Streszczenie

Błona zewnętrzna bakterii Gram-ujemnych jest strukturą biologiczną o unikalnej budowie, która w znacznym stopniu przyczynia się do przeżycia bakterii w niesprzyjających warunkach organizmu gospodarza. Lipopolisacharyd buduje około 70% eksponowanej do środowiska powierzchni błony zewnętrznej i jest zbudowany z trzech, różniących się pod względem strukturalnym części: lipidu A, oligocukru rdzenia oraz antygenu O. Część O-swoista lipopolisacharydu tworzy jedną z najintensywniej badanych struktur powierzchniowych polisacharydów bakteryjnych. Jednak wiele pytań dotyczących mechanizmu biosyntezy antygenu O i jego transportu na powierzchnię komórki wciąż pozostaje bez odpowiedzi. W pracy opisano biosyntezę cząsteczki LPS, ze szczególnym uwzględnieniem biosyntezy łańcucha O-swoistego, sposobu regulacji długości cząsteczek LPS oraz wpływu typu syntetyzowanego łańcucha O-swoistego na przeżywalność bakterii w niesprzyjającym środowisku organizmu gospodarza.

Wprowadzenie

Lipopolisacharyd (lipopolysaccharide, LPS) tworzy około 70% powierzchni błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych i jest niezbędny do funkcjonowania drobnoustroju. Cząsteczka LPS chroni bakterię przed mechanizmami obronnymi gospodarza i działaniem antybiotyków [50, 72] oraz jest jednym z najważniejszych czynników wirulencji u bakterii Gram-ujemnych. W budowie lipopolisacharydu można wyróżnić trzy domeny strukturalne: lipid A, rdzeń oraz łańcuch O-swoisty (antygen O) zbudowany z powtarzających się jednostek polisacharydowych, tzw. podjednostek O-swoistych (ryc. 1). Lipid A jest kowalencyjnie związany z rdzeniem i odpowiada za kotwiczenie LPS w błonie zewnętrznej. Ta część LPS była powszechnie uważana za najbardziej konserwatywną, jednak w latach 90 ub.w. wykazano, że lipid A po syntezie może ulegać znacznym modyfikacjom [41, 42, 43], co wpływa na heterogenność jego struktury u różnych gatunków bakterii [84]. W lipidzie A można wyróżnić składnik sacharydowy, kwasy tłuszczowe oraz hydrofilowe podstawniki (m.in. grupy fosforanowe, etanoloamina). Najbardziej konserwatywną częścią lipidu A jest część cukrowa, najczęściej zbudowana z dwóch cząsteczek glukozaminy połączonych wiązaniem 
β(1->6) glikozydowym, podstawionych nierozgałęzionymi, nasyconymi kwasami tłuszczowymi (2-hydroksykwasy, 3-hydroksykwasy), które nadają cząsteczce charakter amfifilowy [72]. Ze względu na unikatową budowę lipid A determinuje aktywność biologiczną LPS i stanowi centrum toksyczności cząsteczki.

Rdzeń oligosacharydowy jest połączony z lipidem A wiązaniem ketozydowym. W obrębie rdzenia można wyróżnić dwa umowne regiony: zewnętrzny – w skład którego wchodzą głównie heksozy oraz region wewnętrzny – zbudowany z heptoz oraz kwasu 3-deoksy-D-manno-oktulozonowego (Kdo). Najbardziej eksponowaną do środowiska zewnętrznego częścią LPS jest łańcuch O-swoisty zbudowany z kilkunastu do kilkudziesięciu powtarzających się podjednostek polisacharydowych, zawierających 1-8 reszt cukrowych. Polimery te wykazują się dużą zmiennością ze względu na charakter chemiczny poszczególnych podjednostek węglowodanowych. Antygeny O różnią się od siebie składem chemicznym, sekwencją ułożenia cukrów, typem wiązań, odgałęzieniami bocznymi lub zawartością niecukrowych podstawników [60, 72, 105]. Powyższe modyfikacje wpływają na ogromną różnorodność łańcuchów O-swoistych, dotychczas opisano 186 różnych antygenów O dla Escherichia coli (w tym Shigella sp.), 54 dla Salmonella enterica, 193 dla Vibrio cholerae i około 20 dla Pseudomonas aeruginosa [99, 105, 108]. Łańcuch O-swoisty, jako najbardziej eksponowana na powierzchni błony zewnętrznej struktura, jest jednym z podstawowych składników, niezbędnym do przetrwania bakterii w tkankach gospodarza. Bakterie wykorzystują antygen O m.in. do unikania fagocytozy oraz litycznego działania układu dopełniacza [38, 40, 81, 82]. Natomiast z klinicznego punktu widzenia antygeny O są niezwykle ważnym czynnikiem różnicującym bakterie w obrębie gatunku, pozwalającym na określenie przynależności do konkretnego serowaru.

Precyzyjne poznanie szlaków zaangażowanych w syntezę antygenów O ma zasadnicze znaczenie dla rozwoju następnej generacji środków leczniczych. Odkrycie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw syntezy łańcucha O-swoistego i kontrolowania jego długości przez bakterie ma podstawowe znaczenie biomedyczne. Antygen O jest jedną z najintensywniej badanych struktur powierzchniowych polisacharydów bakteryjnych. Jednak wiele pytań dotyczących mechanizmu biosyntezy antygenu O i jego transportu na powierzchnię komórki bakteryjnej pozostaje jeszcze bez odpowiedzi.

Biosynteza lipopolisacharydu – ze szczególnym uwzględnieniem biosyntezy łańcucha O-swoistego

Biosynteza części lipidowo-rdzeniowej LPS

Pierwszym etapem biosyntezy pełnej cząsteczki LPS jest synteza lipidu A, która zachodzi po cytoplazmatycznej stronie błony wewnętrznej. Do syntezy cząsteczki Kdo2-lipid A, będącej akceptorem części oligosacharydowego rdzenia, potrzebne jest zaangażowanie dziewięciu enzymów [30, 96]. Biosynteza LPS u E. coli rozpoczyna się od małej cząsteczki, UDP-N-acetyloglukozaminy (UDP-GlcNAc), w której grupa OH przy atomie węgla 3C w pierwszym etapie biosyntezy podstawiona zostaje resztą 3-hydroksylowego kwasu tłuszczowego przez acylotransferazę LpxA. Enzym LpxA do tego procesu wykorzystuje białkowy przenośnik grup acylowych – białko acyl-ACP, które jest donorem reszt kwasów tłuszczowych. Acylotransferazy LpxA są bardzo selektywne dla przyłączanych reszt hydroksykwasów o różnej długości np. u Helicobacter pylori są podstawiane 16-węglowe łańcuchy hydroksyacylowe, podczas gdy u P. aeruginosa są podstawiane reszty 10-węglowe [130, 134]. U E. coli są przyłączane reszty kwasu mirystynowego [31]. Następnym etapem syntezy cząsteczki Kdo2-lipid A jest przekształcenie powstałego produktu UDP-3-O-(β-hydroksymirystol)-GlcNAc przez metaloamidazę LpxC w UDP-3-O-(β-hydroksymirystol)-D-glukozaminę [107, 131]. Przyłączenie drugiego łańcucha acylowego przez acylotransferazę LpxD prowadzi do powstania UDP-2,3-bis(β-hydroksymirystol)-D-glukozaminy [65]. Ze względu na brak odpowiedników enzymów Lpx u ssaków, enzymy te stanowią obiecujące cele działania dla nowych środków przeciwbakteryjnych [9, 56, 132]. W kolejnym etapie biosyntezy pirofosfataza LpxH hydrolizuje UDP-2,3-bis(β-hydroksymirystol)-D-glukozaminę do monofosforanu urydyny (UMP) oraz lipidu X [5].

W przypadku lipidu A u większości gatunków bakterii następnym etapem biosyntezy jest połączenie powstałego lipidu X z cząsteczką UDP-2,3-diacyl-GlcNAc i wytworzenie charakterystycznego wiązania β(1->6) glikozydowego. Reakcja ta jest katalizowana przez syntazę disacharydową lipidu A LpxB, która kondensuje jedną cząsteczkę UDP-2,3-diacyl-GlcNAc z jedną cząsteczką lipidu X, uwalniając UDP [26]. Następne etapy biosyntezy lipidu A są katalizowane przez integralne białka błony wewnętrznej, które do aktywacji wymagają obecności czynników cytozolowych (LpxK, KdtA, LpxM, LpxL). Białko LpxK katalizuje ATP-zależną fosforylację powstałego wcześniej disacharydu, powodując powstanie lipidu IVA [37]. Do powstałej cząsteczki lipidu IVA transferaza KdtA (WaaA) dołącza dwie cząsteczki Kdo wykorzystując cząsteczkę CMP-Kdo jako donor. Prekursorem dojrzałej cząsteczki Kdo jest rybulozo-5-fosforan, który ulega przekształceniu przez izomerazę yrbH do arabinozo-5-fosforanu, a następnie przez syntazę KdsCA do kwasu 3-deoksy-D-manno-oktulozonowego-8-fosforanu. Fosfataza 8-fosforanu kwasu 3-deoksy-D-manno-oktulozonowego – KdsC – przez usunięcie grupy fosforanowej doprowadza do powstania cząsteczki Kdo, do której syntaza CMP-Kdo KdsB przyłącza CMP. Dojrzała cząsteczka Kdo może zostać przyłączona do cząsteczki lipidu IVA [13, 69, 98]. Powstała cząsteczka Kdo2-lipid IVA ulega dalszym modyfikacjom, które prowadzą do powstania cząsteczki Kdo2-lipid A. Reakcje są katalizowane przez ACP-zależne acylotransferazy LpxL oraz LpxM, odpowiedzialne za przyłączenie kolejnych łańcuchów kwasów tłuszczowych [14, 22].

W skład części wewnętrznej rdzenia oprócz Kdo wchodzą również heptozy (zazwyczaj L-glicero-D-manno-heptopiranozy), natomiast część zewnętrzna rdzenia wykazuje znacznie większą różnorodność strukturalną w porównaniu do części wewnętrznej i można w niej wyróżnić przeważnie sześciowęglowe reszty cukrowe np. galaktozy, glukozy, kwasy uronowe czy glukozaminy [75]. Biosynteza regionu rdzeniowego obejmuje podstawienie cząsteczki Kdo2-lipid A kolejnymi resztami cukrowymi w reakcjach katalizowanych przez glikozylotransferazy.

Geny odpowiedzialne za biosyntezę części rdzeniowej LPS E. coli są zgromadzone w trzech operonach: gmhD (geny odpowiedzialne za biosyntezę oligosacharydów rdzenia wewnętrznego), waaQ (geny odpowiedzialne za biosyntezę oligosacharydów rdzenia zewnętrznego) oraz kdtA, w którym są zgromadzone geny odpowiedzialne za biosyntezę i przyłączanie cząsteczek Kdo [13, 101].

Transport części lipidowo-rdzeniowej LPS do błony wewnętrznej

Prekursory LPS (cząsteczki lipid A-rdzeń, podjednostki O) są składane w cytoplazmie, natomiast ligacja poszczególnych fragmentów LPS w kompletną cząsteczkę zachodzi w peryplazmie, w związku z tym niezbędny jest mechanizm umożliwiający przetransportowanie poszczególnych składowych LPS do przestrzeni peryplazmatycznej. Mechanizm, dzięki któremu odbywa się transport powstałego kompleksu lipidowo-rdzeniowego przez błonę cytoplazmatyczną, wymaga obecności transportera ABC, białka MsbA. Białko MsbA E. coli jest zbudowane z sześciu transbłonowych helis i cytoplazmatycznej domeny wiążącej ATP [20]. Mechanizm transportu wykorzystujący białko MsbA nazwano mechanizmem typu „chwyć i przerzuć” (trap and flip). W tym procesie po związaniu cząsteczki ADP, białko MsbA otwiera się od strony cytoplazmy, dzięki czemu część lipidowo-rdzeniowa LPS może wejść do utworzonego kanału. Następnie białko MsbA zamyka się wokół części lipidowo-rdzeniowej LPS, następuje hydroliza ATP i zmiana konformacji białka, dzięki czemu transportowana cząsteczka jest uwalniana po stronie peryplazmatycznej. Po opuszczeniu białka MsbA przez część lipidowo-rdzeniową LPS, układ ponownie zmienia konformację i kolejna cząsteczka może zostać przetransportowana przez błonę cytoplazmatyczną [78, 126].

Organizacja genów odpowiedzialnych za biosyntezę łańcucha O-swoistego

W zależności od gatunku bakterii, powtarzająca się podjednostka łańcucha O-swoistego składa się z 1-8 reszt cukrowych, ułożonych w sposób liniowy lub rozgałęziony [127]. Pojedyncza podjednostka O powstaje na lipidowym nośniku, osadzonym po cytoplazmatycznej stronie błony wewnętrznej, natomiast montaż kompletnego antygenu O odbywa się w peryplazmie.

Geny odpowiedzialne za syntezę antygenu O można podzielić na trzy główne grupy. W pierwszej wyróżnia się geny odpowiedzialne za syntezę białek uczestniczących w biosyntezie prekursorów cukrowych, wchodzących w skład podjednostki O-swoistej. W drugiej grupie znajdują się geny kodujące białkowe transferazy glikozylowe, odpowiedzialne za przeniesienie prekursorów cukrowych na błonowy nośnik lipidowy, w celu wytworzenia oligosacharydu. Ostatnia grupa genów koduje białka odpowiedzialne za translokację powstałego antygenu O przez błonę wewnętrzną i polimeryzację z wcześniej powstałą cząsteczką lipidowo-rdzeniową [105, 127]. Geny zaangażowane w biosyntezę antygenu O są umiejscowione na chromosomie i tworzą tzw. klaster genów antygenu O. Do najdokładniej zbadanych należą klastery E. coli oraz S. enterica, gdzie geny odpowiedzialne za syntezę łańcucha O-swoistego leżą między genem galF oraz gnd [100]. U niektórych bakterii klastery genów odpowiedzialne za biosyntezę antygenu O są umiejscowione między genami himD a tyrB (P. aeruginosa) [99], gmhD a rjg (V. cholerae) [108] czy hemH oraz gsk (Yersinia sp.) [138]. Uważa się, że geny odpowiedzialne za syntezę antygenu O leżą blisko siebie, są transkrybowane jako jedna jednostka i zawierają mniej GC w stosunku do pozostałej części genomu. Niewielka zawartość GC może wskazywać na międzygatunkowy transfer genów odpowiedzialnych za biosyntezę części O-swoistej z różnych gatunków bakterii [105]. Przenoszeniem genów między różnymi gatunkami bakterii można przynajmniej częściowo wyjaśnić tak dużą różnorodność struktur antygenów O wśród bakterii Gram-ujemnych.

Biosynteza części O-swoistej cząsteczki LPS

Podczas procesu biosyntezy antygenu O można wyróżnić następujące etapy: reakcję inicjacji, wydłużanie i translokację powtarzających się podjednostek O lub kompletnego antygenu O, ligację powstałego antygenu O do części lipidowo-rdzeniowej oraz recykling nośnika Und-P.

Inicjacja reakcji biosyntezy antygenu O rozpoczyna się w cytoplazmie, gdzie są zgromadzone reszty cukrowe (w postaci: UDP-cukier), które wejdą w skład podjednostki O-swoistej. Przyjmuje się, że każdy klaster genów odpowiedzialny za syntezę antygenu O zawiera geny odpowiedzialne za biosyntezę prekursora nukleotydowego poszczególnych cukrów, wchodzących w skład kompletnej powtarzającej się podjednostki antygenu O. Należy jednak zaznaczyć, że geny odpowiedzialne za syntezę cukrów, zaangażowanych w inne, niezbędne komórce do życia szlaki (UDP-Glc, UDP-Gal, UDP-GlcNAc) nie są duplikowane w klasterze genów antygenu O [105]. Niezależnie od rodzaju wykorzystywanej reszty cukrowej reakcja inicjacji biosyntezy antygenu O rozpoczyna się od utworzenia wiązania pomiędzy fosforanem undekaprenylu (Und-P) a wybraną resztą cukrową z uwolnieniem cząsteczki UMP (powstaje Und-PP-związany cukier). Fosforan undekaprenylu jest wbudowanym w błonę wewnętrzną lipidowym nośnikiem z „główką” fosforanową wyeksponowaną do przestrzeni cytoplazmatycznej. W zależności od rodzaju mikroorganizmu reakcja inicjacji jest katalizowana przez enzym należący do jednej z dwóch grup transferaz poliizoprenylofosforanu: N-acetyloheksozamino-1-fosforanowych (polyisoprenyl-phosphate N-acetylhexosamine-1-phosphate transferase, PNPT) lub heksozo-1-fosforanowych (polyisoprenyl-phosphate hexose-1-phosphate transferases, PHPT) [105]. Białka z rodziny PNPT występują zarówno u organizmów eukariotycznych jak i prokariotycznych, natomiast białka z rodziny PHPT nie mają swoich homologów w komórkach eukariotycznych.

Bakteryjne PNPT (np. WecA, MraY, WbpL) są odpowiedzialne za przenoszenie na błonowy nośnik Und-P różnych substratów N-acetyloheksozaminy. Białkiem reprezentującym grupę PNPT jest białko WecA inicjujące biosyntezę antygenu O u szczepów charakteryzujących się łańcuchem O-swoistym, w którego skład wchodzi GalNAc czy GlcNAc [1, 3]. U Enterobacteriaceae gen wecA jest umiejscowiony poza klasterem genów odpowiedzialnym za syntezę antygenu O i tworzy część klastra odpowiedzialnego za syntezę wspólnego antygenu powierzchniowego pałeczek rodziny Enterobacteriaceae (enterobacterial common antigen, ECA).

Przedstawicielem rodziny PHPT jest białko WbaP, po raz pierwszy zidentyfikowane u S. enterica, pełniące funkcję pierwotnej transferazy galaktozy [57]. Innymi transferazami inicjującymi reakcję biosyntezy antygenu O grupy PHPT są np. WbgY i WbIG, odpowiedzialne za przyłączanie odpowiednio 4-n-D-Fuc2NAc-P u Shigella sonnei i Bordetella pertussis [2, 135].

Po zakończeniu reakcji inicjacji konieczne jest przyłączenie dodatkowych reszt cukrowych do stworzenia kompletnej podjednostki O-swoistej. Reakcje elongacji są katalizowane przez swoiste glikozylotransferazy, stanowiące grupę enzymów rozpuszczalnych lub bezpośrednio związanych z błoną plazmatyczną przez oddziaływania jonowe [17]. W przypadku S. enterica grupy B1 wyróżnia się 3 białka odpowiedzialne za przyłączanie kolejnych cukrów i wytworzenie pełnej podjednostki O: białko WbaN odpowiedzialne za przyłączanie cząsteczki ramnozy, WbaU za przyłączanie cząsteczki mannozy oraz WbaV odpowiedzialne za przyłączanie cząsteczki abekwozy [51]. Powstaje gotowa podjednostka O, która na etapie biosyntezy może zostać przetransportowana przez błonę w celu połączenia jej z częścią lipidowo-rdzeniową cząsteczki LPS (ryc.2).

Biosynteza LPS jest złożonym procesem, który wymaga przestrzennej i czasowej koordynacji kilku niezależnych od siebie szlaków. Synteza poszczególnych składników LPS odbywa się w trzech różnych przedziałach komórkowych: cytoplazmie, błonie cytoplazmatycznej oraz peryplazmie. Większość enzymów i genów kodujących białka odpowiedzialne za biosyntezę i eksport LPS zidentyfikowano u E. coli [94, 95, 134], jednak na podstawie analizy sekwencji genetycznych wykazano, że geny zaangażowane w biosyntezę LPS są podobne u większości bakterii Gram-ujemnych [96, 127]. Biosyntezę cząsteczki LPS można podzielić na 2 podstawowe etapy: biosyntezę części lipidowo-rdzeniowej oraz biosyntezę antygenu O.

Transport powtarzającej się podjednostki O przez błonę wewnętrzną

Droga Wzx/Wzy-zależna

Droga Wzx/Wzy-zależna występuje podczas syntezy większości antygenów O, szczególnie w czasie syntezy heteropolisacharydów. Co najmniej trzy białka (Wzx, Wzy i Wzz) są zaangażowane w tę ścieżkę eksportu, jednak brak jest szczegółowych informacji dotyczących sposobu ich wzajemnego oddziaływania.

Po syntezie poszczególnych podjednostek O związanych z lipidowym przenośnikiem Und-P w cytoplazmie, muszą one zostać przetransportowane do przestrzeni peryplazmatycznej. Wszystkie dotychczas przebadane klastry genów odpowiedzialnych za Wzx/Wzy-zależny transport podjednostek O zawierają geny kodujące flipazę Wzx odpowiedzialną za translokację podjednostek cukrowych przez błonę wewnętrzną do przestrzeni peryplazmatycznej [71]. Białka Wzx charakteryzują się bardzo małym podobieństwem w sekwencji aminokwasów, dlatego też obecność genów wzx jest często uważana za cechę swoistą serotypu, a geny wzx mogą być wykorzystywane jako markery genetyczne do rozróżniania między poszczególnymi serotypami [33, 34, 52]. Zmienność sekwencji genów wzx łączono z różnorodnością struktur antygenu O, w licznych badaniach wykazano jednak, że u E. coli flipaza Wzx jest swoista tylko dla pierwszego cukru wchodzącego w skład powtarzającej się podjednostki O-swoistej [32, 76]. Przeczą temu jednak wyniki badań Honga i wsp. [51], którzy wykazali, że u S. enterica z grup B, D2 i E, flipaza Wzx wykazuje znaczną swoistość do całej powtarzającej się podjednostki O. Badacze wykazali, że warianty podjednostek O różniące się pojedynczymi resztami cukrowymi są transportowane z mniejszą wydajnością i wytwarzany jest krótszy antygen O [51]. Drugim składnikiem ścieżki Wzx/Wzy-zależnej jest białko Wzy, które bierze udział w polimeryzacji kolejnych podjednostek O do końca wcześniej przetransportowanej cząsteczki Und-PP-podjednostka O-swoista. Po przyłączeniu powtarzającej się podjednostki uwolniony Und-PP jest przekształcany do aktywnej postaci monofosforylowanej poprzez reakcję defosforylacji. Wykazano, że mutanty z defektem genu wzy wytwarzają LPS zbudowany z jednej podjednostki O-swoistej [23]. Dotychczas przeprowadzono niewiele badań in vitro w związku z czym białko Wzy nie zostało dobrze scharakteryzowane. Trzecim białkiem wchodzącym w skład drogi Wzx/Wzy-zależnej jest białko Wzz, które ze względu na pełnioną funkcję regulacyjną długości O-swoistych polisacharydów zostało scharakteryzowane w osobnym rozdziale.

Droga zależna od transportera ABC

Droga zależna od transportera ABC jest wykorzystywana w antygenach O zbudowanych z powtarzających się podjednostek tego samego cukru (tzw. homopolimeryczne antygeny O). Przykładem mogą być polimannozowe antygeny E. coli O8, O9 i O9a [128]. W tym szlaku zsyntezowany polimer jest transportowany z cytoplazmy do przestrzeni peryplazmatycznej z wykorzystaniem białek wiążących ATP (tzw. transporter ABC). Transporter ABC odpowiedzialny za eksport antygenu O składa się z dwóch domen transmembranowych, kodowanych przez gen wzm oraz dwóch domen wiążących nukleotyd kodowanych przez gen wzt. Po utworzeniu prekursora, którym jest Und-PP-GlcNAc następuje przyłączenie przez glikozylotransferazy adaptora, którym jest cząsteczka cukru. Dopiero po przyłączeniu adaptora następuje przyłączenie następnych podjednostek cukrowych i transport powstałej cząsteczki do przestrzeni peryplazmatycznej przez utworzony przez białka Wzt i Wzm kanał [27].

Droga syntazozależna

Trzeci mechanizm transportu podjednostek O przez błonę wewnętrzną został dotychczas opisany tylko w przypadku antygenu O S. enterica serowar Borreze [62, 63]. Antygen O S. Borreze jest homopolimerem utworzonym z N-acetylomannozaminy (ManNAc). Droga syntazozależna w podobny sposób jak droga ABC-zależna rozpoczyna się od białka WecA [62], a pierwsza reszta cukrowa ManNAc jest przenoszona na cząsteczkę Und-PP z udziałem transferazy WbbE [61]. Następnie syntaza WbbF katalizuje reakcje polimeryzacji, jednocześnie eksportując polisacharydowy łańcuch przez błonę wewnętrzną [28, 64]. Dokładny mechanizm transportu podjednostek O przez syntazę WbbF nie jest w pełni wyjaśniony.

Ligacja antygenu O (powstałego w jednej z trzech wcześniej omówionych dróg) do części lipidowo-rdzeniowej zachodzi po peryplazmatycznej stronie błony wewnętrznej, jednak jej mechanizm nie został w pełni wyjaśniony. Produkt genu waaL wydaje się obecnie jedynym białkiem niezbędnym bakterii do przeprowadzenia ligacji. Reakcja ligacji nie jest jednak unikalna i poza biosyntezą LPS zachodzi również w czasie glikozylacji białek w bakteriach i eukariontach [102].

Wytwarzanie nośnika Und-P w komórce bakteryjnej w bardzo małych ilościach jest czynnikiem ograniczającym biosyntezę antygenów O. Izoprenoidowy nośnik lipidowy jest niezbędny nie tylko do biosyntezy LPS, ale i do biosyntezy peptydoglikanu oraz innych polimerów węglowodanowych. Po procesach inicjacji, wydłużania i translokacji powtarzających się podjednostek O następuje uwolnienie Und-PP po stronie peryplazmatycznej błony komórkowej i przekształcenie do Und-P przez pirofosfatazę [124]. Niektóre bakterie (Bacillus subtilis, B. licheniformis) są zdolne do wytwarzania antybiotyków peptydowych (bacytracyna), które wiążąc się z Und-PP hamują jego defosforylację, blokując recykling Und-PP do Und-P [113, 114]. W przypadku polisacharydów, które wykorzystują do transportu szlak zależny od Wzy/Wzx, działanie bacytracyny może poważnie zaburzyć biosyntezę LPS, ponieważ ta droga transportu wykorzystuje jedną cząsteczkę Und-PP do transportu jednej podjednostki O-swoistej. W przypadku drogi syntazozależnej oraz drogi zależnej od transportera ATP jest wykorzystywana tylko jedna cząsteczka Und-P do transportu całego cukrowego polimeru, w związku z czym recykling Und-PP nie jest czynnikiem ograniczającym biosyntezę LPS i sam proces biosyntezy LPS jest bardziej odporny na działanie antybiotyków peptydowych [55].

Dotychczas opisano co najmniej trzy różne mechanizmy składania i translokacji podjednostek O: drogę Wzx/Wzy-zależną, drogę zależną od transportera ABC oraz drogę syntazozależną.

Transport LPS z przestrzeni peryplazmatycznej do błony zewnętrznej

Dopiero stosunkowo niedawno zidentyfikowano białka odpowiedzialne za transport kompletnych cząsteczek LPS przez przestrzeń peryplazmatyczną na powierzchnię błony zewnętrznej [104]. Transport cząsteczki LPS wymaga współdziałania kompleksu białek Lpt [21]. Sugeruje się, że do transportu LPS przez powstały „mostek białkowy” jest niezbędna hydroliza cząsteczek ATP [87]. W licznych badaniach wykazano, że białkowe mutanty E. coli z niedoborami białek Lpt charakteryzowały się akumulacją cząsteczek LPS w peryplazmie [74, 103, 109]. W skład kompleksu białkowego odpowiedzialnego za transport cząsteczek LPS wchodzą: LptA, LptB, LptC, LptD, LptE, LptF oraz LptG [127]. Uważa się, że ABC transporter LptBFG inicjuje uwolnienie cząsteczek LPS z błony wewnętrznej w celu ułatwienia wejścia cząsteczek w przestrzeń peryplazmatyczną [103, 110]. W następnym etapie LPS jest transportowany przez peryplazmę z udziałem białek LptC, LptA, LptD. Transport cząsteczki LPS przez przestrzeń peryplazmatyczną umożliwiają prawdopodobnie charakterystyczne domeny OstA, zidentyfikowane w grupie białek odpowiedzialnych za jego transport [11, 35, 111, 125, 130]. Białko LptA pełni funkcję łącznika między kompleksami LptBFGC a kompleksem LptDE, natomiast białka LptD i LptE odpowiadają za wbudowanie cząsteczki LPS w błonę zewnętrzną [10, 74, 109, 110]. Mechanizm transportu cząsteczek LPS został opisany dla E. coli, jednak wykazano, że system białek Lpt nie jest konserwatywny dla wszystkich bakterii [44, 117]. Dokładne poznanie mechanizmu transportu cząsteczek LPS do błony zewnętrznej u różnych gatunków bakterii wymaga dalszych, systematycznych badań wykraczających poza badania przeprowadzone dotychczas dla E. coli.

Kontrola długości cząsteczki lipopolisacharydu

Antygeny O różnią się nie tylko składem chemicznym, ale także liczbą powtarzających się podjednostek w łańcuchu polisacharydowym. Przeprowadzona analiza rozkładu długości poprzez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE) [16, 38, 54, 118] wykazuje, że lipopolisacharyd wyizolowany z tego samego szczepu bakterii składa się z populacji cząsteczek o bardzo zróżnicowanej masie cząsteczkowej, związanej z różną liczbą podjednostek polisacharydu O-swoistego. Uznano, że taki rozkład długości cząsteczek LPS jest spowodowany obecnością genów odpowiedzialnych za kontrolę długości antygenu O. We wstępnym okresie badań nad mechanizmami biosyntezy lipopolisacharydu tym samym genom homologicznym przypisano różne nazwy. Gen rol (regulator of O-antigen length) po raz pierwszy zidentyfikowali Batchelor i wsp. [8]; Bastin i wsp. [6] nazwali gen odpowiedzialny za kontrolę długości O-antygenu cld (chain length determinant). Opisywany w latach 90 ub.w. gen odpowiedzialny za regulację długości łańcucha O-swoistego jest obecnie znany jako wzzB. Stevenson i wsp. zidentyfikowali inny gen odpowiedzialny za syntezę bardzo długiego antygenu O u S. flexneri [112]. Zidentyfikowany gen wykazywał duże podobieństwo sekwencji do genu fepE E. coli K12, kodującego system wychwytu żelaza ze środowiska. Również Murray i wsp. zidentyfikowali białko odpowiedzialne za kontrolę długości łańcucha O-swoistego, np. złożonego z ponad 100 powtarzających się podjednostek w lipopolisacharydzie Salmonella Typhimurium. I w tym przypadku wykazano, że gen wzzfepE znajduje się w obrębie klastra genów odpowiedzialnych za wychwyt żelaza [81].

Cząsteczki LPS mogą się charakteryzować występowaniem trzech wyraźnie odrębnych frakcji, różniących się liczbą powtarzających się podjednostek O. W szczepach S. Enteritidis i S. Typhimurium można wyróżnić frakcję cząsteczek LPS o małej masie cząsteczkowej (low molecular weight O-antigen LPS, LMW-OAg LPS) – zawierających antygen O zbudowany z mniej niż 15 powtarzających się podjednostek, frakcję LPS z długim łańcuchem O swoistym (long O antigen LPS, L-OAg LPS) zbudowanym z 16-35 powtarzających się podjednostek oraz frakcję LPS z bardzo długim łańcuchem O-swoistym (very long O antigen LPS, VL-OAg LPS) – zbudowanym z ponad 100 powtarzających się podjednostek. Wykazano, że za syntezę L-OAg LPS odpowiada gen wzzST, natomiast za syntezę VL-OAg LPS odpowiedzialny jest gen wzzfepE [81]. Homologi białka WzzfepE zidentyfikowano m.in. u E. coli O157:H7, E. coli K-12, S. flexneri i S. Typhi [81, 88, 90, 106]. Wskazuje to, że cząsteczki LPS występujące w trzech wyraźnie zróżnicowanych frakcjach długościowych są powszechne u Enterobacteriaceae, jednak często – prawdopodobnie ze względu na trudności w detekcji – VL-OAg LPS nie zostają rozpoznane w izolowanych preparatach LPS.

Wkrótce po odkryciu genów wzz (wzzST, wzzfepE) postawiono pytanie, w jaki sposób białka Wzz kontrolują długość antygenu O? Obserwacja, że blisko spokrewnione regulatory długości łańcucha O-swoistego mogą być ekspresjonowane u pokrewnych bakterii i narzucać charakterystykę rozkładu długości antygenu O sprawiła, że poznanie sposobu ich działania stało się jeszcze bardziej istotne [7, 80]. Ustalono, że regulacja długości łańcucha O-swoistego jest wewnętrznie określona przez sam regulator (WzzB, WzzFepE) niezależnie od ogromnych różnic w strukturze chemicznej poszczególnych substratów, z których zbudowany jest antygen O u różnych gatunków bakterii.

Białka regulujące długość antygenu O należą do nadrodziny białek bakteryjnych, znanych jako kopolimery wielocukrów (polysaccharide co-polimers, PCP) [27, 79, 121]. PCP są odpowiedzialne za eksport złożonych polisacharydów, zarówno u bakterii Gram-ujemnych jak i Gram-dodatnich. W obrębie PCP można wyróżnić trzy klasy: PCP-1 – PCP-3. Białka odpowiedzialne za procesowanie antygenu O należą do grupy PCP-1 i są zbudowane z dwóch transmembranowych helis oraz jednej domeny peryplazmatycznej. Analiza strukturalna przebadanych PCP (WzzB z S. Typhimurium, FepE z E. coli) wykazała, że regulatory długości łańcucha są montowane w oligomery o różnym składzie (WzzB – pentamer, FepE – nonamer), jednocześnie przyjmując podobne trójwymiarowe struktury mimo niewielkiej identyczności w sekwencji (około 23%). Obserwacje te mogą wskazywać na wspólny molekularny mechanizm wykorzystywany przez te cząsteczki do kontrolowania długości łańcucha polisacharydowego [121].

Dotychczas zaproponowano kilka modeli interakcji między regulatorami długości łańcucha O-swoistego i polimerazą Wzy. Carter i wsp. [19] w swoim modelu zakładali, że białko Wzz łączy się w kompleks wielobiałkowy, zbudowany z flipazy Wzx, polimerazy Wzy oraz ligazy WaaL. Uzyskane dane eksperymentalne z testów immunopercypitacji i chemicznego linkowania nie wskazały jednak jednoznacznie na interakcje między regulatorem długości WzzB a polimerazą Wzy [19]. Alternatywne badania in vitro przeprowadzone przez Woodwarda i wsp., polegające na „rekonstrukcji” ścieżki biosyntezy antygenu O z użyciem oczyszczonych białek, wskazały wprawdzie, że długość dojrzałego antygenu zależy wyłącznie od obecności polimerazy Wzy i regulatora długości Wzz, ale również w tym przypadku nie zaobserwowano wyraźnej interakcji między tymi białkami [133]. Uważa się, że powstający antygen O jest wydłużany przez dołączanie przez polimerazę Wzy kolejnych podjednostek O do nieredukującego końca wzrastającej cząsteczki. Kalynych i wsp. [59] proponują model regulacji długości łańcuchów O-swoistych, który zakłada, że białka Wzz regulują długość dojrzałego antygenu O przez utrzymywanie wzrastającego łańcucha O-swoistego w konformacji umożliwiającej dalszą polimeryzację, zapobiegając przedwczesnemu uwolnieniu rosnącego polisacharydu. W chwili gdy antygen O osiągnie liczbę powtarzających się podjednostek, które nie mogą już być dłużej związane przez białka Wzz, dochodzi do zmiany konformacji i białka regulujące długość dysocjują. W następnej kolejności dojrzały antygen O może zostać przyłączony do części lipidowo-rdzeniowej przez ligazę WaaL [59].

Mechanizm funkcjonowania systemu kontroli, odpowiedzialnego za powstanie cząsteczek LPS o określonej długości nie jest jeszcze wyjaśniony. Dwie hipotezy dotyczące regulacji procesu syntezy cząsteczki lipopolisacharydu obejmują koncepcję „zegara molekularnego” (molecular clock), regulującego polimeryzację poprzez czas trwania reakcji [6] oraz „molekularnej linijki” (molecular ruler), gdzie proces powstawania nowego łańcucha zatrzymuje się wraz z osiągnięciem jego zadanej długości [121]. Najnowsze badania dotyczące syntezy polisacharydu O-swoistego u E. coli O9a [66] wskazują jednak, że na długość powstającego łańcucha ma wpływ proporcja ilościowa ekspresji dwu enzymów zaangażowanych w biosyntezę O-antygenu: WbdA odpowiedzialnego za wydłużanie polisacharydu oraz WbdD odpowiedzialnego za terminację procesu syntezy.

Istnieją doniesienia, które sugerują, że na długość łańcucha O-swoistego, oprócz genów wzz, wpływają również czynniki środowiskowe. McConnell i Wright wykazali, że długość i rozkład antygenu O S. Anatum są zależne od temperatury wzrostu. Podczas gdy komórki S. Anatum syntetyzują LPS gładki w 37°C, w niższej temperaturze (20-25°C) dochodzi również do syntezy półszorstkiego LPS [77]. Delgado i wsp. udowodnili, że u S. Typhimurium ekspresja genu wzzST jest indukowana w medium hodowlanym zawierającym jony Mg2+ i Fe3+ [29]. Według Bravo i wsp. u S. Typhimurium i S. Enteritidis synteza części O-swoistej lipopolisacharydu jest zależna od fazy wzrostu [12]. Pawlak i wsp. wykazali, że przedłużona ekspozycja na surowicę ludzką szczepów Salmonella O48 wpływa na długość powstającego antygenu O, a także że testowane szczepy różniły się wrażliwością na surowicę przed i po długotrwałej ekspozycji na surowicę ludzką (u trzech z czterech testowanych szczepów zaobserwowano wzrost oporności na bakteriobójcze działanie surowicy ludzkiej po przedłużonej ekspozycji) [91]. Pomimo licznych doniesień na temat wpływu czynników środowiskowych na regulację długości lipopolisacharydu, niewiele wiadomo w jaki sposób warunki hodowli drobnoustrojów modulują długość powstających łańcuchów O-swoistych.

Mimo że istnieją pewne przesłanki na temat mechanizmów regulacji długości łańcuchów O-swoistych, niewiele jest informacji na temat proporcji łańcuchów LPS o różnej długości na powierzchni komórki bakteryjnej. Palva i Mäkäla wykazali, że u S. Typhimurium rozkład cząsteczek LPS na powierzchni komórki bakteryjnej jest nierówny i charakteryzuje się tylko niewielkim procentem cząsteczek z 2-18 powtarzającymi się podjednostkami O-swoistymi, podczas gdy 77% LPS ma 19-34 powtarzających się podjednostek O [89].

Techniki pomiaru długości cząsteczki lipopolisacharydu

Lipopolisacharyd cechuje wysoki stopień zmienności strukturalnej, jak również zmienna liczba powtarzających się podjednostek polisacharydu O-swoistego. Różnice te przyczyniają się do znacznej niejednorodności uzyskiwanych eksperymentalnie preparatów LPS. Ponieważ cząsteczki LPS w komórce są wysoce heterogenne i mają skłonność do tworzenia agregatów o różnych rozmiarach, dokładny pomiar długości lipopolisacharydu jest trudny. Metodą najpowszechniej wykorzystywaną do pomiaru długości LPS jest SDS-PAGE. Wykorzystanie znakowania LPS izotopami promieniotwórczymi, umożliwiało analizę rozkładu populacji cząsteczek lipopolisacharydu za pomocą radiografii i densytometrii [38, 89, 112]. Opracowanie czułej metody barwienia LPS w żelu za pomocą metalicznego srebra [48, 123], będącą modyfikacją podobnego protokołu, stosowanego do barwienia elektroforegramów białkowych [118], umożliwiło uproszczenie procedury i zaczęło być powszechnie wykorzystywane do analizy rozkładu długościowego cząsteczek LPS [16, 25, 129]. Elektroforeza wciąż pozostaje podstawową metodą tej analizy, wykorzystywaną współcześnie zarówno w połączeniu z autoradiografią [66] jak i barwieniem metodą srebrową [45]. Opracowano także rzadziej stosowane modyfikacje tej metody (elektroforeza dwuwymiarowa, wstępny rozdział LPS w chromatografii kolumnowej lub elektroforezie preparatywnej, użycie deoksycholanu zamiast SDS [93, 97]). Ponieważ dokładniejsza ocena masy cząsteczkowej LPS z wykorzystaniem PAGE jest utrudniona – dostępne są jedynie białkowe markery masy cząsteczkowej – do analizy rozkładu wielkości cząsteczek LPS w próbie stosowano także rozdział cząsteczek w polu elektrycznym wykorzystujący technikę elektroforezy kapilarnej, również z użyciem mikroukładów elektroforetycznych [67, 120].

Inną stosowaną metodą oceny długości części O-swoistej lipopolisacharydu była analiza proporcji między składnikiem cukrowym, występującym w powtarzających się podjednostkach części O-swoistej, a jednym z elementów rdzenia LPS. Pomiar proporcji realizowano testami kolorymetrycznymi (np. proporcji występowania kolitozy do Kdo w LPS E. coli O111 [38]), ale również zastosowano analizę spektrometryczną (proporcje między kwasem sjalowym i Kdo w LPS różnorodnych szczepów Salmonella O48 [15, 91]). Metoda ta jest jednak ograniczona do szczepów, w których w podjednostce O-swoistej obecny jest charakterystyczny składnik, niewystępujący w pozostałej części cząsteczki LPS (kolitoza, kwas sjalowy, abekwoza czy inne). Metoda pozwala na określenie średniej długości polisacharydu O-swoistego w całej populacji cząsteczek LPS w próbie, jednak nie umożliwia określenia wprost proporcji ilościowych między poszczególnymi formami cząsteczek LPS.

Wiele innych nietypowych metod wykorzystywanych jest do analizy strukturalnej i oceny długości lipopolisacharydu m.in. spektroskopia elektronowego rezonansu spinowego (electron spin resonance, ESR) [92] oraz spektroskopia osłabionego całkowitego odbicia w podczerwieni (attenuated total reflectance infrared spectroscopy, ATR-IR) [136]. Rozwijające się techniki analizy mikroskopii sił atomowych (atomic force microscopy, AFM) pozwalają obrazować strukturalne właściwości powierzchni komórki, związane z różnicami długości lipopolisacharydu [39]. Informację dotyczącą postaci LPS uzyskiwano także za pomocą mikroskopii elektronowej, analizując zarówno izolowane preparaty lipopolisacharydowe [73] jak i powierzchnię całej komórki bakteryjnej [36, 39].

Metody spektrometryczne analizy strukturalnej lipopolisacharydów i ich fragmentów obejmują metody związane z łagodną jonizacją analizowanych substancji, przez bombardowanie szybkimi atomami (fast atom bombardment, FAB), elektrorozpylanie (electrospray ionization, ESI), desorpcję za pomocą plazmy (plasma desorption, PD), pirolizy, lasera bądź lasera z udziałem matrycy (matrix assisted laser desorption/ionization, MALDI) [18, 46, 47, 119]. Techniki wykorzystujące PD-MS pozwalały uzyskiwać widma cząsteczek LPS o stosunkowo wysokich masach cząsteczkowych, rzędu 6 000 Da, podczas gdy użycie MALDI pozwalało na analizę cząsteczek do 8 000-14 000 Da [4, 53, 137]. Ze względu jednak na heterogenność cząsteczki lipopolisacharydu oraz jego amfifilowy charakter techniki MALDI mają raczej zastosowanie do analizy całych cząsteczek lipooligosacharydów lub LPS typu szorstkiego, czasem z zastosowaniem dodatkowych technik wstępnego rozdziału w celu zmniejszenia heterogenności próbki [70, 115, 116, 119]. W przypadku lipopolisacharydów typu gładkiego, dopiero po de-O-acetylacji uzyskiwano widma cząsteczek o masach rzędu 10 000-14 000 Da, a dla izolowanego polisacharydu O-swoistego do 16 000 Da [53, 70].

Wpływ długości cząsteczki lipopolisacharydu na interakcje z układem odpornościowym

Lipopolisacharyd, jako jeden z głównych składników błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych, odgrywa główną rolę w interakcji z układem odpornościowym. Podczas infekcji bakterie są bezpośrednio narażone na środowisko organizmu gospodarza, które jest kontrolowane przez komórki odpornościowe. Drobnoustroje wykształciły wiele mechanizmów obronnych, w tym zdolność modulacji syntezy i struktury LPS, umożliwiającą skuteczną ochronę przed działaniem czynników układu immunologicznego.

W odniesieniu do bakterii Gram-ujemnych przyjmuje się, że szczepy gładkie (smooth, S) syntetyzują LPS składający się z trzech odrębnych regionów: lipidu A, rdzenia oraz łańcucha O-swoistego, zbudowanego z powtarzających się podjednostek cukrowych. W odróżnieniu od szczepów gładkich, LPS szczepów półszorstkich (semi-rough, SR) jest zbudowany z lipidu A, rdzenia oraz jednej powtarzającej się podjednostki cukrowej w łańcuchu O-swoistym. Natomiast szczepy szorstkie (rough, R) syntetyzują tzw. lipooligosacharyd (LOS) zbudowany jedynie z lipidu A i części rdzeniowej. Badania porównujące bakterie z rodzaju Salmonella o różnych postaciach LPS (S, R) wykazały, że łańcuch O-swoisty odgrywa podstawową rolę w kolonizacji jelita grubego myszy [85], oporności bakterii na mechanizmy zabijania w neutrofilach [86] oraz w procesach unikania lizy przez kaskadę białek układu dopełniacza [40, 58, 122]. Badania przeprowadzone na szczepie dzikim S. Typhimurium oraz szorstkich mutantach pozbawionych łańcuchów O-swoistych w cząsteczce LPS wykazały, że zdolność szczepu S. Typhimurium do kolonizacji mysiego jelita grubego zmniejsza się, gdy LPS ulega skróceniu [85]. W badaniach porównywano jednak tylko szczepy dzikie, wytwarzające łańcuch O-swoisty, nie charakteryzując jego dokładnej długości oraz szczepy pozbawione całkowicie antygenu O (mutant rfb) i głębsze mutanty części rdzeniowej LPS (mutanty rfaJ, rfa-990) [85].

Późniejsze badania Grossmana i wsp. [40] powiązały obecność długich łańcuchów O-swoistych w LPS z opornością na bakteriobójcze działanie surowicy ludzkiej. Grossman i wsp. [40] wykazali, że w szczepach S. Montevideo przeżywalność bakterii w surowicy jest ściśle związana z liczbą powtarzających się podjednostek w cząsteczce LPS. Do testów wykorzystano zmutowany szczep S. Montevideo, w którym synteza O antygenu, którego składnikiem była m.in. mannoza, następowała tylko wtedy gdy bakterie hodowano w pożywce z dodatkiem tego cukru. W celu modulowania długości powstającego antygenu O bakterie hodowano w pożywkach z różną zawartością mannozy. Analizę profili cząsteczek LPS przeprowadzono z wykorzystaniem SDS-PAGE. W badaniach porównywano trzy parametry składu LPS (średnią liczbę powtarzających się podjednostek przypadającą na cząsteczkę LPS, procent cząsteczek LPS zawierających więcej niż 14 powtarzających podjednostek w cząsteczce LPS oraz procent szorstkich LPS) i korelowano z bakteriobójczym działaniem surowicy ludzkiej. Wykazano, że przeżycie bakterii S. Montevideo w surowicy było związane z lipopolisacharydem, który zawierał więcej niż 14 powtarzających się podjednostek w części O-swoistej. Na podstawie uzyskanych danych Grosmann i wsp. wysnuli wnioski, że na powierzchni komórki bakteryjnej konieczna jest odpowiednia gęstość długich łańcuchów O-swoistych, które zapewnią komórce bakteryjnej ochronę przed działaniem układu dopełniacza przez przestrzenne utrudnianie depozycji kompleksu MAC (membrane atack complex, MAC) na powierzchni błony zewnętrznej [40]. Tomas i wsp. również wykazali, że szczepy S. Typhimurium z wysokocząsteczkowym LPS są oporne na bakteriobójczą aktywność surowicy, w przeciwieństwie do szczepów z niskocząsteczkowym LPS [122]. Joiner i wsp. natomiast dowiedli, że składnik C3 układu dopełniacza preferencyjnie wiąże cząsteczki LPS S. Montevideo składające się z ponad 60 powtarzających się podjednostek O, wobec LPS z 20-21 powtarzającymi się podjednostkami [58].

Mimo licznych badań wskazujących na udział długich łańcuchów O-swoistych na przeżywanie bakterii w surowicy, udział genów wzz w tym procesie nie został definitywnie potwierdzony. Murray i wsp. przeprowadzili badania nad rolą regulacji długości łańcucha O-swoistego w zjadliwości bakterii z rodzaju Salmonella [81]. Wykazali, że u szczepów S. Typhimurium występuje tzw. modalny rozkład długości cząsteczek lipopolisacharydu, z wyraźnie wyodrębnionymi trzema frakcjami, różniącymi się liczbą powtarzających się podjednostek polisacharydu O-swoistego: LMW-OAg LPS, L-OAg LPS, VL-OAg LPS. W badaniach potwierdzono znaczenie długości łańcuchów O-swoistych u S. Typhimurium w procesie patogenezy [81]. Udział LPS o różnej długości w procesie generowania oporności na surowicę zbadano przez porównanie wrażliwości na surowicę różnych mutantów długościowych LPS w stosunku do szczepu dzikiego S. Typhimurium. Wykazano, że szczep dziki był bardzo oporny na działanie układu dopełniacza, szczep z usuniętym genem wzzST (szczep nie wytwarzał L-OAg LPS) lub wzzfepE (szczep nie wytwarzał VL-OAg LPS) nie wykazał istotnej statystycznie różnicy we wrażliwości na działanie układu dopełniacza, natomiast mutant z dwoma wyłączonymi genami wzz (szczep nie wytwarzał ani L-OAg LPS ani VL-OAg LPS) charakteryzował się dużą wrażliwością na działanie białek układu dopełniacza [81]. Bugla-Płoskońska i wsp. testując 21 szczepów Salmonella O48 o różnej średniej długości łańcucha O-swoistego nie znaleźli korelacji między długością łańcucha O-swoistego a poziomem przeżywalności bakterii w surowicy ludzkiej [15]. Według Crawforda i wsp. bardzo długie łańcuchy O-swoiste wpływają na przeżywalność S. Typhimurium w żółci [24]. Murray i wsp. uważają, że długość antygenu O u S. Typhimurium odgrywa również główną rolę w procesie fagocytozy [83]. Holzer i wsp. badając wpływ długości LPS na inwazję i wewnątrzkomórkową replikację S. Typhimurium udowodnili, że długość antygenu O jest kluczowa dla funkcjonowania sytemu sekrecji typu III oraz dla procesu inwazji bakterii [49].

Podsumowanie

Mimo znacznego postępu w zrozumieniu genetycznych, biochemicznych i strukturalnych podstaw biosyntezy antygenów O, dokładny mechanizm regulujący długość łańcucha O-swoistego pozostaje niewyjaśniony. Niezbędne wydaje się poznanie dokładnych interakcji zachodzących między białkami Wzz, a rosnącym łańcuchem O-swoistym oraz dalsza charakterystyka biochemiczna interakcji białko-białko, aby uzyskać pełny wgląd w organizację komórkowego aparatu biosyntezy antygenów O. Wyjaśnienie mechanizmu unikania przez bakterie Gram-ujemne działania układu odpornościowego gospodarza przez regulację długości cząsteczki lipopolisacharydu również się przyczyni do lepszego zrozumienia mechanizmów patogenności tych bakterii. Poznanie dokładnego szlaku biosyntezy cząsteczki LPS, mechanizmów regulujących długość powstającego łańcucha O-swoistego oraz ich wpływu na oporność bakterii będzie także istotnym krokiem w kierunku tworzenia nowych, skutecznych leków przeciwbakteryjnych.

Pełna treść artykułu