Abstrakt

Mikropęcherzyki błonowe (EV – extracellular vesicles) są zróżnicowaną populacją, najczęściej kulistych struktur błonowych uwalnianych przez komórki, w tym również komórki nowotworowe zarówno w warunkach in vivo, jak i in vitro. Ich wielkość waha się od 30 nm do 1 μm, a rozmiar jest jednym z głównych wyznaczników podziału EV na dwie kategorie: mniejszych (30-100 nm) i bardziej jednorodnych egzosomów (exosomes) oraz większych (0,1-1 μm) zwanych mikrofragmentami błonowymi (microvesicles) lub ektosomami. Obecność EV stwierdzono w wielu płynach ustrojowych człowieka: krwi, moczu, ślinie, nasieniu i płynie owodniowym. Powstawanie EV jest ściśle kontrolowane, a ich funkcja oraz skład biochemiczny zależą od właściwości i rodzaju komórek, z których pochodzą. EV będąc nośnikami bioaktywnych cząsteczek, takich jak białka, mRNA i mikroRNA mogą odgrywać istotną rolę w komunikacji międzykomórkowej oraz modulacji funkcji, m.in. komórek układu odpornościowego. Ponadto na EV pochodzenia nowotworowego (TMV – tumour-derived microvesicles) zwanych onkosomami, zidentyfikowano markery nowotworowe charakterystyczne dla komórek nowotworowych, co wskazuje, że TMV mogą odgrywać istotną rolę w procesie wzrostu guza i rozwoju choroby nowotworowej. Jednak obecność na powierzchni TMV charakterystycznych markerów komórek nowotworowych może być potencjalnie wykorzystana w diagnostyce jako źródło biomarkerów pomocnych w ocenie rokowania oraz może służyć do opracowania nowych schematów leczenia chorych nowotworowych z zastosowaniem celowanej immunoterpii.

Wstęp

Opisanie przez Wolfa w 1967 r. w ludzkiej krwi małych struktur wytwarzanych przez aktywowane płytki krwi i wykazujących działanie prokoagulacyjne, a określonych wówczas jako „pył płytkowy” (platelet dust) [65], zapoczątkowało lawinę badań dotyczących powstawania tzw. mikropęcherzyków błonowych (EV – extracellular vesicles) i ich roli w organizmie. Dziś wiadomo, że większość komórek ma zdolność do uwalniania EV, a ich obecność stwierdzono m.in. w moczu, krwi, płynie owodniowym, ślinie, czy nasieniu [38,39,42]. Mechanizm powstawania EV jest ściśle kontrolowany i różny w zależności od ich rodzaju [10]. Skład biochemiczny EV i ich rola w dużej mierze zależą od właściwości komórek, z których pochodzą. EV będąc nośnikami bioaktywnych cząsteczek, takich jak: białka, mRNA i mikroRNA zdają się odgrywać istotną rolę w komunikacji międzykomórkowej [33,37,59]. EV występują powszechnie w krwi obwodowej zdrowych osób, a ich poziom wzrasta w przebiegu niektórych schorzeń ogólnoustrojowych, np. miażdżycy, chorób autoimmunologicznych czy nowotworowych [9,12,21,22,39,61].

Obecnie wiele uwagi poświęca się potencjalnej roli EV w progresji choroby nowotworowej. Prowadzone badania mają na celu zweryfikowanie roli obecnych na EV antygenów, zwłaszcza tych pochodzenia nowotworowego. Występowanie swoistych biomarkerów i dokładne poznanie mechanizmów decydujących o obecności bądź braku danego białka na powierzchni EV może w niedalekiej przyszłości umożliwić efektywne wykorzystanie tej wiedzy w diagnostyce onkologicznej i/lub terapii chorób nowotworowych [15,33,37,38,39]. W pracy przedstawiono szczegółową charakterystykę EV, ich budowę, klasyfikację, potencjalne właściwości oraz możliwości wykorzystania, ze szczególnym uwzględnieniem mikropęcherzyków pochodzenia nowotworowego (TMV – tumour-derived microvesicles).

Charakterystka mikropęcherzyków błonowych

Terminologia i klasyfikacja

Mikropęcherzyki błonowe są zróżnicowaną populacją, najczęściej kulistych struktur błonowych (pęcherzyków) uwalnianych zarówno przez komórki eukariotyczne, jak i prokariotyczne, zarówno in vivo, jak i in vitro. Ich wielkość waha się od 30 nm do 1 µm, a rozmiar i pochodzenie są głównymi wyznacznikami klasyfikacji EV. Chociaż EV na ogół wykazują podobną budowę [29], to występują również zasadnicze różnice dotyczące m.in. wspomnianego już rozmiaru, mechanizmu i źródła ich powstawania oraz właściwości fizykochemicznych [10,15]. Różnice te doprowadziły do wyodrębnienia dwóch głównych rodzajów EV: mniejszych, bardziej jednorodnych pęcherzyków nazwanych egzosomami (exosomes) oraz większych – ektosomów (ectosomes). Egzosomy są nanometrowej wielkości (30-100 nm), sferycznymi pęcherzykami, zawierającymi białka, mRNA, mikroRNA oraz lipidy [10,15,32]. Drugą, bardziej zróżnicowaną grupę stanowią pęcherzyki większych rozmiarów (0,1-1 µm), zwane mikrofragmentami błonowymi (MV – microvesicles) lub ektosomami (ectosomes), wydzielanymi na zewnątrz komórki bezpośrednio przez błonę komórkową [18,21].

Przedstawiony podział pozwala usystematyzować zebraną dotychczas wiedzę na temat EV i umożliwia precyzyjniejsze porównywanie wyników różnych badań. Jednak należy zaznaczyć, iż przyjęta powszechnie terminologia nastręcza wiele trudności, co jest związane z ciągłym pojawianiem się nowych odkryć w tej dziedzinie, a co za tym idzie z dynamiczną zmianą nomenklatury. W celu dokładniejszej identyfikacji, wyróżnia się dodatkowe rodzaje EV (patrz tab. 1).

Mechanizm powstawania EV

Mechanizm tworzenia EV oraz ich transport do przestrzeni zewnątrzkomórkowej w zależności od typu pęcherzyków jest różny [10,18,48]. Egzosomy powstają przez wpuklenie błony do światła późnych endosomów. Powstające struktury są nazywane ciałkami wielopęcherzykowymi (MVB – multivesicular body). Egzosomy zawierają charakterystyczne dla komórki rodzicielskiej proteiny i/lub kwasy nukleinowe (mRNA, mikroRNA). Wykazano, że podczas transportu egzosomów w cytosolu, jak i w kompartmentach MVB istotną rolę odgrywa kompleks biał- kowy tzw. ESCRT (endosomal sorting complex required for transport), który bierze udział w „sortowaniu” zawartości egzosomów. Ponadto, według najnowszych badań, w transporcie i fuzji błon wewnątrz przedziałów MVB oraz w sekrecji egzosomów uczestniczą także białka z rodziny Rab: Rab11, Rab27a i b oraz Rab35 [10]. Uwolnienie egzosomów do przestrzeni zewnątrzkomórkowej (egzocytoza) następuje w wyniku fuzji błony komórkowej i MVB, co następuje z udziałem transbłonowego kompleksu białkowego SNARE (soluble N – ethylmaleiamide-sensitive factor attachment protein receptor) (ryc. 1) [10,50].

Błona egzosomów pod względem budowy i składu biochemicznego nie jest identyczna z błoną komórki rodzicielskiej. Podczas tworzenia egzosomów, ulega przebudowie, a dokładniej fosfotydyloseryna (PS) zostaje przeniesiona do zewnętrznej części warstwy lipidowej. Uwidacznia się to szczególnie w miejscach, gdzie dochodzi do fuzji błon. Topologia białek błonowych pozostaje nienaruszona, przy czym należy zaznaczyć, że nie wszystkie białka błonowe są obecne w egzosomach [12,32].

Większe EV – MV/ektosomy powstają bezpośrednio w wyniku „pączkowania” (budding) błony komórkowej. Jednak zanim do tego dojdzie, zachodzi wiele zmian i procesów umożliwiających uwolnienie mikrofragmentów na zewnątrz komórki. W stanie równowagi w warstwie lipidowej błony komórkowej znajdują się asymetrycznie ułożone fosfolipidy: PS i fosfatydyloetanoloamina (PE) po wewnętrznej części błony, natomiast fosfatydylocholina (PC) i sfingomielina (SM) są obecne w zewnętrznej warstwie. Kontrolę nad tym charakterystycznym rozmieszczeniem sprawuje kompleks składający się z trzech enzymów: flipazy (flippase), flopazy (floppase) i skramblazy (scramblase). Flipaza odpowiada za przenoszenie PE i PS z zewnętrznej do wewnętrznej warstwy błony komórkowej. Ze względu na amfipatyczny charakter przenoszonych fosfolipidów, jest to proces wymagający sporego nakładu energii dostarczanej z procesu hydrolizy ATP. Flopaza natomiast wykazuje działanie przeciwstawne, czyli odpowiada za transport z wewnętrznej warstwy do zewnętrznej części dwuwarstwy lipidowej. Trzeci enzym – skramblaza, którego funkcją jest transport lipidów w obrębie dwuwarstwy lipidowej, w stanie równowagi komórki, podobnie jak flopaza, pozostaje nieaktywny (ryc. 2A) [12].

Powstawanie MV zależy od jonów wapnia II (Ca2+). Uwolnione przez retikulum endoplazmatyczne jony Ca2+ inaktywują działanie flipazy, aktywują zaś flopazę i skramblazę, powodując tym samym zaburzenia w transporcie fosfolipidów, co prowadzi do reorganizacji ich ułożenia w błonie. Wynikiem tych zmian jest zerwanie wiązań między włókienkami cytoszkieletu a fosfolipidami. Ponadto uwolnione Ca2+ aktywują kolejne grupy enzymów: kalpaniny oraz gelsoniny, które mają zdolność do wiązania i częściowej degradacji filamentów aktynowych. Włókienka białkowe tworzące cytoszkielet zostają więc w znacznym stopniu osłabione, co umożliwia bezpośrednie zainicjowanie procesu wydzielenia ektosomów na zewnątrz komórki (ryc. 2 B) [12,31].

Budowa EV

Badania ostatniej dekady oraz rozwój współczesnej proteomiki pozwoliły na zidentyfikowanie profilu białkowego EV. MV są opisywane głównie na podstawie obecności białek charakterystycznych dla komórki rodzicielskiej [34]. Natomiast dla egzosomów udało się zidentyfikować typowe markery białkowe (ryc. 3). Do „podstawowego” zestawu białek większości egzosomów zalicza się m.in. białka przezbłonowe należące do rodziny tetraspanin (tetraspanin family): CD9, CD63, CD81 i CD82, grupę białek zaangażowanych w proces apoptozy: AIP-1/Alix, ALG-2, TPxII oraz antyapoptyczną galaktynę 3 [33,56,58], powierzchniowe białko wiążące lipidy MFGE8 (milk fat globule EGF/factor VIII), cząsteczki głównego układu zgodności tkankowej MHC (major histocompatibility complex) klasy I i II, integryny, powierzchniowe peptydazy (CD13, CD26), białka GPI-zakotwiczone (GPI-anchored): CD55 i CD59 [14] oraz białko TSG101 uczestniczące w biogenezie MVB [56,57]. W egzosomach zidentyfikowano również inne białka, takie jak np. klatrynę, aneksyny, kompleks Rab-GTP, białka cytoszkieletu (aktyna, tubulina), białka szoku cieplnego HSP (heat shock proteins), enzymy: dehydrogenazę gliceroaldehydofosforanową – GAPDH, enolazy, kinazę fosfoglicerynianową i aldolazy oraz czynnik inicjujący translację – eIF4 i czynnik elongacyjny – eEF1 [15].

Względnie częste występowanie wymienionych białek oraz to, że ich obecność koreluje z pełnioną przez nie funkcją (białka cytoszkieletu, enzymy, białka zaangażowane bezpośrednio w proces uwalniania egzosomów czy białka ochronne) dowodzą, że mechanizm powstawania egzosomów jest procesem swoistym i dokładnie zaplanowanym, a same egzosomy nie są jedynie sferycznymi fragmentami błony komórkowej, ale prawdziwymi subkomórkowymi kompartmentami [57]. MV mają bardziej niejednorodny skład białkowy, ściśle zależny od rodzaju komórki, z której pochodzą. Na ich powierzchni zidentyfikowano wiele specyficznych markerów np. antygen CD235a występujący na MV pochodzenia erytrocytarnego [12], CD11c obecny na MV uwalnianych z komórek dendrytycznych (DC – dendritic cells) czy CD41 na MV uwalnianych z płytek krwi. Markery te sugerują określone właściwości MV i pełnione przez nie funkcje w organizmie oraz pozwalają określić ich potencjalne wykorzystanie w medycynie czy biotechnologii [12,40].

Oprócz białek, ektosomy zwierają również liczne fosfolipidy, które są ważnym elementem składowym ich błony. Na podstawie dotychczasowych badań nie można określić stałego, charakterystycznego dla mikrofragmentów błonowych profilu lipidowego. Zwraca się jednak uwagę na podobieństwa w składzie lipidowym błony komórki rodzicielskiej i EV, z uwzględnieniem szczególnej roli tratw lipidowych (lipid rafts) w tych ostatnich [32]. Na przykład opisano podobieństwo składu lipidowego błony erytrocytów i pochodzących z nich mikrofragmentów błonowych [63]. Jednak ektosomy uwalniane przez limfocyty B, komórki dendrytyczne, komórki tuczne i linie komórkowe czerniaka są wzbogacone w sfingomielinę a nie cholesterol w porównaniu do komórek, z których pochodzą [66].

Opublikowane w 2006 i 2007 r. wyniki badań wskazywały na obecność informacji genetycznej w postaci mRNA i mikroRNA zawartej w MV uwalnianych przez komórki linii raka trzustki oraz linie komórek tucznych [10,59]. Zweryfikowanie tego odkrycia nastąpiło nieznacznie później, kiedy wyizolowano mRNA i mikroRNA z egzosomów oczyszczonych z komórek ludzkiego glejaka, a obecność kwasów rybonukleinowych potwierdzono za pomocą analizy z użyciem mikromacierzy [52].

Funkcja i znaczenie EV

Skład EV odzwierciedla w dużej mierze pochodzenie komórkowe i określa zakres informacji przenoszonych przez EV. Małe rozmiary EV umożliwiają ich „przemieszczanie się” na znaczne odległości wraz z płynami ustrojowymi, a zdolność do wiązania się z komórkami docelowymi umożliwia szeroki zakres działania. Ten rodzaj komunikacji międzykomórkowej odgrywa zasadniczą rolę w modulacji mikrośrodowiska, gdyż w pęcherzykach transportowany jest cały „pakiet” informacji, który oprócz białek regulatorowych i receptorów zawiera również RNA i lipidy [32,50].

Do tej pory poznano kilka mechanizmów wymiany informacji za pośrednictwem EV:

• bezpośrednia stymulacja komórki docelowej poprzez ligandy dostarczone przez EV (pobudzenie do wydzielania czynników wzrostu, cytokin, bioaktywnych lipidów) [8,30,67];

• transfer receptorów powierzchniowych z jednej komórki do drugiej (cząsteczki adhezyjne, receptory błonowe) [7,45];

• epigenetyczne reprogramowanie komórki docelowej przez dostarczenie białek, mRNA i/lub czynników transkrypcyjnych [13];

EV mogą służyć również jako wektor dla cząstek zakaź- nych, takich jak HIV czy priony [35,44,45].

Komórka docelowa otrzymuje więcej informacji, w wyniku czego może dojść nawet do zmiany jej pierwotnego charakteru (transformacji). Tak zmieniona komórka może wydzielać dalej do mikrośrodowiska EV zawierające „zaktualizowane” informacje [43].

Dotychczas dużą część badań nad EV przeprowadzono na MV pochodzenia płytkowego (PMV – platelet-derived microvesicles). Pozwoliły one stwierdzić, że PMV wpływają na proces krzepnięcia i mogą zwiększać ryzyko tworzenia zakrzepów naczyniowych [62]. W niektórych schorzeniach charakteryzujących się zaburzeniami krzepnięcia krwi (np. zespół Scotta, defekt Castamana) stwierdzono wrodzony defekt tworzenia PMV [68]. Poza niewątpliwą funkcją pełnioną w procesie krzepnięcia, PMV odgrywają także ważną rolę w innych procesach biologicznych, np. mogą stymulować wydzielanie cytokin i czynnika tkankowego w komórkach śródbłonka lub hamować apoptozę leukocytów [31]. Sugeruje się również, że obecne w dużych stężeniach PMV w rejonach objętych stanem zapalnym modulują chemotaksję komórek układu odpornościowego: monocytów, komórek NK (natural killer), limfocytów B i T [22]. Ponadto PMV wykazują ekspresję integryny CD41 i P-selektyny (CD62P), które biorą udział w aktywacji granulocytów obojętnochłonnych i tworzeniu oddziaływań między nimi a komórkami śródbłonka oraz między samymi neutrofilami, co ma znaczenie w różnego typu reakcjach zapalnych [26]. Obecne na powierzchni PMV bioaktywne lipidy, w tym 1-fosforan sfingozyny (S1P) i cząsteczki kwasu arachidonowego (AA) działają proangiogennie [27].

Druga duża grupa badań dotyczy egzosomów, które uwalniane przez DC mogą bezpośrednio stymulować limfocyty T CD8+ dzięki obecności cząsteczek MHC klasy I [1]. Ponadto stwierdzono, iż egzosomy pochodzące z dojrzałych DC lepiej aktywują limfocyty T niż egzosomy z niedojrzałych DC, co może potwierdzać ich rolę w kostymulacji limfocytów T [1]. EV indukując wydzielanie różnych białek mogą również (w sposób pośredni) podnosić efektywność odpowiedzi immunologicznej [8]. Wiele badań wskazuje jednak, że MV oprócz stymulacji układu odpornościowego mogą powodować także hamowanie reakcji odpornościowych. Odnosi się to zwłaszcza do MV pochodzenia nowotworowego (TMV, patrz dalej).

Rola tmv w chorobie nowotworowej

Od czasów ukazania się pierwszej publikacji dotyczącej wydzielania EV przez komórki czerniaka [41] do chwili obecnej, opublikowano wyniki wielu badań potwierdzających zdolność komórek nowotworowych do uwalniania TMV, zarówno w warunkach in vivo jak i in vitro. Wraz z rozwojem metod badawczych wzrosła możliwość wykrywania TMV w krwi, moczu czy innych płynach ustrojowych. W 2009 r. Nilsson i wsp. zidentyfikowali na powierzchni MV wyizolowanych z moczu od pacjentów chorych na raka gruczołu krokowego typowe dla tego rodzaju nowotworu markery: PSA (prostate specific antigen) i PCA3 (prostate cancer gene 3) [38]. Dalsze analizy wykazały, że TMV mogą bezpośrednio uczestniczyć w wielu etapach rozwoju choroby nowotworowej, między innymi w procesie angiogenezy, co ma istotne znaczenie w przerzutowaniu nowotworu.

Mechanizm działania TMV można określić jako parakrynny, ponieważ przenoszą/dostarczają „ładunek informacyjny”, różny w  zależności od rodzaju komórki nowotworowej, do odległych komórek. Wykazano także występowanie dodatniej korelacji między liczbą TMV we krwi chorych, a stopniem zaawansowania choroby, co może dodatkowo potwierdzać znaczenie TMV w progresji nowotworu [9,64].

Wpływ TMV na układ immunologiczny

Rozwój nowotworu jest złożonym procesem, w którym układ immunologiczny zaczyna odgrywać rolę stosunkowo późno, w chwili pojawienia się pierwszych komórek nowotworowych. Jest to etap już po wystąpieniu i utrwaleniu zmian w materiale genetycznym komórki, jednak nie na tyle późno, by nie móc zahamować lub spowolnić rozwój choroby. Jedną z podstawowych funkcji, którą przypisuje się TMV jest właśnie supresja odpowiedzi immunologicznej w reakcji na rozwijający się nowotwór [25]. Istnieje kilka teorii wyjaśniających rolę TMV w ucieczce guza spod nadzoru immunologicznego (ryc. 4). W miarę zaawansowania choroby nowotworowej zwiększa się liczba wydzielanych TMV, przez co komórki nowotworowe tracą większość swoich antygenów i przestają być rozpoznawane przez limfocyty Tc i komórki NK pacjenta [18]. Wyniki innych badań przedstawiają zdolność TMV pochodzących z komórek czerniaka i komórek raka jelita grubego do indukowania różnicowania monocytów do supresorowych MDSC (myeloid derived supressor cells) [60]. Stwierdzono również, że monocyty po inkubacji z TMV wydzielały transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β – transforming growth factor β), który hamował proliferację limfocytów T [60]. Ponadto wykazano, że TMV mające ekspresję cząsteczek FasL, TRAIL lub galektyny 9, w warunkach in vitro są w stanie indukować apoptozę efektorowych limfocytów T [5]. TMV mogą również zmniejszać wydzielanie interleukiny 2 (IL-2), niezbędnej do proliferacji limfocytów T, a także mogą promować powstawanie limfocytów T regulatorowych (Treg) i/lub mieloidalnych komórek supresorowych, hamujących reakcje odpornościowe [25,54,55]. Dodatkowo niektórzy badacze sugerują, że wzmożone wydzielanie TMV przez komórki nowotworowe może powodować utratę przez nie kaspazy 3 – enzymu „wykonawczego” apoptozy, co przypuszczalnie prowadzi do obniżonej wrażliwości komórek nowotworowych na indukcję tego rodzaju śmierci komórki [11]. Dane literaturowe wskazują, że TMV mogą wywierać wieloraki wpływ na układ immunologiczny, ale ostateczny wynik ich działania jest wypadkową wielu czynników, m.in. rodzaju nowotworu i/lub jego stadium zaawansowania oraz rodzaju komórek układu immunologicznego, do których docierają TMV [25,55].

Funkcja TMV w progresji nowotworu

TMV mogą nie tylko ułatwiać ucieczkę nowotworu spod nadzoru immunologicznego, ale również promować jego rozwój przez sygnalizację auto – i/lub parakrynną, modulując tym samym mikrośrodowisko guza i ułatwiając nabycie przez prawidłowe komórki agresywnego fenotypu [2]. Dzięki możliwości poziomego transferu cząsteczek, w tym mRNA i mikroRNA, TMV mogą modyfikować fenotyp i genotyp prawidłowych komórek docelowych. Wykazano, że TMV wyizolowane z krwi pacjentów z glejakiem wielopostaciowym przenoszą onkogeny np. EGFRvIII [2,52]. Wyniki badań prowadzonych na TMV wyizolowanych z płynów ustrojowych chorych na raka piersi i raka płuc dowiodły, że wzmacniają one ekspresję mRNA dla czynników angiogennych, takich jak: naczyniowo-sródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF – vascular endothelial growth factor), IL-8, czynnik wzrostu hepatocytów (HGF – hepatocyte growth factor) oraz zwiększają adhezję komórek raka płuc do śródbłonka, powodując tym samym zwiększenie powstawania przerzutów in vivo [30]. Zdolność do inwazji komórek nowotworowych jest w dużej mierze zależna od ich zdolności do degradacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM – extracellular matrix), migracji wraz z krwiobiegiem i/lub limfą, obecnością białek adhezyjnych umożliwiających „zasiedlenie” nowych nisz oraz powstawania naczyń krwionośnych odżywiających nowo powstające ognisko guza. W licznych badaniach zidentyfikowano na powierzchni TMV pochodzących z różnych typów nowotworów obecność białek adhezyjnych, proteaz, białek macierzy zewnątrzkomórkowej i stymulatorów aniogenezy. Stwierdzono, że niektóre TMV zawierają kilka rodzajów metaloproteinaz: MMP2, MMP9, MT1-MMP i ich nieaktywne postaci – zymogeny oraz urokinazowy aktywator plazminogenu (uPA), a także induktor metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej (EMMPRIN – extracellular matrix metalloprotease inducer) [7,23,28]. MMP są odpowiedzialne za degradację kolagenu, natomiast uPA ułatwia aktywację zymogenów MMP w postaci aktywne przez konwersję plazminogenu do aktywnej plazminy oraz bierze udział w degradacji fibryny, która jest składową ECM. TMV mogą dodatkowo zawierać również inny czynnik rozkładający ECM – katepsynę β, któ- ra uaktywnia się przy niskim pH (charakterystycznym zwłaszcza dla guzów litych), a spowodowanym wzmo- żonym procesem glikolizy przeprowadzanym przez komórki nowotworowe [29]. TMV wyizolowane z hodowli mysich i ludzkich komórek nowotworowych wykazywały ekspresję cząsteczek adhezji międzykomórkowej typu 1 (ICAM-1 – intercellular adhesion molecule-1) i cząsteczek adhezji śródbłonka (VCAM – vascular adhesion molecule), które umożliwiają adhezję komórek [66]. ICAM-1 i VCAM mogą również wspomagać angiogenezę niezbędną do rozwoju guza przez stymulację fibroblastów zrębu do wydzielania czynników proangiogennych. Ponadto niektóre TMV wpływają bezpośrednio na proces tworzenia nowych naczyń krwionośnych dzięki obecności śródbłonkowego czynnika wzrostu i jego receptora (VEGF/ VEGFR – vascular andothelial growth factor/receptor) [7] oraz lipidów proangiogennych, takich jak S1P [22]. Z przeprowadzonych dotychczas badań wynika zatem, że TMV odgrywają ważną rolę w progresji nowotworu, z jednej strony wzmacniając „złośliwy” fenotyp komórek nowotworowych przez poziomy transfer cząstek efektorowych, z drugiej zaś, mając zdolność migracji na znaczne odległości, modulują „zasiedlane” mikro- środowisko stwarzając optymalne warunki do rozwoju nowego ogniska guza.

Wpływ TMV na dystrybucję leków w organizmie

TMV, oprócz supresji odpowiedzi układu immunologicznego na rozwijający się nowotwór, prawdopodobnie zwiększają także oporność komórek nowotworowych na stosowane leki. Przyczyną zmniejszonej skuteczność terapii lekowej stwierdzanej u niektórych pacjentów jest oporność wielolekowa (MDR – multi drug resistance), która charakteryzuje się zdolnością do usuwania z komórki różnych chemioterapeutyków przez specjalistyczne pompy błonowe, np. glikoproteinę P. Przypuszcza się, że TMV mogą przekazywać glikoproteinę P komórkom nowotworowym, które jej wcześniej nie miały i uniewrażliwiać kolejne komórki nowotworowe na działanie leków [3,25]. Inną strategią tłumaczącą rolę TMV w lekooporności komórek nowotworowych może być eliminacja leku z komórki nowotworowej wraz z uwalnianymi TMV, co zostało opisane w przypadku eliminacji doksorubicyny z komórek raka jajnika [47]. Również wyniki badań z użyciem cisplatyny (CDD – cis-diamminedichloroplatinum) wskazujące na 2,6-krotnie większe stężenie CDDP w TMV uwalnianych z komórek raka jajnika opornych na działanie leku w porównaniu do TMV pochodzących z komórek wrażliwych na CDDP [46], zdają się przemawiać za słusznością tej hipotezy.

Potencjalne możliwości wykorzystania EV

Od czasu stwierdzenia obecności EV krążących we krwi, pojawiły się liczne teorie dotyczące roli EV jako nośników informacji biologicznej. Wykazano, że EV występujące w osoczu krwi mogą pochodzić z różnych elementów morfotycznych krwi, takich jak płytki krwi, erytrocyty i leukocyty, ale także z komórek sąsiednich, np. śródbłonka naczyń. Mimo że EV stanowią niewielki odsetek całkowitego składu białkowego osocza to zawierają dość zróżnicowany profil białkowy, który jest ściśle zależny od komórki, z której pochodzą [53]. Można to wykorzystać do wczesnej identyfikacji stanu chorobowego, a nawet do oceny stadium zaawansowania choroby [9,15,53,64]. Dodatkowym atutem przemawiającym za wykorzystaniem EV w diagnostyce klinicznej jest także możliwość ich izolacji z płynów ustrojowych. Oprócz krwi, obecność EV potwierdzono między innymi w moczu, który może być jednym z najbardziej obiecujących źródeł tych biomarkerów [34].

Duże nadzieje pokłada się w wykorzystaniu EV w immunoterapii różnych schorzeń. Wiąże się to z właściwościami EV pochodzących z komórek układu odpornościowego. Wiadomo, że EV są w stanie uniknąć lizy zależnej od aktywacji układu dopełniacza [17] oraz są oporne na RNAazy, co chroni transportowane przez nie mRNA i microRNA przed degradacją [58]. Liczne badania, w tym także badania fazy przedklinicznej, wykazały zdolność EV do stymulacji układu immunologicznego [16,19,55], co może być w przyszłości wykorzystane do produkcji szczepionek. W fazie badań klinicznych znajdują się prace nad stworzeniem szczepionki zawierającej egzosomy pochodzące z DC (Dex – dendritic cell derived-exosomes) mające między innymi zdolność aktywacji limfocytów T CD4+ i T CD8+ [24,55]. Dex zostały przetestowane pod względem bezpieczeństwa i skuteczności w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów w zaawansowanym stadium czerniaka i drobnokomórkowego raka płuc. Wyniki prób klinicznych wskazują, iż Dex mogą skutecznie indukować swoistą odpowiedź limfocytów T [24,36,55]. Ponadto trwają również zaawansowane badania nad wykorzystaniem egzosomów pochodzenia nowotworowego (Tex – tumour cell derived-exosomes) oraz egzosomów z płynu wysiękowego jamy opłucnej lub otrzewnej pacjentów z chorobą nowotworową (Aex – ascites derived- -exosomes) [55]. Wykazano, że szczepionka zawierająca Aex i czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów i granulocytów (GM-CSF – granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) może wywołać silną odpowiedź przeciwnowotworową przez stymulację limfocytów Tc u pacjentów w zaawansowanym stadium raka jelita grubego (CRC – colorectal cancer) co sugeruje, że użycie Aex + GM-CSF może być skuteczną alternatywą stosowaną w imunoterapii zaawansowanego CRC [20].

Aktywacja limfocytów T i możliwość aktywacji komórek żernych układu odpornościowego mogą być wykorzystane także do produkcji szczepionek przeciwko niektórym drobnoustrojom chorobotwórczym, np. Mycobacterium tuberculosis czy wiciowców z rodzaju Leishmania (L. major, L. donovani). W takim przypadku przypuszcza się, że MV uwolnione z zakażonych makrofagów będą aktywować mechanizmy prowadzące do eliminacji patogenów [49,51].

Podsumowanie

Ze względu na właściwości EV, w tym TMV uważa się, że mogą one odgrywać istotną rolę w progresji choroby nowotworowej (ryc. 5). Prowadzone badania mają na celu przede wszystkim weryfikację obecności na powierzchni MV niektórych antygenów, zwłaszcza tych pochodzenia nowotworowego. Jednym z takich nowatorskich podejść może być wykrywanie w płynach ustrojowych antygenów nowotworowych przenoszonych przez TMV i ich potencjalne wykorzystanie w diagnostyce onkologicznej jako wczesnego markera choroby oraz celowanej terapii przeciwnowotworowej [33,39,55]. Dotychczasowe badania dostarczyły licznych argumentów potwierdzających obecność markerów nowotworowych przenoszonych przez TMV zarówno in vivo (TMV izolowane najczęściej z osocza pacjentów), jak i in vitro (TMV pochodzące z medium hodowlanego nowotworowych linii komórkowych). Zidentyfikowanie markerów nowotworowych na TMV jest celem nowych i/lub alternatywnych strategii leczenia chorób nowotworowych. Jednym z potencjalnych sposobów wykorzystania właściwości TMV może być stymulacja układu odpornościowego do zwalczania komórek nowotworowych przez szczepionki zawierające neoantygeny pochodzące z TMV [55]. U podstaw tej koncepcji leżą badania potwierdzające możliwość wykorzystania TMV do transportu antygenów nowotworowych do komórek prezentujących antygen, głównie DC, co inicjuje i/lub wzmacnia swoistą odpowiedź przeciwnowotworową [14]. Zmniejszenie jednak liczby uwalnianych TMV mogłoby spowolnić wzrost guza oraz, według niektórych badaczy [18], zwiększyć „widoczność” komórek nowotworowych, które nie traciłyby wraz z TMV markerów, istotnych dla układu odpornościowego. Obiecujące wyniki badań dotyczących właściwości MV i/lub TMV przemawiają za możliwością ich wykorzystania w terapii przeciwnowotworowej [55], a same EV wydają się przyszłościowym markerem w diagnostyce klinicznej [42].

Przypisy

• 1. Admyre C., Johansson S.M., Paulie S., Gabrielsson S.: Direct exosomestimulation of peripheral human T cells detected by ELISPOT.Eur. J. Immunol., 2006; 36: 1772-1781
  Google Scholar
• 2. Al-Nedawi K., Meehan B., Micallef J., Lhotak V., May L., GuhaA., Rak J.: Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIIIby microvesicles derived from tumour cells. Nat. Cell Biol.,2008; 10: 619-624
  Google Scholar
• 3. Ambudkar S.V., Sauna Z.E., Gottesman M.M., Szakacs G.: A novelway to spread drug resistance in tumor cells: functional intercellulartransfer of P-glycoprotein (ABCB1). Trends Pharmacol. Sci.,2005; 26: 385-387
  Google Scholar
• 4. Andre F., Schartz N.E., Movassagh M., Flament C., Pautier P.,Morice P., Pomel C., Lhomme C., Escudier B., Le Chevalier T., TurszT., Amigorena S., Raposo G., Angevin E., Zitvogel L.: Malignanteffusions and immunogenic tumour-derived exosomes. Lancet,2002; 360: 295-305
  Google Scholar
• 5. Andreola G., Rivoltini L., Castelli C., Huber V., Perego P., DehoP., Squarcina P., Accornero P., Lozupone F., Lugini L., Stringaro A.,Molinari A., Arancia G., Gentile M., Parmiani G., Fais S.: Inductionof lymphocyte apoptosis by tumor cell secretion of FasL-bearingmicrovesicles. J. Exp. Med., 2002; 195: 1303-1316
  Google Scholar
• 6. Arteaga R.B., Chirinos J.A., Soriano A.O., Jy W., Horstman L.,Jimenez J.J., Mendez A., Ferreira A., de Marchena E., Ahn Y.S.:Endothelial microparticles and platelet and leukocyte activationin patients with the metabolic syndrome. Am. J. Cardiol.,2006; 98: 70-74
  Google Scholar
• 7. Baj-Krzyworzeka M., Szatanek R., Weglarczyk K., Baran J., UrbanowiczB., Brański P., Ratajczak M.Z., Zembala M.: Tumour-derivedmicrovesicles carry several surface determinants and mRNAof tumour cells and transfer some of these determinants to monocytes.Cancer Immunol. Immunother., 2006; 55: 808-818
  Google Scholar
• 8. Baj-Krzyworzeka M., Szatanek R., Węglarczyk K., Baran J., ZembalaM.: Tumour-derived microvesicles modulate biological activityof human monocytes. Immunol. Lett., 2007, 113: 76-82
  Google Scholar
• 9. Baran J., Baj-Krzyworzeka M., Weglarczyk K., Szatanek R., ZembalaM., Barbasz J., Czupryna A., Szczepanik A., Zembala M.: Circulatingtumour-derived microvesicles in plasma of gastric cancerpatients. Cancer Immunol. Immunother., 2010; 59: 841-850
  Google Scholar
• 10. Bobrie A., Colombo M., Raposo G., Théry C.: Exosome secretion:molecular mechanism and roles in immune responses. Traffic,2011; 12: 1659-1668
  Google Scholar
• 11. Böing A.N., Hau C.M., Sturk A., Nieuwland R.: Platelet microparticlescontain active caspase 3. Platelets, 2008; 19: 96-103
  Google Scholar
• 12. Burnier L., Fontana P., Kwak B.R., Angelillo-Scherrer A.: Cell-derivedmicroparticles in haemostasis and vascular medicine. Tromb.Haemost., 2009; 101: 439-451
  Google Scholar
• 13. Camussi G., Deregibus M.C., Bruno S., Grange C., Fonsato V.,Tetta C.: Exosome/microvesicle-mediated epigenetic reprogrammingof cells. Am. J. Cancer Res., 2011; 1: 98-110
  Google Scholar
• 14. Chaput N., Schartz N.E., André F., Taieb J., Novault S., BonnaventureP., Aubert N., Bernard J., Lemonnier F., Merad M., AdemaG., Adams M., Ferrantini M., Carpentier A.F., Escudier B., TurszT., Angevin E., Zitvogel L.: Exosomes as potent cell-free peptidebasedvaccine. II. Exosomes in CpG adjuvants efficiently primenaive Tc1 lymphocytes leading to tumor rejection. J. Immunol.,2004; 172: 2137-2146
  Google Scholar
• 15. Chaput N., Théry C.: Exosomes: immune properties and potentialclinical implementations. Semin. Immunopathol, 2011; 33:419-440
  Google Scholar
• 16. Cho J.A., Lee Y.S., Kim S.H., Ko J.K., Kim C.W.: MHC independentanti-tumor immune responses induced by Hsp70-enrichedexosomes generate tumor regression in murine models. CancerLett., 2009; 275: 256-265
  Google Scholar
• 17. Clayton A., Harris C.L., Court J., Mason M.D., Morgan B.P.: Antigen-presentingcell exosomes are protected from complementmediatedlysis by expression of CD55 and CD59. Eur. J. Immunol.,2003; 33: 522-531
  Google Scholar
• 18. Cocucci E., Racchetti G., Meldolesi J.: Shedding microvesicles:artefacts no more. Trends Cell Biol., 2009; 19: 43-51
  Google Scholar
• 19. Colino J., Snapper C.M.: Exosomes from bone marrow dendriticcells pulsed with diphtheria toxoid preferentially induce type 1antigen-specific IgG responses in naive recipients in the absenceof free antigen. J. Immunol., 2006; 177: 3757-3762
  Google Scholar
• 20. Dai S., Wei D., Wu Z., Zhou X., Wei X., Huang H., Li G.: PhaseI clinical trial of autologous ascites-derived exosomes combinedwith GM-CSF for colorectal cancer. Mol. Ther., 2008; 16: 782-790
  Google Scholar
• 21. Diamant M., Tushuizen M.E., Sturk A., Nieuwland R.: Cellularmicroparticles: new players in the field of vascular disease? Eur.J. Clin. Invest., 2004; 34: 392-401
  Google Scholar
• 22. Distler J.H., Pisetsky D.S., Huber L.C., Kalden J.R., Gay S., DistlerO.: Microparticles as regulators of inflammation: novel playersof cellular crosstalk in the rheumatic diseases. Arthritis Rheum.,2005; 52: 3337-3348
  Google Scholar
• 23. Dolo V., D’Ascenzo S., Violini S., Pompucci L., Festuccia C., GinestraA., Vittorelli M.L., Canevari S., Pavan A.: Matrix-degradingproteinases are shed in membrane vesicles by ovarian cancer cellsin vivo and in vitro. Clin. Exp. Metastasis, 1999; 17: 131-140
  Google Scholar
• 24. Escudier B., Dorval T., Chaput N., André F., Caby M.P., NovaultS., Flament C., Leboulaire C., Borg C., Amigorena S., Boccaccio C.,Bonnerot C., Dhellin O., Movassagh M., Piperno S. i wsp.: Vaccinationof metastatic melanoma patients with autologous dendriticcell (DC) derived-exosomes: results of the first phase I clinical trial.J. Transl. Med., 2005; 3: 10
  Google Scholar
• 25. Filipazzi P., Bürdek M., Villa A., Rivoltini L., Huber V.: Recentadvances on the role of tumor exosomes in immunosuppressionand disease progression. Semin. Cancer Biol., 2012; 22: 342-349
  Google Scholar
• 26. Forlow S.B., McEver R.P., Nollert M.U.: Leukocyte-leukocyteinteractions mediated by platelet microparticles under flow. Blood,2000; 95: 1317-1323
  Google Scholar
• 27. Giusti I., D’Ascenzo S., Millimaggi D., Taraboletti G., Carta G.,Franceschini N., Pavan A., Dolo V.: Cathepsin B mediates the pHdependentproinvasive activity of tumor-shed microvesicles. Neoplasia,2008; 10: 481-488
  Google Scholar
• 28. Hakulinen J., Sankkila L., Sugiyama N., Lehti K., Keski-Oja J.:Secretion of active membrane type 1 matrix metalloproteinase(MMP-14) into extracellular space in microvesicular exosomes. J.Cell. Biochem., 2008; 105: 1211-1218
  Google Scholar
• 29. Hugel B., Martinez M.C., Kunzelmann C., Freyssinet J.M.: Membranemicroparticles: two sides of the coin. Physiology, 2005; 20:22-27
  Google Scholar
• 30. Janowska-Wieczorek A., Wysoczyński M., Kijowski J., MarquezCurtisL., Machaliński B., Ratajczak J., Ratajczak M.Z.: Microvesiclesderived from activated platelets induce metastasis and angiogenesisin lung cancer. Int. J. Cancer, 2005; 113: 752-760
  Google Scholar
• 31. Jimenez J.J., Jy W., Mauro L.M., Soderland C., Horstman L.L.,Ahn Y.S.: Endothelial cells release phenotypically and quantitativelydistinct microparticles in activation and apoptosis. Thromb.Res., 2003; 109: 175-180
  Google Scholar
• 32. Kharaziha P., Ceder S., Li Q., Panaretakis T.: Tumor cell-derivedexosomes: a message in a bottle. Biochim. Biophys. Acta,2012; 1826: 103-111
  Google Scholar
• 33. Kosaka N., Iguchi H., Ochiya T.: Circulating microRNA in bodyfluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.Cancer Sci., 2010; 101: 2087-2092
  Google Scholar
• 34. Mathivanan S., Simpson R.J.: ExoCarta: a compendium of exosomalproteins and RNA. Proteomics, 2009; 9: 4997-5000
  Google Scholar
• 35. Meckes D.G. Jr., Raab-Traub N.: Microvesicles and viral infection.J. Virol., 2011; 85: 12844-12854
  Google Scholar
• 36. Morse M.A., Garst J., Osada T., Khan S., Hobeika A., Clay T.M., ValenteN., Shreeniwas R., Sutton M.A., Delcayre A., Hsu D.H., Le Pecq J.B.,Lyerly H.K.: A phase I study of dexosome immunotherapy in patientswith advanced non-small cell lung cancer. J. Transl. Med., 2005; 3: 9
  Google Scholar
• 37. Muralidharan-Chari V., Clancy J.W., Sedgwick A., D’SouzaSchoreyC.: Microvesicles: mediators of extracellular communicationduring cancer progression. J. Cell Sci., 2010; 123: 1603-1611
  Google Scholar
• 38. Nilsson J., Skog J., Nordstrand A., Baranov V., Mincheva-NilssonL., Breakefield X.O., Widmark A.: Prostate cancer-derived urineexosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br.J. Cancer, 2009; 100: 1603-1607
  Google Scholar
• 39. Pap E.: The role of microvesicles in malignancies. W: Cell Fusionin Health and Disease, Red.: Dittmar T., Zänker K.S.: Adv. Exp.Med., 2011; 950: 183-199
  Google Scholar
• 40. Peche H., Heslan M., Usal C., Amigorena S., Cuturi M.C.: Presentationof donor major histocompatibility complex antigensby bone marrow dendritic cell-derived exosomes modulates allograftrejection. Transplantation, 2003; 76: 1503-1510
  Google Scholar
• 41. Poutsiaka D.D., Schroder E.W., Taylor D.D.: Membrane vesiclesshed by murine melanoma cells selectively inhibit the expressionof Ia antigen by macrophages. J. Immunol., 1985; 134: 138-144
  Google Scholar
• 42. Raimondo F., Morosi L., Chinello C., Magni F., Pitto M.: Advancesin membranous vesicle and exosome proteomics improvingbiological understanding and biomarker discovery. Proteomics,2011; 11: 709-720
  Google Scholar
• 43. Ratajczak J., Wysoczynski M., Hayek F., Janowska-WieczorekA., Ratajczak M.Z.: Membrane-derived microvesicles: importantand underappreciated mediators of cell-to-cell communication.Leukemia, 2006; 20: 1487-1495
  Google Scholar
• 44. Robertson C., Booth S.A., Beniac D.R., Coulthart M.B., BoothT.F., McNicol A.: Cellular prion protein is released on exosomesfrom activated platelets. Blood, 2006; 107: 3907-3911
  Google Scholar
• 45. Rozmyslowicz T., Majka M., Kijowski J., Gaulton G., RatajczakM.Z.: A new role of platelet – and megakaryocyte-derived microparticles(MP) in HIV infection. Blood, 2001; 98: 786a
  Google Scholar
• 46. Safaei R., Larson B.J., Cheng T.C., Gibson M.A., Otani S., NaerdemannW., Howell S.B.: Abnormal lysosomal trafficking and enhancedexosomal export of cisplatin in drug-resistant human ovariancarcinoma cells. Mol. Cancer Ther., 2005; 4: 1595-604
  Google Scholar
• 47. Shedden K., Xie X.T., Chandaroy P., Chang Y.T., Rosania G.R.:Expulsion of small molecules in vesicles shed by cancer cells: associationwith gene expression and chemosensitivity profiles. CancerRes., 2003; 63: 4331-4337
  Google Scholar
• 48. Shen B., Wu N., Yang J.M., Gould S.J.: Protein targeting to exosomes/microvesiclesby plasma membrane anchors. J. Biol. Chem.,2011; 286: 14383-14395
  Google Scholar
• 49. Silverman J.M., Clos J., Horakova E., Wang A.Y., Wiesgigl M.,Kelly I., Lynn M.A., McMaster W.R., Foster L.J., Levings M.K., ReinerN.E.: Leishmania exosomes modulate innate and adaptive immuneresponses through effects on monocytes and dendritic cells. J. Immunol.,2010; 185: 5011-5022
  Google Scholar
• 50. Simons M., Raposo G.: Exosomes – vesicular carriers for intercellularcommunication. Curr. Opin. Cell Biol., 2009; 21: 575-581
  Google Scholar
• 51. Singh P.P., Smith V.L., Karakousis P.C., Schorey J.S.: Exosomesisolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo.J. Immunol., 2012; 189: 777-785
  Google Scholar
• 52. Skog J., Würdinger T., van Rijn S., Meijer D.H., Gainche L., SenaEstevesM., Curry W.T. Jr., Carter B.S., Krichevsky A.M., BreakefieldX.O.: Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins thatpromote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol., 2008; 10: 1470-1476
  Google Scholar
• 53. Smalley D.M., Ley K.: Plasma-derived microparticles for biomarkerdiscovery. Clin. Lab., 2008; 54: 67-79
  Google Scholar
• 54. Szajnik M., Czystowska M., Szczepański M.J., Mandapathil M.,Whiteside T.L.: Tumor-derived microvesicles induce, expand andup-regulate biological activities of human regulatory T cells (Treg).PLoS One, 2010; 5: e11469
  Google Scholar
• 55. Tan A., De La Peña H., Seifalian A.M.: The application of exosomesas a nanoscale cancer vaccine. Int. J. Nanomedicine, 2010;5: 889-900
  Google Scholar
• 56. Théry C., Boussac M., Véron P., Ricciardi-Castagnoli P., RaposoG., Garin J., Amigorena S.: Proteomic analysis of dendritic cell-derivedexosomes: a secreted subcellular compartment distinct fromapoptotic vesicles. J. Immunol., 2001; 166: 7309-7318
  Google Scholar
• 57. Théry C., Zitvogel L., Amigorena S.: Exosomes: composition,biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol., 2002; 2: 569-579
  Google Scholar
• 58. Trajkovic K., Hsu C., Chiantia S., Rajendran L., Wenzel D.,Wieland F., Schwille P., Brügger B., Simons M.: Ceramide triggersbudding of exosome vesicles into multivesicular endosomes. Science,2008; 319: 1244-1247
  Google Scholar
• 59. Valadi H., Ekström K., Bossios A., Sjöstrand M., Lee J.J., LötvallJ.O.: Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs isa novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. CellBiol., 2007; 9: 654-659
  Google Scholar
• 60. Valenti R., Huber V., Iero M., Filipazzi P., Parmiani G., RivoltiniL.: Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression.Cancer Res., 2007; 67: 2912-2915
  Google Scholar
• 61. van Doormaal F.F., Kleinjan A., Di Nisio M., Büller H.R., NieuwlandR.: Cell-derived microvesicles and cancer. Neth. J. Med.,2009; 67: 266-273
  Google Scholar
• 62. VanWijk M.J., VanBavel E., Sturk A., Nieuwland R.: Microparticlesin cardiovascular diseases. Cardiovasc. Res., 2003; 59: 277-287
  Google Scholar
• 63. Vidal M., Sainte-Marie J., Philippot J.R., Bienvenue A.: Asymmetricdistribution of phospholipids in the membrane of vesiclesreleased during in vitro maturation of guinea pig reticulocytes:evidence precluding a role for “aminophospholipid translocase”.J. Cell. Physiol., 1989; 140: 455-462
  Google Scholar
• 64. Welton J.L., Khanna S., Giles P.J., Brennan P., Brewis I.A.,Staffurth J., Mason M.D., Clayton A.: Proteomics analysis of bladdercancer exosomes. Mol. Cell. Proteomics, 2010; 9: 1324-1338
  Google Scholar
• 65. Wolf P.: The nature and significance of platelet products inhuman plasma. Br. J. Haematol., 1967; 13: 269-288
  Google Scholar
• 66. Wubbolts R., Leckie R.S., Veenhuizen P.T., Schwarzmann G.,Möbius W., Hoernschemeyer J., Slot J.W., Geuze H.J., Stoorvogel W.:Proteomic and biochemical analyses of human B cell derived exosomes.Potential implications for their function and multivesicularbody formation. J. Biol. Chem., 2003; 278: 10963-10972
  Google Scholar
• 67. Wysoczynski M., Ratajczak M.Z.: Lung cancer secreted microvesicles:underappreciated modulators of microenvironmentin expanding tumors. Int. J. Cancer, 2009; 125: 1595-1603
  Google Scholar
• 68. Zwaal R.F., Comfurius P., Bevers E.M.: Scott syndrome, a bleedingdisorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids.Biochim. Biophys. Acta, 2004; 1636: 119-128
  Google Scholar

Pełna treść artykułu