Abstrakt

Białka szoku cieplnego (heat shock proteins, HSPs) wykazują silny konserwatyzm oraz wysokązgodność sekwencji, są szeroko rozpowszechnione w naturze, identyfikowane zarówno u Procaryota,jak i Eucaryota. Wśród białek szoku cieplnego wyróżnia się dziesięć rodzin, w tym HSP60,których główną funkcją jest fałdowanie nowo syntetyzowanych łańcuchów polipeptydowychoraz zapobieganie ich agregacji. W wielu pracach wykazano, że białka te są eksponowane napowierzchni komórek, a w przypadku bakterii ekspozycja ma charakter ciągły i wzrasta intensywniew wyniku działania na nie bodźców stresowych. Udowodniono również, że są oneważnym składnikiem biofilmu. W środowisku zewnątrzkomórkowym białka rodziny HSP60same lub w połączeniu z białkami własnymi organizmu lub drobnoustrojów mogą stanowićłącznik między poszczególnymi elementami układu immunologicznego, wpływając na jegoaktywność. Proteiny te oddziałują na układ immunologiczny w postaci antygenu, nośnikainnych cząstek oraz ligandu dla określonych receptorów, prowadząc do pobudzenia zarównoelementów komórkowych układu odporności wrodzonej (makrofagów, monocytów, komórekdendrytycznych), jak i nabytej (limfocytów T regulatorowych, naiwnych, efektorowych orazlimfocytów B). Ponieważ HSP są jednym z dominujących, silnie immunogennych antygenówbakteryjnych oraz grzybiczych identyfikowanych podczas zakażeń, istnieją przesłanki, bystosować je jako składniki szczepionek lub ze względu na ich właściwości jako nośniki innychantygenów.

Charakterystyka ogólna białek szoku cieplnego

HSPs (heat shock proteins) zwane białkami szoku cieplnego to konserwatywne, szeroko rozpowszechnione w środowisku proteiny, identyfikowane zarówno u Procaryota, jak i Eucaryota. Uważa się, że sięgające nawet 50% podobieństwo sekwencji między izolowanymi od ssaków i bakterii białek HSP jest jednym z największych w całej biosferze [28,50,120]. Komórki Procaryota i  Eucaryota syntetyzują białka szoku cieplnego w sposób konstytutywny (niektóre HSP60, HSP90), w wyniku pojawienia się warunków stresowych (HSP70 i HSP27) [76], w tym środowiskowych (promieniowanie UV, metale ciężkie), patologicznych (infekcje, guzy złośliwe) oraz fizjologicznych (czynniki wzrostu, proces różnicowania komórek) [64].

Niezwykłą cechą HSP jest ich zdolność do oddziaływania z wieloma białkami, co odróżnia je od większości protein wewnątrzkomórkowych wchodzących w interakcje zwykle z jedną lub niewielką liczbą partnerów, co przyczynia się do plejotropowej aktywności białek HSP [61]. Główna rola białek szoku cieplnego obejmuje udział w prawidłowym fałdowaniu oraz translokacji protein, a także tworzeniu i  niszczeniu kompleksów białkowych [28]. Udowodniono również, że białka te biorą udział w pobudzeniu układu immunologicznego, w przebiegu programowanej śmierci komórki (działanie proapoptotyczne), ochronie DNA oraz premRNA przed degradacją i uszkodzeniem (działanie antyapoptotyczne) [43,75,83,99]. Jednocześnie mogą się przyczyniać do rozwoju schorzeń na tle autoimmunologicznym, np. reumatoidalnego zapalenia stawów [55], łuszczycy [88], arteriosklerozy, [107], periodontitis [98] czy choroby Behceta [55,63,98]. Istnieją również dowody, że HSP należą do antygenów chroniących komórki przed rozwojem nowotworów z uwzględnieniem różnych modeli guzów [97].

Obecnie są różne propozycje podziału białek szoku cieplnego, m.in. na podstawie jednocześnie pełnionych funkcji oraz ich masy cząsteczkowej. Według Bolhassani i Rafati wśród tej grupy protein wyróżniono dziesięć rodzin w tym: HSP40, 60, 70, 90, 110, niskocząsteczkowe HSP określane mianem sHSP (small HSP), HSP10, HSP95, GRP170 oraz kalretikuliny [10]. Nazwy rodzin białek szoku cieplnego pisane są dużymi literami, np. HSP60, natomiast proteiny należące do poszczególnych rodzin w sposób konwencjonalny, jak nazwy własne, np. Hsp60 [54].

Regulacja transkrypcji genów kodujących H

Biosynteza HSP jest regulowana przez czynniki transkrypcyjne znane jako HSFs (heat-shock factors), które rozpoznają swoiste fragmenty DNA, tzw. HSEs (heat- -shock elements) złożone z wielokrotnych przylegają- cych do siebie powtórzeń pentamerowych sekwencji 5’nGAAn3’ umiejscowionych w  obszarze promotorowym docelowych genów [7,106]. Po związaniu czynnika transkrypcyjnego do HSEs możliwe jest przyłączenie się kompleksu polimerazy II do wybranego genu kodującego HSP i rozpoczęcie procesu transkrypcji. U większo- ści kręgowców oraz roślin identyfikuje się cztery różne czynniki HSF (HSF1-4).

W warunkach stresowych, przy wzroście niestabilności nowo syntetyzowanych polipeptydów, dochodzi do aktywacji czynnika HSF1, obecnego w cytoplazmie w postaci monomerycznych cząsteczek, niezdolnych do wiązania DNA. Aktywność transkrypcyjna HSF1 w  warunkach fizjologicznych znajduje się pod ścisłą kontrolą tworzonych przez monomer HSF1 oraz białka HSP90 i/ lub Hsp70, Hsp40 heterokompleksów (ryc. 1). W przypadku kompleksu tworzonego przez białko Hsp70 oraz HSF regulacja ekspresji genów HSP polega na wiązaniu transaktywnej domeny czynnika transkrypcyjnego. Interakcje te nie mają wpływu na zdolność wiązania przez czynnik HSF1 cząsteczki DNA, jak również zależnej od warunków stresowych fosforylacji, uniemożliwiają jednak aktywację procesu transkrypcji. Inhibicja czynnika transkrypcyjnego prowadząca do hamowania powinowactwa HSF1 do nici DNA jest możliwa przez oddziaływanie cząsteczek HSBP1 (heat shock protein binding factor 1) z aktywną trimeryczną postacią HSF1/ Hsp70. Proces oddysocjowania czynnika transkrypcyjnego od heterokompleksu (HSF/Hsp90/Hsp70/Hsp40) w warunkach stresowych, prowadzący do jego aktywacji, nie został jeszcze wyjaśniony [7,56,78,79]. Wiadomo jednak, że do pełnej aktywacji czynnika HSF1 niezbędny jest proces jego trymeryzacji oraz modyfikacji polegają- cej na jego sumolacji i hiperfosforylacji (ryc. 1). Proces trimeryzacji zachodzi w cytoplazmie komórki, natomiast proces fosforylacji wydaje się bardziej skomplikowanym i może się odbywać zarówno w cytoplazmie, jak i jądrze komórkowym. Aktywacja czynników transkrypcyjnych HSF polega na ich hiperfosforylacji przeprowadzanej przez białka należące do podrodziny kinaz MAPK (kinaz białkowych aktywowanych mitogenem), takich jak ERK1, JNK/SAPK, kinazy białkowej p38 [56,78]. Miejsca konstytutywnej fosforylacji czynnika HSF1 obejmujące Ser303, Ser307, Ser363 odgrywają istotną rolę w represji aktywności transkrypcyjnej HSF1, podczas gdy miejsca indukowanej fosforylacji, takie jak Ser230, Ser326, Ser419 promują jego aktywność. Regulacja ekspresji HSP zależy więc z dużym prawdopodobieństwem od równowagi aktywności kinaz i fosfataz oddziałujących z HSF1 [56,106]. Częściowo ufosforylowany trimer, zbudowany z podjednostek HSF1, ulega translokacji do jądra komórkowego, gdzie po jego hiperfosforylacji indukuje transkrypcję różnych genów HSP, w tym Hsp70 oraz Hsp90. Wzrastający poziom tych chaperonów może następnie wywołać inaktywację HSF1 przez wiązanie jego formy monomerycznej oraz trimerycznej [78,79,80]. Wraz ze starzeniem się komórek coraz więcej monomerycznych form HSF1 jest identyfikowanych we frakcji jądrowej, a komórki takie poddane szokowi cieplnemu znacznie rzadziej w porównaniu do komórek młodych tworzą trimeryczne formy HSF1. Sugeruje się, że zmiany te przyczyniają się do osłabienia aktywności białek szoku cieplnego w przypadku starzenia się komórek [54].

Białka szoku cieplnego o masie 60kDa jako molekularne chaperony

Komórki izolowane od ssaków są zdolne do ekspresji około 10 000 różnych białek. Syntetyzowane z udziałem rybosomów peptydy mogą być zbudowane nawet z kilku tysięcy aminokwasów. Aby polipeptydowe łańcuchy mogły w sposób prawidłowy funkcjonować w organizmie, muszą ulec procesowi fałdowania i przyjąć postać natywną białka [4]. Powstałe, natywne białko w  celu zachowania funkcjonalności musi utrzymać swoją konformację w środowisku fizjologicznym, natomiast przyjęta struktura musi być w minimalnym stopniu korzystna termodynamicznie. Jak dowiodły badania dotyczące eksperymentalnego fałdowania białek w warunkach in vitro, sekwencja aminokwasowa kodowana przez DNA zawiera wszystkie niezbędne informacje dotyczące jego trzeciorzędowej struktury [21]. Należy podkreślić, że proces fałdowania polipeptydowych łańcuchów w komórce najczęściej nie jest procesem spontanicznym i w przypadku wielu protein wymaga obecności molekularnych chaperonów oraz nakładu energii [48]. Białka opiekuńcze chronią łańcuchy peptydowe przed nieprawidłowym fałdowaniem, nie dostarczają jednak żadnej informacji dotyczącej konformacji przyjmowanej w  zachodzącym z ich udziałem procesie [50]. Oprócz kontroli procesu zwijania łańcuchów polipeptydowych chaperony mogą również zapobiegać ich agregacji. Zachodzący proces agregacji nieodwracalnie usuwa białka ze ścieżki fałdowania, co w szczególnych warunkach może prowadzić do tworzenia się fibrylarnych struktur zwanych amyloidami, których obecność może się przyczyniać do rozwoju choroby Alzheimera oraz Huntingtona [85]. Niewątpliwie więc kontrolowanie jakości powstałych protein oraz utrzymanie homeostazy proteomu wydaje się podstawowe dla prawidłowego funkcjonowania komórki oraz całego organizmu. Jest to możliwe dzięki istniejącej w komórce zintegrowanej sieci kilkuset białek, takich jak molekularne chaperony i ich białka regulatorowe, system ubikwityna – proteasom UPS (ubiquitin – proteasome system) oraz procesowi autofagocytozy [49].

Na szczególną uwagę, wśród zaangażowanych w procesy utrzymania homeostazy proteomu rodzin białek szoku cieplnego, zasługują: sHSP, α-krystaliny, HSP40, HSP60, HSP70, HSP90, HSP100 oraz kalretikulina [28,49]. Większość z wymienionych chaperonów wchodzi w interakcje z peptydami przez rozpoznanie reszt hydrofobowych i/lub nieustrukturyzowanych fragmentów szkieletowych substratu [50]. Sposób oddziaływania chaperonów oraz ich udział w procesie fałdowania będzie omówiony na przykładzie białek szoku cieplnego o masie 60 kDa.

Chaperony należące do tej rodziny to duże kompleksy zbudowane z dwóch pierścieni (double-rings complex) ~ 800-900 kDa, które łączą się w sposób umożliwiający utworzenie wewnętrznego kanału. Wśród nich wyróżnia się dwie grupy. Grupa I, znana jako Hsp60s u Eucaryota oraz GroEL u Procaryota, jest identyfikowana wyłącznie u eubakterii oraz w organellach pochodzenia endosymbiotycznego, takich jak mitochondria i  chloroplasty. Białka te kooperują z kofaktorami, do których należą Hsp10 u Eucaryota oraz GroES u Procaryota. Grupę II identyfikuje się u  archeonów oraz w  cytosolu Eucaryota, gdzie są znane jako TRiC (TCP-1 Ring Complex) lub CCT (chaperonin containing the T-complex polypeptide-1). Białka te w przeciwieństwie do grupy I funkcjonują niezależnie od kofaktorów [28,49,50].

Chaperonowy system GroEL-GroES u  Escherichia coli należy do najdokładniej opisanych spośród wszystkich układów związanych z białkami szoku cieplnego [28]. Jak wykazały badania GroEL ma zdolność do oddziaływania z  ponad 250 różnymi białkami cytoplazmatycznymi. Rozmiar większości z nich mieści się w przedziale 20-50 kDa, a ich budowa obejmuje domeny α/β lub α+β [32]. GroEL tworzą dwa heptametryczne pierścienie cis i trans zbudowane z  siedmiu podjednostek o  masie 57 kDa każda. Pierścienie łączą się ze sobą w układzie zwanym back-to-back, czyli tymi samymi fragmentami łańcuchów. Każdy z pierścieni jest zbudowany z trzech domen: apikalnej, pośredniej oraz ekwatorialnej. Domena apikalna GroEL wspomaga proces otwierania cylindra oraz eksponuje do wnętrza kanału hydrofobowe reszty aminokwasowe umożliwiając wiązanie substratu wewnątrz pierścieni. Domena pośrednia łączy się zawiasowo z domeną apikalną i jest wysunięta na zewnątrz pierścienia, natomiast domena ekwatorialna ma aktywność ATP-azy i  stabilizuje strukturę kanału. Hydrofobowa powierzchnia eksponowana przez domenę apikalną obu pierścieni wiąże hydrofobowe reszty aminokwasowe substratu, który zostaje umieszczony w  elastycznym rowku między dwiema amfipatycznymi helisami tej domeny. Aby mógł zajść proces fałdowania peptydu niezbędna jest obecność energii w postaci ATP oraz białka GroES. GroES to homoheptameryczny pierścień złożony z podjednostek o masie ~10 kDa, który może się cyklicznie przyłączać i odłączać od GroEL, w procesie zależnym od ATP. Podjednostki GroES zawierają w swej sekwencji mobilne/ruchome pętle, które oddziałują z  miejscem wiążącym substrat w domenie apikalnej, a także pośredniczą w procesie dysocjacji substratu. Przyłączenie białka GroES do GroEL prowadzi do istotnych zmian konformacyjnych w jego strukturze, co umożliwia formowanie klatki z silnie hydrofilową, naładowaną ujemnie powierzchnią ścian kanału i jednocześnie znacznie zwiększa jego wewnętrzną powierzchnię [49,50].

Według modelu klatki Anafiksena proces fałdowania polipeptydu rozpoczyna się od jego przyłączenia do wolnej domeny apikalnej GroEL-GroES, czyli do pierścienia trans. Zakłada się, że kompleks GroEL-GroES może przyjmować postać symetryczną oraz niesymetryczną. W  przypadku kompleksu asymetrycznego pierścień GroEL, który przyłączył białko GroES jest nazywany pierścieniem cis, natomiast drugi, czyli dystalny, pierścieniem trans (ryc. 2). Bezpośrednio po związaniu substratu następuje przyłączenie cząsteczki GroES oraz siedmiu cząsteczek ATP przez białko GroEL, co skutkuje przesunięciem substratu do wnętrza kanału. Jednocześnie obserwuje się oddysocjowanie siedmiu cząsteczek ADP oraz GroES od istniejącego przed związaniem substratu kompleksu cis. Proces fałdowania trwa około 10 s i jest to czas niezbędny do hydrolizy ATP przez pierścień wiążący substrat, nazywany teraz pierścieniem cis. Hydroliza ATP osłabia wiązanie między GroEL a GroES z jednoczesnym wiązaniem siedmiu nowych cząsteczek ATP przez drugi z pierścieni – trans. Przyłączenie cząsteczek ATP oraz GroES przez pierścień trans powoduje otwarcie „klatki” (powstałej w obrębie pierścienia cis). Substrat opuszcza klatkę po oddysocjowaniu GroES od pierścienia cis, na skutek allosterycznych zmian zachodzących przez związanie ATP przez pierścień trans. W procesie tym są uwolnione polipeptydy, które uzyskały postać natywną i te, które nie uległy procesowi fałdowania (ryc. 2). Substrat, który nie uległ jeszcze pełnemu procesowi fałdowania może być natychmiast powtórnie wiązany przez GroEL [28,49,50].

Do drugiej grupy białek HSP60 należy kompleks TCP-1 (T-complex polypeptide-1) identyfikowany w  cytosolu Eucaryota. Jest to heterooligomeryczny kompleks o masie 970 kDa zbudowany z różnorodnych podjednostek o masach 52-65 kDa. Podjednostki te tworzą pierścienie ułożone w  strukturę przypominającą białko GroEL [31]. W warunkach in vitro białko funkcjonuje niezależnie od kofaktorów, a jego domeny apikalne zawierają w swej strukturze α-helikalny segment w kształcie palca, który tworzy swoiste wieczko funkcjonujące analogicznie jak GroES. Fragment ten umożliwia enkapsulację białka przez zamykanie oraz otwieranie w procesie zależnym od ATP wejścia do kanału tworzonego przez pierścienie, podobnie jak w  kompleksie GroEL-GroES [22]. Najprawdopodobniej reakcja fałdowania białek z udziałem TRiC jest znacznie wolniejsza w porównaniu z kompleksem GroEL-GroES [92]. Białko to bierze udział w fałdowaniu wielu protein cytoplazmatycznych, zakłada się, że oddziałuje z około 10% nowo syntetyzowanych białek cytosolowych, w tym z aktyną i tubuliną [69].

Aktywacja komórek układu odporności nieswoistej przez białka HSP60

W  środowisku zewnątrzkomórkowym białka HSP60 samodzielnie lub w  połączeniu z  białkami własnymi organizmu lub drobnoustrojów mogą stanowić łącznik między poszczególnymi elementami układu immunologicznego, wpływając na jego aktywność. Proteiny te oddziałują na układ immunologiczny w zróżnicowany sposób, w tym jako antygen własny, antygen obcy, nośnik innych cząsteczek oraz ligand określonych receptorów [83]. Od wielu lat trwają badania dotyczące wpływu preparatów Hsp60 pochodzących z różnych źródeł, w tym oczyszczonych bezpośrednio z  preparatów bakteryjnych, uzyskiwanych od ssaków oraz ich rekombinowanych odpowiedników, na aktywację systemu odporności nieswoistej. Wiele doniesień wskazuje na potencjalną zdolność HSP60 do aktywacji komórek wrodzonego układu immunologicznego, takich jak makrofagi, monocyty czy komórki dendrytyczne (DCs) [15,43,46,62,93]. W  badaniach dotyczących stymulacji makrofagów otrzewnowych (uzyskanych od myszy szczepu BALB/c) białkiem Hsp60 pochodzenia bakteryjnego (Legionella pneumophila Hsp60: Lp-Hsp60, Escherichia coli Hsp60: Ec- -Hsp60, Mycobacterium leprae Hsp65: Ml-Hsp65, Mycobacterium bovis BCG Hsp65: Mb-Hsp65) wykazano wzrost ilości transkryptów mRNA dla IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF- α, GM-CSF oraz zwiększoną sekrecję IL-1β [93]. Stymulacja mysich makrofagowych linii komórkowych J774.1 i  RAW264.7 wybranymi rekombinowanymi białkami szoku cieplnego pochodzącymi od ssaków (hHsp60, mysie Hsp60: mHsp60, szczurze Hsp60: rtHsp60, chomicze Hsp60: hamHsp60) oraz bakterii (Chlamydia pneumoniae Hsp60: Chp-Hsp60; Mb-Hsp65, Ec-Hsp60) prowadziła zaś do sekrecji TNF-α w stopniu zależnym od zastosowanej dawki antygenu [46]. W przypadku hHsp60 maksymalny poziom wyrzutu cytokiny obserwowano po 24-godzinnej inkubacji [15].

Cytokinowa funkcja HSP w porównaniu z ich funkcją białek opiekuńczych wydaje się zjawiskiem unikatowym, gdyż nie wymaga wiązania z peptydami, hydrolizy ATP, kofaktorów ani tworzenia kompleksów białkowych, stąd pomysł nadania białkom HSP miana chaperokin, która odzwierciedliłaby ich dwojaką naturę [99]. Wpływ HSP60 pochodzących zarówno od ssaków, jak też bakterii na elementy układu odporności wrodzonej przedstawiono na ryc. 3.

Istnieją poważne obawy, że obserwowany wpływ HSP na komórki wrodzonego układu immunologicznego to raczej skutek zanieczyszczeń preparatów, a nie rezultat działania samego białka. Podejrzenia wzbudza to, że wszystkie białka szoku cieplnego o różnej masie cząsteczkowej i pełnionych w komórce funkcjach wywołują podobny efekt cytokinowy. Po drugie obserwowany wynik wydaje się bardzo podobny do tego wywoływanego przez wzorce molekularne  związane z  patogenami (PAMP), szczególnie LPS i bakteryjne lipoproteiny. Należy podkreślić, że obecnie większość stosowanych w doświadczeniach preparatów Hsp60 to białka rekombinowane wytworzone za pomocą ekspresyjnych szczepów Escherichia coli, w których obecność zanieczyszczeń pochodzenia bakteryjnego jest bardzo prawdopodobna. Po trzecie przypuszcza się, że komórka docelowa rozpoznaje HSP60 z udziałem receptorów TLR2 i/lub TLR4, które są głównymi receptorami rozpoznającymi LPS, a  nie jest prawdopodobne, by tak wyspecjalizowane receptory nie potrafiły w prawidłowy sposób rozróżnić od siebie tych dwóch cząsteczek [100].

W wielu próbach mających na celu zniesienie potencjalnego wpływu zanieczyszczeń preparatów HSP na komórki układu immunologicznego, przyjęto dwa kryteria: pierwsze – LPS jest oporny na inaktywację cieplną oraz drugie – skutek wpływu LPS może być wykluczony przez dodatek polimyksyny B (PmB) [15,62,93]. W innych przypadkach zastosowano przeciwciała anty-Hsp [16,116,117], proteinazę K [29,47] lub inhibitory LPS, takie jak lipid IVa [1], lipid A z Rhodopseudomonas spheroides [23] oraz maganin II amidu (C114H181N31O28S) [16]. Zaobserwowano, że oddziaływanie HSP zależy od temperatury, ponieważ białko to jest inaktywowane podczas ogrzewania (1h 95o C [93]; 10 min 100o C [47]; 20 min 100o C [19,62]), tracąc przez to właściwości stymulacyjne, podczas gdy w przypadku preparatów LPS efekt stymulacyjny jest proteazo- i temperaturowo niezależny [47]. Biologiczne działanie HSP nie jest hamowane lub częściowo znoszone przez polimyksynę B (PmB), podczas gdy stymulacja komórek LPS jest zjawiskiem PmB- -zależnym [15,47,62]. Oddziaływanie nie jest również ograniczane przez inne inhibitory LPS, lecz hamowane w obecności przeciwciał anty-Hsp. Doniesienia te mogą być dowodem, że działanie cytokinowe jest bezpośrednio zależne od białek szoku cieplnego. Wallin i  wsp. wskazali, że wysoce oczyszczone preparaty Hsp70 uzyskane z mysiej wątroby nie stymulują mysich DCs nawet przy koncentracji 200-300 µg/ml, natomiast preparaty nieoczyszczone mają zdolność do ich aktywacji już przy stężeniu 50-100 ng/ml, a uzyskany wynik jest zależny od temperatury i nie jest hamowany przez PmB [101]. Intrygujące wydają się również doniesienia Gao i Tsana, przeczące brakowi wrażliwości LPS na temperaturę, w którym wykazano, że ogrzewanie preparatu LPS (4 ng/ml; 1h 100o C) powoduje nie tylko spadek aktywności endotoksyny (określone z użyciem lizatu Limulus amebocyte), ale również zahamowanie wyrzutu TNF-α podczas stymulacji mysich makrofagów ogrzanym preparatem [35]. Większość badań nie uwzględnia doniesień związanych z wrażliwością LPS na ogrzewanie oraz ignoruje to, że stężenie LPS rzędu 0,1-0,2 [34], a nawet 0,05 ng/ml [35] może powodować wyrzut TNF-α przez mysie makrofagi. W większości badań używane do aktywacji komórek stężenie LPS wynosi 10-500 ng/ml [15,46,62,93]. Przy takich stężeniach, nawet jeśli proces ogrzewania spowoduje inaktywację 99% LPS, pozostanie wystarczająca liczba jego łańcuchów, by aktywować proces wytwarzania TNF-α i jednocześnie skłaniać do stwierdzenia, że LPS jest oporny na ogrzewanie. Poza LPS czynnikami mogącymi indukować aktywność cytokinową mogą być również inne zanieczyszczenia. Gao i Tsan wskazali, że 50% wytworzonego przez stymulowane komórki TNF-α było skutkiem zanieczyszczenia komercyjnie dostępnego preparatu rhHsp60 (Stress-Gen) związkami innymi niż LPS, które okazały się wrażliwe na temperaturę, a ich aktywności nie hamowała polimyksyna B [35]. Możliwe, że właśnie to zjawisko potwierdza doniesienia dotyczące braku lub jedynie częściowemu hamowaniu aktywności cytokinowej przez polimyksynę B.

Receptory swoiste dla białek szoku cieplnego (HSP60)

Podobnie jak w przypadku zanieczyszczeń preparatów HSP endotoksyną, znaczne kontrowersje wzbudza określenie receptorów, dzięki którym komórki wrodzonego układu immunologicznego rozpoznają docelowy ligand w postaci Hsp60. Wśród receptorów, które zostały opisane jako zaangażowane w  rozpoznanie HSP, w  tym HSP60, HSP70 oraz gp96 wymienia się molekułę CD14 [1,62,72] oraz cząsteczki należące do rodziny TLR, w tym TLR2 i TLR4 [19,29]. W przeprowadzonych doświadczeniach, dotyczących zdolności wiązania znakowanego hHsp60 przez makrofagi, DCs oraz ECs (endothelial cells – komórki śródbłonka), wykazano, że wiązanie to ma charakter typowy dla oddziaływania typu ligand- -receptor [43]. Inkubacja komórek z omawianym białkiem w temperaturze fizjologicznej (37o C), optymalnej dla endocytozy potwierdziła z użyciem cytometrii przepływowej jego wchłanianie z  udziałem tego procesu [42]. Wykazano, że wiązanie Hsp60 jest zjawiskiem specyficznym, a charakter wiązania podobny dla wszystkich komórek [42,43,46]. Dotychczas jednoznacznie nie okre- ślono, które z receptorów są odpowiedzialne za reakcje z HSP60. Badania polegające na inkubacji mysiej linii makrofagowej J774.1 z przeciwciałami anty-CD14 oraz anty-TLR nie potwierdziły blokowania reakcji makrofagów ze znakowanym hHsp60 [43]. W doświadczeniach z wykorzystaniem ludzkich komórek linii gwiaździaka (astrocytoma) U373 oraz fibroblastycznej linii komórkowej CHO-K1 (chinese hamster ovary – K1 fibroblast) transfekowanych plazmidem kodującym sekwencję ludzkiego CD14 cDNA wykazano, że obecność cząsteczki CD14 jest niezbędna, lecz w wybranych przypadkach (jak linia CHO-K1) może być niewystarczająca do aktywacji komórek z udziałem zarówno eukariotycznego, jak i prokariotycznego Hsp60 (hHsp60 oraz chHsp60-chlamydia Hsp60). Uzyskane wyniki sugerują, że w przeciwieństwie do komórek uzyskanych od chomików komórki linii ludzkiej ekspresjonują niezbędny koreceptor wspomagający przekazywanie sygnału. Wykazano, że komórki linii CHO-K1 mają mutacje w genie kodującym TLR2, dlatego ekspresjonują afunkcyjne białko. Komórki te są zdolne do rozpoznania LPS (poprzez receptor TLR4), nie rozpoznają jednak innych PAMP, takich jak peptydoglikany, stąd przypuszczenie, że to TLR2 może stanowić poszukiwany koreceptor [62]. W badaniach z wykorzystaniem linii komórkowej VSMC (ludzka fibroblastyczna linia komórkowa) wykazano, że użycie przeciwciał anty- -TLR hamuje ich proliferację pod wpływem stymulacji hHsp60 [19]. W przypadku DCs, izolowanych ze szpiku kostnego myszy szczepu C3H/HeJ (szczep z ekspresją afunkcyjnego receptora TLR4), udowodniono, że ich inkubacja z hHsp60/chHsp60 hamuje lub w znacznym stopniu ogranicza sekrecję cytokin (IL-1β, TNF-α) oraz nieznacznie zwiększa ekspozycję cząsteczek kostymulujących CD86 i CD40 na ich powierzchni [29]. Wykazano jednak, że makrofagi uzyskane ze szpiku kostnego myszy szczepu C57BL/10ScCr (szczepu nieekspresjonującego TLR4) wiążą hHsp60 na poziomie kontroli [42]. Dalsze badania nad zdolnością wiązania Hsp60 przez makrofagi (linia komórkowa J774.1, RAW264.7) oraz populację komórek CD11b+ uzyskanych ze szpiku kostnego myszy C57BL/6J, z wykorzystaniem metody konkurencyjnej, wykazały, że mHsp60 oraz rtHsp60, nie zaś Mb-Hsp60, Ec-Hsp60, Chp-Hsp60 przyczyniają się do osłabienia wią- zania hHsp60 przez te komórki [45,46], a oddziaływania te są niezależne od receptora TLR4 [42]. Zaobserwowano jednak różnicę we właściwościach hamHsp60, które w przypadku linii komórkowej J774.1 nie miało wpływu na wiązanie hHsp60 [46], ale wykazywało te zdolności w  przypadku populacji komórek CD11b+ [45]. Wyniki przeprowadzonych badań wskazały, że oddziaływanie Hsp60 Eucaryota z komórkami układu immunologicznego ma inny charakter niż w przypadku białka izolowanego od Procaryota i biorą w nim udział odmienne struktury powierzchniowe. Wydaje się, że różnica w wiązaniu własnego oraz obcego Hsp60 przez komórki wrodzonego układu immunologicznego jest momentem krytycznym pozwalającym na utrzymanie immunologicznej homeostazy, ponieważ oba prokariotyczne oraz eukariotyczne Hsp60 występują w  surowicy i  mają silny potencjał immunoregulatorowy. Przypuszcza się, że Hsp60 w reakcjach z komórkami immunologicznymi mogą wykorzystywać odmienne miejsce wiązania, odmienne receptory. Mimo że homologia między białkami Hsp60 ssaków i bakterii wynosi 50%, natomiast u różnych gatunków ssaków osiąga wartość 95%, istnieje prawdopodobieństwo, że nawet najmniejsze różnice w sekwencji białka przyczyniają się do zniesienia krzyżowego rozpoznania antygenu [45,46].

Epitopy HSP60 zaangażowane w aktywację wrodzonego układu immunologicznego

Przeprowadzono wiele badań mających na celu określenie sekwencji potencjalnych epitopów białek Hsp60. Model 3D hHsp60 oparty na Escherichia coli GroEL pozwolił zidentyfikować regiony będące epitopami tego białka w jego domenie apikalnej (aa 241-260), domenie pośredniej (aa 391-410) oraz w domenie ekwatorialnej (aa 461- 480 i 481-500). Przypuszcza się, że regiony te uczestniczą w  oddziaływaniu z  receptorami zarówno gdy białko przybiera formę monomeryczną, jak i oligomeru i są zaangażowane w reakcje z komórkami układu immunologicznego [43]. Przeprowadzone doświadczenia, w których wykorzystano zbiór różnorodnych 20aa oligopeptydów, kodujących łącznie całą sekwencję hHsp60 oraz trzy mutanty delecyjne E. coli wytwarzające C-terminalne regiony białka Hsp60 (aa138-573, aa244-573 oraz aa360-573), potwierdziły przypuszczenia dotyczące wskazanych epitopów. Fragmentem oddziałującym z mysią makrofagową linią komórkową J774.1 okazał się region mieszczący się na C-końcu białka, a dokładniej aa481-500 [44]. W przypadku makrofagów izolowanych ze szpiku kostnego myszy szczepu C57BL/6J najintensywniejsze wiązanie zaobserwowano dla oligopeptydów kodujących odmienne niż dla linii J774.1 fragmenty białka (aa241-260, aa391-410, aa461-480) oraz peptydu kodującego fragment hHsp60 aa138-573. Uzyskane wyniki skłoniły do stwierdzenia, że różne komórki wiążą Hsp60 za pomocą odmiennych receptorów, swoistych dla różnych fragmentów tego białka [45].

Szczegółowa analiza sekwencji hHsp60 wykazała, że w domenie szczytowej (apikalnej) znajduje się swoisty region stanowiący miejsce wiązania LPS (aa 354-365) [43]. W celu udowodnienia potencjalnej zdolności białek Hsp60 do wiązania lipopolisacharydu, hHsp60 oraz mHsp60 inkubowano ze znakowanym radioaktywnie LPS ([3 H]LPS) i wykazano, że wiązanie to ma charakter specyficzny i może być blokowane przez preinkubację komórek z nieznakowanym LPS lub przez dodanie przeciwciał anty-Hsp60 klon 4B9 [47,72]. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych klon 24 (aa1-200), 4B9 (aa335-366), LK1 (aa383-447) skierowanych przeciwko hHsp60 oraz swoistym oligopeptydom Hsp60 pomogło zidentyfikować region epitopowy odpowiedzialny za wiązanie LPS i był nim fragment aa354-365. Dalsza analiza tego fragmentu wskazała, że zawiera motyw LKGK, który jest określany jako niezbędny podczas wiązania LPS, co więcej, motyw ten odpowiada za wiązanie LPS przez czynnik C pochodzący od Limulus polyphemus [47]. Fragment ten występuje jedynie w Hsp60 ssaków, dlatego sugeruje się, że za aktywację komórek układu immunologicznego w przypadku stymulacji hHsp60, działanie prozapalne wywo- łuje swoiście wiązany przez tę molekułę LPS, nie zaś samo białko.

Aktywacja komórek układu odporności swoistej przez HSP60

Wpływ HSP60 na elementy nabytego układu immunologicznego należy postrzegać w dwojaki sposób. Białko to może być sygnałem prozapalnym dla organizmu, prowadząc do aktywacji limfocytów B oraz efektorowych limfocytów T, a sygnałem przeciwzapalnym przez swoiste oddziaływanie z limfocytami B oraz limfocytami regulatorowymi, w tym antyergotypowymi limfocytami T. Wpływ HSP60 na układ immunologiczny zależy głównie od koncentracji, rozpoznawanego epitopu Hsp60 oraz miejsca rozpoznania antygenu. Przyjmuje się, że małe stężenie HSP60 identyfikowane we krwi w sposób konstytutywny, którego źródłem jest aktywność chaperonowa białek w komórkach, przyczynia się do utrzymania immunologicznej równowagi przez promowanie aktywności limfocytów T regulatorowych (Treg) i jednoczesne obniżanie aktywności efektorowych limfocytów T. Odmienne zjawiska są obserwowane podczas podwyż- szonego stężenia HSP60 towarzyszącego uszkodzeniu tkanek, procesowi nowotworowemu czy infekcji. Duża koncentracja białka we krwi przyczynia się do pobudzenia makrofagów i komórek dendrytycznych, prowadząc do promowania odpowiedzi prozapalnej monocytów i aktywacji efektorowych limfocytów T, a w przypadku limfocytów B stymulacji w kierunku proliferacji. Gdy stres środowiskowy ulega zmniejszeniu, koncentracja HSP60 maleje i głównymi komórkami odpowiadającymi na to białko stają się ponownie limfocyty Treg (ryc. 3) [83].

Interakcje Hsp60 z limfocytami B

Hsp60 zarówno własne (self), jak i obce (non-self) stanowi dla limfocytów B potencjalny antygen, co potwierdza duże stężenie przeciwciał anty-Hsp60 w surowicach osobników zakażonych bakteriami lub poddanych szczepieniom (Hsp60 to powszechny antygen bakteryjny), jak również u osób chorych na wybrane schorzenia na tle autoimmunologicznym [2,5]. Zaskakująca wydaje się obecność przeciwciał anty-Hsp60 u  osobników zdrowych, u których wysoki poziom przeciwciał klasy IgM wiążących Hsp60 wykrywa się już we krwi pępowinowej. W surowicy dorosłych, zdrowych osób identyfikuje się również przeciwciała autologiczne klasy IgM oraz IgG wiążące Hsp60, jednak w tym przypadku stężenie przeciwciał jest znacznie niższe niż u osób ze schorzeniami autoimmunologicznymi [67]. Istnieją przypuszczenia, że jednoczesna aktywacja receptorów TLR4 oraz BCR limfocytów B swoistych dla Hsp60 przyczynia się do rozpoznania, aktywacji i powstania przeciwciał niezależnie od limfocytów T (grasiczoniezależnie) [83]. W doświadczeniach przeprowadzonych z użyciem naiwnych mysich limfocytów B (B2) izolowanych od myszy szczepu C57BL/6J wykazano, że hHsp60, w procesie zależnym od receptorów TLR4/MyD88 przyczynia się do ich aktywacji, podwyższając stopień proliferacji, zwiększając sekrecję IL-10 i IL-6, a także ekspozycję MHC II oraz cząsteczek kostymulujących CD69, CD40, B7-2 na powierzchni tych komórek. W odpowiedzi na hHsp60 limfocyty B wytwarzają głównie poliklonalne przeciwciała podklasy IgG3 [16]. Wrodzona zdolność limfocytów B do rozpoznania Hsp60 ssaków prawdopodobnie nie jest równoznaczna z rozpoznaniem Hsp60 Procaryota. Yi i wsp. wykazali, że immunizacja myszy mHsp60 pobudza limfocyty B i powoduje wytwarzanie swoistych przeciwciał IgG na poziomie dwukrotnie niższym niż w przypadku szczepienia z  użyciem Hsp60 pochodzenia bakteryjnego (chHsp60) [112]. Wyniki te wskazują na dużą immunogenność Hsp60 pochodzącego od Procaryota. Dotychczas potwierdzono wytwarzanie przeciwciał klasy IgG, w tym podklasy IgG1 oraz IgG2a, w odpowiedzi na Hsp60 pochodzące od: Helicobacter pylori [2,109,111], Salmonella Typhi [3,74], Legionella pneumophila [9,105], Yersinia enterocolitica [70], Piscirickettsia salmonis [108], Histophilus somni [badania własne, niepublikowane] oraz Francisella tularensis [51], Escherichia coli, Pasteurella multocida, Salmonella Enteritidis [badania własne, niepublikowane]. Wysoki poziom przeciwciał anty-Hsp60 pochodzenia bakteryjnego identyfikuje się u osób chorych na schorzenia wywołane przez Helicobacter pylori [2], Mycoplasma pneumoniae [5], Porphyromonas gingivalis [66], Mycobacterium tuberculosis oraz Mycobacterium leprae [113]. Udowodniono również, że przeciwciała skierowane przeciwko bakteryjnym Hsp60 wykazują dużą reaktywność krzy- żową, co potwierdzono w reakcjach Hsp60 uzyskanego od Streptococcus suis z poliklonalną surowicą anty-Hsp60 Pseudomonas aeruginosa, Legionella micdadei oraz z przeciwciałami monoklonalnymi anty-Hsp65 Mycobacterium leprae i Neisseria gonorrhoeae [6], jak również w przypadku białka Hsp60 Giardia lamblia w  reakcji z  poliklonalną surowicą anty-Hsp65 Mycobacterium bovis [91]. Zaobserwowano, że surowica poliklonalna anty-Hsp60 S.suis wykazywała reaktywność krzyżową z lizatami bakterii: Enterococcus faecalis, Streptococcus equisimilis, S. agalactiae, S. bovis, S. pneumoniae, Escherichia coli, Shigella sonnei, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Klebsiella pneumoniae, Salmonella Typhimurium, Bordetella bronchiseptica natomiast przeciwciało monoklonalne swoiste dla Hsp60 Pseudomonas aeruginosa reagowało z P. stutzeri, P. alcaligenes, P. mendocina, P. pseudoalcaligenes [6,65].

Interakcje Hsp60 z limfocytamiT

Podobnie jak limfocyty B komórki T są zdolne do rozpoznania własnego i obcego Hsp60, jednak wpływ tego białka na limfocyty T jest różnorodny i często nieprzewidywalny. W przypadku ludzkiego Hsp60 (hHsp60) rozpoznanie to występuje zarówno u osób zdrowych, jak i chorych na schorzenia o podłożu autoimmunologicznym. Limfocyty T Hsp60-reaktywne izoluje się już z krwi pępowinowej zdrowych noworodków, tak więc zdolność rozpoznania przez limfocyty T własnego Hsp60 wydaje się zjawiskiem wrodzonym i  naturalnym [87]. Reaktywność limfocytów T wobec Hsp60 skutkować może zróżnicowanym profilem wytwarzanych przez nie cytokin. Limfocyty T, które wskutek oddziaływania z Hsp60 wytwarzać będą cytokiny prozapalne przyczynią się do rozwoju choroby autoimmunologicznej, odegrają jednak istotną rolę w czasie zwalczania infekcji bakteryjnej.

Natomiast wytwarzanie przez limfocyty T cytokin supresorowych będzie korzystne dla osób z chorobą autoimmunologiczną, lecz niekorzystne w przypadku infekcji bakteryjnej. Analizując następstwa oddziaływania białek Hsp60 z  limfocytami T, należy uwzględnić udział limfocytów T: naiwnych, efektorowych, supresorowych (Treg) oraz antyergotypowych. Dodatkowo należy rozróżnić dwie możliwości wpływu Hsp60 na limfocyty T jako liganda dla receptora TLR lub jako antygenu.

Jak udokumentowano hHsp60 reguluje aktywność efektorowych oraz naiwnych limfocytów T z udziałem receptora TLR2 nie zaś TLR4. Wyizolowane z ludzkiej krwi obwodowej zdrowych osobników limfocyty T o fenotypie CD45RO+ (efektorowe limfocyty T) oraz CD45RA+ (naiwne limfocyty T) wykazują zdolność do rozpoznania hHsp60 oraz peptydu p277 kodującego 24aa fragment tego białka przez receptor TLR2. Zaobserwowano, że preinkubacja obu frakcji limfocytów T z hHsp60 i peptydem p277 powoduje hamowanie chemotaksji indukowanej przez SDF-1α i ECL. hHsp60 wzmacnia proces adhezji obu frakcji limfocytów T do fibronektyny, zaś Ec-Hsp60 (nie Mt-Hsp65) adhezję jedynie limfocytów T naiwnych [116,117]. Ramage i wsp. wykazali, że frakcja komórek jednojądrzastych izolowanych z krwi zdrowych osobników wykazuje podwyższoną proliferację wskutek stymulacji przez hHsp60, przy czym jedynie wybrana frakcja komórek CD45RA+ (naiwne limfocyty T) proliferuje intensywnie pod wpływem tego antygenu, a użycie antygenów pochodzenia bakteryjnego o wysokiej homologii do hHsp60, takich jak Ml-Hsp65, Ec-Hsp60 oraz Cht-Hsp60 (Chlamydia trachomatis Hsp60) przyczynia się do stymulacji obu frakcji limfocytów T [87]. Badania Osterloha i wsp. dotyczące stymulacji limfocytów T pod wpływem Hsp60 wolnego od endotoksyn wykazały, że obecność wolnego od LPS mHsp60 prowadzi do wzrostu antygenozależnego wytwarzania IFN-γ przez zaktywowane limfocyty T niezależnie od TLR4/MyD88 (ryc. 4) [72,73]. Neutralizacja IL-6 oraz TNF-α nie wpływa na wytwarzanie IFN-γ przez limfocyty T. Jego wytwarzanie jest również niezależne od IL-12 (głównego induktora IFN-γ) oraz IL-23, podczas gdy uwolnienie IFN-γ wskutek stymulacji komórek LPS lub kompleksem LPS/ hHsp60 silnie zależy od IL-12. Wykazano, że to IFN-α (uwalniany przez komórki APC) pod wpływem wolnego od endotoksyn Hsp60 stanowi główny mediator wzmacniający aktywację limfocytów T. Osterloh i wsp. wysunęli przypuszczenie, że Hsp60 prowadzi do aktywacji układu immunologicznego na dwóch różnych, lecz częściowo powiązanych ze sobą ścieżkach (ryc. 4) [72,73]. W pierwszym przypadku, kiedy jest obecny LPS, czyli w czasie infekcji bakteryjnej, Hsp60 pochodzące od Eucaryota (gospodarza) funkcjonuje jako proteina wiążąca LPS, co ułatwia jego oddziaływanie z kompleksem CD14/TLR4 na powierzchni APC i wzmacnia sygnał przekazywany przez receptor TLR4. Komórki ulegają również stymulacji pod wpływem Hsp60 pochodzącego od Procaryota (bakterii), w ten sposób oba białka przyczyniają się do rozpoznania patogenu (ryc. 4A). W drugim przypadku Hsp60 pochodzące od Eucaryota działa jako sygnał zagrożenia dla organizmu, pośrednicząc we wzmocnieniu antygenozależnej aktywacji limfocytów T. Zjawisko to obserwuje się, kiedy w środowisku brak jest nie tylko LPS, ale również innych struktur bakteryjnych. W tym przypadku Hsp60 może oddziaływać z receptorami APC przez nieopisane dotychczas receptory, inne niż TLR4 i TLR2. Taka sytuacja może się zdarzyć podczas zakażeń wirusowych, uszkodzenia komórek, śmierci nekrotycznej komórek (ryc. 4B).

W  przypadku limfocytów Treg Zanin-Zhorov i  wsp. wykazali, że stymulacja receptora TLR2, eksponowanego na ich powierzchni, przez hHsp60 oraz peptyd p277 przyczynia się do wzmocnienia przeciwzapalnego ich oddziaływania [115]. Obecność limfocytów Treg (CD4+ CD25+ ) w populacji komórek CD4+ izolowanej z krwi obwodowej zdrowych osobników powoduje zmniejszenie sekrecji cytokin: IFN-γ, TNF-α przez te komórki pod wpływem hHsp60/p277. Natomiast preinkubacja oczyszczonej frakcji komórek CD4+ CD25+ z hHsp60, a następnie ich hodowla w kokulturze z niestymulowanymi hHsp60, lecz zaktywowanymi z udziałem przeciwciał anty-CD3 komórkami CD4+ CD25- prowadzi do supresji proliferacji tej populacji (CD4+ CD25- ). Wiąże się to z wpływem hHsp60 zarówno na komórki T regulatorowe, jak i T efektorowe. hHsp60 może również w sposób pośredni, poprzez limfocyty Treg hamujące wyrzut cytokin IFN-γ i  TNF-α, oddziaływać na limfocyty T cytotoksyczne (CD8+ ). hHsp60 przyczynia się jednocze- śnie do zwiększonej sekrecji IL-10 oraz TGF-β przez limfocyty T regulatorowe. Należy zaznaczyć, że aktywacja limfocytów T przez TLR2 wymaga 1000x mniejszego stężenia tego białka niż w przypadku aktywacji przez TLR4 monocytów i limfocytów B, stąd przyjmuje się, że małe stężenie Hsp60 w surowicy krwi przyczynia się do aktywacji limfocytów Treg [115], natomiast duża koncentracja tego białka wywołuje prozapalną odpowiedź monocytów [83].

Należy również podkreślić rolę antyergotypowych regulatorowych limfocytów T w rozpoznaniu Hsp60 prezentowanego przez zaktywowane efektorowe limfocyty T. Antyergotypowe limfocyty T to typ Treg, które rozpoznają z  udziałem receptora TCR epitopy białkowe, prezentowane w restrykcji MHC I/II przez pobudzone efektorowe limfocyty T. Jedynie te komórki są zdolne do prezentacji ergotypów (markerów aktywacji) komórkom antyergotypowym. Wykazano, że w  przypadku szczurów immunizowanych hHsp60, zarówno w postaci szczepionki DNA, jak i z użyciem wybranych fragmentów białka, a następnie poddanych indukcji AA (adjuvant athritis – reumatoidalne zapalenie stawów indukowane adiuwantem) nie obserwuje się rozwoju choroby, a izolowane z węzłów chłonnych limfocyty (w tym limfocyty antyergotypowe) wykazują w obecności pobudzonych limfocytów T (linia komórkowa A2b) podwyższoną proliferację oraz sekrecję TGF-β. Jednocześnie udowodniono, że antyergotypowe limfocyty T wpływają na obniżenie stopnia proliferacji oraz sekrecji IFN-γ przez efektorowe limfocyty T (np. izolowane od szczurów z AA) zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo, mogą się przyczyniać do hamowania rozwoju chorób autoimmunologicznych [83,84].

Ekspozycja HSP60 na powierzchni komórek

Wiele doniesień naukowych, potwierdza ekspozycję białek HSP60 na powierzchni komórek Eucaryota i Procaryota. Mechanizmy zaangażowane w translokację białek szoku cieplnego na powierzchnię komórki nie są znane, szczególnie, że są to typowe białka cytoplazmatyczne i brak w ich strukturze swoistych sekwencji liderowych odpowiedzialnych za translokację na powierzchnię komórki [37,68]. Zakłada się, że proces ten u Eucaryota jest niezależny od sekrecyjnej ścieżki ER-Golgi, gdyż zastosowanie inhibitorów tej drogi nie hamuje uwalniania HSP z przestrzeni wewnątrzkomórkowej. Wiadomo również, że białka szoku cieplnego w przypadku Eucaryota są eksponowane jedynie na powierzchni komórek zakażonych wirusami lub bakteriami oraz w komórkach nowotworowych, lecz nie identyfikuje się ich w komórkach zdrowych. Obserwacje te nasunęły wniosek, że to silnie zaburzony w  tych komórkach metabolizm zakłóca proces sekrecji. W przypadku komórek nowotworowych wewnątrzkomórkowe środowisko charakteryzuje się silną kwasowością, hipoksją oraz obniżoną ilością składników odżywczych. Kwaśne środowisko może odpowiadać za konformacyjne zmiany HSP, a to może promować jego powierzchniowe umiejscowienie [68]. U Procaryota obserwuje się stałą ekspozycję HSP60 na powierzchni komórki, ekspozycja intensywnie wzrasta pod wpływem bodźców stresowych, takich jak szok termiczny lub osmotyczny. Podobne zjawisko występuje w chwili wniknięcia drobnoustroju do organizmu gospodarza. Patogen narażony jest wówczas na zróżnicowane zmiany środowiskowe, które mogą być dla komórki bardzo stresogenne. Należy tutaj wymienić zmianę temperatury, pH oraz pO2 . Jednocześnie patogen jest narażony na naturalne procesy obronne organizmu, np. fagocytozę. Sfagocytowana komórka bakteryjna jest poddawana działaniu reaktywnych form tlenu, mediatorów NO oraz enzymów lizosomalnych. W celu obrony przed tymi czynnikami patogen uruchamia różnorodne procesy ochronne, w tym zwiększa ilość syntetyzowanych HSP [120]. Przypuszcza się, że w przypadku Procaryota to obecność domeny hydrofobowej na domenie C-terminalnej białka może ułatwiać jego interakcje z hydrofobowymi regionami innych cząsteczek, takich jak fosfolipidy oraz lipopolisacharydy i sprzyjać translokacji na powierzchnię komórki oraz sekrecji do przestrzeni zewnątrzkomórkowej [53].

Ekspozycja cząsteczek HSP na powierzchni komórek odgrywa istotną rolę w  interakcji między bakterią a komórką docelową, rozpoznawaniu komórki bakteryjnej przez układ immunologiczny, rozwoju chorób autoimmunizacyjnych i  neurodegeneracyjnych, rozwoju procesów zapalnych, infekcjach wirusowych, odrzucaniu przeszczepów oraz rozpoznawaniu komórek nowotworowych przez komórki układu immunologicznego [68]. U Procaryota obserwuje się dwa zjawiska związane z ekspozycją białek szoku cieplnego na powierzchni komórek: w  pierwszym HSP60 komórek docelowych jest receptorem dla bakteryjnych ligandów, w drugim sam jest ligandem bakteryjnym. Przykładem pierwszego z obserwowanych zjawisk są wyniki badań przeprowadzonych przez Burkholder i Bhunia, w których analizowano interakcje między Listeria monocytogens a komórkami gospodarza [13]. Zespół Bhunia zidentyfikował u  Listeria białko adhezyjne (Listeria adhesion protein, LAP) i uznał je za przypuszczalny czynnik adhezyjny, promujący wiązanie do kultur komórkowych wyprowadzonych z tkanek jelit, jak również czynnik umożliwiający translokację bakterii do wątroby i śledziony u zakażonych doustnie myszy [58]. Wskazał również receptor LAP, którym okazało się białko Hsp60 eksponowane na powierzchni komórek nabłonkowych. Inkubacja linii komórkowej Caco-2 (ludzka linia komórkowa nabłonka okrężnicy) z  przeciwcia- łami anty-Hsp60 wywoływała zależną od LAP redukcję adhezji komórek bakteryjnych [102], a interakcja LAP z Hsp60 gospodarza umożliwiała przyleganie, a następnie translokację bakterii przez jednowarstwowy nabłonek jelita. Potwierdzono również, że infekcja komórek nabłonka jelit z wykorzystaniem małej dawki bakterii (1×106 cfu/ml) powodowała wzrost ekspozycji Hsp60 na ich powierzchni, co prowadziło do jeszcze wydajniejszego wiązania patogenu przez komórki docelowe [13]. Rolę HSP, jako czynnika stanowiącego receptor ligandów pochodzenia bakteryjnego wykazano również w  oddziaływaniach białka wiążącego fibronektynę (fibronectin binding protein, FnBP) Staphylococcus aureus z Hsp60 komórek nabłonkowych (linia komórkowa MCT-1) [24], białka X wirusa zapalenia wątroby typu B (HBx) tworzącego z h/E.c-Hsp60 i h/E.c Hsp70 kompleksy mogące mieć wyraźny udział w molekularnych mechanizmach infekcji wirusowej [119]. Białko Hsp70 (Hsc70) również eksponowane przez komórki olbrzymie trofoblastu są wykorzystywane przez Brucella abortus w procesie inwazji trofoblastu ciężarnych myszy [104].

Przykładem drugiego zjawiska są wyniki badań przeprowadzonych przez Hennequin i wsp. dotyczące interakcji Clostridium difficile z komórkami gospodarza [53]. Zaobserwowano, że jej adhezja do docelowych komó- rek wzrasta podczas szoku cieplnego, osmotycznego czy kwasowego oraz przy niedoborze żelaza, maleje w obecności surowicy zawierającej przeciwciała anty- -GroEL Mycobacterium leprae. Ekspozycja białek Hsp60 na powierzchni C. difficile wzrasta podczas jej termicznego szokowania w 42oC oraz 48oC, a w temperaturze wyż- szej zwiększa się również wyrzut białka do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Zastosowanie przeciwciał anty- -Hsp60 C. difficile oraz oczyszczonego rekombinowanego białka Hsp60 C. difficile przyczynia się do zahamowania procesu adhezji patogenu do komórek gospodarza. Wyniki te potwierdziły przypuszczenia dotyczące adhezyjnej roli Hsp60. Analogicznych obserwacji dostarczyły badania dotyczące: Legionella pneumophila [37,38], Helicobater pylori [110], Haemophilus ducreyi [30], Salmonella Typhimurium [25], Actinobacillus actinomycetemcomitana [41], Borrelia burgdorferi [60], w których potwierdzono udział białka Hsp60 w procesach adhezji oraz infekcji komórek docelowych.

U Eucaryota zastosowanie przeciwciał monoklonalnych umożliwiło identyfikację białek HSP na powierzchni licznych komórek nowotworowych. W liniach komórkowych MKN28, MKN45, KATOIII, Caco-2, H9 wykazano powierzchniową obecność Hsp60 [77,102,110], a  linii GCL-1 ekspozycję Hsp72 i Hsp90 [27]. Obecność Hsp60 stwierdzono również na nieobjętych procesem transformacji nowotworowej komórkach, takich jak makrofagi i komórki endotelialne [52,103]. Należy jednak podkre- ślić, że w przypadku makrofagów izolowanych ze szpiku kostnego, powierzchniową ekspozycję Hsp60 identyfikowano dopiero po 3-dniowej inkubacji w  warunkach in vitro, ze znacznym wzrostem translokacji po 9 dniach hodowli stymulowanej IFN-γ [103]. W komórkach nabłonkowych czynniki stresogenne, takie jak klasyczne czynniki ryzyka w  arteriosklerozie oraz fale magnetyczne przyczyniały się do pozakomórkowego umiejscawiania Hsp60 [52]. Znane są przypadki identyfikacji HSP60 na powierzchni komórek objętych procesami chorobotwórczymi, przykładem może być pozytywny wynik barwienia z użyciem przeciwciał anty-Hsp60 wycinka nabłonka jelita pobranego od pacjenta z chorobą wrzodową jelit [110]. W wielu zaburzeniach na tle autoimmunologicznym, zarówno w modelu ludzkim, jak i mysim, obserwowano występowanie białek HSP na powierzchni komórek objętych zmianami chorobowymi, co przypuszczalnie może indukować zmiany immunopatologiczne. Podejrzewa się, że wszelkie stany zapalne ośrodkowego układu nerwowego jak autoimmunologiczne, przewlekłe zapalenie rdzenia kręgowego i mózgu prowadzą do zmian w ekspresji białek szoku cieplnego [36].

Obecność Hsp60 w strukturze biofilmu

Jednym z czynników wirulencji niektórych bakterii jest ich zdolność do tworzenia biofilmu, który umożliwia przetrwanie komórkom bakteryjnym warunki letalne [95,118]. Biofilm wykazuje dużą oporność na fagocytozę i na 10-1000 razy wyższe stężenia antybiotyków w porównaniu do hodowli, gdzie nie został wytworzony [17]. Dlatego infekcje spowodowane przez bakterie zdolne do tworzenia biofilmu mają najczęściej charakter przewlekłych lub nawracających, które trudno zwalczać standardowymi antybiotykami [59]. W dotychczas przeprowadzonych badaniach wykazano, że w macierzy biofilmu tworzonego zarówno przez H. somni [118], jak i H. influenzae [33] są obecne białka szoku cieplnego o masie 60 kDa wytwarzane przez nie. Zarankiewicz i wsp. udowodnili, że przeciwciała anty-rHsp60 H. somni (zarówno mysie, jak i  kozie) aktywnie hamują tworzenie biofilmu przez H. somni w warunkach in vitro [118]. Ponieważ H. somni, tworzy biofilm w warunkach in vivo [96], immunizacja rHsp60 może przynieść znaczące korzyści w postaci inhibicji tworzenia biofilmu przez ten patogen u zwierząt hodowlanych, a tym samym ekspozycja patogenu na antybiotyki i skuteczność układu immunologicznego gospodarza w jego zwalczaniu może bardzo wzrosnąć.

Zastosowanie białek szoku cieplnego (w tym HSP60) jako składnika szczepionek

Szczepionką nazywa się produkt pochodzenia biologicznego zawierający substancje zdolne do indukcji procesów immunologicznych warunkujących powstanie trwałej i swoistej odporności bez wywołania działań toksycznych [39]. Idealna szczepionka przeciwko chorobom infekcyjnym oraz nowotworowym powinna jednocześnie indukować humoralne i komórkowe mechanizmy odporności, charakteryzować się dobrą stabilnością, bezpieczeństwem, niskim kosztem produkcji, a wzbudzona przez nią odporność powinna być długotrwała. Ponieważ HSP są dominującymi antygenami bakteryjnymi identyfikowanymi podczas zakażeń, mogą stanowić składnik szczepionek podjednostkowych lub ze względu na ich właściwości być nośnikami innych antygenów. Obecnie istnieje wiele szczepień z wykorzystaniem tych białek, wśród których wymienić należy:

• Białka szoku cieplnego oczyszczane chromatograficznie izolowane z linii komórek nowotworowych

Przykładem jest tu białko Hsp70 izolowane z mysiej linii komórkowej wątrobiaka (HCaF), oczyszczane chromatografią powinowactwa ConA-sefaroza, ADP-agaroza oraz chromatografią jonowymienną. Dwukrotna immunizacja podskórna samic myszy szczepu BALB/c oczyszczonym w ten sposób mHsp70 (600 µg/kg) spowodowała wzrost przeżywalności myszy do 83,3% w porównaniu do grupy kontrolnej (przeżywalność 0%) po podskórnym podaniu 5×104 komórek nowotworowych HCaF. Podobny wynik uzyskano po wykonaniu transferu adoptywnego splenocytów myszy immunizowanych mHsp70, co wskazuje na przeciwnowotworowe właściwości izolowanego białka [14]. W  przypadku białka szoku cieplnego HSPPC-96 (heat-shock protein peptide complex-96) izolowanego ze zmian skórnych pacjentów z czerniakiem złośliwym (wg skali Karnofsky’go > 70%, stopnia III i IV) zastosowano oczyszczanie, wykorzystując precypitację z użyciem siarczanu amonu, chromatografię powinowactwa ConA-sefaroza oraz chromatografię jonowymiennej. Wykazano, że u pacjentów poddanych operacji usunięcia znamion oraz leczeniu z zastosowaniem chemioterapii standardowej/cytokin, czterokrotna śródskórna immunizacja oczyszczonym, autologicznym białkiem HSPPC- 96 w dawce 2,5 µg/25 µg/100 µg może stanowić terapię uzupełniającą. Zastosowana szczepionka okazała się bezpieczna, nie zaobserwowano objawów toksycznych oraz reakcji autoimmunologicznych. Dziewięciu pacjentów (spośród 36 objętych doświadczeniem) z IV stopniem zaawansowania klinicznego czerniaka poddanych terapii adiuwantowej oraz immunizacji HSPPC-96 przeżyło ponad 10 lat [26].

• Szczepionki DNA jako antygen związany kowalencyjnie lub niekowalencyjnie z HSP

Przykładem jest tu szczepionka DNA złożona z genów, zintegrowanych z ekspresyjnym plazmidem pCI, kodujących endogenne białko mGp96 oraz immunodominujący peptyd Listeria monocytogenes (p60217-225 lub LLO91-99) prezentowany w restrykcji MHC I podczas zakażeń tym patogenem. W tym przypadku endogenne mGp96 jest swoistym nośnikiem białkowym ułatwiającym prezentację peptydów w restrykcji MHC I. Trzykrotna domię- śniowa immunizacja myszy szczepu BALB/c 50 µg DNA wykazała działanie protekcyjne podczas ich zakażenia letalną dawką L. monocytogenes. Zaobserwowano, że stymulacja splenocytów (myszy immunizowanych szczepionką DNA) peptydem homologicznym (p60 lub LLO) przyczyniła się do wyrzutu IFN-γ oraz antygonowoswoistej odpowiedzi limfocytów T cytotoksycznych [90]. Wykazano również, że proponowana strategia może być wykorzystana w leczeniu chorych z nowotworem. Przykładem są badania Huanga i wsp., które objęły skonstruowanie rekombinowanych plazmidów ekspresyjnych zintegrowanych z genem kodującym hHsp60 oraz białko E6 i/lub E7 (najbardziej onkogenne proteiny wirusa HPV-wirus brodawczaka ludzkiego typ16) [57]. Dwukrotna immunizacja myszy szczepu C57BL/6J dawką 2 µg DNA (w tym z wykorzystaniem konstruktów Hsp60/ E6; Hsp60/E7; Hsp60/E6/E7) w  pełni chroniła myszy przed rozwojem nowotworu po podskórnym podaniu 5×104 komórek TC-1 (ekspresjonujących białka E6 oraz E7). Ten rodzaj szczepionki wzmacniał odpowiedź typu komórkowego, za co, jak podejrzewają autorzy, bezpo- średnio odpowiada obecność Hsp60.

• Białka HSP lub ich fragmenty jako swoiste adiuwanty/ nośniki innych białek lub peptydów

Przykładem jest wykorzystanie białek fuzyjnych zbudowanych z  N-terminalnego końca proteiny Gp96 (N1-355aa/N34-355aa) oraz białka VSV8 (proteina wirusa pęcherzowego zapalenia jamy ustnej VSV). W przeprowadzonym doświadczeniu Biswas i wsp. wykorzystali właściwości N-terminalnej domeny białka Gp96 zdolnej do wiązania nukleotydów lub peptydów oraz właściwości samego białka, które jest ligandem receptorów CD91 oraz SP-A  eksponowanych na powierzchni komórek APC i bierze udział w prezentacji antygenów w restrykcji MHC I [8]. Zaobserwowano, że splenocyty izolowane od myszy 2-krotnie immunizowanych kompleksem N1-335-VSV8 (20 µg N1-335 oraz 20 ng VSV8) wykazywały aktywność cytolityczną, wyższą niż splenocyty myszy immunizowanych samym białkiem VSV8 zemulgowanym z kompletnym adiuwantem Freunda. Białka fuzyjne swoiście wiązały się do powierzchni komórek APC i wpływały na dojrzewanie komórek dendrytycznych. Rico i wsp., stosując białko Hsp70 pochodzące od Leishmania infantum (Li-Hsp70) powiązane z  białkiem wiążącym maltozę (MBP) pochodzącym od Escherichia coli wykazali, że dwukrotna dootrzewnowa immunizacja myszy BALB/c 5,6 µg LiHsp70-MBP prowadziła do silnej, swoistej odpowiedzi humoralnej skierowanej przeciwko MBP (anty-MBP IgG1 [94]. Natomiast populacja komórek LNCs izolowanych od tych zwierząt charakteryzowała się wzmożoną proliferacją oraz wyrzutem IL-2 i IFN-γ pod wpływem MBP. Nie zaobserwowano takich działań podczas immunizacji myszy białkiem MBP oraz mieszaniną MBP z Li-Hsp70.

• Szczepionki typu „prime-boost”

Strategia szczepienia polegająca na wstępnej immunizacji z  wykorzystaniem DNA, a  następnie podaniu dawki przypominającej w postaci białka. Przykładem jest zastosowanie szczepionki złożonej z DNA/białka E7 ludzkiego wirusa HPV16 oraz Xenopus Gp96. Bolhassani i wsp. opisali doświadczenie, w którym poddali procesowi immunizacji myszy szczepu C57BL/6 z  użyciem DNA (pcDNA-E7 i/lub pcDNA-Gp96) oraz rekombinowanych białek rE7 i/lub rNT-Gp96 (fragment N-terminalny) i/lub rCT-Gp96 (fragment C-terminalny) zemulgowanych z Montanidem 720 [11]. Wykazali silną odpowiedź humoralną we wszystkich możliwych kombinacjach podania szczepionki, skierowaną przeciwko fragmentom rE7 i rGp96, wskazując na szczególne zaangażowanie limfocytów Th2 w odpowiedź immunologiczną. Badania nad proliferacją oraz wyrzutem cytokin (IFN-γ) przez splenocyty izolowane od immunizowanych zwierząt i stymulowanych rE7, NT-Gp96, CT-Gp96 dowiodły, że zastosowanie pierwszego szczepienia w postaci DNA pobudza również limfocyty Th1, czyli odpowiedź typu komórkowego. Uzyskane wyniki są przesłanką do wykorzystania takiego sposobu immunizacji do leczenia chorych z nowotworem szyjki macicy, gdyż anga- żuje zarówno odpowiedź humoralną, jak i komórkową organizmu. Innym przykładem jest immunizacja myszy szczepu BALB/c (szczep wrażliwy) i  C57BL/6 (szczep oporny) w systemie „prime-boost” przeciwko Leishmania major białkiem Hsp70 pochodzącym od tego patogenu. Rafati i wsp. wykazali, że podskórne podanie zwierzę- tom 100 µg pcDNA-Hsp70, a następnie (trzy tygodnie później) 30 µg rHsp70 zemulgowanego z 70% Montanidem 720 i zakażenie ich dawką 3,5×105 komórek pasożyta nie chroniło zwierząt przed rozwojem zmian patologicznych w miejscu zakażenia [86]. Uzyskane od zakażonych zwierząt splenocyty nie wykazywały zwiększonej proliferacji oraz wyrzutu cytokin (IFN-γ i IL-5) pod wpływem stymulacji rHsp70 lub jego C – albo N-końcowymi fragmentami. W uzyskanych po 9 tygodniach od zakażenia surowicach myszy szczepu BALB/c identyfikowano duże stężenie przeciwciał podklas IgG1 i IgG2a anty-Hsp70, co świadczy o  zaangażowaniu w  odpowiedź immunologiczną limfocytów Th1 i Th2. Należy jednak zaznaczyć, że strategia ta okazała się nieskuteczna w zapobieganiu infekcjom wywoływanym przez Leishmania sp.

• Szczepionki DNA lub szczepionki białkowe HSP pochodzącego od patogenów

Istnieje wiele doniesień naukowych dotyczących zastosowania białek szoku cieplnego izolowanych z patogennych szczepów bakterii, drożdży oraz pasożytów jako szczepionek wykazujących wysoki poziom immunogenności oraz protektywności w przypadku zakażania zwierząt letalnymi dawkami wybranych mikroorganizmów lub chorób autoimmunologicznych indukowanych z udziałem patogenów. Niewątpliwie istnieją co najmniej dwie możliwości zastosowania tego rodzaju szczepionek i są nimi immunizacja z użyciem DNA lub rekombinowanego białka. Pierwsza z możliwości jest stosowana znacznie rzadziej, mimo że istnieją doniesienia o jej dużej skuteczności. Quintana i wsp. wykazali, że trzykrotna domięśniowa immunizacja szczurów Lewis (150 µg/os.) plazmidem kodującym całą sekwencję mikobakteryjnego Hsp60 (pMl-Hsp60), ludzkiego Hsp60 (phHsp60) lub jedynie wybranym fragmentem hHsp60 (1-140aa-pI, 130-260aa-pII) chroniła zwierzęta przed rozwojem zapalenia stawów indukowanego adiuwantem (AA) [81,82]. W porównaniu z grupą kontrolną szczury immunizowane wykazywały jedynie nieznaczne zmiany w obrębie kości, chrząstek oraz mazi stawowej. Zaobserwowano, że immunizacja z  udziałem phHsp60 przyczyniła się do znacznego wzrostu stężenia Hsp60 w  surowicy, a izolowana z węzłów chłonnych podkolanowych oraz pachwinowych populacja komórek (LNC) wykazywała wzmożoną proliferację pod wpływem stymulacji ludzkim oraz mikobakteryjnym Hsp60. Wykazano również, że komórki LNC pozyskane od szczurów immunizowanych zarówno phHsp60, jak i pMl-Hsp65 z indukowanym AA cechuje bardzo duże wytwarzanie IFN-γ, IL-10 oraz TGF-β1 pod wpływem stymulacji hHsp60. Za wytwarzanie tego profilu cytokinowego odpowiadają najprawdopodobniej limfocyty T regulatorowe – Treg1 kontrolujące odpowiedź immunologiczną limfocytów Th1 i 2. Bonato i wsp. udowodnili, że 4-krotna domięśniowa immunizacja myszy szczepu BALB/c plazmidem kodującym Ml-Hsp65 (pMl-Hsp65) przyczyniła się do zwiększenia populacji limfocytów T Hsp65 reaktywnych o fenotypie CD4+ /CD8- – CD44+hi i CD8+ /CD4- CD44+hi wytwarzających IFN-γ [12]. Transfer adoptywny limfocytów CD8+ /CD4- CD44+hi chronił zwierzęta przed rozwojem gruźlicy wywołanej dożylnym zakażeniem Mycobacterium tuberculosis.

Ponieważ Hsp60 jest jednym z dominujących antygenów mikroorganizmów identyfikowanych podczas zakażenia, istnieją przesłanki, aby mógł znaleźć zastosowanie jako składnik szczepionek podjednostkowych w immunoprofilaktyce wielu zakażeń. W literaturze naukowej odnaleźć można liczne potwierdzenia ochronnej roli białek szoku cieplnego Hsp60 (tabela nr 1). Dotychczas stwierdzono protektywność białek Hsp60 pochodzących od drobnoustrojów z rodzaju Salmonella enterica serowar Typhi [3,74], Helicobacter pylori [109,111], Histoplasma capsulatum [20,40], Legionella pneumophila [9,105], Yersinia enterocolitica [70,71], Chlamydia trachomatis [89], Paracoccidioides brasiliensis [18], Piscirickettsia salmonis [108] oraz Francisella tularensis [51]. Jednak w przedstawionych przykładach istnieją wyraźne różnice dotyczące postaci (pełne białko lub fragment), sposobu podania oraz zastosowanej do immunizacji dawki antygenu. Doświadczenia przeprowadzane były na różnorodnych modelach zwierzęcych, co istotnie utrudnia ocenę realnej skuteczności zastosowanych szczepionek.

Przypisy

• 1. Asea A., Kraeft S.K., Kurt-Jones E.A., Stevenson M.A., Chen L.B.,Finberg R.W., Koo G.C., Calderwood S.K.: Hsp70 stimulates cytokineproduction through a CD14-dependent pathway, demonstrating itsdual role as a chaperone and cytokine. Nat. Med., 2000; 6: 435-442
  Google Scholar
• 2. Bai Y., Li L.R., Wang J.D., Chen Y., Jin J.F., Zhang Z.S., Zhou D.Y.,Zhang Y.L.: Expression of Helicobacter pylori Hsp60 protein and itsimmunogenicity. World. J. Gastroenterol., 2003; 9: 2711-2714
  Google Scholar
• 3. Bansal A., Paliwal P.K., Sagi S.S., Sairam M.: Effect of adjuvants onimmune response and protective immunity elicited by recombinantHsp60 (GroEL) of Salmonella typhi against S. typhi infection. Mol. Cell.Biochem., 2010; 337: 213-221
  Google Scholar
• 4. Bartlett A.I., Radford S.E.: An expanding arsenal of experimentalmethods yields an explosion of insights into protein folding mechanisms.Nat. Struct. Mol. Biol., 2009; 16: 582-588
  Google Scholar
• 5. Benčina D., Slavec B., Narat M.: Antibody response to GroEL variesin patients with acute Mycoplasma pneumoniae infection. FEMSImmunol. Med. Microbiol., 2005; 43: 399-406
  Google Scholar
• 6. Benkirane R., Gottschalk M.G., Dubreuil J.D.: Identification ofa Streptococcus suis 60-kDa heat-shock protein using western blotting.FEMS Microbiol. Lett., 1997; 153: 379-385
  Google Scholar
• 7. Bharadwaj S., Ali A., Ovsenek N.: Multiple components of theHSP90 chaperone complex function in regulation of heat shock factor 1 in vivo. Mol. Cell. Biol., 1999; 19: 8033-8041
  Google Scholar
• 8. Biswas C., Sriram U., Ciric B., Ostrovsky O., Gallucci S., ArgonY.: The N-terminal fragment of grp94 is sufficient for peptide presentationvia professional antigen-presenting cells. Int. Immunol.,2006; 18: 1147-1157
  Google Scholar
• 9. Blander S.J., Horwitz M.A.: Major cytoplasmic membrane proteinof Legionella pneumophila, a genus common antigen and member ofthe hsp60 family of heat shock proteins, induces protective immunityin a guinea pig model of Legionnaires’ disease. J. Clin. Invest.,1993; 91: 717-723
  Google Scholar
• 10. Bolhassani A., Rafati S.: Heat-shock proteins as powerful weaponsin vaccine development. Expert Rev. Vaccines, 2008; 7: 1185-1199
  Google Scholar
• 11. Bolhassani A., Zahedifard F., Taghikhani M., Rafati S.: Enhancedimmunogenicity of HPV16E7 accompanied by Gp96 as an adjuvantin two vaccination strategies. Vaccine, 2008; 26: 3362-3370
  Google Scholar
• 12. Bonato V.L., Lima V.M., Tascon R.E., Lowrie D.B., Silva C.L.: Identificationand characterization of protective T cells in hsp65 DNA–vaccinated and Mycobacterium tuberculosis-infected mice. Infect.Immun., 1998; 66: 169-175
  Google Scholar
• 13. Burkholder K.M., Bhunia A.K.: Listeria monocytogenes uses Listeriaadhesion protein (LAP) to promote bacterial transepithelialtranslocation and induces expression of LAP receptor Hsp60. Infect.Immun., 2010; 78: 5026-5073
  Google Scholar
• 14. Chen D.X., Su Y.R., Shao G.Z., Qian Z.C.: Purification of heat shockprotein 70-associated tumor peptides and its antitumor immunityon hepatoma in mice. World J. Gastroenterol., 2004; 10: 361-365
  Google Scholar
• 15. Chen W., Syldath U., Bellmann K., Burkart V., Kolb H.: Human60-kDa heat-shock protein: a danger signal to the innate immunesystem. J. Immunol., 1999; 162: 3212-3219
  Google Scholar
• 16. Cohen – Sfady M., Nussbaum G., Pevsner-Fischer M., Mor F.,Carmi P., Zanin-Zhorov A., Lider O., Cohen I.R.: Heat shock protein 60 activates B cells via TLR4-MyD88 pathway. J. Immunol., 2005;175: 3594-3602
  Google Scholar
• 17. Davey M.E., O’toole G.A.: Microbial biofilms: from ecology tomolecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2000; 64: 847-867
  Google Scholar
• 18. de Bastos Ascenço Soares R., Gomez F.J., de Almeida Soares C.M.,Deepe G.S.Jr.: Vaccination with heat shock protein 60 induces a protectiveimmune response against experimental Paracoccidioides brasiliensispulmonary infection. Infect. Immun., 2008; 76: 4214-4221
  Google Scholar
• 19. de Graaf R., Kloppenburg G., Kitslaar P.J., Bruggeman C.A., StassenF.: Human heat shock protein 60 stimulates vascular smooth musclecell proliferation trough Toll-like receptors 2 and 4. MicrobesInfect., 2006; 8: 1859-1865
  Google Scholar
• 20. Deepe G.S.Jr., Gibbons R.S.: Cellular and molecular regulation ofvaccination with heat shock protein 60 from Histoplasma capsulatum.Infect. Immun., 2002; 70: 3759-3767
  Google Scholar
• 21. Dobson C.M., Karplus M.: The fundamentals of protein folding:Bringing together theory and experiment. Curr. Opin. Struct. Biol.,1999; 9: 92-101
  Google Scholar
• 22. Douglas N.R., Reissmann S., Zhang J., Chen B., Jakana J., KumarR., Chiu W., Frydman J.: Dual action of ATP hydrolysis couples lidclosure to substrate release into the group II chaperonin chamber.Cell, 2011; 144: 240-252
  Google Scholar
• 23. Dybdahl B., Wahba A., Lien E., Flo T.H., Waage A., Qureshi N.,Sellevold O.F., Espevik T., Sundan A.: Inflammatory response afteropen heart surgery: release of heat-shock protein 70 and signalingthrough toll-like receptor-4. Circulation, 2002; 105: 685-690
  Google Scholar
• 24. Dziewanowska K., Carson A.R., Patti J.M., Deobald C.F., BaylesK.W., Bohach G.A.: Staphylococcal fibronectin binding protein interactswith heat shock protein 60 and integrins: role in internalizationby epithelial cells. Infect. Immun., 2000; 68: 6321-6328
  Google Scholar
• 25. Ensgraber M., Loos M.: A 66-kilodalton heat shock protein ofSalmonella typhimurium is responsible for binding of the bacteriumto intestinal mucus. Infect. Immun., 1992; 60: 3072-3078
  Google Scholar
• 26. Eton O., Ross M.I., East M.J., Mansfield P.F., Papadopoulos N.,Ellerhorst J.A., Bedikian A.Y., Lee J.E.: Autologous tumor-derivedheat-shock protein peptide complex-96 (HSPPC-96) in patients withmetastatic melanoma. J. Transl. Med., 2010; 8: 9
  Google Scholar
• 27. Ferrarini M., Heltai S., Zocchi M.R., Rugarli C.: Unusual expressionand localization of heat-shock proteins in human tumor cells.Int. J. Cancer, 1992; 51: 613-619
  Google Scholar
• 28. Fink A.L.: Chaperone-mediated protein folding. Physiol. Rev.,1999; 79: 425-449
  Google Scholar
• 29. Flohé S.B., Brüggemann J., Lendemans S., Nikulina M., MeierhoffG., Flohé S., Kolb H.: Human heat shock protein 60 induces maturationof dendritic cells versus a Th1-promoting phenotype. J. Immunol.,2003; 170: 2340-2348
  Google Scholar
• 30. Frisk A., Ison C.A., Lagergard T.: GroEL heat shock protein of Haemophilusducreyi: association with cell surface and capacity to bindto eukaryotic cells. Infect. Immun., 1998; 66: 1252-1257
  Google Scholar
• 31. Frydman J., Nimmesgern E., Erdjument-Bromage H., Wall J.S.,Tempst P., Hartl F.U.: Function in protein folding of TRiC, a cytosolicring complex containing TCP-1 and structurally related subunits.EMBO J., 1992; 11: 4767-4778
  Google Scholar
• 32. Fujiwara K., Ishihama Y., Nakahigashi K., Soga T., Taguchi H.:A systematic survey of in vivo obligate chaperonin-dependent substrates.EMBO J., 2010; 29: 1552-1564
  Google Scholar
• 33. Gallaher T.K., Wu S., Webster P., Aguilera R.: Identification ofbiofilm proteins in non-typeable Haemophilus influenzae. BMC Microbiol.,2006; 6: 65
  Google Scholar
• 34. Gao B., Tsan M.F.: Endotoxin contamination in recombinanthuman heat shock protein 70 (Hsp70) preparation is responsiblefor the induction of tumor necrosis factor α release by murine macrophages.J. Biol. Chem., 2003; 278: 174-179
  Google Scholar
• 35. Gao B., Tsan M.F.: Recombinant human heat shock protein 60does not induce the release of tumor necrosis factor α from murinemacrophages. J. Biol. Chem., 2003; 278: 22523-22529
  Google Scholar
• 36. Gao Y.L., Brosnan C.F., Raine C.S: Experimental autoimmuneencephalomyelitis. Qualitative and semiquantitative differences inheat shock protein 60 expression in the central nervous system. J.Immunol., 1995; 154: 3548-3556
  Google Scholar
• 37. Garduño R.A., Faulkner G., Trevors M.A., Vats N., Hoffman P.S.:Immunolocalization of Hsp60 in Legionella pneumophila. J. Bacteriol.,1998; 180: 505-513
  Google Scholar
• 38. Garduño R.A., Garduño E., Hoffman P.S.: Surface-associatedHsp60 chaperonin of Legionella pneumophila mediates invasion ina HeLa cell model. Infect. Immun., 1998; 66: 4602-4610
  Google Scholar
• 39. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W., Stokłosa T.: Immunologia.Wydawnictwo PWN, Warszawa 2009
  Google Scholar
• 40. Gomez F.J., Allendoerfer R., Deepe G.S.Jr.: Vaccination with recombinantheat shock protein 60 from Histoplasma capsulatum protectsmice against pulmonary histoplasmosis. Infect. Immun., 1995;63: 2587-2595
  Google Scholar
• 41. Goulhen F., Hafezi A., Uitto V.J., Hinode D., Nakamura R., GrenierD., Mayrand D.: Subcellular localization and cytotoxic activity of theGroEL-Like protein isolated from Actinobacillus actinomycetemcomitans.Infect. Immun., 1998; 66: 5307-5313
  Google Scholar
• 42. Habich C., Baumgart K., Kolb H., Burkart V.: The receptor for heatshock protein 60 on macrophages is saturable, specific, and distinct fromreceptors for other heat shock proteins. J. Immunol., 2002; 168: 569-576
  Google Scholar
• 43. Habich C., Burkart V.: Heat shock protein 60: regulatory role oninnate immune cells. Cell. Mol. Life Sci., 2007; 64: 742-751
  Google Scholar
• 44. Habich C., Kempe K., Burkart V., van der Zee R., Lillicrap M.,Gaston H., Kolb H.: Identification of the heat shock protein 60 epitopeinvolved in receptor binding on macrophages. FEBS Lett., 2004;568: 65-69
  Google Scholar
• 45. Habich C., Kempe K., Gomez F.J., Lillicrap M., Gaston H., van derZee R., Kolb H., Burkart V.: Heat shock protein 60: identification ofspecific epitopes for binding to primary macrophages. FEBS Lett.,2006; 580: 115-120
  Google Scholar
• 46. Habich C., Kempe K., van der Zee R., Burkart V. Kolb H.: Differentheat shock protein 60 species share pro-inflammatory activitybut not binding sites on macrophages. FEBS Lett., 2003; 533: 105-109
  Google Scholar
• 47. Habich C., Kempe K., van der Zee R., Rümenapf R., Akiyama H.,Kolb H., Burkart V.: Heat shock protein 60: specific binding of lipopolysaccharide.J. Immunol., 2005; 174: 1298-1305
  Google Scholar
• 48. Hartl F.U.: Molecular chaperones in cellular protein folding.Nature, 1996; 381: 571-580
  Google Scholar
• 49. Hartl F.U., Bracher A., Hayer-Hartl M.: Molecular chaperones inprotein folding and proteostasis. Nature, 2011; 475: 324-332
  Google Scholar
• 50. Hartl F.U., Hayer-Hartl M.: Molecular chaperones in the cytosol:from nescent chain to folded protein. Science, 2002; 295: 1852-1858
  Google Scholar
• 51. Hartley M.G., Green M., Choules G., Rogers D., Rees D.G., NewsteadS., Sjostedt A., Titball R.W.: Protection afforded by heat shockprotein 60 from Francisella tularensis is due to copurified lipopolysaccharide.Infect. Immun., 2004; 72: 4109-4113
  Google Scholar
• 52. Henderson B.R., Pfister G., Boeck G., Kind M., Wick G.: Expressionlevels of heat shock protein 60 in human endothelial cells invitro are unaffected by exposure to 50 Hz magnetic fields. Cell StressChaperones, 2003; 8: 172-182
  Google Scholar
• 53. Hennequin C., Porcheray F., Waligora-Dupriet A.J., Collignon A.,Barc M.C., Bourlioux P., Karjalainen T.: GroEL (Hsp60) of Clostridiumdifficile is involved in cell adherence. Microbiology, 2001; 147: 87-96
  Google Scholar
• 54. Hightower L.E., Hendershot L.M.: Molecular chaperones andthe heat shock response at Cold Spring Harbor. Cell Stress Chaperones,1997; 2: 1-11
  Google Scholar
• 55. Hirata D., Hirai I., Iwamoto M., Yoshio T., Takeda A., MasuyamaJ.I., Mimori A., Kano S., Minota S.: Preferential binding withEscherichia coli hsp60 of antibodies prevalent in sera from patientswith rheumatoid arthritis. Clin. Immunol. Immunopathol., 1997;82: 141-148
  Google Scholar
• 56. Hu Y., Mivechi N.F.: HSF-1 interacts with Ral-binding protein 1in a stress – responsive, multiprotein complex with HSP90 in vivo. J.Biol. Chem., 2003; 278: 17299-17306
  Google Scholar
• 57. Huang C.Y., Chen C.A., Lee C.N., Chang M.C., Su Y.N., Lin Y.C.,Hsieh C.Y., Cheng W.F.: DNA vaccine encoding heat shock protein 60 co-linked to HPV16 E6 and E7 tumor antigens generates morepotent immunotherapeutic effects than respective E6 or E7 tumorantigens. Gynecol. Oncol., 2007; 107: 404-412
  Google Scholar
• 58. Jaradat Z.W., Wampler J.W., Bhunia A.W.: A Listeria adhesionprotein-deficient Listeria monocytogenes strain shows reduced adhesionprimarily to intestinal cell lines. Med. Microbiol. Immunol.,2003; 192: 85-91
  Google Scholar
• 59. Jefferson K.K.: What drives bacteria to produce a biofilm? FEMSMicrobiol. Lett., 2004; 236: 163-173 60 Kaneda K., Masuzawa T., Yasugami K., Suzuki T., Suzuki Y., YanagiharaY.: Glycosphingolipid-binding protein of Borrelia burgdorferisensu lato. Infect. Immun., 1997; 65: 3180-3185
  Google Scholar
• 60. acts as a receptor for the Listeria adhesion protein in Caco-2cells. Infect. Immun., 2004; 72: 931-936
  Google Scholar
• 61. Kaźmierczuk A., Kiliańska Z.M.: Plejotropowa aktywność białekszoku cieplnego. Postępy Hig. Med. Dośw., 2009; 63: 502-521
  Google Scholar
• 62. Kol A., Lichtman A.H., Finberg R.W., Libby P., Kurt-Jones E.A.:Cutting edge: heat shock protein (HSP) 60 activates the innate immuneresponse: CD14 is an essential receptor for HSP60 activationof mononuclear cells. J. Immunol., 2000; 164: 13-17
  Google Scholar
• 63. Lehner T., Lavery E., Smith R., van der Zee R., Mizushima Y., ShinnickT.: Association between the 65-kilodalton heat shock protein,Streptococcus sanguis, and the corresponding antibodies in Behcet’ssyndrome. Infect. Immun., 1991; 59: 1434-1441
  Google Scholar
• 64. Lindquist S., Craig E.A.: The heat-shock proteins. Ann. Rev. Genet.,1988; 22: 631-677
  Google Scholar
• 65. Lűneberg E., Műller D., Steinmetz I., Frosch M.: Monoclonalantibody against species-specific epitope of Pseudomonas aeruginosaHsp60 protein cross-reacts with Pseudomonas stutzeri and other Pseudomonasspecies. FEMS Microbiol. Lett., 1997; 154: 131-137
  Google Scholar
• 66. Maeda H., Miyamoto M., Kokeguchi S., Kono T., Nishimura F.,Takashiba S., Murayama Y.: Epitope mapping of heat shock protein 60 (GroEL) from Porphyromonas gingivalis. FEMS Immunol. Med. Microbiol.,2000; 28: 219-224
  Google Scholar
• 67. Merbl Y., Zucker-Toledano M., Quintana F.J., Cohen I.R.: Newbornhumans manifest autoantibodies to defined self molecules detectedby antigen microarray informatics. J. Clin. Invest., 2007; 117: 712-718
  Google Scholar
• 68. Multhoff G., Hightower L.E.: Cell surface expression of the heatshock proteins and the immune response. Cell Stress Chaperones,1996; 1: 167-176
  Google Scholar
• 69. Muñoz I.G., Yébenes H., Zhou M., Mesa P., Serna M., Park A.Y.,Bragado-Nilsson E., Beloso A., de Cárcer G., Malumbres M., RobinsonC.V., Valpuesta J.M., Montoya G.: Crystal structure of the openconformation of the mammalian chaperonin CCT in complex withtubulin. Nat. Struct. Mol. Biol., 2011; 18: 14-19
  Google Scholar
• 70. Noll A., Autenrieth I.B.: Immunity against Yersinia enterocoliticaby vaccination with Yersinia HSP60 immunostimulating complexesor Yersinia HSP60 plus interleukin-12. Infect. Immun., 1996; 64:2955-2961
  Google Scholar
• 71. Noll A., Roggenkamp A., Heesemann J., Autenrieth I.B.: Protectiverole for heat shock protein-reactive αβ T cells in murine yersiniosis.Infect. Immun., 1994; 62: 2784-2791
  Google Scholar
• 72. Osterloh A., Kalinke U., Weiss S., Fleischer B., Breloer M.: Synergisticand differential modulation of immune responses by Hsp60and lipopolysaccharide. J. Biol. Chem., 2007; 282: 4669-4680
  Google Scholar
• 73. Osterloh A., Veit A., Gessner A., Fleischer B., Breloer M.: Hsp60– mediated T cell stimulation is independent of TLR4 and IL-12. Int.Immunol., 2008; 20: 433-443
  Google Scholar
• 74. Paliwal P.K., Bansal A., Sagi S.S., Mustoori S., Govindaswamy I.:Cloning, expression and characterization of heat shock protein 60(groEL) of Salmonella enterica serovar Typhi and its role in protectiveimmunity against lethal Salmonella infection in mice. Clin. Immunol.,2008; 126: 89-96
  Google Scholar
• 75. Parcellier A., Gurbuxani S., Schmitt E., Solary E., Garrido C.:Heat shock proteins, cellular chaperones that modulate mitochondrialcell death pathways. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003;304: 505-512
  Google Scholar
• 76. Pivovarova A.V., Mikhailova V.V., Chernik I.S., Chebotareva N.A.,Levitsky D.I., Gusev N.B.: Effects of small heat shock proteins on thethermal denaturation and aggregation of F-actin. Biochem. Biophys.Res. Commun., 2005; 331: 1548-1553
  Google Scholar
• 77. Poccia F., Piselli P., Di Cesare S., Bach S., Colizzi V., Mattei M., BolognesiA., Stirpe F.: Recognition and killing of tumor cells expressingheat shock protein 65kD with immunotoxins containing saporin. Br.J. Cancer, 1992; 66: 427-432
  Google Scholar
• 78. Pockley A.G.: Heat shock proteins in health and disease: therapeutictargets or therapeutic agents? Expert. Rev. Mol. Med., 2001;3: 1-21
  Google Scholar
• 79. Pockley A.G.: Heat shock proteins as a regulators of the immuneresponse. Lancet, 2003; 362: 469-476
  Google Scholar
• 80. Powers M.V., Workman P.: Inhibitors of the heat shock response:biology and pharmacology. FEBS Lett., 2007; 581: 3758-3769
  Google Scholar
• 81. Quintana F.J., Carmi P., Mor F., Cohen I.R.: Inhibition of adjuvantarthritis by a DNA vaccine encoding human heat shock protein 60.J. Immunol., 2002; 169: 3422-3428
  Google Scholar
• 82. Quintana F.J., Carmi P., Mor F., Cohen I.R.: DNA fragments ofthe human 60-kDa heat shock protein (HSP60) vaccinate againstadjuvant arthritis: identification of a regulatory HSP60 peptide. J.Immunol., 2003; 171: 3533-3541
  Google Scholar
• 83. Quintana F.J., Cohen I.R.: The HSP60 immune system network.Trends Immunol., 2011; 32: 89-95
  Google Scholar
• 84. Quintana F.J., Mimran A., Carmi P., Mor F., Cohen I.R.: HSP60 asa target of anti-ergotypic regulatory T cells. PLoS One, 2008; 3: e4026
  Google Scholar
• 85. Radford S.E.: Protein folding: progress made and promises ahead.Trends Biochem. Sci., 2000; 25: 611-618
  Google Scholar
• 86. Rafati S., Gholami E., Hassani N., Ghaemimanesh F., Taslimi Y.,Taheri T., Soong L.: Leishmania major heat shock protein 70 (HSP70)is not protective in murine models of cutaneous leishmaniasis andstimulates strong humoral responses in cutaneous and visceral leishmaniasispatients. Vaccine, 2007; 25: 4159-4169
  Google Scholar
• 87. Ramage J.M., Young J.L., Goodall J.C., Gaston J.S.: T cell responsesto heat shock protein 60: differential responses by CD4+ T cellsubsets according to their expression of CD45 isotypes. J. Immunol.,1999; 162: 704-710
  Google Scholar
• 88. Rambukkana A., Das P.K., Witkamp L., Yong S., Meinardi M.M.,Bos J.D.: Antibodies to mycobacterial 65-kDa heat shock protein andother immunodominant antigens in patients with psoriasis. J. Invest.Dermatol., 1993; 100: 87-92
  Google Scholar
• 89. Rank R.G., Dascher C., Bowlin A.K., Bavoil P.M.: Systemic immunizationwith Hsp60 alters the development of chlamydial oculardisease. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1995; 36: 1344-1351
  Google Scholar
• 90. Rapp U.K., Kaufmann S.H.: DNA vaccination with pg96-peptidefusion proteins induces protection against an intracellular bacterialpathogen. Int. Immunol., 2004; 16: 597-605
  Google Scholar
• 91. Reiner D.S., Shinnick T.M., Ardeshir F., Gillin F.D.: Encystationof Gardia lamblia leads to expression of antigens recognized by antibodiesagainst conserved heat shock proteins. Infect. Immun.,1992; 60: 5312-5315
  Google Scholar
• 92. Reissmann S., Parnot C., Booth C.R., Chiu W, Frydman J.: Essentialfunction of the built-in lid in the allosteric regulation of eukaryoticor archaeal chaperonins. Nat. Struct. Mol. Biol., 2007; 14: 432-440
  Google Scholar
• 93. Retzlaff C., Yamamoto Y., Hoffman P.S., Friedman H., Klein T.W.:Bacterial heat shock proteins directly induce cytokine mRNA andinterleukin-1 secretion in macrophage cultures. Infect. Immun.,1994; 62: 5689-5693
  Google Scholar
• 94. Rico A.I., Del Real G., Soto M., Quijada L., Martinez-A. C., AlonsoC., Requena J.M.: Characterization of the immunostimulatory propertiesof Leishmania infantum HSP70 by fusion to the Escherichia colimaltose-binding protein in normal and nu/nu BALB/c mice. Infect.Immun., 1998; 66: 347-352
  Google Scholar
• 95. Sandal I., Hong W., Swords W.E., Inzana T.J.: Characterizationand comparison of biofilm development by pathogenic and commensalisolates of Histophilus somni. J. Bacteriol., 2007; 189: 8179-8185
  Google Scholar
• 96. Sandal I., Shao J.Q., Annadata S., Apicella M.A., Boye M., JensenT.K., Saunders G.K., Inzana T.J.: Histophilus somni biofilm formationin cardiopulmonary tissue of the bovine host following respiratorychallenge. Microbes. Infect., 2009; 11: 254-263
  Google Scholar
• 97. Srivastava P.: Roles of heat-shock proteins in innate and adaptiveimmunity. Nat. Rev. Immunol., 2002; 2: 185-194
  Google Scholar
• 98. Tabeta K., Yamazaki K., Hotokezaka H., Yoshie H., Hara K.: Elevatedhumoral immune response to heat shock protein 60 (hsp60) familyin periodontitis patients. Clin. Exp. Immunol., 2000; 120: 285-293
  Google Scholar
• 99. Tsan M.F., Gao B.: Cytokine function of heat shock proteins. Am.J. Physiol. Cell. Physiol., 2004; 286: C739-C744
  Google Scholar
• 100. Tsan M.F., Gao B.: Heat shock proteins and immune system. J.Leukoc. Biol., 2009; 85: 905-910
  Google Scholar
• 101. Wallin R.P., Lundqvist A., Moré S.H., von Bonin A., Kiessling R., Ljunggren H.G.: Heat-shock proteins as activators of the innateimmune system. Trends Immunol., 2002; 23: 130-135
  Google Scholar
• 102. Wampler J.L., Kim K.P., Jaradat Z., Bhunia A.K.: Heat shock protein
  Google Scholar
• 103. Wand-Württenberger A., Schoel B., Ivanyi J., Kaufmann S.H.:Surface expression by mononuclear phagocytes of an epitope sharedwith mycobacterial heat shock protein 60. Eur. J. Immunol.,1991; 21: 1089-1092
  Google Scholar
• 104. Watanabe K., Tachibana M., Tanaka S., Furuoka H., Horiuchi M.,Suzuki H., Watarai M.: Heat shock cognate protein 70 contributes toBrucella invasion into trophoblast giant cells that cause infectiousabortion. BMC Microbiol., 2008; 8: 212
  Google Scholar
• 105. Weeratna R., Stamler D.A., Edelstein P.H., Ripley M., Marrie T.,Hoskin D., Hoffman P.S.: Human and guinea pig immune responsesto Legionella pneumophila protein antigens OmpS and Hsp60. Infect.Immun., 1994; 62: 3454-3462
  Google Scholar
• 106. Westerheide S.D., Morimoto R.I.: Heat shock response modulatorsas therapeutic tools for diseases of protein conformation. J.Biol. Chem., 2005; 280: 33097-33100
  Google Scholar
• 107. Wick G., Jakic B., Buszko M., Wick M.C., Grundtman C.: Therole of heat shock proteins in atherosclerosis. Nat. Rev. Cardiol.,2014; 11: 516-529
  Google Scholar
• 108. Wilhelm V., Soza C., Martinez R., Rosemblatt M., Burzio L.O.,Valenzuela P.D.: Production and immune response of recombinantHsp60 and Hsp70 from the salmon pathogen Piscirickettsia salmonis.Biol. Res., 2005; 38: 69-82
  Google Scholar
• 109. Yamaguchi H., Osaki T., Kai M., Taguchi H., Kamiya S.: Immuneresponse against a cross-reactive epitope on the heat shockprotein 60 homologue of Helicobacter pylori. Infect. Immun., 2000;68: 3448-3454
  Google Scholar
• 110. Yamaguchi H., Osaki T., Taguchi H., Hanawa T., Yamamoto T.,Kamiya S.: Flow cytometric analysis of the heat shock protein 60expressed on the cell surface of Helicobacter pylori. J. Med. Microbiol.,1996; 45: 270-277
  Google Scholar
• 111. Yamaguchi H., Osaki T., Taguchi H., Sato N., Toyoda A., TakahashiM., Kai M., Nakata N., Komatsu A., Atomi Y., Kamiya S.: Effectof bacterial flora on postimmunization gastritis following oral vaccinationof mice with Helicobacter pylori heat shock protein 60. Clin.Diagn. Lab. Immunol., 2003; 10: 808-812
  Google Scholar
• 112. Yi Y., Yang X., Brunham R.C.: Autoimmunity to heat shockprotein 60 and antigen-specific production of interleukin-10. Infect.Immun., 1997; 65: 1669-1674
  Google Scholar
• 113. Young D., Lathigra R., Hendrix R., Sweetser D., Young R.A.:Stress proteins are immune targets in leprosy and tuberculosis.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988; 85: 4267-4270
  Google Scholar
• 114. Zanin-Zhorov A., Bruck R., Tal G., Oren S., Aeed H., HershkovizR., Cohen I.R., Lider O.: Heat shock protein 60 inhibits Th1-mediatedhepatitis model via innate regulation of Th1/Th2 transcription factorsand cytokines. J. Immunol., 2005; 174: 3227-3236
  Google Scholar
• 115. Zanin-Zhorov A., Cahalon L., Tal G., Margalit R., Lider O., CohenI.R.: Heat shock protein 60 enhances CD4+CD25+ regulatory Tcell function via innate TLR2 signaling. J. Clin. Invest., 2006; 116:2022-2032
  Google Scholar
• 116. Zanin-Zhorov A., Nussbaum G., Franitza S., Cohen I.R., LiderO.: T cells respond to heat shock protein 60 via TLR2: activation ofadhesion and inhibition of chemokine receptors. FASEB J., 2003;17: 1567-1569
  Google Scholar
• 117. Zanin-Zhorov A., Tal G., Shivtiel S., Cohen M., Lapidot T., NussbaumG., Margalit R., Cohen I.R., Lider O.: Heat shock protein 60activates cytokine-associated negative regulator suppressor of cytokinesignaling 3 in T cells: effects on signaling, chemotaxis, andinflammation. J. Immunol., 2005; 175: 276-285
  Google Scholar
• 118. Zarankiewicz T., Madej J., Galli J., Bajzert J., Stefaniak T.: Inhibitionof in vitro Histophilus somni biofilm production by recombinantHsp60 antibodies. Pol. J. Vet. Sci., 2012; 15: 373-378
  Google Scholar
• 119. Zhang S.M., Sun D.C., Lou S., Bo X.C., Lu Z., Qian X.H., WangS.Q.: HBx protein of hepatitis B virus (HBV) can form complex withmitochondrial HSP60 and HSP70. Arch. Virol., 2005; 150: 1579-1590
  Google Scholar
• 120. Zügel U., Kaufmann S.H.: Role of heat shock proteins in protectionfrom and pathogenesis of infectious diseases. Clin. Microbiol.Rev., 1999; 12: 19-39
  Google Scholar

Pełna treść artykułu