Streszczenie

Defensyny to peptydy odpornościowe – HDP (Host Defence Peptides) wykazujące dużą aktywność wobec wirusów, bakterii i grzybów u ssaków, w tym człowieka. Związki te są ważnym elementem odporności naturalnej w tych makroorganizmach, na którą mikroorganizmy w procesie ewolucji, nie wykształciły oporności. Defensyny w makroorganizmach kręgowców, oddziaływają bezpośrednio oraz pośrednio na zarazki, m.in. przez pobudzenie syntezy substancji odpornościowych, takich jak cytokiny, chemokiny i czynniki wzrostu.

Wprowadzenie

Defensyny należą do grupy peptydów odpornościowych, określanych jako endogenne peptydy przeciwdrobnoustrojowe (antimicrobial peptides) o dużej aktywności przeciwzakaźnej. Ze względu na strukturę ich prekursorów, długość łańcucha aminokwasów oraz wiązań dwusiarczkowych, podzielono je u kręgowców na α‑, β – i θ‑defensyny [1, 10, 15, 20, 23, 36, 37, 40, 47, 48, 70]. Ich rola w odporności przeciw wirusom, bakteriom i grzybom jest najdokładniej scharakteryzowana u ssaków, głównie u ludzi [10, 14, 19, 20, 23, 37, 40, 41, 44, 47, 48, 58, 70, 77]. Działają nie tylko bezpośrednio na zarazki, ale także oddziaływają pośrednio, przez transdukcję sygnałów i regulację szlaków zapalnych, wywołując aktywację układu odpornościowego [40, 47, 48, 70, 77]. Na wirusy działają hamująco i niszcząco [15, 23, 27, 40, 70], a wobec bakterii i grzybów przez prostopadłe i równoległe wbudowywanie się w ich błonę, powodują tworzenie por, czego skutkiem jest niszczenie tych zarazków [48, 70]. Konstytutywnie są syntetyzowane przez neutrofile, komórki Panetha i nabłonkowe, głównie przewodu pokarmowego, choć także układu moczowo‑płciowego, a także keratynocyty. Natomiast w wyniku oddziaływania cytokin i LPS są syntetyzowane przez monocyty‑makrofagi, komórki tuczne, trombocyty, limfocyty T CD8+ i komórki NK [27, 30, 48, 76]. Defensyny to drobnocząsteczkowe, krótkie, kationowe, amfipatyczne polipeptydy, bogate w cysteinę (przeważnie 6 reszt cysteinowych tworzących trzy mostki dwusiarczkowe) oraz argininę, które jako przeciwzarazkowe białka kationowe izolowano już w latach 1966‑1971 z neutrofili od królików, a w latach 1985/86 opisano je jako czynniki wirusobójcze u ludzi i królików nazywając α‑defensynami. Zidentyfikowany w komórkach tchawicy bydła peptyd TAP (tracheal antimicrobial peptide) w 1991 r., to obecne β‑defensyny, które są filogenetycznie starsze od α‑defensyn [18, 27, 47, 76].

Defensyny wykazano u wielu kręgowców i bezkręgowców, a nawet u roślin [14, 24, 33, 42, 47, 56, 65, 74]. U tych ostatnich opisano je u jęczmienia i pszenicy, jako ɣ – tioniny, charakteryzujące się dużą aktywnością wobec bakterii i pasożytów [42, 65]. Szacuje się, że u kręgowców jest ponad 80 α‑defensyn, ponad 200 β‑defensyn i tylko 5 θ‑defensyn [77]. U ssaków peptydy te opisano w postaci 12 α‑defensyn, 25 β‑defensyn i 5 θ‑defensyn, które stwierdzono m.in. w komórkach PMN i makrofagach oraz komórkach nabłonkowych i śródnabłonkowych oraz kariomiocytach [47]. Geny defensyn u człowieka są umiejscowione na chromosomach 8p 23, u bydła i owiec na chromosomie 27 i 26, a u świń na chromosomie 15 [27]. Zarejestrowano także u ludzi gen defensyn na chromosomach 6 i 20 [26]. Defensyny opisano u naczelnych (ludzie i małpy) oraz zwierząt, w tym zwierząt gospodarskich (bydło, owce, świnie, konie), laboratoryjnych (świnki morskie, szczury, myszy, króliki, chomiki, szynszyle), dzikich (zające, słonie afrykańskie) oraz torbaczy, a także u ptaków domowych (kura, kaczka, indyk) i dzikich (czarnoskóra, wróbel), też u waleni, ryb i owadów [1, 4, 25, 27, 28, 35, 42, 43, 47, 53, 67]. U ssaków, w tym człowieka, nie tylko warunkują odporność naturalną, ale także wpływają na odporność nabytą, przez co przyczyniają się do utrzymania pełnej homeostazy immunologicznej, m.in. przez wzmaganie działania bójczego i cytotoksycznego komórek układu odpornościowego oraz wpływ na wytwarzanie cytokin, chemokin i czynników wzrostu [1, 6, 7, 9, 11, 15, 22, 23, 27, 29, 34, 35, 40, 43, 47, 48, 49, 58, 59, 69, 70, 72].

Defensyny u ludzi

Peptydy ludzi opisano jedynie jako α – i β‑defensyny, które mają masę cząsteczkową 3‑6 kDa, strukturę β‑kartki z charakterystyczną ,,szpilką” do włosów, co przypomina strukturę chemokin [1, 27, 40, 42, 47, 76]. Są wytwarzane 100 razy szybciej niż immunoglobuliny, a ich synteza rozpoczyna się w 14‑17 tygodniu życia płodu [53, 71].

W przypadku α – defensyn wykazano, że są to małe peptydy o ciężarze cząsteczkowym 3‑4 kDa, zawierające 29‑35 reszt aminokwasowych bogatych w argininę i lizyny, z trzema mostkami dwusiarczkowymi, które łączą ze sobą cysteiny C1‑C6, C2‑C4, C3‑C5 (charakterystyczny motyw dla tej grupy białek) [40, 69]. U ludzi w obrębie α – defensyn, wyróżnia się 6 peptydów, wśród których 4 peptydy – HNP (human neutrophil peptides) 1‑4, ulegają ekspresji w neutrofilach, monocytach, limfocytach, komórkach NK i komórkach dendrytycznych, a peptyd HD5 i HD6 (kryptydyna), ulega ekspresji w komórkach nabłonkowych przewodu pokarmowego, zwłaszcza w komórkach Panetha, choć także w komórkach nabłonkowych dróg oddechowych i komórkach żeńskiego układu rozrodczego tworząc i warunkując odporność ogólną i lokalną [3, 15, 22, 32, 47, 61].

Natomiast β‑defensyny u ludzi, to peptydy o ciężarze 4‑5 kDa i w odróżnieniu od α‑defensyn, są nieco dłuższe, ponieważ zawierają do 45 reszt aminokwasowych i mimo że mają podobną strukturę trzeciorzędową jak α‑defensyny, zawierają inny motyw cysteinowy (C1‑C5, C2‑C4, C3‑C6), mają też stosunkowo więcej argininy i lizyny [40]. Są reprezentowane przez peptydy HBD1‑4 (human beta defensin), przy czym najlepiej scharakteryzowanym jest peptyd HBD1 [15]. Peptyd ten jest kodowany przez geny DEFB1, ulega ekspresji w sposób konstytutywny. Ekspresja peptydu HBD2 i HBD3 następuje w wyniku oddziaływania na różne bodźce zapalne, w tym bakterie, cytokiny prozapalne, a także substancje powstałe w wyniku aktywacji receptorów TLR i NOD [15]. β‑defensyny poza właściwościami przeciwdrobnoustrojowymi, cechują się działaniem immunomodulującym, ponieważ oddziałują m.in. na aktywność makrofagów, limfocytów CD4+ oraz niedojrzałych komórek dendrytycznych, wpływają też na modulację cytokin prozapalnych i przyśpieszają proces gojenia ran [21].

Przeciwdrobnoustrojowe działanie, tak α – jak i β‑defensyn u ludzi, łączy się, podobnie jak u innych ssaków, z ich hamującym oddziaływaniem na wirusy i bakterie [10, 15, 19, 22, 27, 36, 37, 40, 47, 48, 70]. Ich przeciwwirusową aktywność wykazano zwłaszcza wobec wirusa HIV‑1 (human immunity virus‑1), HIV‑2 (human immunity virus‑2), cytomegalii, opryszczki, grypy, adenowirusów, enterowirusów, a także wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej [15, 23, 27, 40, 47]. W przypadku wirusa HIV‑1, stwierdzono bezpośredni wpływ α‑defensyn na jego inaktywację, dzięki czemu wykorzystuje się je do zwalczaniu zakażeń tym patogenem, gdy okazało się, że ich duże stężenie w mleku matki, zmniejsza ryzyko wystąpienia poporodowego zakażenia HIV‑1 [15]. Wykazano że α‑defensyny HNP1, HD5 i HD6, działają także na HSV‑2 (human simplex virus‑2), uniemożliwiając wiązanie się tych wirusów do glikoproteiny B lub do siarczanu heparyny [40, 47]. Działanie α‑defensyny, a przede wszystkim HNP1, wobec wirusa opryszczki – HSV‑1 (human simplex virus‑1), jest uzależnione od temperatury oraz pH środowiska [40, 47]. W przypadku β‑defensyn wykazano, że oddziaływają w czasie zakażenia wirusem HIV, gdyż zarejestrowano wyraźny wzrost peptydu HBD2 i HBD3, a to powoduje niszczenie tego wirusa. Dowiedziono również, że peptydy te ograniczają ruch limfocytów T CD4+, przez hamowanie działania chemokiny CXCR4, co może być przyczyną rozwoju infekcji [15]. Udowodniono, że hamujące działanie peptydu HBD3 wobec wirusa HSV‑2, wiąże się z jego działaniem supresyjnym na ludzkie komórki nabłonka szyjki macicy i zakłóceniem przenikania tego wirusa, tak jak się to dzieje w przypadku działania α‑defensyn (HNP1, HD5 i HD6), które także umożliwiają wiązanie wirusa HIV do glikoproteiny B i siarczanu heparyny [23].

Wykazano natomiast, że przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze działanie α – i β‑defensyn jest najbardziej skuteczne wobec bakterii z rodzaju Streptococcus, Staphylococcus, Salmonella, Escherichia, Mycobacterium, Shigella, Vibrio, Lactobacillus, Campylobacter, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Micrococcus, Listeria, a z grzybów Candida spp. [40, 47, 77]. Bardziej efektywne oddziaływanie wykazują wobec bakterii tlenowych niż beztlenowych [20, 77]. Stwierdzono ponadto, że α‑defensyny, takie jak HNP‑1, HNP‑3 i HD‑5, blokują jeden z głównych czynników wirulencji Clostridium difficile – toksynę B [20, 77], a β‑defensyna – HBD‑3, wykazuje dużą aktywność wobec lekoopornych klinicznie szczepów: Staphylococcus aureus, Enterococcus feacium, Pseudomonas aureginosa, Stenotrophomonas maltophila oraz Acinetobacter baumanie, bo in vitro w ciągu 20 minut, zabijają te drobnoustroje nawet przy ich niskim stężeniu [36]. β‑defensyna – HBD‑3 sama lub z lizozymem, metronidazolem czy amoksycykliną, wykazuje in vitro, bakteriobójczą aktywność wobec powszechnie izolowanych bakterii z jamy ustnej, takich jak Streptococcus mutants, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus acidophilus, Actinomycetemcomitans actinomycetemcomitans i Porphyromonas gingivalis [37]. Peptyd ten (HBD‑3) jest również silnym inhibitorem tworzenia biofilmu na powierzchniach implantów medycznych, utworzonych przez oporne na metycylinę szczepy Staphylococcus (S.) epidermidis i S. aureus [40]. Również β‑defensyna HBD‑2, wykazując bójcze działanie wobec bakterii jest dobrym związkiem do stosowania w zapobieganiu zakażeń tytanowymi implantami ortopedycznymi [52].

Poza silnym oddziaływaniem α i β‑defensyn, wobec wirusów, bakterii i grzybów, peptydy te biorą udział w regulacji odporności wrodzonej i nabytej. Wykazano że α‑defensyny hamując wydzielanie cytokin przez makrofagi [54], oddziaływają supresyjnie na klasyczną i lektynową aktywację drogi dopełniacza oraz wpływają na ekspresję receptorów HLA‑DR, przez co działają przeciwzapalnie [35]. Ponadto α‑defensyna – HNP‑1, wzmaga w neutrofilach u ludzi wydzielanie TNF‑α i IFN‑γ, a to aktywuje i wzmaga zdolność procesu fagocytozy makrofagów [14]. Alfa‑defensyna (HNP‑1), wraz z peptydem HNP‑2, przez sygnalizację β‑kateniny, stymulując syntezę kolagenu i proliferację ludzkich fibroblastów płucnych, uczestniczy w hamowaniu procesów patologicznych [69]. Natomiast oddziaływanie β‑defensyny – HBD‑2 i także HBD‑1, wiąże się z indukcją m.in. chemotaktyczności komórek T pamięci CD4+ oraz niedojrzałych komórek dendrytycznych przez wiązanie CCR6 (C‑C chemokine receptor type 6) [13, 17, 47, 50, 51]. Stwierdzono także, że β‑defensyny aktywują neutrofile, monocyty, limfocyty T, komórki dendrytyczne oraz komórki tuczne [47, 61]. Takie β‑defensyny jak HBD2, HBD3 i HBD4 również wpływają na keratynocyty u ludzi [62], które pod wpływem ich działania, zwiększają ekspresję mediatorów prozapalnych, np. MPC‑1 (monocyte chemoattractant protein‑1), MIP3α (macrophage inflammatory protein 3α), RANTES (regulated on activation, normal T‑cell expressed and secreted) oraz IL‑6, IL‑10 i IL‑31 [61]. W przypadku β‑defensyny HBD‑1, która zwiększa migrację keratynocytów przez fosforylację naskórkowego receptorowego czynnika wzrostu, wpływa także na regulację szybkości proliferacji keratynocytów i w ten sposób korzystnie oddziałuje m.in. na proces gojenia się ran [69]. Dowiedziono także, że oprócz bezpośredniego udziału β‑defensyny np.: HDB‑3 w reakcjach zapalnych, przez indukcję cytokin prozapalnych, peptydy te biorą udział w hamowaniu apoptozy neutrofili, ponieważ stwierdzono, że wiążąc się z CCR6 na powierzchni granulocytów obojętnochłonnych, inicjują wzrost antyapoptotycznych białek Bcl‑xL i inhibitora kaspazy‑3 [45]. Taki udział α – i β – defensyn u ludzi, w oddziaływaniu na procesy immunologiczne, tj. m.in. proliferację, migrację, bójczość i cytotoksyczność komórek układu odpornościowego, to dowód na ich immunomodulujące oddziaływanie i wpływ na homeostazę makroorganizmu w czasie zakażenia makroorganizmu wirusami, bakteriami i grzybami [8, 11, 15, 21, 22, 35, 38, 45, 49, 55, 62, 68, 69, 73].

Oprócz przeciwzarazkowgo i aktywującego działania α – i β‑defensyn na układ odpornościowy, obecnie przyjmuje się, że defensyny mogą służyć także jako biomarkery niektórych chorób infekcyjnych [10]. Wykazano, że zwłaszcza u osób z zakażeniem dróg moczowych [10, 75], stężenie α‑defensyn (HNP‑1, HNP‑2, HNP‑3 i HD‑5) oraz β‑defensyny, głównie HBD‑2 w moczu, jest znacznie zwiększone. Przyjmuje się także, że ,,określony” poziom α‑defensyn u ludzi, to dobry biomarker nowotworów złośliwych, bo np. u osób z rakiem okrężnicy, zarejestrowano wzrost stężenia, co świadczy, że α‑defensyny mogą stanowić dobry marker do rozpoznania tego stanu chorobowego [2, 75]. Zarówno α – jak i β – defensyny mogą być także stosowane jako potencjalne adiuwanty, a nawet nośniki szczepionek [31, 70]. Stężenie fizjologiczne defensyn w surowicy osób dorosłych wynosi 81,85 ng/ml, w ślinie 0,8 ng/l, w plwocinie 18,2 ng/ml, w płynie oskrzelowym – pęcherzykach 268,3 ng/ml, w moczu 15,7 ng/ml, a stany chorobowe u ludzi powodują podwyższenie ich ilości 50 – 250% [76].

Defensyny u zwierząt

Peptydy te są najbardziej poznane u człowieka, choć opisano i scharakteryzowano je u wielu kręgowców w tym małp, zwierząt gospodarskich, laboratoryjnych, zwierząt dzikich oraz ptaków, waleni, ryb, owadów, u których występują przeważnie jako β – i/lub α‑defensyny, a ich działanie jest podobne do defensyn u ludzi [1, 4, 25, 27, 28, 35, 42, 43, 47, 53, 67].

U małp, oprócz β‑defensyn vhBD‑1, – 2 [5] i α‑defensyn – PHD1‑3 [66], które są zbliżone budową i funkcjami do α‑defensyn u ludzi, opisano tylko u tego gatunku ssaków bardzo aktywne θ‑defensyny [5, 12, 17, 27, 64, 66], które cechują się najsilniejszym działaniem biologicznym wśród defensyn u ssaków [59, 60]. Defensyny‑θ u małp, występują u rezusa, makaków, gibona i orangutana, w postaci peptydu RTD (rhesus theter defensyn) 1‑3, w neutrofilach i monocytach [5, 19, 27, 47, 66, 76, 77], u pawianów występują w postaci peptydu BTD (babon T‑defensin) 1‑5 [63] w komórkach szpiku, nerkach oraz mózgu [19, 27]. Najnowsze badania [19, 27] wykazały, że u pawiana płaszczowego zarejestrowano także θ‑defensyny o nazwie PhTD (papio humane drys theta‑defensyn) 1 i 3. Wymienione θ‑defensyny u małp mają strukturę kolistą, która powstaje przez połączenie się dwóch peptydów, z których każdy składa się z 9 reszt aminokwasowych [1, 27, 40, 42, 47, 57]. U małp wykazują silne działanie przeciwwirusowe (HIV1, HIV2, wirus grypy) oraz przeciwbakteryjne (Bacillus anthracis) [3, 12, 19, 27, 38, 39]. Opisano [29, 34, 47] także, że θ‑defensyny, występują u bliżej nieokreślonych zwierząt (nie podano nazwy), jako retrocyklina‑1 i – 3. Podano również, że istnieje gen u człowieka, który mógłby kodować θ‑defensyny, ale w sekwencji tego genu jest kodon „stop” [46].

Natomiast w przypadku defensyn u zwierząt gospodarskich, to jest bydła, owiec, koni i świń, peptydy te występują jako β‑defensyny, z tym że u bydła reprezentowane są przez peptydy TAP, LAP, EBD, BNBD 1‑12, BBD119, 120, 122, 122a, 123, 124, 142 oraz peptyd DEFB 401 i 405, zaś u owiec, kóz i koni przez peptyd SBD 1 i 2, GBD 1 i 2 (kozy i owce) oraz HBD 1 (albo eBD) – konie – choć u tych ostatnich opisano także α‑defensyny o nazwie DEFA1. U świń zarejestrowano aż 13 β‑defensyn, to jest: pBD 1‑4, 104, 108, 114, 123, 125, 126, 129 oraz pBD 125 i 129 albo pEP2C i pEP2E [4, 27, 35, 47, 48, 53]. Defensyny u zwierząt gospodarskich, są bardzo ważnym elementem odporności naturalnej i głównie u bydła i owiec, ponieważ biorą udział w zapaleniu wymienia u krów, płuc u owiec, a ponadto działają u tych zwierząt modulująco na układ odpornościowy [27, 35]. U świń i koni peptydy te są stosunkowo mniej poznane, ale przyjmuje się, że stanowią ważny element obronny, zwłaszcza element obrony naturalnej, w tym lokalnej [27, 35, 47, 53].

U zwierząt laboratoryjnych, np. świnek morskich, chomików, szynszyli, szczurów, myszy i królików, peptydy te są reprezentowane przez α‑defensyny o nazwie NP1 i 5 oraz kryptydynę‑3 i – 4 [67]. Według Linde i wsp. [35] defensyny u świnki morskiej występują także w postaci peptydu o nazwie GPNP I i III, u królików jako NP1‑3a, NP3b‑5 i rNP1‑2.4. Autorzy wyróżniają także u chomika α‑defensyny i określają je jako peptydy HANP1‑4 i Crp 1‑6 [35]. Podają, że β‑defensyny występują u szynszyli w postaci peptydu cBD1, u szczurów w postaci peptydu 42rBDs, a u myszy jako peptyd mBD1‑15 i mBD34‑40 [35]. Przyjmuje się [35, 47], że defensyny u zwierząt laboratoryjnych, w tym królików, są ważnymi i głównymi elementami obronnymi w infekcjach bakteryjnych przewodu pokarmowego.

Defensyny opisano także u zwierząt dzikich, takich jak torbacze: koala, kangur mały i diabeł tasmański, które są zbliżone budową do β – i/lub α‑defensyn ssaczych i wykazują silne działanie niszczące wobec błon biologicznych w tym błon makroorganizmów [28].

U ptaków peptydy te opisano, jako β‑defensyny, z tym że u kurcząt opisano je jako GA1‑3,6,11,13 lub β‑defensyny 1‑10 i 13, u kaczek jako peptyd AvBD 2, 9, 10 i stwierdzono, że syntetyzowane są przez leukocyty krwi, komórki przewodu pokarmowego, płuc, śledziony, wątroby, tchawicy, skóry, mózgu oraz torebkę Fabrycjusza i wykazują działanie przeciwzarazkowe [4, 33].

U waleni, ryb i owadów wykazano, że peptydy te występują w postaci β‑defensyn, które mają silne działanie bójcze wobec bakterii wywołujących procesy zapalne [42, 43].

Dodać należy, że dane dotyczące defensyn u zwierząt, w stosunku do analogicznych u ludzi, są zdecydowanie łagodniejsze, choć przyjmuje się, że działają antyzarazkowo. Wykazano in vitro, ich m.in. silne bójcze działanie wobec wielu bakterii i niektórych wirusów zwierzęcych [27, 30, 76]. Przyjmuje się ponadto, że defensyny zwierząt, podobnie jak u ludzi, oddziaływają nie tylko bezpośrednio na zarazki, ale także pośrednio, aktywując układ odpornościowy, przez co wpływają na utrzymanie właściwej homeostazy makroorganizmu [27, 47, 53].

Podsumowanie

Defensyny jako peptydy odpornościowe u ludzi i zwierząt, są ważnymi elementami odporności przeciwwirusowej, bakteryjnej i grzybiczej. Są także silnymi induktorami układu odpornościowego, a ze względu na oddziaływanie regulacyjne wobec substancji odpornościowych, stają się w niektórych schorzeniach dobrymi markerami tych stanów. Ich budowę i rolę biologiczną najbardziej poznano u ludzi, choć opisano je u wielu zwierząt kręgowych, w tym gospodarskich, bezkręgowych, m.in. owadów oraz u roślin. Peptydy te, ze względu na brak oporności zarazków na nie, stają się alternatywnymi związkami wobec chemioterapeutyków i są określane jako naturalne antybiotyki.

Pełna treść artykułu