególną uwagę na specyficzne cechy tych komórek, które mogą stanowić potencjalny cel strategii neuroprotekcyjnych.
Wprowadzenie
Choroby naczyniopochodne (udary) mózgu stanowią trzecią, po chorobie niedokrwiennej serca i nowotworach, najczęstszą przyczynę zgonów oraz główny powód trwałej niepełnosprawności osób dorosłych na świecie [30]. Definicja opracowana przez Światową Organizację Zdrowia w 1978 r. określa udar jako „zespół objawów klinicznych charakteryzujący się nagłym wystąpieniem ogniskowych, a czasem uogólnionych zaburzeń czynności mózgu, które – jeśli nie powodują wcześniej zgonu – utrzymują się dłużej niż 24 godziny i nie mają innej przyczyny niż naczyniowa” [88]. Około 80% przypadków stanowią udary niedokrwienne spowodowane zablokowaniem lub znacznym upośledzeniem dopływu krwi do określonego obszaru mózgowia definiowanego przez zakres unaczynienia zajętej tętnicy. Przyczyną zaburzeń przepływu jest najczęściej skrzeplina powstała w ognisku miażdżycowym, znaczne zwężenie światła naczynia przez ogniska miażdżycowe w połączeniu z obniżeniem ciśnienia tętniczego lub rzadziej proces zapalny obejmujący ścianę naczynia [105]. Ponieważ, jak wspomniano, najczęstszym typem udaru mózgu jest udar niedokrwienny, dlatego większość badań klinicznych i eksperymentalnych koncentruje się na poszukiwaniu skutecznych metod leczenia chrorych. Obecnie u pacjentów w ostrej fazie udaru jedynym swoistym sposobem postępowania jest dożylne podanie rekombinowanego tkankowego aktywatora plazminogenu (rtPA) do 4,5 godz. od wystąpienia pierwszych objawów. Ponadto wykazano, że u chorych do 60 roku życia ze złośliwym zawałem półkuli mózgu obejmującym cały obszar unaczynienia tętnicy środkowej mózgu lub rozległym zawałem móżdżku, istotnie zmniejsza śmiertelność odpowiednio wcześnie wykonana dekompresja chirurgiczna (do 48 godz.) [109]. W prewencji wtórnej potwierdzono skuteczność doustnych leków antykoagulacyjnych u chorych z migotaniem przedsionków, endarterektomii tętnicy szyjnej wewnętrznej, leków przeciwpłytkowych i inhibitorów reduktazy 3-hydroksy-3-metylo-glutarylokoenzymu A (statyn) [30]. Duże nadzieje wciąż budzi neuroprotekcja, czyli zapobieganie niekorzystnym zmianom biochemicznym związanym z tzw. kaskadą niedokrwienia. Jednak, mimo iż w ciągu ostatnich dwóch dekad przeprowadzono ponad 1000 badań klinicznych nad zastosowaniem różnych substancji neuroprotekcyjnych w udarze mózgu, to nie udało się wykazać skuteczności żadnej z nich [12]. Jedną z przyczyn niepowodzeń jest to, iż większość prac eksperymentalnych koncentruje się na mechanizmach śmierci neuronów. Skuteczna strategia neuroprotekcyjna powinna natomiast uwzględniać utrzymanie funkcji i ograniczenie śmiertelności także innych typów komórek, w tym astrocytów i komórek śródbłonka naczyń mózgowych tworzących wraz z neuronami tzw. jednostkę neurowaskularną [119]. Astrocyty są najliczniej występującymi komórkami glejowymi w ludzkim mózgu, a w niektórych jego obszarach ich liczba znacznie przewyższa liczbę neuronów [85]. Biorą udział w procesach zapalnych i wydzielają substancje potencjalnie neurotoksyczne (tj. białko S-100b), przez co mogą się przyczyniać do zwiększenia obszaru niedokrwienia. Jednak przez wpływ na homeostazę glutaminianu, bilans wodny, równowagę jonową, utrzymanie bariery krew- -mózg (blood-brain barrier, BBB), regulację mózgowego przepływu krwi i wydzielanie substancji neuroprotekcyjnych, astrocyty podczas udaru korzystnie wpływają na żywotność neuronów [96].
Astrocyty pełnią funkcje patologiczne i adaptacyjne, zarówno we wczesnej (minuty-kilka godzin, ryc. 1), jak i późnej (dni-tygodnie, ryc. 2) fazie udaru niedokrwiennego mózgu, a przez to modulują wielkość obszaru uszkodzenia. Stąd też żadna substancja neuroprotekcyjna, która chroni neurony, ale nie zmniejsza śmiertelności astrocytów lub nie nasila ich korzystnych właściwości, nie może być skuteczna. W pracy omówiono badania eksperymentalne i kliniczne dotyczące adaptacyjnej i patologicznej roli astrocytów w przebiegu udaru niedokrwiennego mózgu. Ponadto wskazano te swoiste cechy komórek, które są lub powinny stać się punktem uchwytu strategii protekcyjnych w celu ograniczenia wielkości zawału i poprawy stanu funkcjonalnego.
Odmienna wrażliwość astrocytów i neuronów na niedokrwienie – uwarunkowania metaboliczne
W strefie centralnej zawału (core), przy spadku mózgowego przepływu krwi do wartości 0,17-0,24 ml/g/min, z powodu przerwania dopływu tlenu i glukozy, dochodzi do martwicy wszystkich typów komórek, w tym neuronów i astrocytów. Natomiast w rejonie penumbry (pół- cienia ischemicznego), czyli obszarze, gdzie perfuzja jest częściowo zachowana, astrocyty przeżywają dłużej niż neurony [23]. Jednak z czasem, w obrębie penumbry dochodzi do dalszego obniżenia przepływu krwi, narastania zaburzeń metabolicznych i aktywacji wielu procesów molekularnych. Obszar penumbry maleje, a powiększa się strefa zawału. Względna oporność astrocytów, w porównaniu do neuronów, na niedokrwienie in vivo jest ciągle przedmiotem dyskusji. Część badań na zwierzęcych modelach ogniskowego niedokrwienia sugeruje nawet, że astrocyty protoplazmatyczne, które szybciej tracą integralność niż astrocyty włókniste, mogą być bardziej wrażliwe niż neurony [70]. Także komórki pochodzące z różnych rejonów mózgu (kory, prążkowia, hipokampa) może charakteryzować różna wrażliwość na ischemię [112,118]. Jednak zdecydowana większość danych, pochodzących głównie z badań in vitro prowadzonych na modelach jednoczesnej deprywacji tlenu i glukozy (oxygen and glucose deprivation, OGD) potwierdza, iż astrocyty mogą przetrwać warunki stresu ischemicznego dłużej niż neurony. Podczas gdy godzina OGD powoduje znaczny spadek żywotności neuronów, nie ma żadnego wpływu na astrocyty [3]. Odmienna wrażliwość neuronów i astrocytów na niedotlenienie wynika z istotnych różnic w metabolizmie energetycznym [40]. Stosunkowo duża oporność astrocytów na ischemię jest spowodowana obecnością w nich zapasów glikogenu, którego nie gromadzą neurony [99]. Substratem dla syntezy glikogenu w astrocytach jest nie tylko glukoza, ale także pirogronian, mleczan, alanina oraz glutaminian [99]. Astrocyty charakteryzuje także duża aktywność enzymów: karboksylazy pirogronianowej i dehydrogenazy mleczanowej [46]. Karboksylaza pirogronianowa katalizuje przyłączenie CO2 do pirogronianu, umożliwiając tym samym syntezę dodatkowej cząsteczki szczawiooctanu i następcze utrzymanie etapów pośrednich cyklu kwasu cytrynowego [46]. Stosując metody histochemiczne wykazano w astrocytach obecność tego enzymu, niewykrywalnego w neuronach [22]. Duża aktywność dehydrogenazy mleczanowej nadaje astrocytom wyjątkową, w porównaniu do neuronów, zdolność wytwarzania ATP za pośrednictwem glikolizy beztlenowej [40]. Jednak przedłużająca się, nasilona glikoliza zwiększa wytwarzanie kwasu mlekowego i prowadzi do kwasicy. Astrocyty są o wiele bardziej wrażliwe na kwasicę niż neurony [41]. Przy spadku zewnątrzkomórkowego pH do wartości poniżej 6,6 dochodzi do zatrzymania glikolizy i nieodwracalnego ich obumierania. Astrocyty, zwłaszcza pochodzące z regionów mózgu o dużej liczbie neuronów glutaminergicznych, charakteryzuje również wyraźna aktywność oksydazy cytochromowej [4]. Ze względu na energochłonny proces wychwytu glutaminianu (patrz niżej), wymagają szczególnie intensywnego metabolizmu energetycznego [46]. Ponadto, duże stężenie niskocząsteczkowych antyoksydantów, takich jak zredukowany glutation (GSH), kwas askorbinowy czy tokoferol oraz znaczna aktywność enzymów antyoksydacyjnych, zwłaszcza peroksydazy glutationowej (GPx), ale także dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), katalazy, ceruloplazminy, transferyny i metalotioneiny (MT) warunkuje mniejszą podatność astrocytów na stres oksydacyjny w porównaniu do neuronów i komórek śródbłonka naczyń [20].
Wraz z postępującym procesem starzenia się mózgu następują zmiany morfologii, liczby i reaktywności astrocytów, osłabiające ich funkcje adaptacyjne [97]. U starszych szczurów z eksperymentalnie wywołanym zawałem mózgu obserwowano zwiększoną reaktywność astrocytów, nasilenie procesu formowania blizny glejowej oraz upośledzenie procesu przebudowy struktury macierzy zewnątrzkomórkowej [69]. Zmniejszenie wraz z wiekiem wydzielania z astrocytów czynników wzrostowych (IGF-1, bFGF, VEGF) i białka Wnt3 znacznie osłabia endogenny mechanizm naprawczy, jakim jest proces neurogenezy [97].
W zmiennej wrażliwości astrocytów na niedokrwienie istotny także wydaje się – podkreślany ostatnio przez wielu autorów – regulujący wpływ hormonów płciowych (androgenów, estrogenów, progesteronu) oraz ich metabolitów na funkcje neuroprotekcyjne tych komórek. Hormony płciowe (zarówno w mózgu nieuszkodzonym, jak i uszkodzonym przez udar) powodują wzrost ekspresji czynników wzrostowych pochodzenia astrocytarnego i glejowych transporterów aminokwasów pobudzających. U szczurów pozbawionych gonad wielokrotnie stwierdzano osłabienie reaktywnej astrogliozy indukowanej zawałem mózgu na skutek podawania estrogenu, testosteronu, dihydrotestosteronu, progesteronu oraz neurosteroidów (dehydroepiandrosteronu, pregnenolonu, siarczanu pregnenolonu) [97]. Działanie neuroprotekcyjne hormonów płciowych może być wynikiem ich bezpośredniego wpływu na astrocyty lub oddziaływania przez mechanizmy parakrynne. Dostępne dane świadczą niewątpliwie, iż hormony płciowe wspomagają właściwości adaptacyjne astrocytów [96]. Zanikanie czynności hormonalnej jajników jest uznanym czynnikiem wpływającym zarówno na większą zapadalność na udar mózgu kobiet po menopauzie oraz gorszy jego przebieg w tej populacji chorych [97].
Przesunięcia jonowe i obrzęk
Jedną z pierwszych zmian występujących w neuronach w warunkach ograniczonego dostępu tlenu i glukozy jest szybkie zahamowanie fosforylacji oksydacyjnej i wyczerpanie zasobów ATP [100,102]. Przez krótki czas niedobory energetyczne neuronów są uzupełniane w wyniku glikolizy beztlenowej, który to proces powoduje jednak gromadzenie się kwasu mlekowego zarówno w ich wnętrzu, jak i w przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Z powodu kwasicy mitochondria tracą zdolność do prawidłowej sekwestracji wapnia [16]. „Przeładowanie” mitochondriów jonami Ca2+ upośledza ich funkcje i hamuje syntezę ATP [16]. Załamanie homeostazy energetycznej wywołuje niewydolność pomp jonowych (Na+ / K+ -ATP-azy, Ca2+/H+ -ATP-azy, wymiennika Na+ -Ca2+) i prowadzi do wewnątrzkomórkowej akumulacji jonów Na+ , Ca2+ i Cl – a wypływu K+ . Następuje depolaryzacja błon przyległych komórek neuronalnych, co powoduje przeciekanie przez nie jonów, których gradient nie może być dłużej utrzymywany przez Na+ /K+ ATP-azę. W zdepolaryzowanych błonach neuronalnych usunięta zostaje blokada receptorów NMDA (kwas N-metylo-D-asparaginowy) przez jony Mg2+, zatem możliwe jest ich pobudzenie przez glutaminian. To powoduje masowy napływ jonów Ca2+ przez kanał związany z receptorem NMDA i dalsze pogłębianie strat ATP [61].
Zmiany właściwości błon astrocytarnych nie zachodzą tak dramatycznie i nagle jak neuronów ze względu na ich wyższy potencjał oraz transbłonowy gradient jonów Na+ i K+ [111]. Komórki glejowe odgrywają ważną rolę w usuwaniu zwiększonego stężenia K+ z przestrzeni zewnątrzkomórkowej w procesie określanym jako „przestrzenny mechanizm buforowy”. Astrocyty połączone za pomocą złącz szczelinowych działają bowiem jak elektrody potasowe [98]. Jednak ostatecznym skutkiem znacznej utraty jonów K+ przez neurony drogą kanałów potasowych wrażliwych na jony Ca2+ lub ATP jest uogólniona depolaryzacja błon astrocytów. Powoduje to otwarcie w nich kanałów anionowych zależnych od napięcia (voltage-regulated anion channels, VRACs) i biernego, elektroobojętnego przepływu K+ , Cl – i HCO3 – przez siły Donnana. Napływający do astrocytów CO2 powoduje wewnątrzkomórkową alkalozę i jest prawdopodobnie przyczyną kwasicy przestrzeni zewnątrz – i wewnątrzkomórkowej neuronów [80]. Początkowo umiarkowanakwasica wpływa protekcyjnie na neurony, ponieważ łagodzi napływ Ca2+ występujący po ekspozycji na glutaminian i depolaryzację indukowaną K+ [80]. Przy zmniejszeniu wartości pH do 6,4 dochodzi do całkowitego „wyłączenia” receptorów NMDA. Jest to więc naturalny mechanizm obronny przeciwdziałający lawinowemu doneuronalnemu napływowi Ca2+ [106]. W wyniku dalszego zmniejszania się potencjału błonowego astrocytów następuje jednak aktywacja ich kanałów wapniowych zależnych od potencjału (voltage-operated calcium channels, VOCCs), a to zwiększa szybkość zużycia ATP. Straty energetyczne pogłębia także zwiększony wychwyt glutaminianu, pochłaniający energię jednej cząsteczki ATP na jedną cząsteczkę aminokwasu [10]. Zatem ostatecznie, wobec braku odpowiedniego stężenia ATP, także komórki glejowe tracą zdolność do utrzymania homeostazy. Glutaminian zwiększa w astrocytach wytwarzanie puli metabolicznej CO2 i H+ , przyczyniając się do ich obrzmienia.
Astrocyty w przebiegu zawału mózgu mogą przez złącza szczelinowe rozprzestrzeniać fale wolnego wapnia wewnątrzkomórkowego ([Ca2+]i ). Powstanie fal wapniowych pozwala na propagowanie swoistych czasowo-przestrzennych zmian i jest postrzegane jako sposób amplifikacji aktywacji astrocytów. Fale wapniowe są indukowane m.in. przez wzrost zewnątrzkomórkowego ATP oraz zjawisko tzw. indukowanego przez wapń uwalniania wapnia z jego wewnątrzkomórkowych magazynów. Astrocytarne fale wapniowe rozchodzące się przez połączenia szczelinowe mogą bezpośrednio wpływać na stężenie wapnia w przyległych neuronach oraz nasilać uwalnianie z astrocytów glutaminianu, aktywującego następnie neuronalne jonotropowe receptory glutaminianergiczne [29]. Połączenia szczelinowe między astrocytami we wczesnej fazie udaru pozostają otwarte, co przyczynia się do nasilenia procesu ekscytotoksyczności [29]. Na udział astrocytarnych złącz szczelinowych patomechanizmie udaru mózgu wskazuje to, iż podanie systemowe ich inhibitorów (tj. halotan, oktanol, karbenoksolon) znacznie redukowało objętość strefy uszkodzenia w modelach zwierzęcych [29].
Zjawisko obrzmienia astrocytów obserwuje się w bardzo wczesnym etapie ischemii (w ciągu kilku minut) i jest wynikiem konwergencji kilku różnych mechanizmów prowadzących do wzrostu objętości komórek [111]. Obrzmieniu ulegają zarówno wypustki stopkowate wokół neuronów i naczyń włosowatych, jak i ciała komórek glejowych, których cytoplazma jest widoczna jako jasna i wodnista [81]. Działające jednocześnie wymienne układy transportujące Cl- /HCO3 – i Na+ /H+ podlegają stymulacji przez przenikający swobodnie przez błony CO2 . Wewnątrz astrocytów ulega uwodnieniu z utworzeniem jonów H+ i HCO3 – , które na zasadzie wymiany z Na+ i Cl – przechodzą z przestrzeni wewnątrz – do zewnątrzkomórkowej [19]. Przyczyną obrzmienia może być także załamanie się selektywności przepuszczalności błony komórkowej, będące skutkiem powstawania reaktywnych form tlenu (RFT) oraz utrata tauryny – neuromodulatora odgrywającego ważną rolę w kontroli objętości komórek. Astrocyty mają sprawnie działający system usuwania tauryny z przestrzeni zewnątrzkomórkowej przez zależny od Na+ mechanizm transportu, który generuje i utrzymuje 10 000-krotny gradient jej stężenia między środowiskiem wewnątrz – i zewnątrzkomórkowym [73]. Jednym z głównych następstw obrzmienia astrocytów obserwowanych in vivo jest prawie 50% zmniejszenie średnicy światła naczyń włosowatych, dalsza redukcja przepływu krwi i wzrost ciśnienia wewnątrzczaszkowego.
W przebiegu udaru mózgu astrocyty są głównymi mediatorami obrzęku cytotoksycznego (komórkowego) [111]. W stopkach końcowych astrocytów przylegających do naczyń włosowatych stwierdza się wysoką ekspresję swoistej dla tych komórek akwaporyny 4 (AQP4), która ulega dalszemu wzrostowi we wczesnej fazie udaru [71]. Akwaporyny (AQP) to rodzina białek stanowiących wyspecjalizowane kanały wodne. AQP4 charakteryzuje bardzo dobra przepuszczalność wody, wynikająca ze specyficznej struktury tetrameru i zgrupowania w duże klastery o średnicy około 100 nm [71]. Woda przenikająca przez kanały AQP4, ze względu na ich umiejscowienie na wypustkach astrocytarnych otaczających naczynia oraz dużą przepustowość, jest główną przyczyną obrzęku cytotoksycznego w udarze niedokrwiennym. Potwierdzają to wyniki badań na myszach z delecją genu AQP4, u których obserwowano zmniejszenie obrzęku cytotoksycznego na skutek niedokrwienia [38] oraz redukcję objętości uszkodzenia wywołanego ischemią/reperfuzją [71]. Wydaje się zatem, iż zahamowanie kanałów AQP4 może zmniejszać obrzęk cytotoksyczny w udarze niedokrwiennym i stać się potencjalnym punktem uchwytu strategii protekcyjnych. Takie podejście jest tym bardziej obiecujące, gdyż AQP4 nasila także migrację astrocytów, formowanie blizny glejowej oraz uczestniczy w procesach zapalnych [38]. W zwierzęcych modelach zawału mózgu stwierdzono, iż wiele substancji o właściwościach neuroprotekcyjnych (propofol, piroksykam, agmatyna, octan mirystynianu forbolu), zmniejsza ekspresję AQP4, co może stanowić istotną składową ich plejotropowego działania [17,55,78,120]. Obecnie prowadzi się prace mające na celu otrzymanie swoistych inhibitorów AQP4, które mogłyby mieć zastosowanie kliniczne [103].
Skutkiem obrzęku cytotoksycznego astrocytów jest nasilenie uwalniania z nich glutaminianu przez kanały VRACs w penumbrze [14]. W badaniach in vitro stwierdzono, iż wyciszenie genu kodującego AQP4 powoduje ograniczenie aktywności VRACs i działania ekscytotoksycznego glutaminianu [14]. Tamoksifen, inhibitor VRACs, w szczurzym modelu niedokrwienia redukuje średnio o 50% uwalnianie glutaminianu w obszarze penumbry [115]. Po podaniu tamoksifenu 3 godz. od zaciśnięcia tętnicy środkowej mózgu (middle cerebral artery occlusion, MCAO) obserwowano także zmniejszenie strefy zawału i zaburzeń behawioralnych [115].
Astrocyty uczestniczą również w powstawaniu obrzęku naczyniopochodnego, do którego dochodzi na skutek utraty integralności BBB. We wczesnej fazie udaru (kilka minut do kilku godzin) z naczyń krwionośnych do mózgu przenika tylko woda, która gromadzi się w przestrzeni zewnątrzkomórkowej w wyniku wzrostu przepuszczalności śródbłonka naczyniowego. W fazie drugiej (po kilkunastu godzinach) dochodzi do znacznego uszkodzenia BBB i osłabienia ścian tętnic mózgowych, co jest przyczyną ich pęknięcia i wynaczynienia krwi [116]. Do destrukcji BBB przyczyniają się wydzielane przez astrocyty już około 1 godzinę od udaru czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (vascular endothelial growth factor, VEGF) oraz metaloproteinazy (matrix metalloproteinases, MMPs), głównie metaloproteinaza 9 (MMP-9) [117]. Wykazano, że aktywacja MMP-9 i związana z nią zewnątrzkomórkowa proteoliza są związane z rozwojem obrzęku naczyniopochodnego i ukrwotocznieniem udaru [28]. W badaniach nad mechanizmami warunkującymi neuroprotekcyjny wpływ hartowania ischemicznego stwierdzono pozytywną korelację między ekspresją AQP4, a redukcją obrzęku naczyniopochodnego [15]. Na obecnym etapie wiedzy wydaje się, iż w tym przypadku dochodzi do zmniejszenia obrzęku naczyniopochodnego na skutek intensywnego wypompowywania wody przez kanały AQP4 z mózgu do krwi obwodowej. Dodatkowym mechanizmem może być redystrybucja wody z kompartmentu astrocytarnego przez przestrzenną sieć astrocytów do płynu mózgowo-rdzeniowego (cerebrospinal fluid, CSF). Hipotezę tę pośrednio potwierdza wykrycie znacznego wzrostu ekspresji AQP4 w komórkach wyściółki układu komorowego mózgu w zwierzę- cym modelu traumatycznego uszkodzenia mózgu [15].
Zapalenie i zaburzenie homeostazy glutaminianu
Zapalenie jest ważnym czynnikiem determinującym wielkość obszaru uszkodzenia indukowanego ischemią oraz stan funkcjonalny w podostrej fazie udaru. Zahamowanie enzymów aktywnych w procesach zapalnych, takich jak cyklooksygenazy 2 (COX-2) czy indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS) redukuje powiększanie się objętości ogniska zawałowego w zwierzęcych modelach niedokrwienia [49]. Astrocyty biorą udział w zainicjowaniu i utrzymaniu odpowiedzi zapalnej w udarze niedokrwiennym mózgu przez wydzielanie cytokin, zwłaszcza TNF-a i IL-1b [49].
W nieuszkodzonym mózgu, ekspresja mRNA TNF-a jest na niskim poziomie i ogranicza się głównie do mikrogleju i astrocytów, a stężenie białka TNF-a jest na lub poni- żej granicy detekcji. Niedokrwienie ogniskowe powoduje znaczny (10-100-krotny) i szybki (2-6 godz.) wzrost stężenia TNF-a w obszarze uszkodzenia [13]. Neurony w strefie objętym ischemią są więc eksponowane na duże stężenie TNF-a, który może prowadzić do ich degeneracji [49]. Astrocyty stymulowane TNF-a wykazują obecność mRNA TNF-a, co świadczy o pozytywnej pętli sprzężenia dla ekspresji TNF-a i amplifikacji odpowiedzi [12]. TNF-a stymuluje astrocyty do uwalniania także innych cytokin (tj. IL-1b, IL-6, IL-8), czynników stymulujących kolonie granulocytarne i granulocytarno- -makrofagowe (granulocyte colony-stimulating factor/ granulocyte-macrophage colony stimulating factor, G-CSF/GM-CSF), czynnika hamującego białaczkę (leukemia inhibitory factor, LIF) oraz białka chemotaktycznego dla monocytów (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1). Obserwowany na astrocytach wzrost ekspresji molekuł adhezyjnych, ICAM-1 i VACM-1, pod wpływem TNF-a może ułatwiać ich działanie jako mózgowych komórek prezentujących antygen (antigen presenting cells, APC) [42]. Także wydzielane G-CSF i GM-CSF wzmagają odpowiedź immunologiczną przez nasilenie migracji granulocytów i makrofagów do obszaru uszkodzenia, wzrost ich przeżywalności i funkcji efektorowych. Ponadto GM-CSF indukuje proliferację i aktywuje mikroglej [9].
W proces neurodegeneracji wywołany niedotlenieniem jest zaangażowana także wydzielana przez astrocyty IL-1b [49]. W modelu eksperymentalnej ischemii u gryzoni wykazano, że wzrost ekspresji IL-1β na poziomie mRNA i białka zachodzi w prawie identycznym czasie jak TNF-a [116]. IL-1β pobudza astrocyty do proliferacji, wydzielania TNF-a, IL-6, NGF, G-CSF i GM-CSF oraz odgrywa rolę stymulatora wytwarzania NO [13]. Podobnie jak TNF-a, także IL-1β nasila w astrocytach ekspresję ICAM-1 oraz VCAM-1 [116]. IL-1b zwiększa wytwarzanie IL-2 przez limfocyty pomocnicze Th i ekspresję receptorów dla IL-2 na limfocytach Tc. Astrocyty zarówno wytwarzają, jak i odpowiadają na IL-1b, co stanowi autokrynny mechanizm regulujący mózgowe stężenie IL-1b [49]. W badaniach na kokulturach neuronów i astrocytów narażonych jednocześnie na hipoksję i IL-1b stwierdzono, że pobudzenie receptora IL-1 typu I (IL1-R1) na astrocytach indukuje śmierć neuronów na skutek nasilenia uwalniania z nich glutaminianu przez transporter cystyna/glutaminian (Xc) [37]. Naturalnie występujący antagonista receptora IL-1 (IL-1ra) podany do 3 godz. od MCAO u szczurów zmniejszał wielkość zawału i upośledzenie sprawności. Podobnie w badaniu klinicznym po wdrożeniu leczenia IL-1ra do 6 godz. od pojawienia się objawów u pacjentów z zawałem korowym obserwowano lepsze wyniki leczenia, bez zwiększenia działań niepożądanych, w porównaniu z placebo [33]. Ten potencjalnie korzystny wynik IL-1ra wymaga potwierdzenia w większej liczbie próbie klinicznej.
Uwalniane z astrocytów podczas wczesnej fazy niedokrwienia cytokiny prozapalne przyczyniają się do załamania homeostazy glutaminianu i ekscytotoksyczności [9]. W warunkach fizjologicznych glutaminian jest transportowany do wnętrza astrocytów przez transportery aminokwasów pobudzających EAAT2 (GLT-1) i EAAT1 (GLST) [57]. W hodowlach astrocytów narażonych na hipoksję lub TNF-a stwierdzono obniżenie ekspresji transporterów glutaminianu w wyniku aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-kB [90]. Możliwe zatem, iż wzrost ekspresji transporterów, zwłaszcza EAAT2, może zapobiegać ekscytotoksyczności w udarze i chorobach neurodegeneracyjnych. Poszukiwania leków, które indukowałyby EAAT2 w astrocytach doprowadziły do odkrycia, iż właściwości takie wykazuje antybiotyk β-laktamowy – ceftriakson (CFX) [64]. W badaniu in vitro, CFX działał protekcyjne wobec kokultur neuronalno-astrocytarnych narażonych na OGD [64]. Znaczne ograniczenie strefy zawału obserwowano także in vivo po podawaniu CFX na 5 dni przed MCAO. Niestety, podanie CFX 0,5 godz. po MCAO nie redukowało obszaru uszkodzenia [25]. Brak działania protekcyjnego w takim schemacie doświadczalnym nie jest jednak zaskakujący, ponieważ ekscytotoksyczność jest jednym z pierwszych etapów kaskady niedokrwienia [25]. Z tego powodu nie jest możliwe by CFX znalazł zastosowanie kliniczne w leczeniu udaru, ale nie wyklucza jego potencjalnej skuteczności w innych schorzeniach OUN.
Białko S-100β
Jednym z mechanizmów, przez który astrocyty mogą prowadzić do śmierci neuronów po udarze niedokrwiennym mózgu jest uwalnianie białka S-100b. S-100 to rodzina białek wiążących wapń, syntetyzowanych w astrogleju we wszystkich częściach OUN [47]. Składa się z dwóch podjednostek a i b tworzących różne możliwości dimerycznych postaci: a-a, a-b, b-b [56]. Dimery b-b (S-100b) występują głównie w astrocytach [47]. W prawidłowych warunkach nie stwierdza się obecności tego białka we krwi. Natomiast w przypadku uszkodzenia OUN jest ono wydzielane do surowicy oraz CSF, co świadczy zarówno o uszkodzeniu komórek mózgu, jak i BBB [75]. W zawałach mózgu, z zakresu unaczynienia tętnicy środkowej mózgu, podwyższone stężenie S-100b w surowicy krwi i CSF występuje 24-96 godz. od wystąpienia objawów, a jego stężenie koreluje z rozległością strefy zawałowej i może wskazywać na niepomyślne rokowanie dotyczące przeżycia lub stopnia niepełnosprawności [36]. Patologiczny wpływ S-100b jest najprawdopodobniej skutkiem aktywacji iNOS oraz wzrostu uwalniania NO z astrocytów [47]. Ponadto S-100b nasila odpowiedź prozapalną przez aktywację mikrogleju oraz astrocytów i zaangażowanie w ten mechanizm czynnika transkrypcyjnego NF-κB [58].
Wyniki prac klinicznych wskazujących, iż stężenie białka S-100b w surowicy krwi jest dobrym wskaźnikiem biologicznym stopnia uszkodzenia mózgu, stanowiły podstawę do poszukiwania substancji neuroprotekcyjnych, które ograniczałyby aktywację astrocytów i ekspresję białka S-100b [36]. Zdolność blokowania ekspresji i wydzielania S-100b z astrocytów wykazuje kwas arundowy (arundic acid, AA; ONO-2506) [8]. Zmniejszenie stężenia S-100b w CSF szczurów obserwowano 24 godz. po podaniu AA bezpośrednio po MCAO. Podanie AA zmniejszało ponadto strefy zawału i poprawiało funkcjonowanie 7 dni od niedokrwienia [104]. Ponieważ szczyt wydzielania białka S-100b obserwuje się 24-72 godz. od udaru, można by oczekiwać, że AA zastosowany nawet kilka godzin od pojawienia się objawów będzie wykazywał działanie neuroprotekcyjne. To, iż podanie AA 24 godz. od udaru redukowało opóźnione poszerzenie strefy niedokrwienia sugeruje o wiele szersze okno terapeutyczne AA w porównaniu do większości innych neuroprotektantów [104]. Wyniki eksperymentów, zarówno in vitro, jak i in vivo, wskazują też na jego działanie plejotropowe związane z redukcją COX-2 i iNOS (niezależną od S-100b), nasileniem syntezy GSH oraz wzrostem ekspresji transporterów glutaminianu EAAT-2 i EAAT-1 w reaktywnych astrocytach [8]. W przeprowadzonej próbie klinicznej po podaniu AA stwierdzono zmniejszenie stężenia białka S-100b w surowicy krwi chorych z zawałem mózgu [86]. Badanie bezpieczeństwa leku, przeprowadzone u chorych ze średnio ciężkim udarem mózgu po podaniu AA przez 7 dni w postaci 1-godzinnego wlewu dożylnego w zakresie dawek 2-12 mg/kg/godz., potwierdziło dobrą tolerancję i brak działań niepożądanych [86]. Mimo iż celem badania nie była ocena skuteczności AA, to jednak należy zaznaczyć, że tylko u pacjentów otrzymujących dawkę 8 mg/kg/godz. obserwowano korzystny wynik terapeutyczny. Z powodu braku skuteczności AA w udarze niedokrwiennym mózgu przerwano wieloośrodkową próbę kliniczną [86]. Obecnie AA jest testowany jako potencjalny lek w terapii innych schorzeń neurologicznych przebiegających z reaktywną astrogliozą, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (amyotrophic lateral sclerosis, ALS).
Tlenek azotu
Stres oksydacyjny, czyli zaburzenie równowagi między ciągłym wytwarzaniem RFT, a ich likwidacją w enzymatycznych i nieenzymatycznych reakcjach neutralizacji, pełni istotną rolę w patomechanizmie udaru mózgu [45]. Szkodliwe są zwłaszcza: anionorodnik ponadtlenkowy (O2 – ·), nadtlenek wodoru (H2 O2 ) oraz rodnik hydroksylowy (OH·) [45]. RFT uznano za czynniki sprawcze śmierci komórkowej w wyniku nekrozy lub apoptozy. Ze stresem oksydacyjnym jest ściśle zwią- zany stres nitrozylacyjny związany z powstawaniem reaktywnych form azotu (RFA). Do RFA zalicza się tlenek azotu (·NO) oraz jego pochodne powstałe w wyniku przemian metabolicznych: kation nitrozoniowy (NO+ ), anion nitroksylowy (NO- ) i nadtlenoazotyn (ONOO- ). NO jest wytwarzany w OUN z udziałem neuronalnej, endotelialnej i indukowalnej NOS w wyniku konwersji argininy do cytruliny w obecności tlenu i NADPH jako kofaktorów [53]. Izoforma NOS1 (nNOS) występująca w neuronach oraz izoforma endotelialna (NOS3, eNOS) są enzymami konstytutywnymi regulowanymi przez kompleks Ca2+-kalmodulina pod wpływem czynników zwiększających stężenie Ca2+]i [53]. Izoforma trzecia NOS (NOS2, iNOS), zidentyfikowana w astrocytach i mikrogleju, stanowiąca źródło cytotoksycznych ilości NO, ulega indukcji pod wpływem cytokin prozapalnych (IL-1b, TNF-a, INF-g), a jej aktywność nie zależy od [Ca2+] i , lecz od związania kalmoduliny [28]. Cytokiny prozapalne aktywują czynniki transkrypcyjne STAT1, NF-kB i ich translokację do jądra komórkowego, gdzie wiążą się do odpowiedniego elementu promotora genu NOS2 [83]. RFT aktywują także bezpośrednio NF-kB i pobudzają ekspresję genu NOS2 w astrocytach [83]. mRNA dla NOS2 jest wykrywalny w mózgu 12-24 godz. po ischemii, osiąga szczyt pod koniec drugiej doby i powraca do wartości podstawowej po około 7 dniach [114]. W obrębie OUN, astrocyty mają największe wewnątrzkomórkowe stężenia prekursora NO· – L-argininy [5]. NO wytworzony w astrocytach podczas udaru z udziałem iNOS przechodzi swobodnie przez błony komórkowe i przyczynia się do opóźnionej śmierci neuronów. U myszy pozbawionych iNOS wykazano znacznie mniejsze uszkodzenie mózgu po ogniskowej ischemii, niż u zwierząt szczepu dzikiego [50]. Działanie toksyczne NO wynika ze zdolności do tworzenia ONOO – w reakcji z O2 – ·. Ten bardzo reaktywny utleniacz może powodować peroksydację lipidów, hamować enzymy mitochondrialne (kompleks I-IV łańcucha oddechowego) i mitochondrialną SOD oraz rozpad kwasów nukleinowych [50]. Uszkodzenie mitochondriów i DNA, spowodowane przez NO i peroksynitraty, aktywuje poli-ADP-rybozopolimerazę 1 (poly-ADP-ribose- -polymerase, PARP). W warunkach prawidłowych PARP ułatwia naprawę DNA i reguluje transkrypcję. Jednak nadmierna aktywacja enzymu podczas uszkodzenia ischemicznego prowadzi do utraty dinukleotydu nikotynoaminoadeninowego (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+ ) i ATP [34]. Ponadto NO bezpośrednio aktywuje MMP-9, łącząc w ten sposób sygnalizację MMP z dobrze poznanymi szlakami NO w udarze niedokrwiennym mózgu [28].
Astrocyty są w mózgu głównym źródłem erytropoetyny (EPO), endogennego hormonu glikoproteinowego o właściwościach neuroprotekcyjnych [72]. W warunkach hipoksji ekspresja EPO jest regulowana przez czynniki transkrypcyjne indukowane hipoksją (hypoxia inducible factor, HIF): HIF-1 i HIF-2 [72]. Receptory dla EPO (EpoR) wykryto zarówno na astrocytach, mikrogleju, neuronach, jak i komórkach śródbłonka naczyń mózgowych [72]. W parakrynnym mechanizmie działania neuroprotekcyjnego EPO uczestniczą trzy główne szlaki sygnalizacyjne: JAK2/STAT/Bcl-2 z indukcją cząsteczek antyapoptotycznych (Bcl-2 i Bcl-XL ) i hamowaniem cząsteczek proapoptotycznych (Bad), PI3K/Akt oraz NF-kB aktywowany za pośrednictwem JAK2 [107]. EPO powoduje także wzrost ekspresji MT, endogennego neuroprotektanta pochodzenia astrocytarnego (zob. niżej) oraz hamuje wytwarzanie czynników prozapalnych, tj. TNFa, IL-6 i MCP-1 [109]. Ponadto EPO wzmaga regenerację tkanki po udarze mózgu przez stymulację angiogenezy [21]. Protekcyjne działanie EPO wobec neuronów i astrocytów udowodniono wielokrotnie w eksperymentalnych modelach niedokrwienia mózgu, zarówno in vivo, jak i in vitro. Wykazano m.in., że EPO chroni neurony przed śmiercią indukowaną OGD i glutaminianem [92] oraz komórki prekursorowe oligodendrocytów narażone na hipoksję/reoksygenację [54]. Prawdopodobnie EPO odgrywa też ważną rolę w endogennym mechanizmie neuroprotekcyjnym hartowania ischemicznego. Także w zwierzęcym modelu niedokrwienia mózgu u noworodków stwierdzono, że EPO działa neuroprotekcyjnie, stymuluje neurogenezę i poprawia stan funkcjonalny [43]. Przegląd systematyczny z metaanalizą, którym objęto 19 badań z użyciem zwierzęcych modeli ogniskowego niedokrwienia mózgu potwierdził, że podanie EPO powoduje redukcję strefy obszaru niedokrwienia i poprawę funkcji neurobehawioralnych [51].
Obiecujące wyniki badań przedkliniczych stanowiły podstawę do przeprowadzenia prób klinicznych mających na celu ocenę bezpieczeństwa i skuteczności EPO w leczeniu udaru niedokrwiennego mózgu. Wyniki badań II fazy nie wskazywały na jakiekolwiek problemy związane z bezpieczeństwem stosowania i sugerowały skuteczność protekcyjną EPO w udarze [31]. Następnie przeprowadzono randomizowane badanie III fazy z podwójnie ślepą próbą i grupą kontrolną placebo, którym objęto 522 pacjentów. Chorym podawano rekombinowaną EPO (rEPO) do 6 godz. od pojawienia się pierwszych symptomów udaru we wlewie dożylnym (40 000 UI), a klinicznie oceniano po 60-90 dniach [32]. Nie potwierdzono lepszej skuteczności klinicznej EPO w porównaniu z placebo. Natomiast w grupie chorych otrzymujących EPO odnotowano wyższą śmiertelność w porównaniu do placebo. Negatywne rezultaty badań klinicznych rEPO mogą wynikać z problemu dostarczenia skutecznej dawki leku do obszaru o osłabionej perfuzji w krótkim czasie od dokonanego zawału mózgu. Wydaje się, iż zamiast bezpośredniego podawania rEPO bardziej korzystne byłoby zastosowanie małych cząsteczek, które indukowałyby endogenną EPO. Inhibitory propylo-4-hydroksylazy HIF są małymi cząsteczkami stabilizującymi białka, które powodują wzrost ekspresji HIF-1 i HIF-2 oraz genów od nich zależnych (VEGF, EPO, 21(WAF/cip1), enolazy) [95]. Zastosowanie różnych związków tej grupy (compound A, 3,4-DHB, DFO) przed MCAO wyraźnie zmniejszało strefy niedokrwienia, co czyni je potencjalnie atrakcyjnym podmiotem dalszych badań nad neuroprotekcją farmakologiczną.
Antyoksydanty
Sprawnie działający system detoksykacji RFT w astrocytach determinuje znaczną oporność tych komórek na ischemię oraz wskazuje na istotne znaczenie w procesach antyoksydacyjnych w mózgu. Astrocyty charakteryzują się dużym stężeniem GSH (1-20 mM) oraz znaczną aktywnością endogennych enzymów antyoksydacyjnych, tj.: katalazy, SOD, GPx i reduktazy glutationu [9]. Natomiast neurony są o wiele bardziej wrażliwe na uszkodzenie wolnorodnikowe niż astrocyty ze względu na niski poziom GSH (<1mM) i wysoką zawartość Fe2+ [9]. GSH, główny wewnątrzkomórkowy przeciwutleniacz, odgrywa znaczną rolę w bezpośrednim usuwaniu RFT w reakcji katalizowanej przez GPx. Usuwa także nadtlenki powstające podczas peroksydacji lipidów [11]. Do wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia GSH w astrocytach przyczynia się wytwarzana tam glutamina. Astrocyty wykazują także obecność swoistych antyoksydantów, tj. apolipoproteiną D i transferyną [79]. Wzrost ekspresji receptorów transferyny na astrocytach jest związany z transportem i mobilizacją nadmiaru żelaza z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, co ogranicza jego aktywność prooksydacyjną oraz peroksydację lipidów indukowaną przez RFT [79]. W astrocytach występuje także izoenzym oksydaza hemowa 1 (HO-1) warunkujący szybkość syntezy potencjalnych przeciwutleniaczy, tj. biliwerdyny czy bilirubiny [40]. W ostatnich latach uwagę badaczy zajmujących się reakcją gleju na niedokrwienie zwrócił enzym MT, który może działać jako donor grup tiolowych i wymiatacz RFT [62]. W ciałach komórek astrocytarnych stwierdzono obecność dwóch izoform MT, tj. MT-I i MT-II, niewykrywalnych w neuronach [101]. MT są wyraźnie indukowane w niedokrwieniu mózgu oraz wykazują właściwości neuroprotekcyjne zarówno in vitro, jak i in vivo [108]. Na silne antyoksydacyjne właściwości MT składa się bardzo wysoka stała szybkości reakcji z rodnikami hydroksylowymi (OH- ·) [93], większa efektywność w porównaniu z GSH jako środkiem chroniącym przed degradacją DNA wywołaną przez OH- · [94], zdolność tworzenia kompleksów żelazo – tiolowo – nitrozylowych, wtórnych do wydzielania żelaza przez MT [94] oraz reaktywność zarówno z kwasem nadtlenoazotowym ONOOH, jak i jego anionem (ONOO- ) [89]. Sugeruje się, że występująca w astrocytach MT może odgrywać ważną rolę w regulacji wewnątrzkomórkowego stężenia cynku, który jest niezbędny do aktywacji enzymów (tj. polimeraza DNA, fosfataza alkaliczna, dehydrogenaza glutaminianowa, karboksypeptydaza E), czynników transkrypcyjnych (tj. Sp1) i białka S-100β. Ponadto MT chroni wrażliwe grupy –SH na transporterach glutaminianu [113]. W astrocytach w udarze mózgu dochodzi również do indukcji tioredoksyny (TRX), niewielkiego wielofunkcyjnego białka o działaniu antyoksydacyjnym, które jest uważane za regulatora neuroprotekcji [74].
Mimo potwierdzonego udziału astrocytów w osłabieniu stresu oksydacyjnego w przebiegu udaru, w badaniach na hodowlach komórkowych i/lub zwierzętach doświadczalnych odnotowano skuteczność neuroprotekcyjną jedynie kilku substancji, których mechanizm działania oparty jest o specyficzne właściwości tych komórek. Stwierdzono m.in., że podanie kwasu dehydroaskorbinowego (dehydroascorbic acid, DHAA), utlenionej postaci kwasu askorbinowego (witaminy C) przenikającej BBB, zarówno przed, jak i po MCAO, zmniejsza objętość ogniska zawałowego [48]. DHAA jest pobierany przez astrocyty, redukowany do witaminy C i w tej postaci uwalniany, zapobiegając ich obrzmieniu i zmiatając wolne rodniki [48]. W warunkach in vitro wykazano, że anestetyk propofol (lipofilny antyoksydant) w dawkach terapeutycznych nasila akumulację kwasu askorbinowego w astrocytach narażonych na stres oksydacyjny i traktowanych DHAA [27]. Również witamina E (tokoferol) podana przed MCAO zmniejsza obję- tość ogniska zawałowego [76]. Wyniki zarówno badań in vitro, jak i in vivo, świadczą o właściwościach neuroprotekcyjnych ebselenu [2-phenyl-1,2-benzisoselenazol- -3(2H)-on), związku selenoorganicznego działającego przeciwzapalnie i przeciwutleniająco oraz naśladującego w astrocytach endogenną GPx [39]. Znacznym ograniczeniem zastosowania terapeutycznego ebselenu jest jednak skuteczność tylko w przypadku podania w krótkim czasie od udaru. Ebselen może natomiast korzystnie działać jednocześnie zastosowany z trombolizą, ponieważ istotnie zwiększa działanie neuroprotekcyjne małych dawek rtPA [59].
Adenozyna
Astrocyty odgrywają główną rolę w kontroli zewnątrzkomórkowego stężenia adenozyny, endogennego związku neuroprotekcyjnego [18]. Zewnątrzkomórkowe stężenie adenozyny w mózgu w warunkach normoksji jest małe mieszcząc się w zakresie 30-300 nM [84]. Podczas niedokrwienia, w związku z deficytem energetycznym oraz nasileniem uwalniania glutaminianu, pozakomórkowe stężenie adenozyny gwałtownie rośnie i wartości te mogą wzrastać ponad stukrotnie [84]. Zwiększone zewnątrzkomórkowe stężenie adenozyny podczas pierwszych 3 godz. ischemii ma znaczenie ochronne [84]. Działanie protekcyjne wynika z aktywacji receptorów adenozynowych (A1 , A2B i A3 ), a następstwem jest rozszerzenie naczyń krwionośnych, zahamowanie kana- łów wapniowych, zmniejszenie uwalniania glutaminianu oraz aktywacja presynaptycznych kanałów potasowych [84]. W modelu MCAO wykazano, że redukcja stężenia adenozyny na skutek nadekspresji głównego enzymu metabolizującego, kinazy adenozyny, a także zastosowanie antagonistów receptorów A1, powoduje wzrost strefy uszkodzenia [87].
Adenozyna jest tworzona zarówno wewnątrz-, jak i zewnątrzkomórkowo. We wnętrzu komórek jej źródłem jest AMP, które ulega hydrolizie z udziałem 5’-nukleotydaz, a następnie wytworzona adenozyna zostaje przetransportowana transporterami nukleotydów do synapsy. Natomiast pozakomórkowo, adenozyna powstaje z uwolnionego ATP w wyniku działania ekt-5’nukleotydazy i ekto-difosfohydrolazy trifosforanów nukleozydów (NTPDazy) [60]. Oprócz neuronów, źródłem zewnątrzkomórkowego ATP są też astrocyty. Sugeruje się, co najmniej trzy rodzaje mechanizmów uwalniania ATP z astrocytów. Dwa z nich, tj. liza komórek zachodząca w wyniku martwicy i zależna od Ca2+ fuzja pęcherzyków magazynujących z błoną plazmatyczną, są podobne jak w neuronach. W astrocytach stwierdzono obecność trzech białek: cellubrewiny, synaptobrewiny II i syntaksyny, które tworzą (podobnie jak w neuronach) podczas egzocytozy ATP tzw. kompleks wydzielniczy. Trzeci mechanizm oparty jest na działaniu hemikanałów umiejscowionych w błonie komórkowej zbudowanych z koneksyny 43 (connexin 43, Cx43), której ekspresja zachodzi wyłącznie w astrocytach [70]. ATP uwalniane z astrocytów przez Cx43 odgrywa znaczącą rolę w mechanizmie neuroprotekcyjnym hartowania ischemicznego [67].
W błonie komórkowej astrocytów dominują receptory A2B, które do aktywacji wymagają większych stężeń adenozyny niż receptory A2A. Prawdopodobnie to właśnie do ich pobudzenia dochodzi przede wszystkim podczas ischemii. Skutkiem jest wzrost stężenia cAMP przyczyniający się do zwiększonego rozpadu glikogenu w niedotlenionych astrocytach, wzrostu ekspresji czynnika neurotroficznego pochodzenia glejowego (glial-derived neurotrophic factor, GDNF) i osłabienia reakcji zapalnej [44]. Donoszono także o ochronnej roli astrocytarnych receptorów A3 przed skutkami niedokrwienia mózgu. W wyniku ich pobudzenia następuje aktywacja fosfolipazy C (PLC) i uruchomienie kaskady wtórnych przekaźników informacji. Uwolniony diacyloglicerol (DG) aktywuje kinazę białkową C (PKC), która przez fosforylację uczynnia enzymy przeciwutleniające, w tym SOD [87]. Zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo wykazano jednak, że podczas przedłużonego okresu ischemii (12-24 godz.) następuje desensetyzacja receptorów adenozynowych o 70-80% [63]. Niemniej jednak zdolność zarówno neuronów, jak i astrocytów do uwalniania oraz reagowania na ATP i adenozynę sugeruje, że są one autokrynnymi i parakrynnymi mediatorami protekcji w udarze niedokrwiennym mózgu [26].
Trombospondyna
Astrocyty wydzielają trombospondynę 1 i 2 (TSP1/2), glikoproteiny macierzy zewnątrzkomórkowej, modulujące fenotyp komórek i strukturę zrębu zewnątrz – komórkowego [1]. Po eksperymentalnie wywołanym udarze mózgu (MCAO) u myszy przez cztery tygodnie obserwowano znaczny wzrost ekspresji mRNA i białka TSP1/2 w astrocytach [68]. W uszkodzonym mózgu TSP1/2 nasilają synaptogenezę i stymulują odrost uszkodzonych neurytów [66]. U myszy z wyłączonymi genami dla TSP1/2 (TSP1/2 KO) po miesiącu od MCAO stwierdzono znacznie mniejszą gęstość synaps oraz słabszą poprawę funkcji motorycznych, w porównaniu do myszy szczepu dzikiego [66]. Mimo znanego antyangiogennego działania TSP u myszy TSP1/2 KO nie zaobserwowano różnic w angiogenezie przed i po MCAO [66]. Wydaje się zatem, iż strategie farmakologiczne, które prowadziłyby do nasilenia funkcji TSP1/2 mogłyby prawdopodobnie korzystnie wpływać na poprawę stanu funkcjonalnego po udarze mózgu.
VEGF iMMPs
W przebiegu niedokrwienia w neuronach, mikrogleju i astrocytach dochodzi do indukcji ekspresji VEGF pod wpływem czynnika transkrypcyjnego HIF-1. Wiele badań wskazuje, iż VEGF może wpływać zarówno niekorzystnie, jak i protekcyjnie, w zależności od fazy udaru, w której ulega ekspresji. W fazie ostrej, jak wspomniano wyżej, VEGF zwiększa obszar uszkodzenia przez nasilenie obrzęku naczyniopochodnego na skutek wzrostu przepuszczalności BBB [116]. Jednak po kilku dniach od udaru dochodzi do zmiany funkcji VEGF na adaptacyjną. VEGF stymuluje wtedy angiogenezę, zapobiega opóźnionej śmierci neuronów, działa silne przeciwzapalnie i promuje neuroplastyczność, nasilając dodatkowo migrację i proliferację neuronalnych komórek prekursorowych [91]. Podobna zmiana funkcji dotyczy wydzielanych przez astrocyty MMPs, których wzrost aktywności proteolitycznej powoduje przebudowę i degradację składników macierzy zewnątrzkomórkowej [7]. W ostrej fazie, zwłaszcza MMP-9, zwiększa przepuszczalność BBB i obszar zawału. Potwierdzeniem są wyniki badań na zwierzęcych modelach niedokrwienia mózgu, w których wykazano, iż podanie w tym okresie inhibitorów MMP-9 (BB-1101, BB94) lub wyłączenie genu dla MMP-9 redukuje obszar uszkodzenia [7]. Niewątpliwą korzyścią płynącą z zahamowania MMP-9 w fazie ostrej zawału mózgu jest ograniczenie skutków toksycznych rtPA związanych z uszkodzeniem błony podstawnej naczyń krwionośnych: obrzęku, dezintegracji BBB lub krwotoku [2]. rtPA aktywuje MMP-9 zarówno na poziomie aktywacji proenzymu na skutek proteolizy zwanej cystein-switch, jak i na poziomie transkrypcji genu stymulowanej przez indukcję NF-κB, następującej po przyłączeniu rtPA do astrocytarnych receptorów LRP1 (low-density lipoprotein-receptor related protein) [2].
W fazie późnej, 7-14 dni po udarze, stwierdzono wzrost aktywności MMP-9 w astrocytach i neuronach. Ekspresja VEGF w tym okresie była natomiast ograniczona tylko do astrocytów strefy okołozawałowej [6]. W tym przedziale czasowym MMP-9 pochodzenia astrocytarnego odgrywa pośrednio rolę neuroprotekcyjną przez uwolnienie i aktywację VEGF [117]. Rozbieżności w profilu działania VEGF i MMP wskazują zatem, iż cząsteczki te uwalniane przez astrocyty mogą pełnić rolę patologiczną lub adaptacyjną, w zależności od fazy udaru, w której ulegają ekspresji.
Blizna glejowa
Po 7-10 dniach od udaru wokół ogniska zawałowego obserwuje się nasiloną proliferację reaktywnych astrocytów odgraniczających strefę martwicy od żywej tkanki i formowanie trwałej blizny glejowej [96]. Bliznę tworzą głównie astrocyty i wytwarzane przez nie proteoglikany – wielkocząsteczkowe składniki macierzy zewnątrzkomórkowej. Reaktywne astrocyty wydzielają proteoglikany zawierające glikozoaminoglikany, tj.: siarczany heparanu, dermatanu, ketaranu i chodroityny. Stanowią główną barierę dla odrastających aksonów, upośledzają regenerację neurytów i plastyczność synaptyczną [77]. Wyniki licznych prac doświadczalnych wskazują, iż ograniczenie astrogliozy w ischemii mózgu zazwyczaj koreluje z redukcją obszaru uszkodzenia. Zahamowanie proliferacji reaktywnych astrocytów przez podanie inhibitora kinaz zależnych od cyklin, melanotropiny a, kwasu kofeinowego lub cilostazolu zmniejszało strefę martwicy i osłabiało reaktywną gliozę [12]. Jednak należy zaznaczyć, że powstanie blizny glejowej jest ważne ze względu na jej funkcję anatomicznej i czynnościowej bariery wokół zawału, co zapobiega rozprzestrzenianiu się procesów zapalnych i powiększaniu obszaru martwicy [35].
Astrocyty jako potencjalna regeneracyjna terapia komórkowa w udarze mózgu
Wraz z postępem wiedzy na temat właściwości neuroprotekcyjnych astrocytów obserwuje się znaczny wzrost zainteresowania możliwościami ich wykorzystania w leczeniu udaru mózgu. Najwięcej nadziei budzą trzy eksperymentalne strategie regeneracyjne polegające na: (i) transplantacji mezenchymalnych komórek macierzystych (mesenchymal stem cells, MSC) izolowanych ze szpiku kostnego, które indukują in vivo wydzielanie z astrocytów substancji neuroprotekcyjnych; (ii) reprogramowanie endogennych astrocytów do neuronów oraz (iii) przeszczepienie astrocytów o zwiększonych właściwościach neuroprotekcyjnych na skutek manipulacji genetycznych.
MSC stanowią heterogenną populację mezenchymalnych komórek macierzystych i progenitorowych, w obrębie której znajdują się tzw. ukierunkowane tkankowo komórki macierzyste. Podczas zawału mózgu dochodzi do wzrostu gradientu stromalnego czynnika wzrostu 1 (stromal cell derived factor-1, SDF-1), będącego sygnałem przemieszczenia się MSC do miejsca uszkodzenia [65]. Liczne dane wskazują, iż mechanizm wzmagania procesów regeneracyjnych w mózgu przez MSC jest wynikiem nasilenia ekspresji i wydzielania z astrocytów czynników neurotroficznych (VEGF, BDNF, bFGF, GDNF) oraz zwiększenia wytwarzania endogennego tPA w tych komórkach [119].
Wyniki niedawno opublikowanych badań sugerują, iż astrocyty izolowane z mózgów noworodków szczurzych można z powodzeniem reprogramować do neuronów. Różnicowanie takie można przeprowadzić np. przez wymuszenie nadekspresji czynników transkrypcyjnych krytycznych dla procesu różnicowania w kierunku określonego fenotypu neuronów. Wykazano, że wymuszenie w astrocytach nadekspresji genu NEUROG2 powoduje ich różnicowanie do neuronów glutaminergicznych, genów Mash1 i DLX2 do fenotypu GABA-ergicznego, a ASCL1, LMX1B i NURR1 do neuronów dopaminergicznych [24]. Astrocyty w wyniku reprogramowania nie tylko nabierają charakterystycznych dla neuronów cech fenotypowych, ale także właściwości elektrofizjologicznych, takich jak: pobudliwość, zdolność do generowania potencjałów czynnościowych i tworzenia połączeń synaptycznych [24].
Korzystne wyniki w zakresie poprawy funkcjonalnej po eksperymentalnie wywołanym udarze mózgu u szczurów obserwowano także w wyniku transplantacji astrocytów o zwiększonych właściwościach neuroprotekcyjnych [51]. Nowy typ astrocytów (Olig2PC-Astros) otrzymano po dyferencjacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem czynnika transkrypcyjnego Olig2. U zwierząt, którym przeszczepiono Olig2PC-Astros obserwowano znacznie mniejszy obszar uszkodzenia, wyższy poziom BDNF oraz białek związanych ze wzrostem i przeżywalnością neuronów w porównaniu do grupy kontrolnej. Co niezwykle istotne z punktu widzenia bezpieczeństwa potencjalnej terapii, astrocyty Olig2PC-Astros nie powodują powstawania guzów, nie różnicują się w inne typy komórek i pozostają w miejscu wszczepienia [51].
Podsumowanie
W toku wieloletnich badań na znaczeniu zyskał pogląd o istotnej roli astrocytów w patomechanizmie udaru niedokrwiennego mózgu. O złożoności problemu niech świadczy liczba opisanych czynników biorących udział w tym procesie. Określenie zmian zachodzących w astrocytach w zawale mózgu może mieć w przyszłości aspekt praktyczny. Umożliwi bowiem stworzenie naukowych podstaw do opracowania nowoczesnych strategii terapeutycznych zapobiegania przez astrocyty opóźnionej, poischemicznej śmierci neuronów. W myśl tej koncepcji strategie takie powinny polegać na wzmocnieniu neuroprotekcyjnych właściwości astrocytów lub naśladowaniu działania endogennych substancji neuroprotekcyjnych pochodzenia astrocytarnego.
Przypisy
- 1. Adams J.C., Lawler J.: The thrombospondins. Int. J. Biochem. CellBiol., 2004; 36: 961-968
Google Scholar - 2. Adibhatla R.M., Hatcher J.F.: Tissue plasminogen activator (tPA)and matrix metalloproteinases in the pathogenesis of stroke: therapeuticstrategies. CNS Neurol. Disord. Drug Targets, 2008; 7: 243-253
Google Scholar - 3. Almeida A., Delgado-Esteban M., Bolaños J.P., Medina J.M.: Oxygenand glucose deprivation induces mitochondrial dysfunctionand oxidative stress in neurones but not in astrocytes in primaryculture. J. Neurochem., 2002; 81: 207-217
Google Scholar - 4. Aoki C., Kaneko T., Starr A., Pickel V.M.: Identification of mitochondrialand non-mitochondrial glutaminase within select neuronsand glia of rat forebrain by electron microscopic immunocytochemistry.J. Neurosci. Res., 1991; 28: 531-548
Google Scholar - 5. Aoki E., Semba R., Mikoshiba K., Kashiwamata S.: Predominantlocalization in glial cells of free L-arginine. Immunocytochemicalevidence. Brain Res., 1991; 547: 190-192
Google Scholar - 6. Argaw A.T., Asp L., Zhang J., Navrazhina K., Pham T., MarianiJ.N., Mahase S., Dutta D.J., Seto J., Kramer E.G., Ferrara N., SofroniewM.V., John G.R.: Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrierdisruption in CNS inflammatory disease. J. Clin. Invest., 2012;122: 2454-2468
Google Scholar - 7. Asahi M., Asahi K., Jung J.C., del Zoppo G.J., Fini M.E., Lo E.H.: Rolefor matrix metalloproteinase 9 after focal cerebral ischemia: effectsof gene knockout and enzyme inhibition with BB-94. J. Cereb. BloodFlow Metab., 2000; 20: 1681-1689
Google Scholar - 8. Asano T., Mori T., Shimoda T., Shinagawa R., Satoh S., Yada N.,Katsumata S., Matsuda S., Kagamiishi Y., Tateishi N.: Arundic acid (ONO-2506) ameliorates delayed ischemic brain damage by preventingastrocytic overproduction of S100B. Curr. Drug Targets CNS Neurol. Disord.,2005; 4: 127-142
Google Scholar - 9. Aschner M.: Astrocytic functions and physiological reactions to injury:the potential to induce and/or exacerbate neuronal dysfunction.A forum position paper. Neurotoxicology, 1998; 19: 7-18
Google Scholar - 10. Bakken I.J., White L.J., Unsgard G., Aasly J., Sonnenwald U.: [U-13C]glutamate metabolism in astrocytes during hypoglycemia and hypoxia.J. Neurosci. Res., 1998; 51: 636-645
Google Scholar - 11. Barker J.E., Heales S.J.R., Cassidy A., Bolanos J.P., Land J.M., ClarkJ.B.: Depletion of brain glutathione results in a decrease of glutathionereductase activity: an enzyme susceptible to oxidative damage. BrainRes., 1996; 716: 118-122
Google Scholar - 12. Barreto G., White R.E., Ouyang Y., Xu L., Giffard R.G.: Astrocytes:targets for neuroprotection in stroke. Cent. Nerv. Syst. Agents Med.Chem., 2011; 11: 164-173
Google Scholar - 13. Beneviste E.N.: Astrocyte-microglia interactions. W: Astrocytes:Pharmacology and Function, red.: Murphey S. Academic Press, SanDiego, 1993, 355-383
Google Scholar - 14. Benfenati V., Nicchia G.P., Svelto M., Rapisarda C., Frigeri A., FerroniS.: Functional down-regulation of volume-regulated anion channelsin AQP4 knockdown cultured rat cortical astrocytes. J. Neurochem.,2007; 100: 87-104
Google Scholar - 15. Berezowski V., Fukuda A.M., Cecchelli R., Badaut J.: Endothelial cellsand astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. Int. J. CellBiol., 2012; 2012: 176287
Google Scholar - 16. Bernardi P.: The permeability transition pore. Control points ofa cyclosporin A-sensitive mitochondrial channel involved in cell death.Biochim. Biophys. Acta, 1996; 1275: 5-9
Google Scholar - 17. Bhattacharya P., Pandey A.K., Paul S., Patnaik R., Yavagal D.R.: Aquaporin-4inhibition mediates piroxicam-induced neuroprotection againstfocal cerebral ischemia/reperfusion injury in rodents. PLoS One,2013; 8: e73481
Google Scholar - 18. Boison D., Chen J.F., Fredholm B.B.: Adenosine signaling and functionin glial cells. Cell Death Differ., 2010; 17: 1071-1082
Google Scholar - 19. Bourke R.S., Kimelberg H.K., Daze M., Church G.: Swelling and ionuptake in cat cerebrocortical slices: control by neurotransmitters andion transport mechanisms. Neurochem. Res., 1983; 8: 5-24
Google Scholar - 20. Bresgen N., Jaksch H., Bauer H.C., Eckl P., Krizbai I., Tempfer H.:Astrocytes are more resistant than cerebral endothelial cells towardgeno – and cytotoxicity mediated by short-term oxidative stress.J. Neurosci. Res., 2006; 84: 1821-1828
Google Scholar - 21. Brines M., Cerami A.: Erythropoietin-mediated tissue protection:reducing collateral damage from the primary injury response. J. Intern.Med., 2008; 264: 405-432
Google Scholar - 22. Cesar M., Hamprecht B.: Immunocytochemical examination ofneural rat and mouse primary cultures using monoclonal antibodiesraised against pyruvate carboxylase. J. Neurochem., 1995; 64: 2312-2318
Google Scholar - 23. Chen Y., Swanson R.A.: Astrocytes and brain injury. J. Cereb. BloodFlow Metab., 2003; 23: 137-149
Google Scholar - 24. Chouchane M., Costa M.R.: Cell therapy for stroke: use of local astrocytes.Front. Cell. Neurosci., 2012; 6: 49
Google Scholar - 25. Chu K., Lee S.T., Sinn D.I., Ko S.Y., Kim E.H., Kim J.M., Kim S.J., ParkD.K., Jung K.H., Song E.C., Lee S.K., Kim M., Roh J.K.: Pharmacologicalinduction of ischemic tolerance by glutamate transporter-1 (EAAT2)upregulation. Stroke, 2007; 38: 177-182
Google Scholar - 26. Cunha R.A.: Neuroprotection by adenosine in the brain: from A1 receptoractivation to A2A receptor blockade. Purinergic Signaling, 2005;1: 111-134
Google Scholar - 27. Daskalopoulos R., Korcok J., Tao L., Wilson J.X.: Accumulation of intracellularascorbate from dehydroascorbic acid by astrocytes is decreasedafter oxidative stress and restored by propofol. Glia, 2002; 39: 124-132
Google Scholar - 28. del Zoppo G.J.: The neurovascular unit, matrix proteases, and innateinflammation. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2010; 1207: 46-49
Google Scholar - 29. Dong Q.P., He J.Q., Chai Z.: Astrocytic Ca2+ waves mediate activationof extrasynaptic NMDA receptors in hippocampal neurons to aggravatebrain damage during ischemia. Neurobiol. Dis., 2013; 58: 68-75
Google Scholar - 30. Donnan G.A., Fisher M., Macleod M., Davis S.M.: Stroke. Lancet,2008; 371: 1612-1623
Google Scholar - 31. Ehrenreich H., Hasselblatt M., Dembowski C., Cepek L., Lewczuk P.,Stiefel M., Rustenbeck H.H., Breiter N., Jacob S., Knerlich F., Bohn M.,Poser W., Rüther E., Kochen M., Gefeller O., et al.: Erythropoietin therapyfor acute stroke is both safe and beneficial. Mol. Med., 2002; 8: 495-505
Google Scholar - 32. Ehrenreich H., Weissenborn K, Prange H, Schneider D, Weimar C,Wartenberg K, Schellinger PD, Bohn M, Becker H, Wegrzyn M, JähnigP, Herrmann M, Knauth M, Bähr M, Heide W, et al.: EPO Stroke TrialGroup. Recombinant human erythropoietin in the treatment of acuteischemic stroke. Stroke, 2009; 40: e647-e656
Google Scholar - 33. Emsley H.C., Smith C.J., Georgiou R.F., Vail A., Hopkins S.J., RothwellN.J., Tyrrell P.J.: Acute Stroke Investigators. A randomised phase II studyof interleukin-1 receptor antagonist in acute stroke patients. J. Neurol.Neurosurg. Psychiatry, 2005; 76: 1366-1372
Google Scholar - 34. Endres M., Wang Z.Q., Namura S., Waeber C., Moskowitz M.A.: Ischemicbrain injury is mediated by activation of poly (ADP-ribose) polymerase.J. Cereb. Blood Flow Metab., 1997; 17: 1143-1151
Google Scholar - 35. Faulkner J.R., Herrmann J.E., Woo M.J., Tansey K.E., Doan N.B., SofroniewM.V.: Reactive astrocytes protect tissue and preserve functionafter spinal cord injury. J. Neurosci., 2004; 24: 2143-2155
Google Scholar - 36. Foerch C., Singer O.C., Neumann-Haefelin T., du Mesnil de RochemontR., Steinmetz H., Sitzer M.: Evaluation of serum S100B as a surrogatemarker for long-term outcome and infarct volume in acute middlecerebral artery infarction. Arch. Neurol., 2005; 62: 1130-1134
Google Scholar - 37. Fogal B., Li J., Lobner D., McCullough L.D., Hewett S.J.: System xc –activity and astrocytes are necessary for interleukin-1β-mediated hypoxicneuronal injury. J. Neurosci., 2007; 27: 10094-10105
Google Scholar - 38. Fukuda A.M., Badaut J.: Aquaporin 4: a player in cerebral edema andneuroinflammation. J. Neuroinflammation, 2012; 9: 279
Google Scholar - 39. Gabryel B., Małecki A.: Ebselen attenuates oxidative stress in ischemicastrocytes depleted of glutathione. Comparison with glutathioneprecursors. Pharmacol. Rep., 2006; 58: 381-392
Google Scholar - 40. Galeffi F., Turner D.A.: Exploiting metabolic differences in gliomatherapy. Curr. Drug Discov. Technol., 2012; 9: 280-293
Google Scholar - 41. Giffard R.G., Swanson R.A.: Ischemia-induced programmed celldeath in astrocytes. Glia, 2005; 50: 299-306
Google Scholar - 42. Girvin A.M., Gordon K.B., Welsh C.J., Clipstone N.A., Miller S.D.: Differentialabilities of central nervous system resident endothelial cellsand astrocytes to serve as inducible antigen-presenting cells. Blood,2002; 99: 3692-3701
Google Scholar - 43. Gonzalez F.F., Abel R., Almli C.R., Mu D., Wendland M., Ferriero D.M.:Erythropoietin sustains cognitive function and brain volume after neonatalstroke. Dev. Neurosci., 2009; 31: 403-411
Google Scholar - 44. Grenz A., Homann D., Eltzschig H.K.: Extracellular adenosine: a safetysignal that dampens hypoxia-induced inflammation during ischemia.Antioxid. Redox Signal., 2011; 15: 2221-2234
Google Scholar - 45. Hall E.D.: Cerebral ischaemic, free radicals and antioxidant protection.Biochem. Soc. Trans., 1993; 21: 334-339
Google Scholar - 46. Hertz L., Xu J., Song D., Du T., Yan E., Peng L.: Brain glycogenolysis,adrenoceptors, pyruvate carboxylase, Na+,K+-ATPase and Marie E.Gibbs’ pioneering learning studies. Front. Integr. Neurosci., 2013; 7: 20
Google Scholar - 47. Hu J., Castets F., Guevara J.L., Van Eldik L.J.: S100β stimulates induciblenitric oxide synthase activity and mRNA levels in rat corticalastrocytes. J. Biol. Chem., 1996; 271: 2543-2547
Google Scholar - 48. Huang J., Agus D.B., Winfree C.J., Kiss S., Mack W.J., McTaggart R.A., Choudhri T.F., Kim L.J., Mocco J., Pinsky D.J., Fox W.D., Israel R.J., BoydT.A., Golde D.W., Connolly E.S.Jr.: Dehydroascorbic acid, a blood-brainbarrier transportable form of vitamin C, mediates potent cerebroprotectionin experimental stroke. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001; 98:11720-11724
Google Scholar - 49. Iadecola C., Alexander M.: Cerebral ischemia and inflammation.Curr. Opin. Neurol., 2001; 14: 89-94
Google Scholar - 50. Iadecola C., Zhang F., Casey R., Nagayama M., Ross M.E.: Delayedreduction of ischemic brain injury and neurological deficits in micelacking the inducible nitric oxide synthase gene. J. Neurosci.: 1997;17: 9157-9164
Google Scholar - 51. Jerndal M., Forsberg K., Sena E.S., Macleod M.R., O’Collins V.E., LindenT., Nilsson M., Howells D.W.: A systematic review and meta-analysisof erythropoietin in experimental stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab.,2010; 30: 961-968
Google Scholar - 52. Jiang P., Chen C., Wang R., Chechneva O.V., Chung S.H., Rao M.S.,Pleasure D.E., Liu Y., Zhang Q., Deng W.: hESC-derived Olig2+ progenitorsgenerate a subtype of astroglia with protective effects against ischaemicbrain injury. Nat. Commun., 2013; 4: 2196
Google Scholar - 53. Kader A., Frazzini V.I., Solomon R.A., Trifiletti R.R.: Nitric oxideproduction during focal cerebral ischemia in rats. Stroke, 1993; 24:1709-1716
Google Scholar - 54. Kato S., Aoyama M., Kakita H., Hida H., Kato I., Ito T., Goto T., HusseinM.H., Sawamoto K., Togari H., Asai K.: Endogenous erythropoietinfrom astrocyte protects the oligodendrocyte precursor cell againsthypoxic and reoxygenation injury. J. Neurosci. Res., 2011; 89: 1566-1574
Google Scholar - 55. Kim J.H., Lee Y.W., Park K.A., Lee W.T., Lee J.E.: Agmatine attenuatesbrain edema through reducing the expression of aquaporin-1 after cerebralischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 2010; 30: 943-949
Google Scholar - 56. Kokocińska D., Gruenpeter P., Jałowiecki P., Partyka R.,Wieczorek P.,Michalecki Ł., Chanek I., Jarząb J., Cierpka L.: The usefulness of assessingthe serum levels of S-100 protein in patients with ischemic stroke. ActaAngiol., 2005; 11: 105-113
Google Scholar - 57. Kreft M., Bak L.K., Waagepetersen H.S., Schousboe A.: Aspects ofastrocyte energy metabolism, amino acid neurotransmitter homoeostasisand metabolic compartmentation. ASN Neuro., 2012; 4, e00086
Google Scholar - 58. Lam A.G., Koppal T., Akama K.T., Guo L., Craft J.M., Samy B., SchavockyJ.P., Watterson D.M., Van Eldik L.J.: Mechanism of glial activationby S100B: involvement of the transcription factor NFκB. Neurobiol.Aging, 2001; 22: 765-772
Google Scholar - 59. Lapchak P.A., Zivin J.A.: Ebselen, a seleno-organic antioxidant, isneuroprotective after embolic strokes in rabbits: synergism with low–dose tissue plasminogen activator. Stroke, 2003; 34: 2013-2018
Google Scholar - 60. Latini S., Pedata F.: Adenosine in the central nervous system: releasemechanisms and extracellular concentrations. J. Neurochem.,2001; 79: 463-484
Google Scholar - 61. Lau A., Tymianski M.: Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.Pflugers Arch., 2010; 460: 525-542
Google Scholar - 62. Lazo J.S., Kondo Y., Dellapiazza D., Michalska A.E., Choo K.H., PittB.R.: Enhanced sensitivity to oxidative stress in cultured embryoniccells from transgenic mice deficient in metallothionein I and II genes.J. Biol. Chem., 1995; 270: 5506-5510
Google Scholar - 63. Lee K.S., Tetzlaff W., Kreutzberg G.W.: Rapid down regulation ofhippocampal adenosine receptors following brief anoxia. Brain Res.,1986; 380: 155-158
Google Scholar - 64. Lee S.G., Su Z.Z., Emdad L., Gupta P., Sarkar D., Borjabad A., VolskyD.J., Fisher P.B.: Mechanism of ceftriaxone induction of excitatory aminoacid transporter-2 expression and glutamate uptake in primary humanastrocytes. J. Biol. Chem., 2008; 283: 13116-13123
Google Scholar - 65. Li L., Jiang J.: Regulatory factors of mesenchymal stem cell migrationinto injured tissues and their signal transduction mechanisms.Front. Med., 2011; 5: 33-39
Google Scholar - 66. Liauw J., Hoang S., Choi M., Eroglu C., Choi M., Sun G.H., Percy M., Wildman-TobrinerB., Bliss T., Guzman R.G., Barres B.A., Steinberg G.K.: Thrombospondins 1 and 2 are necessary for synaptic plasticity and functionalrecovery after stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab., 2008; 28: 1722-1732
Google Scholar - 67. Lin J.H., Lou N., Kang N., Takano T., Hu F., Han X., Xu Q., Lovatt D.,Torres A., Willecke K., Yang J., Kang J., Nedergaard M.: A central role ofconnexin 43 in hypoxic preconditioning. J. Neurosci., 2008; 28: 681-695
Google Scholar - 68. Lin T.N., Kim G.M., Chen J.J., Cheung W.M., He Y.Y., Hsu C.Y.: Differentialregulation of thrombospondin-1 and thrombospondin-2 afterfocal cerebral ischemia/reperfusion. Stroke, 2003; 34: 177-186
Google Scholar - 69. Lively S., Moxon-Emre I., Schlichter L.C.: SC1/hevin and reactivegliosis after transient ischemic stroke in young and aged rats. J. Neuropathol.Exp. Neurol., 2011; 70: 913-929
Google Scholar - 70. Lukaszevicz A.C., Sampaïo N., Guégan C., Benchoua A., CouriaudC., Chevalier E., Sola B., Lacombe P., Onténiente B.: High sensitivity ofprotoplasmic cortical astroglia to focal ischemia. J. Cereb. Blood FlowMetab., 2002; 22: 289-298
Google Scholar - 71. Manley G.T., Fujimura M., Ma T., Noshita N., Filiz F., Bollen A.W.,Chan P., Verkman A.S.: Aquaporin-4 deletion in mice reduces brainedema after acute water intoxication and ischemic stroke. Nat. Med.,2000; 6: 159-163
Google Scholar - 72. Marti H.H.: Erythropoietin and the hypoxic brain. J. Exp. Biol., 2004;207: 3233-3242
Google Scholar - 73. Martin D.L.: Synthesis and release of neuroactive substances byglial cells. Glia, 1992; 5: 81-94
Google Scholar - 74. Masutani H., Bai J., Kim Y.C., Yodoi J.: Thioredoxin as a neurotrophiccofactor and an important regulator of neuroprotection. Mol. Neurobiol.,2004; 29: 229-242
Google Scholar - 75. Matsui T., Mori T., Tateishi N., Kagamiishi Y., Satoh S., Katsube N.,Morikawa E., Morimoto T., Ikuta F., Asano T.: Astrocytic activation anddelayed infarct expansion after permanent focal ischemia in rats. Part I:enhanced astrocytic synthesis of S-100β in the periinfarct area precedesdelayed infarct expansion. J. Cereb. Blood. Flow Metab 2002; 22: 711-722
Google Scholar - 76. Mishima K., Tanaka T., Pu F., Egashira N., Iwasaki K., Hidaka R.,Matsunaga K., Takata J., Karube Y., Fujiwara M.: Vitamin E isoformsα-tocotrienol and g-tocopherol prevent cerebral infarction in mice.Neurosci. Lett., 2003; 337: 56-60
Google Scholar - 77. Murphy T.H., Corbett D.: Plasticity during stroke recovery: fromsynapse to behaviour. Nat. Rev. Neurosci., 2009; 10: 861-872
Google Scholar - 78. Okuno K., Taya K., Marmarou C.R., Ozisik P., Fazzina G., KleindienstA., Gulsen S., Marmarou A.: The modulation of aquaporin-4 by usingPKC-activator (phorbol myristate acetate) and V1a receptor antagonist(SR49059) following middle cerebral artery occlusion/reperfusion inthe rat. Acta Neurochir. Suppl., 2008; 102: 431-436
Google Scholar - 79. Orita T., Akimura T., Nishizaki T., Kamiryo T., Ikeyama Y., Aoki H.,Ito H.: Transferrin receptors in injured brain. Acta Neuropathol., 1990;79: 686-688
Google Scholar - 80. Ou-Yang Y.B., Kristian T., Mellergard P., Siesjö B.K.: The influence ofpH on glutamate – and depolarization-induced increases of intracellularcalcium concentration in cortical neurones in primary culture. BrainRes., 1994; 646: 65-72
Google Scholar - 81. Panickar K.S., Norenberg M.D.: Astrocytes in cerebral ischemic injury:morphological and general considerations. Glia, 2005; 50: 287-298
Google Scholar - 82. Papadopoulos M.C., Verkman A.S.: Potential utility of aquaporinmodulators for therapy of brain disorders. Prog. Brain Res. 2008; 170:589-601
Google Scholar - 83. Park S.K., Lin H.L., Murphy S.: Nitric oxide regulates nitric oxidesynthase-2 gene expression by inhibiting NF-κB binding to DNA. Biochem.J., 1997; 322: 609-613
Google Scholar - 84. Pedata F., Melani A., Pugliese A.M., Coppi E., Cipriani S., Traini C.:The role of ATP and adenosine in the brain under normoxic and ischemicconditions. Purinergic Signal., 2007; 3: 299-310
Google Scholar - 85. Pelvig D.P., Pakkenberg H., Stark A.K., Pakkenberg B.: Neocortical glialcell numbers in human brains. Neurobiol. Aging, 2008; 29: 1754-1762
Google Scholar - 86. Pettigrew L.C., Kasner S.E., Albers G.W., Gorman M, Grotta JC, ShermanDG, Funakoshi Y, Ishibashi H.; Arundic Acid (ONO-2506) StrokeStudy Group: Safety and tolerability of arundic acid in acute ischemicstroke. J. Neurol. Sci., 2006; 251: 50-56
Google Scholar - 87. Pignataro G., Simon R.P., Boison D.: Transgenic overexpression ofadenosine kinase aggravates cell death in ischemia. J. Cereb. Blood FlowMetab., 2007; 27: 1-5
Google Scholar - 88. Prusiński A., Domżał T.M., Kozubski W., Szczudlik A.: Niedokrwienneudary mózgu. Wyd. alfa-medica Press, Bielsko-Biała 1999
Google Scholar - 89. Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A.: Peroxynitrite oxidationof sulphydryls. The cytotoxic potential of superoxide and nitricoxide. J. Biol. Chem., 1991; 266: 4244-4250
Google Scholar - 90. Rao V.L., Bowen K.K., Dempsey R.J.: Transient focal cerebral ischemiadown-regulates glutamate transporters GLT-1 and EAAC1 expressionin rat brain. Neurochem. Res., 2001; 26: 497-502
Google Scholar - 91. Ruiz de Almodovar C., Lambrechts D., Mazzone M., Carmeliet P.:Role and therapeutic potential of VEGF in the nervous system. Physiol.Rev., 2009; 89: 607-648
Google Scholar - 92. Ruscher K., Freyer D., Karsch M., Isaev N., Megow D., Sawitzki B.,Priller J., Dirnagl U., Meisel A.: Erythropoietin is a paracrine mediatorof ischemic tolerance in the brain: evidence from an in vitro model. J.Neurosci., 2002; 22: 10291-10301
Google Scholar - 93. Sato M., Bremner I.: Oxygen free radicals and metallothionein. FreeRadic. Biol. Med., 1993; 14: 325-337
Google Scholar - 94. Schwarz M.A., Lazo J.S., Yalowich J.C., Allen W.P., Whitmore M.,Bergonia H.A., Tzeng E., Billiar T.R., Robbins P.D., Lancaster J.R.: Metallothioneinprotects against the cytotoxic and DNA-damaging effects ofnitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995; 92: 4452-4456
Google Scholar - 95. Siddiq A., Ayoub I.A., Chavez J.C., Aminova L., Shah S., LaManna J.C.,Patton S.M., Connor J.R., Cherny R.A., Volitakis I., Bush A.I., LangsetmoI., Seeley T., Gunzler V., Ratan R.R.: Hypoxia-inducible factor prolyl4-hydroxylase inhibition. A target for neuroprotection in the centralnervous system. J. Biol. Chem., 2005; 280: 41732-41743
Google Scholar - 96. Sofroniew M.V., Vinters H.V.: Astrocytes: biology and pathology.Acta Neuropathol., 2010; 119: 7-35
Google Scholar - 97. Sohrabji F., Bake S., Lewis D.K.: Age-related changes in brain supportcells: implications for stroke severity. Neurochem. Int., 2013; 63: 291-301
Google Scholar - 98. Song Y., Gunnarson E.: Potassium dependent regulation of astrocytewater permeability is mediated by cAMP signaling. PLoS One, 2012;7: e34936
Google Scholar - 99. Stobart J.L., Anderson C.M.: Multifunctional role of astrocytes asgatekeepers of neuronal energy supply. Front. Cell. Neurosci., 2013; 7: 38
Google Scholar - 100. Sugawara T., Fujimura M., Noshita N., Kim G.W., Saito A., Hayashi T.,Narasimhan P., Maier C.M., Chan P.H.: Neuronal death/survival signalingpathways in cerebral ischemia. NeuroRx., 2004; 1: 17-25
Google Scholar - 101. Suzuki K., Nakajima K., Kawaharada U., Uehara K., Hara F., OtakiN., Kimura M., Tamura Y.: Metallothionein in the human brain. ActaHistochem. Cytochem., 1992; 25: 617-622
Google Scholar - 102. Sweeney M.I., Yager J.Y., Walz W., Juurlink B.H.: Cellular mechanismsinvolved in brain ischemia. Can. J. Physiol. Pharmacol., 1995;73: 1525-1535
Google Scholar - 103. Tanimura Y., Hiroaki Y., Fujiyoshi Y.: Acetazolamide reversibly inhibitswater conduction by aquaporin-4. J. Struct. Biol., 2009; 166: 16-21
Google Scholar - 104. Tateishi N., Mori T., Kagamiishi Y., Satoh S., Katsube N., MorikawaE., Morimoto T., Matsui T., Asano T.: Astrocytic activation and delayedinfarct expansion after permanent focal ischemia in rats. Part II: suppressionof astrocytic activation by a novel agent (R)-(-)-2-propyloctanoicacid (ONO-2506) leads to mitigation of delayed infarct expansionand early improvement of neurologic deficits. J. Cereb. Blood Flow Metab.,2002; 22: 723-734
Google Scholar - 105. Thrift A.G., Dewey H.M., Macdonell R.A., McNeil J.J., Donnan G.A.:Incidence of the major stroke subtypes: initial findings from the NorthEast Melbourne stroke incidence study (NEMESIS). Stroke, 2001; 32:1732-1738
Google Scholar - 106. Tombaugh G.C., Sapolsky R.M.: Evolving concepts about the role ofacidosis in ischemic neuropathology. J. Neurochem., 1993; 61: 793-803
Google Scholar - 107. Trendelenburg G, Dirnagl U.: Neuroprotective role of astrocytesin cerebral ischemia: focus on ischemic preconditioning. Glia, 2005;50: 307-320
Google Scholar - 108. Trendelenburg G., Prass K., Priller J., Kapinya K., Polley A., MuselmannC., Ruscher K., Kannbley U., Schmitt A.O., Castell S., Wiegand F.,Meisel A., Rosenthal A., Dirnagl U.: Serial analysis of gene expressionidentifies metallothionein-II as major neuroprotective gene in mousefocal cerebral ischemia. J. Neurosci., 2002; 22: 5879-5888
Google Scholar - 109. Vahedi K., Hofmeijer J., Juettler E., Vicaut E., George B., Algra A.,Amelink G.J., Schmiedeck P., Schwab S., Rothwell P.M., Bousser M.G., vander Worp H.B., Hacke W., DECIMAL, DESTINY, and HAMLET investigators:Early decompressive surgery in malignant infarction of the middlecerebral artery: a pooled analysis of three randomised controlled trials.Lancet Neurol., 2007; 6: 215-222
Google Scholar - 110. Villa P., Bigini P., Mennini T., Agnello D., Laragione T., Cagnotto A.,Viviani B., Marinovich M., Cerami A., Coleman T.R., Brines M., GhezziP.: Erythropoietin selectively attenuates cytokine production and inflammationin cerebral ischemia by targeting neuronal apoptosis. J.Exp. Med., 2003; 198: 971-975
Google Scholar - 111. Walz W., Klimaszewski A., Paterson I.A.: Glial swelling in ischemia:a hypothesis. Dev. Neurosci., 1993; 15: 216-225
Google Scholar - 112. Xu L., Sapolsky R.M., Giffard R.G.: Differential sensitivity of murineastrocytes and neurons from different brain regions to injury. Exp.Neurol., 2001; 169: 416-424
Google Scholar - 113. Young J.K., Garvey J.S., Huang P.C.: Glial immunoreactivity formetallothionein in the rat brain. Glia, 1994; 4: 602-610
Google Scholar - 114. Zhang Q., Chen C., Lu J., Xie M., Pan D., Luo X., Yu Z., Dong Q.,Wang W.: Cell cycle inhibition attenuates microglial proliferation andproduction of IL-1β, MIP-1α, and NO after focal cerebral ischemia in therat. Glia, 2009; 57: 908-920
Google Scholar - 115. Zhang Y., Jin Y., Behr M.J., Feustel P.J., Morrison J.P., Kimelberg H.K.:Behavioral and histological neuroprotection by tamoxifen after reversiblefocal cerebral ischemia. Exp. Neurol. 2005; 196: 41-46
Google Scholar - 116. Zhang Z.G., Zhang L., Jiang Q., Zhang R., Davies K., Powers C., BruggenN., Chopp M.: VEGF enhances angiogenesis and promotes blood-brainbarrier leakage in the ischemic brain. J. Clin. Invest., 2000; 106: 829-838
Google Scholar - 117. Zhao B.Q., Wang S., Kim H.Y., Storrie H., Rosen B.R., Mooney D.J.,Wang X., Lo E.H.: Role of matrix metalloproteinases in delayed corticalresponses after stroke. Nat. Med., 2006; 12: 441-445
Google Scholar - 118. Zhao G., Flavin M.P.: Differential sensitivity of rat hippocampaland cortical astrocytes to oxygen-glucose deprivation injury. Neurosci.Lett., 2000; 285: 177-180
Google Scholar - 119. Zhao Y., Rempe D.A.: Targeting astrocytes for stroke therapy. Neurotherapeutics,2010; 7: 439-451
Google Scholar - 120. Zheng Y.Y., Lan Y.P., Tang H.F., Zhu S.M.: Propofol pretreatmentattenuates aquaporin-4 over-expression and alleviates cerebral edemaafter transient focal brain ischemia reperfusion in rats. Anesth. Analg.,2008; 107: 2009-2016
Google Scholar