Abstrakt

Polimery zewnątrzkomórkowe składające się na macierz biofilmu (ECM) charakteryzują się zróżnicowaną budową. Największa pod względem objętościowym jest frakcja polisacharydowa złożona z homo- lub heteropolisacharydów. Pozostałe składniki ECM to białka, eDNA, glikoproteiny i lipidy. Komponenty macierzy chronią komórki przed otaczającym środowiskiem, uczestniczą w procesie powstawania oraz dojrzewania biofilmu, stabilizują strukturę biofilmu, a także są źródłem składników odżywczych i wody dla komórek. Polimery zewnątrzkomórkowe wytwarzane w biofilmie mogą być istotnym czynnikiem chorobotwórczości w rozwoju różnych chorób człowieka, np. w zakażeniach Pseudomonas aeruginosa występujących w przebiegu mukowiscydozy. P. aeruginosa syntetyzuje trzy główne egzopolisacharydy: Pel, Psl i alginian, a także liczne białka zewnątrzkomórkowe – lektyny oraz białka o charakterze enzymatycznym, takie jak: PasP, chitynaza, aminopeptydazy, proteaza IV, które ułatwiają tej bakterii zasiedlanie tkanki płucnej i stymulują rozwój choroby podstawowej.Chorobą, w rozwoju której istotną rolę odgrywa macierz zewnątrzkomórkowa drobnoustrojów, jest próchnica. Schorzenie to jest związane z rozwojem biofilmu wielogatunkowego na powierzchni zębów. Polimery będące częścią tej struktury wykazują skomplikowaną budowę, odmienną u różnych pacjentów. Warunki otaczającego środowiska, np. obecność sacharozy, w bardzo istotny sposób wpływają na syntezę polimerów zewnątrzkomórkowych: mutanu i dekstranu.Infekcje przebiegające z tworzeniem biofilmów na powierzchni implantów medycznych są istotnym problemem medycznym i ekonomicznym. Głównym składnikiem macierzy tych biofilmów są substancje o charakterze cukrowym (np. adhezyna PIA, kwas tejchojowy EC-TA), a także białka zewnątrzkomórkowe i powierzchniowe.Badania nad strukturą macierzy oraz analiza czynników regulujących jej syntezę są niezbędne, ich wyniki mogą być wykorzystane do opracowania technik eradykacji biofilmu i lepszej kontroli infekcji związanych z jego rozwojem.

Wprowadzenie

Mikroorganizmy najczęściej występują w jednej z dwóch postaci wzrostu – osiadłej i planktonowej (zdolnej do przemieszczania). Drobnoustroje przytwierdzone do podłoża stałego, otoczone wydzielanymi przez siebie polimerami zewnątrzkomórkowymi (ECM – extracellular matrix) tworzą złożoną strukturę, zarówno pod względem budowy, jak i funkcji, nazwaną biofilmem. Wiele uwagi poświęca się analizie zmian, jakie zachodzą w komórkach drobnoustrojów podczas przechodzenia w inną postać wzrostu, np. z planktonowej na osiadłą. Badane są różnice w ekspresji genów tych dwóch typów komórek (planktonowych i osiadłych), a także ich cechy fenotypowe. Jedną z istotnych zmian, jakie obserwuje się u komórek żyjących w biofilmie, jest wzmożona synteza polimerów zewnątrzkomórkowych tworzących macierz.

Grubość warstwy biopolimerów w biofilmie zależy od gatunku mikroorganizmu; szacuje się, że najczęściej wynosi 0,2-1,0 μm, często jednak bywa zdecydowanie cieńsza – 10-30 nm [11]. Budowa i skład chemiczny ECM dla danego gatunku mogą się zmieniać w zależności od warunków hodowli, mikroflory towarzyszącej czy stadium, w którym znajdują się komórki. Wiele bakterii może wytwarzać kilka różnych egzopolimerów, w róż- nych proporcjach. W środowisku naturalnym (np. na powierzchniach zanurzonych w wodzie czy na tkankach organizmu podczas rozwoju infekcji) biofilm najczęściej jest uformowany z wielu gatunków mikroorganizmów. Jeśli uwzględni się, że każdy z drobnoustrojów wydziela inne polimery zewnątrzkomórkowe, a każda z populacji tworzących biofilm jest w odmiennym stadium dojrzewania i inaczej reaguje na bodźce ze środowiska, to uświadomimy sobie jak złożoną i unikatową strukturą jest macierz biofilmu [63].

Egzopolimery macierzy są głównymi komponentami w  rozwoju i  funkcjonowaniu biofilmu bakteryjnego. Początkowo uważano, że ochrona przed czynnikami szkodliwymi: fizycznymi (np. promieniowanie UV), chemicznymi (leki, środki dezynfekcyjne) czy biologicznymi (bakteriofagi, pierwotniaki, czynniki układu odporno- ściowego gospodarza) jest podstawową funkcją macierzy. Po wielu latach badań uznano jednak, że polimery zewnątrzkomórkowe pełnią też inne role – stabilizują strukturę biofilmu, nadają jej kształt, są również niezbędne w procesie powstawania i dojrzewania biofilmu [11,43]. Jako przykład takich substancji wymienić można białka zewnątrzkomórkowe, które uczestniczą w procesie adhezji do powierzchni stałych czy eDNA (extracellular DNA), który determinuje prawidłowy rozwój komórek w biofilmie. Nie należy zapominać o jeszcze jednej niezwykle istotnej roli polimerów zewnątrzkomórkowych – stanowią swego rodzaju magazyn składników odżywczych i wody dla komórek żyjących w społeczno- ści osiadłej, np. hydrofilowe egzopolimery zatrzymują w obrębie struktury biofilmu wodę, która może zostać wykorzystana przez komórki bakterii w  warunkach skrajnego odwodnienia środowiska wzrostu. Polisacharydy zewnątrzkomórkowe obecne w strukturze matriks w warunkach głodowych mogą być źródłem pierwiastków biogennych.

Budowa macierzy

Podstawowym składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej jest woda, która może stanowić nawet 97% całej matriks [63]. Ponadto macierz tworzą: egzopolisacharydy (EPS – extracellular polysaccharides), białka, kwasy nukleinowe, glikoproteiny, a także lipidy. Coraz częściej jako budulec matriks wymienia się kwasy lipotejchojowe i lipopolisacharyd (LPS) [74]. Wielu badaczy podkreśla, że struktura macierzy w biofilmie pałeczek Gram-ujemnych może wykazywać duże podobieństwo do lipopolisacharydu. W  przypadku bakterii z  rodzaju Proteus oceniono, że zawartość LPS w macierzy biofilmu waha się w granicach 50-90% [1,53,70].

Polisacharydy

Najbardziej istotnym pod względem objętościowym składnikiem macierzy są polisacharydy, głównie cukrowce obojętne lub kwasy uronowe, najczęściej tworzące długie łańcuchy o masie cząsteczkowej 0,5-2 x 106 Da. Wielu badaczy dzieli polisacharydy macierzy na różne grupy. Niżej przedstawiono najczęściej stosowane klasyfikacje (ryc. 1):

1. Podział ze względu na postać (strukturę), w której występują egzopolisacharydy – wyróżnia się trzy główne postaci: liniową, rozgałęzioną bądź cykliczną [60].

2. Podział ze względu na umiejscowienie w biofilmie – wyróżnia się wielocukry związane z komórką (egzopolisacharyd otoczkowy, związany z komórką przez lipidy, np. zawierające glicerol) i egzopolisacharydy niezwią- zane z komórką – często określane mianem śluzu.

3. Podział ze względu na budowę chemiczną – na homopolisacharydy i heteropolisacharydy [11,63]. Ostatnia z wymienionych klasyfikacji jest najczęściej stosowanym podziałem sacharydów macierzy.

Homopolisacharydy są złożone tylko z jednego rodzaju cukrów prostych: D-glukozy lub L-fruktozy, najczęściej są trudno rozpuszczalne w wodzie. Większość autorów dzieli je na trzy grupy:

• α-D-glukany, zbudowane z  monomerów D-glukozy, połączonych wiązaniem α [1,6],

• β-D-glukany, zbudowane z  monomerów D-glukozy, połączonych wiązaniem β [1,3],

• fruktany, zbudowane z podjednostek fruktozy, połączonych wiązaniem β (2, 6) [11,21].

Przykładem homopolisacharydów jest PNAG (poli-N- -acetyloglukozamina) wytwarzana przez Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis czy celuloza wydzielana m.in. przez Gluconacetobacter xylinus oraz Escherichia coli. Do grupy α-D-glukanów zalicza się dekstran wytwarzany przez Leuconostoc mesenteroides, do β-D-glukanów – kurdlan wydzielany przez Agrobacterium spp., a do fruktanów – lewan syntetyzowany przez wiele grup bakterii, np. Bacillus spp. [11,21].

Heteropolisacharydy najczęściej mają ładunek ujemny, dzięki obecności w ich budowie np. grup fosforanowych, siarczanowych, kwasów uronowych. Cecha ta sprawia, że polimery są dobrze rozpuszczalne w wodzie. Są to związki zbudowane z powtarzających się jednostek węglowodanowych, zawierających najczęściej np. D-glukozę, L-fruktozę, L-ramnozę, kwas D-glukuronowy, kwas L-guluronowy, N-acetyloglukozaminę czy też N-acetylogalaktozaminę. Przykładem takich związków jest alginian wytwarzany przez Pseudomonas aeruginosa czy różne polisacharydy wytwarzane przez bakterie kwasu mlekowego [8,11,21,47]. O właściwościach polisacharydów decyduje wiele różnych czynników, m.in. rodzaj wiązań między monomerami oraz typ rozgałęzienia cząsteczki. Najczęściej drobnoustroje należące do różnych gatunków syntetyzują odmienne składniki cukrowe, zdarza się jednak, że odmienne gatunki bakterii mają zdolność syntezy identycznego związku, np. PNAG jest syntetyzowany zarówno przez bakterie Gram-dodatnie: S. epidermidis, S. aureus, jak i Gram-ujemne: E. coli czy Yersinia pestis [36].

Białka

Niezwykle istotnym komponentem macierzy są białka; mogą pochodzić zarówno z  żywych, jak i  martwych komórek biofilmu. Obecność w macierzy białek, będą- cych składnikiem cytosolu komórki, może sugerować, że pochodzą z martwych komórek lub są transportowane przez pęcherzyki błonowe [67]. Białka matrycy to najczę- ściej makromolekuły o masie 10-200 kDa, które zawierają 40-60% aminokwasów hydrofobowych (brak aminokwasów siarkowych) [11]. Wielu badaczy dzieli białka wystę- pujące w macierzy według pełnionej funkcji; najczęściej wyróżnia się białka o charakterze enzymatycznym oraz lektyny.

Lektyny to białka zdolne do rozpoznawania i  wiązania się do swoistych fragmentów oligosacharydowych, występujących w obrębie różnych wielocukrów. Lektyny są najczęściej izolowane z tkanek roślinnych, zwierzę- cych lub z mikroorganizmów [30,66]. U tych ostatnich odgrywają rolę w  patogenezie zakażeń, np. w  adhezji, zarówno do komórek innych drobnoustrojów, jak i  powierzchni abiotycznych i  biotycznych, tj. tkanek makroorganizmu. Lektyny najczęściej są umiejscowione na fimbriach, w błonie zewnętrznej lub peptydoglikanie, a ich rola w strukturze biofilmu nie jest dokładnie poznana. Najczęściej uznaje się, że mają udział w procesach adhezyjnych, a więc zapoczątkowują proces tworzenia biofilmu. Ich funkcji upatruje się również w agregacji form planktonowych, a także w procesie wiązania komó- rek i EPS [30].

Bardzo ważną grupą białek macierzy są enzymy, zwłaszcza liazy i polisacharazy. Liazy alginianowe trawią wiązania glikozydowe α (1, 4) lub β (1, 4), a produktami reakcji są nienasycone kwasy uronowe i oligosacharydy złożone z 2-5 jednostek węglowodanowych. Polisacharazy natomiast to grupa enzymów, które katalizują hydrolityczny rozpad wiązań glikozydowych w polisacharydach [60].

Funkcja białek enzymatycznych jest niezwykle istotna, biorą udział w  biosyntezie EPS, gdzie regulują długość łańcuchów cukrowych (np. glikozylotransferazy). W warunkach głodowych umożliwiają rozpad macierzy zewnątrzkomórkowej, a  zdegradowane polimery mogą być źródłem substancji odżywczych dla rosną- cych komórek. Warto wspomnieć, że wytwarzanie enzymów degradujących macierz może być także sposobem regulacji grubości biofilmu, polegającej na odrywaniu się komórek z biofilmu i zasiedlaniu przez nie nowych powierzchni. Nie należy również zapominać, że obecność białek enzymatycznych i ich aktywność w macierzy jest sposobem ochrony drobnoustrojów, zarówno przed czynnikami obronnymi makroorganizmu, jak i  przed innymi mikroorganizmami współtworzącymi biofilm. Białka te są np. zaangażowane w degradację komórek gospodarza, a uwalniające się w tym procesie substancje mogą stanowić źródło pierwiastków biogennych dla mikroorganizmów w biofilmie [67]. Sugeruje się, że wiele białek enzymatycznych macierzy jest związanych z pęcherzykami membranowymi, których obecność niejednokrotnie potwierdzano w macierzy [56]. Ważną grupą białek macierzy są również proteiny wią- żące DNA; zidentyfikowano je u wielu gatunków bakterii, np. E. coli czy Haemophilus influenzae, są odpowiedzialne m.in. za zmianę architektury DNA, a tym samym oddzia- łują na transkrypcję genów i funkcje eDNA [67].

Zewnątrzkomórkowy DNA (extracellular DNA – eDNA)

Rola zewnątrzkomórkowego DNA w strukturze biofilmu od wielu lat budzi dyskusje. Wcześniejsze doniesienia marginalizowały funkcję eDNA, sugerując, że jego obecność w biofilmie jest przypadkowa i pochodzi jedynie z rozpadu komórek. Obecnie liczne doniesienia podkre- ślają niezwykle istotną rolę eDNA w procesie rozwoju biofilmu różnych gatunków bakterii, np. P. aeruginosa czy Burkholderia cepacia, gdzie cząsteczka ta jest komponentem strukturalnym, umożliwiającym formowanie i stabilizację struktury biofilmu [41,72]. Wykorzystując różne gatunki drobnoustrojów udowodniono, iż dodatek DN-azy do środowiska, w którym tworzony jest biofilm, powoduje znaczne ograniczenie masy biofilmu, a także wzrost jego wrażliwości na antybiotyki [25,29,61]. Bardzo dużo uwagi poświęca się roli eDNA w  oporności biofilmu różnych gatunków na antybiotyki. Prawdopodobnie uczestniczą dwa mechanizmy w ochronie komó- rek przed działaniem antybiotyków. Pierwszy zakłada, że eDNA stanowi rodzaj tarczy – ekranu, który opóźnia przenikanie leków do wnętrza biofilmu. Drugi mechanizm polega na wiązaniu przez eDNA kationów obecnych w środowisku wzrostu biofilmu. Obniża to stężenia kationów w otoczeniu komórek, co aktywuje geny pmr, odpowiedzialne za syntezę spermidyny. Skutkiem tych procesów jest powstanie płaszcza ochronnego z polikationu spermidyny na powierzchni struktury biofilmu, który zapobiega przyłączaniu leków przeciwbakteryjnych do właściwych receptorów, znajdujących się np. w błonie zewnętrznej [9]. Przypuszczalna rola zewnątrzkomórkowego DNA może również polegać na horyzontalnej wymianie materiału genetycznego między komórkami w biofilmie.

Ciekawego odkrycia dokonali Walker i wsp., którzy udowodnili, że DNA makroorganizmu również odgrywa rolę w stabilizacji i formowaniu struktury biofilmu tworzonego przez mikroorganizmy [71]. Podczas zasiedlania tkanek ekspresji ulegają czynniki wirulencji drobnoustrojów (np. ramnolipid u P. aeruginosa w  przebiegu mukowiscydozy), które mogą doprowadzić do lizy granulocytów (leukocytów polimorfojądrowych), gdy zawodzi wrodzona odpowiedź immunologiczna. Podczas rozpadu tych komórek dochodzi do uwolnienia DNA i innych składników, które zostają włączone w strukturę macierzy biofilmu tworzonego przez te patogeny.

Funkcje i rodzaje E

Pod względem funkcji w biofilmie polimery zewną- trzkomórkowe można podzielić na siedem różnych kategorii: ECM o charakterze strukturalnym, sorpcyjnym, powierzchniowo czynnym, aktywnym, informacyjnym, odżywczym oraz o  aktywności redoks [13]. Główną część macierzy stanowią polimery budulcowe (strukturalne), które chronią komórki bakteryjne przed działaniem środowiska zewnętrznego. W  skład tych egzopolimerów wchodzą na ogół sacharydy obojętne i amyloidy. Inne ważne elementy macierzy – polisacharydy obdarzone ładunkiem lub hydrofobowe, odpowiadają za wymianę jonową oraz za właściwości sorpcyjne egzopolimerów. Związki te są odpowiedzialne za interakcje komórka–powierzchnia. Przykładem takiego egzopolimeru jest poli-γ-glutaminian (γ-PGA) wytwarzany przez B. subtilis. Na ECM o charakterze aktywnym składają się wydzielane zewnątrzkomórkowo enzymy, których rola polega głównie na degradacji łańcuchów polisacharydowych. Niezwykle ważną funkcję pełnią również polimery zaliczane do kategorii powierzchniowo czynnej. Są to związki o charakterze amfifilowym, najczęściej wchodzące w  skład pęcherzyków błonowych. Polimery te uczestniczą m.in. w interakcjach z  powierzchnią, na której tworzy się biofilm. Przykładem takiego związku jest surfaktyna – cykliczny lipopeptyd wytwarzany przez B. subtilis [13,40,43]. Inne związki z tej kategorii ECM, mające właściwości antybakteryjne i przeciwgrzybowe, biorą udział w procesie adhezji podczas formowania biofilmu. Lektyny i eDNA są składnikami macierzy o  funkcji informacyjnej, uczestniczą w rozpoznawaniu informacji genetycznej. Rola egzopolimerów o aktywności redoks jest słabiej poznana, związki te mogą być donorami bądź akceptorami elektronów [13]. Ważną funkcję w życiu biofilmu pełni macierz o funkcji odżywczej. Zbudowana z róż- nych polimerów, głównie heteropolisacharydów, które w razie niedoborów energetycznych są trawione i stanowią źródło składników odżywczych: węgla, azotu i  fosforu. Funkcje poszczególnych składników ECM podsumowano w tabeli 1.

Wpływ środowiska zewnętrznego na syntezę egzopolimerów

Mikroorganizmy w  biofilmie regulują ilość i  skład wytwarzanych przez nie polimerów zewnątrzkomórkowych. Największe ich zróżnicowanie jest widoczne w  biofilmach wielogatunkowych, np. biofilmu płytki nazębnej. Najważniejszymi czynnikami, od których zależy skład i  ilość powstających egzopolimerów są: gatunek mikroorganizmu, który go wytwarza, faza wzrostu drobnoustrojów lub etap dojrzewania biofilmu, a także środowisko wzrostu drobnoustrojów. Czynniki środowiskowe, takie jak: stężenie tlenu, źródło węgla i innych pierwiastków biogennych, temperatura oraz pH, mają ogromny wpływ na strukturę macierzy [11,70].

Wielu autorów uważa, że w  środowiskach bogatych w  substancje odżywcze, np. glukozę czy sacharozę, mikroorganizmy syntetyzują EPS z większą intensywnością [28,42]. Petry i wsp. sugerują ponadto, że glukoza obecna w środowisku może być wykorzystywana do budowy EPS w  późnej fazie stacjonarnej wzrostu drobnoustrojów [48]. Duży wpływ na wytwarzanie EPS ma odpowiednie pH środowiska wzrostu mikroorganizmów, przy czym największą syntezę egzopolimerów wykazywano w pH bliskim obojętnego [48,50]. Możliwe, że hodowla drobnoustrojów w  obniżonym pH wiąże się z  ograniczeniem intensywności wzrostu bakterii w postaci biofilmu, a niekoniecznie z redukcją stężenia wytwarzanych polisacharydów [28]. Temperatura wzrostu ma również istotny wpływ na wytwarzanie macierzy, a najbardziej wydajna synteza, w przypadku większości drobnoustrojów, zachodzi w dość wąskim jej zakresie. Wydajność wytwarzania EPS jest zależna od fazy wzrostu drobnoustroju, przy czym obserwowano różnice w zależności od gatunku mikroorganizmu. Na przykład u P. aeruginosa i S. epidermidis najwięcej wytwarzanych polimerów stwierdzono pod koniec fazy logarytmicznej wzrostu oraz na początku fazy stacjonarnej, natomiast w przypadku np. Enterobacter aerogenes w tych fazach nie wykazano wytwarzania EPS [11,63].

Macierz jako czynnik chorobotwórczości w zakażeniach bakteryjnych w przebiegu mukowiscydozy

Macierz biofilmu jest czynnikiem wirulencji i odgrywa ogromną rolę w patogenezie wielu schorzeń człowieka, m.in. w przebiegu mukowiscydozy, gdzie w tkance płucnej w czasie infekcji wywołanej P. aeruginosa dochodzi do rozwoju biofilmu. Pałeczki P. aeruginosa wytwarzają trzy główne egzopolisacharydy: Pel, Psl i alginian, pełniące różne funkcje w ich biofilmie [37]. Budowę chemiczną tych związków przedstawiono w tabeli 2. Alginian jest kodowany przez operon złożony z 12 genów (PA3540- -PA3551), Psl przez operon złożony z 15 genów, z czego 11 jest istotnych w wytwarzaniu Psl w biofilmie – (PA2231- -PA2242), natomiast Pel przez operon złożony z 7 genów (PA3058-PA3064) [39,54,58]. Alginian to wysokoczą- steczkowy O-acetylowany polimer zawierający w swojej strukturze kwasy L-glukuronowy i D-mannuronowy połączone wiązaniem β (1, 4), który jest uważany za niezwykle ważny czynnik wirulencji P. aeruginosa. Odpowiada za groźne, często śmiertelne zakażenia tą pałeczką w  przebiegu mukowiscydozy. Szczepy izolowane od pacjentów dotkniętych tą chorobą bardzo często mają tzw. fenotyp śluzowy – wytwarzają alginian w  dużej ilości. Jest to spowodowane mutacją w genie mucA, co prowadzi do niekontrolowanej (przez sigma factor) ekspresji tego związku. Częstość tej mutacji wśród izolowanych szczepów jest bardzo duża, a bezpośredni wpływ na to zjawisko ma przewlekły stan zapalny w tkance płucnej (np. obecność reaktywnych form tlenu) [39]. Wykazano, że alginian nie jest niezbędny w procesie tworzenia biofilmu P. aeruginosa, jednak u szczepów go wytwarzają- cych pełni rolę ochronną – zwiększając ich oporność na antybiotyki, a także składniki układu odpornościowego gospodarza [54,59]. Szczepy syntetyzujące ten związek są nawet 1000 razy bardziej oporne na antybiotyki (np. tobramycynę) w porównaniu do bakterii niewytwarzających śluzu [30]. Alginian jest także immunogenem, w surowicy chorych na mukowiscydozę wykrywane są przeciwciała przeciwko temu polisacharydowi. Może również wyłapywać wolne rodniki, uwalniane przez komórki odpornościowe, chroniąc w ten sposób ukryte w śluzie bakterie przed działaniem układu odpornościowego. Polisacharyd ma ponadto właściwości retencyjne – zatrzymuje wodę i składniki odżywcze [39]. Udowodniono, że związek ten ułatwia powstawanie charakterystycznej dla P. aeruginosa struktury biofilmu, a jego nadmierne wytwarzanie znacząco zmienia architekturę biofilmu [54].

Drugi z  syntetyzowanych przez P. aeruginosa polisacharydów – Psl jest niezbędny do powstania biofilmu. We wstępnym etapie jego tworzenia umożliwia przywieranie komórek do podłoża, tworząc rodzaj rusztowania, do którego przyłączają się komórki drobnoustrojów. Po zakończeniu procesu adhezji jest natomiast związany z  tworzeniem charakterystycznych grzybkowatych struktur mikrokolonii [18,54]. Związek uczestniczy ponadto w interakcjach komórka–komórka, m.in. w  komunikacji międzykomórkowej czy koagregacji. Psl składa się z powtarzających się fragmentów pentasacharydowych, zawierających D-mannozę, D-glukozę i L-ramnozę. Najczęściej występuje w dwóch postaciach, jako składnik związany z komórką, o dużej masie cząsteczkowej i jako postać rozpuszczalna, o mniejszej masie cząsteczkowej [15]. Istotne, zwłaszcza w mukowiscydozie, jest to, że Psl pełni rolę w  różnicowaniu biofilmu, podczas zakażenia zmieniają się bowiem rozmieszczenia tego wielocukru w matrycy biofilmu [54].

Inny z istotnych związków syntetyzowanych w biofilmie P. aeruginosa to Pel – polisacharyd bogaty w glukozę, o budowie zbliżonej do celulozy (nie jest znana szczegółowa struktura chemiczna). Stanowi rusztowanie dla komórek we wczesnym etapie powstawania biofilmu, a także pełni funkcję w interakcjach komórka-komórka. Nazwa Pel pochodzi od pellicle – błonka, gdyż zwią- zek ten odpowiada za tworzenie błonki na granicy faz ciecz–powietrze, a także za wzrost P. aeruginosa w postaci pomarszczonych kolonii [18,39]. Wykazano, że szczepy P. aeruginosa najczęściej wytwarzają polisacharydy Psl i  Pel jednocześnie – z  matriks biofilmu są izolowane wtedy duże ilości glukozy i mannozy. Stwierdzono natomiast, że syntezy Psl/Pel i alginianu mogą się wzajemnie wykluczać [30].

Innymi istotnymi patogenami odpowiedzialnymi za groźne infekcje u chorych na mukowiscydozę są gatunki Burkholderia cepacia complex (Bcc). Egzopolimery wytwarzane przez te drobnoustroje mają istotne znaczenie w rozwoju choroby. Cepacian to związek złożony z powtarzających się rozgałęzionych jednostek siedmiosacharydowych. Oprócz cepacianu, wspólnego dla większości Bcc, w macierzy biofilmu tych drobnoustrojów wykryto co najmniej sześć innych związków polisacharydowych, m.in. PNAG, PGA, które są niezbędne zarówno w procesie powstawania, jak i stabilizowania struktury dojrzałego biofilmu pojawiającego się w przebiegu zaka- żenia tymi mikroorganizmami. Wykazano, iż cepacian zawarty w  macierzy biofilmu jest odpowiedzialny za hamowanie antybakteryjnego działania peptydów, osłabienie chemotaksji neutrofilów, a także jest akceptorem reaktywnych form tlenu [10,75].

W rozwoju zakażeń bakteryjnych u chorych z mukowiscydozą ogromne znaczenie mają również inne składniki macierzy – eDNA i  białka. Zewnątrzkomórkowy DNA wpływa na ograniczenie wrażliwości patogenów na stosowane antybiotyki, m.in. tobramycynę i czynniki układu odpornościowego makroorganizmu [41]. Biał- kowe wyrostki – fimbrie, które również można traktować jako element macierzy, a także lektyny, pośredniczą w przyleganiu komórek do powierzchni – odpowiadają za proces tworzenia biofilmu [30]. Szczególnie istotną rolę w zakażeniach P. aeruginosa u chorych na mukowiscydozę przypisuje się lektynom LecA i LecB. LecA (PA-IL) jest kodowana przez gen lecA i wiąże się z pochodnymi D-galaktozy, natomiast LecB (PA-IIL), kodowana jest przez gen lecB i jest swoista dla L-fukozy. Białka te mają znaczenie w procesie komunikacji miedzykomórkowej – quorum sensing, a także najprawdopodobniej uczestniczą w procesie tworzenia biofimu w drogach oddechowych. Możliwe, że są również zaangażowane w  interakcje między komórkami drobnoustrojów, np. w koagregacji. Białka CdrA to związki istotne w rozprzestrzenianiu infekcji P. aeruginosa. Wiążąc się do składników cukrowych macierzy – Psl, umacniają wiązanie tego wielocukru do komórek bakterii w biofilmie, zwiększając tym samym integralność biofilmu i promując jej rozwój na powierzchni tkanki [6,67]. Niektóre białka mają istotne znaczenie w regulacji procesów formowania i dojrzewania biofilmu (białka LapD), inne (LapA) pełnią funkcję cząsteczki łączącej komórki drobnoustrojów [19].

Z macierzy P. aeruginosa izolowano również białka o charakterze enzymatycznym, tj. PasP, chitynazę, aminopeptydazy, proteazę IV [67]. Istotnymi czynnikami zjadliwości są również inne składniki macierzy, m.in. LPS, który pośredniczy w utrzymaniu stabilności biofilmu i  wpływa na zmianę hydrofobowości komórki. Pęcherzyki błonowe mają ogromny udział w rozwoju biofilmu – oddziałują z innymi składnikami macierzy, m.in. z  eDNA, dostarczają duże ilości LPS do macierzy, pozwalają zachować wewnętrzną asymetrię lipidów w membranie zewnętrznej, a także transportują do macierzy składniki przestrzeni peryplazmatycznej, tj. proteazy, fosfatazy, lipazy, autolizyny i toksyny [39]. Charakterystycznym czynnikiem chorobotwórczości, związanym z macierzą biofilmu P. aeruginosa, jest ramnolipid. Synteza tego biosurfaktantu ułatwia adaptację komórek mikroorganizmu do trudnych warunków otoczenia (sugeruje się, że ułatwia asymilację węglowodorów). Związek ponadto działa cytotoksycznie, np. na neutrofile, co prowadzi do rozwoju bardzo uporczywych infekcji. Ramnolipid ma również ogromne znaczenie w procesie formowania struktury biofilmu, bierze udział w rozwoju mikrokolonii przypominających kształtem grzyby czy wieże, a także odpowiada za kształtowanie się tzw. kanałów wodnych. Udowodniono również, że pośredniczy w uwalnianiu komórek potomnych z biofilmu [5]. Wszystkie składniki macierzy są zintegrowane i wspólnie stanowią niezwykle istotny czynnik wirulencji patogenów, wywołujących groźne zakażenia w obrębie płuc u chorych na mukowiscydozę.

Rola polimerów zewnątrzkomórkowych w rozwoju próchnicy

Chorobą, w  rozwoju której ogromne znaczenie mają polimery zewnątrzkomórkowe wydzielane przez drobnoustroje, jest próchnica. Dowodem na poparcie tej tezy są badania nad składem biofilmów izolowanych z jamy ustnej. Airesa i wsp. oszacowali, że 40% suchej masy biofilmu nazębnego stanowią polisacharydy [2], natomiast Bowen i Koo wykazali, że 10-20% masy płytki nazębnej stanowią glukan i fruktan, natomiast białka to aż 40% [7]. W badanych macierzach były również inne składniki, np. lipidy i jony pierwiastków: Ca, Mg, P, F. W jamie ustnej biofilm jest tworzony przez wiele róż- nych gatunków drobnoustrojów (przypuszcza się, że nawet 19000 gatunków), zatem i  budowa macierzy w tej strukturze jest niezwykle złożona, inna u każ- dego pacjenta. Ulega ciągłym zmianom w zależności od warunków środowiska, interakcji między mikroorganizmami oraz między bakteriami, a białkami gospodarza [57].

Rola EPS w  rozwoju próchnicy polega na ułatwianiu adhezji drobnoustrojów do powierzchni zębów oraz zapewnieniu integralności i stabilności struktury biofilmu [34]. Polimery utrudniają również dyfuzję substancji do wnętrza i na zewnątrz biofilmu. Dzięki tym właściwościom macierz może być rezerwuarem, np. jonów metali lub substancji odżywczych dla komórek drobnoustrojów, o czym już wspomniano w rozdziale dotyczącym funkcji ECM [32]. Znaczna ilość wytwarzanej macierzy osłaniającej komórki drobnoustrojów powoduje wzrost masy biofilmu i porowatości jego struktury, co ułatwia akumulację cukrów na powierzchni macierzy. Stwierdzono, że obecność produktów rozkładu sacharozy w strukturze biofilmu przyczynia się do obniżenia zawartości jonów wapnia, fluoru i fosforu w tkance zębowej, co w połączeniu z niskim pH środowiska oraz ograniczeniem dyfuzji substancji demineralizuje szkliwo i zwiększa chorobotwórczą rolę biofilmu [31,45].

Na rozwój i dojrzewanie biofilmu nazębnego szczególny wpływ ma otaczające środowisko, obecność związków pokarmowych w  dużym stężeniu, zwłaszcza cukrów, np. sacharozy, zmiany pH wywołane rozkładem określonych węglowodanów. To środowisko zewnętrzne determinuje rozwój konkretnych grup drobnoustrojów, np. obecność sacharozy stymuluje namnażanie Streptococcus mutans i pałeczek Lactobacillus, a hamuje wzrost Streptococcus sanguinis. W wyniku tych zmian środowiskowych następuje zachwianie balansu w społeczności bakteryjnej, co prowadzi do zmian w strukturze biofilmu, a także w składzie i ilości EPS [46]. Zatem to obecność sacharozy wzmaga znaczenie EPS jako czynnika chorobotwórczości drobnoustrojów powodujących próchnicę.

Drobnoustrojem odpowiedzialnym za rozwój próchnicy jest m.in. S. mutans. Bakterie te, a także inne obecne w jamie ustnej, np. S. sanguis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus salivarius, Lactobacillus spp. syntetyzują glikozylotransferazy (Gtf), które katalizują rozkład sacharozy i  przyłączenie powstałej reszty glukozy do łańcucha akceptora np. łańcucha oligosacharydowego. Enzymy te są niezbędne do syntezy egzopolisacharydów występujących w biofilmie – mutanu i dekstranu, zbudowanych z  reszt D-glukozy, połączonych odpowiednio wiązaniami α (1, 3) lub α (1, 6) (tabela 2) [21,73]. Za syntezę mutanu odpowiada glukozylotransferaza B, za syntezę dekstranu glukozylotransferaza-D. S. mutans wytwarza dodatkowo glukozylotransferazę-C, która odpowiada za syntezę mieszaniny wymienionych wyżej polimerów [2,7]. Enzymy te w części N-terminalnej, składają się z fragmentu wspólnego dla wszystkich typów (38 aminokwasów) i zmiennego – charakterystycznego dla danego typu enzymu (200 aminokwasów). Część C-terminalna również jest zróżnicowana w  zależności od rodzaju enzymu. Gtf B i C mają inną budowę części C-terminalnej, natomiast Gtf B i D wykazują podobieństwo w jej strukturze [7].

Za rozkład sacharozy i syntezę składników EPS odpowiadają również inne enzymy syntetyzowane przez S. mutans – fruktozylotransferazy (Ftf), które katalizują powstanie fruktanów połączonych wiązaniem α (2, 6), np. lewanu. Ze względu na to, że biofilm powstający na powierzchni zębów jest złożony z wielu gatunków mikroorganizmów otoczonych wspólną matriks enzymy wydzielane np. przez S. mutans oddziałują na inne drobnoustroje współtworzące biofilm. Sacharoza dostępna powszechnie w środowisku biofilmu, podobnie jak inne cukry: glukoza, fruktoza, maltoza czy skrobia, mogą być równocześnie rozkładane, np. w procesie fermentacji przez drobnoustroje w biofilmie. W wyniku ich rozkładu powstają kwaśne produkty sprzyjające procesom demineralizacji szkliwa nazębnego [74]. Udowodniono, że im bogatsze w różne sacharydy jest środowisko, w którym dochodzi do formowania biofilmu, tym jego struktura jest bardziej złożona, a przez to jest bardziej niebezpieczny – szybciej prowadzi do zmian próchniczych na zębach. Ponadto obecność rozbudowanego polimeru powierzchniowego sprzyja adhezji innych gatunków drobnoustrojów [51].

Trzeba pamiętać, że istnieje drugi mechanizm rozwoju biofilmu na tkance zębów, niezależny od obecności sacharozy w środowisku jamy ustnej. W proces ten są zaanga- żowane białka zawarte w ślinie, takie jak np. aglutyniny, mucyna czy kwasowe białka bogate w prolinę, które przyspieszają proces tworzenia biofilmu wchodząc w interakcje z  adhezyną P1 (reprezentowaną przez białka: Spa P, SspA, SspB), obecną na powierzchni komórek np. S. mutans. Rodzina białek P1 bierze udział w agregacji komórek mikroorganizmów, a także jest zaangażowana w interakcje między komórkami, co wykazano na przykładzie Streptococcus gordonii i  Porphyromonas gingivalis [32]. W rozwoju biofilmu próchniczego bardzo ważną rolę pełnią enzymy obecne w jamie ustnej, syntetyzowane przez makroorganizm, np. amylazy, dekstrynazy, lewanazy, które znacząco wpływają na rozwój macierzy zewnątrzkomórkowej biofilmu, m.in. na sposób rozgałę- zienia łańcuchów cukrowych czy zmianę miejsc wiązania drobnoustrojów na powierzchni EPS [23]. Warto również zwrócić uwagę na rolę białek zewnątrzkomórkowych wydzielanych przez bakterie w  formowaniu biofilmu nazębnego. Szczególnie istotną rolę w procesie tworzenia biofilmu w jamie ustnej pełnią lektyny, które m.in. pośredniczą w koagregacji komórek mikroorganizmów, co ma znaczny wpływ na wzmożoną ich adhezję. Przykładem są cztery lektyny GbpA-D (glucan-binding proteins) wytwarzane przez S. mutans czy lektyny wytwarzane przez inny patogen zębów – Eikenella corrodens [30].

Produkty przemiany materii drobnoustrojów żyjących w jamie ustnej i obecność wydzielanej przez nie egzopolisacharydowej osłony przyczyniają się do rozwoju groźnych chorób zębów, które w swoim przebiegu nie ograniczają się do zmian w  jamie ustnej, lecz często negatywnie wpływają na funkcjonowanie całego makroorganizmu.

Rola macierzy w infekcjach związanych z zastosowaniem implantów medycznych

Infekcje związane z wszczepianiem implantów medycznych do organizmu człowieka (cewniki do dializ, sztuczne zastawki serca, protezy ortopedyczne) funkcjonują w literaturze angielskiej pod nazwą chronic polymer-associated infections, co można przetłumaczyć jako przewlekłe zakażenia związane z rozwojem polimeru. Najczęściej za tego typu infekcje są odpowiedzialne gronkowce koagulazoujemne, np. S. epidermidis. Drobnoustroje te tworzą na powierzchni implantów biofilmy zamknięte w egzopolimerowej osłonie (najczęściej amorficzny materiał śluzowy). Śluz, jako główny element zawiera substancje o charakterze cukrowym, np. glukozaminę czy kwasy tejchojowe. Głównym czynnikiem chorobotwórczości gronkowców, mającym znaczenie w rozwoju biofilmu na powierzchniach abiotycznych, jest PNAG – poli-N-acetyloglukozamina, często określana jako PIA (polysaccharide intercellular adhesin). Głównym jej budulcem jest 130 reszt N-acetylo-D-glukozaminy, połaczonych wiązaniem β (1, 6), co stanowi 80-85% całej cząsteczki. Na pozostałą część PIA składają się deacetylowane reszty D-glukozoaminy, zawierające fosforan i reszty bursztynianu (tabela 2), nadające cząsteczce charakter anionowy. Obecność grup N-acetylowych w strukturze PIA sprawia, że ma właściwości silnie hydrofobowe. Za syntezę i eksport monomerów jest odpowiedzialny operon ica, w skład którego wchodzi gen regulatorowy icaR i 4 geny odpowiedzialne za biosyntezę icaADBC [4,33]. W proces są zaangażowane również homologiczne geny icaA (ortologi): pgaC i hmsR, kodujące glukozylotransferazy katalizujące syntezę polimerów N-acetyloglukozaminy. Ortologi icaB: pgaB i hmsF są natomiast odpowiedzialne za deacetylację N-acetyloglukozaminy. Proces ten jest niezbędny w kotwiczeniu PNAG do komórek [30]. PNAG łącząc się z powierzchnią abiotyczną uczestniczy w adhezji komórek do implantów, udowodniono również udział tego wielocukru w komunikacji międzykomórkowej i ochronie komórek bakteryjnych przed mechanizmami obronnymi gospodarza (m.in. osłabia zdolność fagocytów do pochłaniania komó- rek bakterii) [3,4,27,33].

Zewnątrzkomórkowy kwas tejchojowy (EC-TA – extracellular teichoic acid) wyizolowany z macierzy biofilmu kilku gatunków drobnoustrojów Gram-dodatnich, jest istotnym czynnikiem ich chorobotwórczości.

Stwierdzono, iż jego budowa jest identyczna jak kwasu tejchojowego budującego ścianę komórkową tych drobnoustrojów (WTA – wall teichoic acids). Przykładowo u S. epidermidis oba komponenty mają taką samą strukturę i składają się z 1,3 polifosforanu glicerolu, podstawionego w pozycji drugiej glicerolu resztami α-Glc, α-GlcNAc, D-Ala i α-Glc6Ala. Kwasy tejchojowe to związki silnie polarne, charakteryzujące się ładunkiem ujemnym i  dużą hydrofilowością. Ich budowa, właściwości i luźne zakotwiczenie w komórce powodują, że część z nich może zostać uwolniona do macierzy biofilmu.

W macierzach biofilmów, w których znajdują się oba zróżnicowane pod względem właściwości związki (PNAG i EC-TA) obserwuje się lepszą zdolność do regulowania hydrofilowości składników biofilmu i tworzenia biofilmu nawet w bardzo niekorzystnych warunkach środowiskowych [27]. Wykazano również, że WTA mają ogromne znaczenie w procesie tworzenia biofimu. Vergara-Irigaray i wsp. wysunęli hipotezę, że przyłączanie PNAG do powierzchni bakterii zachodzi na zasadzie jonowych interakcji między dodatnio naładowanymi resztami aminowymi obecnymi w częściowo deacylowanym PNAG, a ujemnie naładowanym WTA [69].

Ogromne znaczenie w procesie przylegania S. aureus do powierzchni np. implantów medycznych mają liczne białka wydzielane poza komórki mikroorganizmów, np. Bap, FnBPs, SasG czy białko A [38,68]. Białka z rodziny Bap (biofilm-associated protein) odgrywają ważną rolę (większą niż polisacharydy) w adhezji bakterii do pod- łoża stałego i utrzymaniu komórek w biofilmie w dużym przybliżeniu, pośredniczą bowiem w  tworzeniu się agregatów bakteryjnych. Białka te, przez ich związanie z receptorem Gp96, odpowiadają również za zahamowanie procesu internalizacji komórek S. aureus do fagocytów. Bakterie unikają w ten sposób odpowiedzi ze strony układu odpornościowego makroorganizmu. Białko Bap jest dużą cząsteczką (2276 aminokwasów), złożoną z 86 powtarzających się sekwencji aminokwasowych. Kodowane jest przez geny bap, zgrupowane w wyspie patogenności (SaPIbov2). Funkcje tego białka są regulowane obecnością w pożywce jonów wapnia [30,68].

Nie należy zapominać o istotnej roli białek powierzchniowych gronkowców w  tworzeniu biofilmu na powierzchniach abiotycznych i  interakcjach między komórkami. Do białek tych można zaliczyć: Sas C, Sas G, główną autolizynę Alt, ClfA, ClfB, białko Emp wiążące ECM, białka wiążące fibronektynę FnBPA i FnBPB, wią- żące kolagen Cna oraz adhezynę Aap [52,62]. Istotnym składnikiem macierzy biofilmu gronkowcowego jest β-toksyna – neutralna sfingomielinaza, która wchodzi w reakcje z eDNA, stymuluje proces tworzenia biofilmu oraz stabilizuje jego strukturę [24].

Złożona budowa i wyspecjalizowane funkcje poszczególnych składników macierzy biofilmów gronkowcowych warunkują rozwój przewlekłych i trudnych do zwalczenia infekcji, rozwijających się na implantach medycznych.

Eradykacja macierzy jako metoda kontroli infekcji związanych z powstawaniem biofilmu

Niesłychanie istotną strategią walki z biofilmem bakteryjnym jest niszczenie struktury zewnątrzkomórkowej macierzy. Degradacja ECM skutkuje utratą ważnego elementu strukturalnego biofilmu, a także bariery ochronnej, co sprawia, że komórki bakterii stają się łatwiej dostępne dla antybiotyków oraz mechanizmów obronnych gospodarza.

Metody opierają się przede wszystkim na degradacji lub odrywaniu polimerów macierzy. Opisanych jest wiele czynników chemicznych mających takie właściwości, są to m.in. enzymy lub surfaktanty. Enzymy mają najczęściej działanie swoiste – degradują konkretne polisacharydy. Ich komercyjne zastosowanie może być zatem trudne, zwłaszcza w przypadku biofilmów tworzonych przez różne gatunki mikroorganizmów, gdzie macierz zewnątrzkomórkowa jest złożona z  mieszaniny róż- nych polimerów. Najczęściej stosowanymi enzymami są hydrolazy, np. dyspersyna B (DspB), która rozkłada polimery N-acetyloglukozaminy oraz hialuronidazy, mutanazy i dekstranazy, wykazujące aktywność m.in. wobec polimerów macierzy S. mutans [49,65]. Bardzo ważną rolę w degradacji macierzy pełnią proteazy (np. proteinaza K). Ich zastosowanie prowadzi bowiem do zniszczenia białek powierzchniowych, np. autolizyny Ami4b, czy internaliny B w macierzy biofilmu Listeria monocytogenes [35].

Niewątpliwie największe znaczenie spośród opisywanych metod degradacji macierzy ma zastosowanie DN- -azy I – enzymu trawiącego zewnątrzkomórkowy DNA. Wielokrotnie udowadniano jego skuteczność w eradykacji biofilmu tworzonego przez różne gatunki mikroorganizmów, np. P. aeruginosa, S. aureus czy Enterococcus faecalis [22,64]. Po zastosowaniu tego enzymu obserwowano również uwrażliwienie biofilmu na stosowane antybiotyki i biocydy. DN-azę wykorzystano już w leczeniu infekcji P. aeruginosa w przebiegu mukowiscydozy, stosując aerozol o nazwie handlowej Pilmozyme. Długotrwałe stosowanie preparatu bardzo korzystnie wpływało na kondycję pacjentów z mukowiscydozą [16].

Duże nadzieje w  zwalczaniu biofilmów bakteryjnych wiąże się również z  zastosowaniem bakteriofagów, zwłaszcza tych zdolnych do wytwarzania depolimeraz polisacharydów. Wyizolowano fagi zdolne do wytwarzania alginiazy, która degraduje macierz P. aeruginosa. Po zadziałaniu tego enzymu odsłonięte zostają komórki drobnoustrojów, które w  dalszej kolejności są „atakowane” i lizowane przez fagi [20]. Uważa się, że ich zastosowanie i samych bakteriofagów może mieć duże znaczenie w zwalczaniu wielu infekcji, np. przebiegają- cych w mukowiscydozie czy też w niszczeniu biofilmów na implantach medycznych, m.in. cewnikach urologicznych [14,27]. Wielu badaczy wskazuje na konieczność synergistycznego zastosowania antybiotykoterapii i bakteriofagów. Obserwowano bowiem, że enzymy wirusów modyfikują strukturę macierzy, odsłaniając tym samym receptory dla antybiotyków, znajdujące się na komórkach drobnoustrojów. Wpływa to znacząco na efektywność terapii.

Surfaktanty to czynniki często stosowane w degradacji macierzy biofilmu. Przykładem tego typu związku jest siarczan dodecylu sodu – SDS, którego skuteczność udowodniono w zwalczaniu biofilmów tworzonych przez liczne gatunki bakterii żyjących w jamie ustnej. Czę- sto również badane jest synergistyczne zastosowanie SDS z dyspersyną B, połączenie tych dwóch związków wydaje się bardziej efektywne w eradykacji biofilmu [26].

Innym sposobem walki z biofilmem jest ograniczenie procesu powstawania macierzy. Przykładem tego typu działania jest hamowanie syntezy adhezyn zewnątrzkomórkowych. Białka powierzchniowe Aap i  SasG są niezwykle istotne w procesie tworzenia biofilmu przez gronkowce (S. epidermidis i  S. aureus). Do właściwego funkcjonowania wymagają obecności cynku. Udowodniono, że można skutecznie hamować syntezę macierzy zewnątrzkomórkowej tych drobnoustrojów chelatując kationy cynku z otoczenia biofilmu [17,76]. Innym sposobem zapobiegania powstawaniu macierzy jest zastosowanie przeciwpasożytniczego leku – nitazoksanidu, który działając na pasożyty wiąże adhezynę Aap, hamując w ten sposób powstawanie biofilmu metycylinoopornego S. aureus [76]. Inny związek – jodowany powidon w stężeniu subinhibicyjnym aktywuje represor (icaR) genów icaADBC, odpowiedzialnych za powstawanie PNAG, blokując w ten sposób jego syntezę [44]. Znane są również inne związki hamujące syntezę gronkowcowego egzopolisacharydu PIA, są to pochodne siarkowe zawarte w czosnku – allicyna, a także dithioteritol, cysteina czy β-merkaptoetanol [76].

Opracowanie skutecznych technik zapobiegania powstawaniu macierzy bądź eradykacji już istniejącej struktury może się przyczynić do ograniczenia rozwoju biofilmu, a w związku z tym i infekcji, w których ma istotne znaczenie.

Podsumowanie

Macierz biofilmu to czynnik chorobotwórczości istotny w przebiegu wielu schorzeń człowieka, m.in. w rozwoju P. aeruginosa w tkance płucnej, S. mutans na powierzchni implantów czy wielogatunkowego biofilmu w  przebiegu próchnicy. Egzopolimery umożliwiają utworzenie biofilmu na powierzchni stałej, nadają mu charakterystyczny kształt i stabilizują jego strukturę. Chronią komórki w biofilmie przed substancjami szkodliwymi i  czynnikami układu odpornościowego makroorganizmu, a w warunkach ekstremalnych stanowią substrat odżywczy. Wydaje się, że szczegółowe scharakteryzowanie polimerów zewnątrzkomórkowych biofilmu, poznanie zależności między różnymi składnikami, szlaków ich biosyntezy, a także związków hamujących ich powstawanie, pozwoli na opracowanie skutecznych metod zapobiegania powstawaniu macierzy bądź eradykacji już istniejącej struktury. Wdrożenie efektywnych technik walki z infekcjami związanymi z rozwojem biofilmu na powierzchniach biotycznych i abiotycznych to wyzwanie dla mikrobiologii na najbliższe lata.

Przypisy

• 1. Absalon C., Ymele-Leki P., Watnick P.I.: The bacterial biofilmmatrix as a platform for protein delivery. MBio., 2012; 3: e00127-12
  Google Scholar
• 2. Aires C.P., Tenuta L.M., Carbonero E.R., Sassaki G.L., Iacomini M.,Cury J.A.: Structural characterization of exopolysaccharides frombiofilm of a cariogenic streptococci. Carbohydr. Polym., 2011; 84:1215-1220
  Google Scholar
• 3. Baranowska A., Rodziewicz A.: Molekularne interakcje w biofilmachbakteryjnych. Kosmos, 2008; 57: 29-38
  Google Scholar
• 4. Begun J., Gaiani J.M., Rohde H., Mack D., Calderwood S.B., AusubelF.M., Sifri C.D.: Staphylococcal biofilm exopolysaccharide protectsagainst Caenorhabditis elegans immune defenses. PLoS Pathog.,2007; 3: e57
  Google Scholar
• 5. Boles B.R., Thoendel M., Singh P.K.: Rhamnolipids mediate detachmentof Pseudomonas aeruginosa from biofilms. Mol. Microbiol.,2005; 57: 1210-1223
  Google Scholar
• 6. Borlee B.R., Goldman A.D., Murakami K., Samudrala R., WozniakD.J., Parsek M.R.: Pseudomonas aeruginosa uses a cyclic-di-GMP-regulatedadhesin to reinforce the biofim extracellular matrix. Mol.Microbiol., 2010; 75: 827-842
  Google Scholar
• 7. Bowen W.H., Koo H.: Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases:role in extracellular matrix formation of cariogenicbiofilms. Caries Res., 2011; 45: 69-86
  Google Scholar
• 8. Branda S.S., Vik A., Friedman L., Kolter R.: Biofilms: the matrixrevisited. Trends Microbiol., 2005; 13: 20-26
  Google Scholar
• 9. Chiang W.C., Nilsson M., Jensen P.Ø., Høiby N., Nielsen T.E., GivskovM., Tolker-Nielsen T.: Extracellular DNA shields against aminoglycosidesin Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob. AgentsChemother., 2013; 57: 2352-2361
  Google Scholar
• 10. Cuzzi B., Herasimenka Y., Silipo A., Lanzetta R., Liut G., RizzoR., Cescutti P.: Versatility of the Burkholderia cepacia complex forthe biosynthesis of exopolysaccharides: a comparative structuralinvestigation. PLoS One, 2014; 9: e94372
  Google Scholar
• 11. Czaczyk K., Myszka K.: Biosynthesis of extracellular polymericsubstances (EPS) and its role in microbial biofilm formation. Pol. J.Environ. Stud., 2007; 16: 799-806
  Google Scholar
• 12. Extracellular polysaccharides & caries.http://www.ncl.ac.uk/dental/oralbiol/oralenv/tutorials/polysaccharides/eps.htm(15.06.2014)
  Google Scholar
• 13. Fleming H.C., Neu T., Wozniak D.J.: The EPS matrix: the „houseof biofilm cells”. J. Bacteriol., 2007; 189: 7945-7947
  Google Scholar
• 14. Francolini I., Donelli G.: Prevention and control of biofilm-basedmedical device-related infections. FEMS Immunol. Med. Microbiol.,2010; 59: 227-238
  Google Scholar
• 15. Franklin M.J., Nivens D.E., Weadge J.T., Howell P.L.: Biosynthesisof the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate,Pel, and Psl. Front. Microbiol., 2011; 2: 167
  Google Scholar
• 16. Frederiksen B., Pressler T., Hansen A., Koch C., Høiby N.: Effectof aerosolized rhDNase (Pulmozyme) on pulmonary colonizationin patients with cystic fibrosis. Acta Paediatr., 2006; 95: 1070-1074
  Google Scholar
• 17. Geoghegan J.A., Corrigan R.M., Gruszka D.T., Speziale P., O’GaraJ.P., Potts J.R., Foster T.J.: Role of surface protein SasG in biofilm formationby Staphylococcus aureus. J. Bacteriol., 2010; 192: 5663-5673
  Google Scholar
• 18. Ghafoor A., Hay I.D., Rehm B.H.: The role of exopolysaccharidesin Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture. Appl.Environ. Microbiol. 2011; 77: 5238-5246
  Google Scholar
• 19. Gjermansen M., Nilsson M., Yang L., Tolker-Nielsen T.: Characterizationof starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms:genetic elements and molecular mechanisms. Mol. Microbiol.,2010; 75: 815-826
  Google Scholar
• 20. Glonti T., Chanishvili N., Taylor P.W.: Bacteriophage-derivedenzyme that depolymerizes the alginic acid capsule associated withcystic fibrosis isolates of Pseudomonas aeruginosa. J. Appl. Microbiol.,2010; 108: 695-702
  Google Scholar
• 21. Górska S., Grycko P., Rybka J., Gamian A.: Egzopolisacharydybakterii kwasu mlekowego – biosynteza i struktura. Postępy Hig.Med. Dośw. 2007; 61: 805-818
  Google Scholar
• 22. Guiton P.S., Hung C.S., Kline K.A., Roth R., Kau A.L., Hayes E.,Heuser J., Dodson K.W., Caparon M.G., Hultgren S.J.: Contribution ofautolysin and sortase A during Enterococcus faecalis DNA-dependentbiofilm development. Infect. Immun., 2009; 77: 3626-3638
  Google Scholar
• 23. Hayacibara M.F., Koo H., Vacca-Smith A.M., Kopec L.K., ScottAnneK., Cury J.A., Bowen W.H.: The influence of mutanase and dextranaseon the production and structure of glucans synthesizedby streptococcal glucosyltransferases. Carbohydr. Res., 2004; 339:2127-2137
  Google Scholar
• 24. Huseby M.J., Kruse A.C., Digre J., Kohler P.L., Vocke J.A., Mann E.E.,Bayles K.W., Bohach G.A., Schlievert P.M., Ohlendorf D.H., Earhart C.A.:Beta toxin catalyzes formation of nucleoprotein matrix in staphylococcalbiofilms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010; 107: 14407-14412
  Google Scholar
• 25. Izano E.A., Amarante M.A., Kher W.B., Kaplan J.B.: Differentialroles of poly-N-acetylglucosamine surface polysaccharide and extracellularDNA in Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidisbiofilms. Appl. Environ. Microbiol., 2008; 74: 470-476
  Google Scholar
• 26. Izano E.A., Wang H., Ragunath C., Ramasubbu N., Kaplan J.B.:Detachment and killing of Aggregatibacter actinomycetemcomitansbiofilms by dispersin B and SDS. J. Dent. Res., 2007; 86: 618-622
  Google Scholar
• 27. Jabbouri S., Sadovskaya I.: Characteristics of the biofilm matrixand its role as a possible target for the detection and eradicationof Staphylococcus epidermidis associated with medical implant infections.FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2010; 59: 280-291
  Google Scholar
• 28. Jung J.H., Choi N.Y., Lee S.Y.: Biofilm formation and exopolysaccharide(EPS) production by Cronobacter sakazakii depending on environmentalconditions. Food Microbiol., 2013; 34:70-80
  Google Scholar
• 29. Kaplan J.B., LoVetri K., Cardona S.T., Madhyastha S., SadovskayaI., Jabbouri S., Izano E.A.: Recombinant human DNase I decreasesbiofilm and increases antimicrobial susceptibility in staphylococci.J. Antibiot., 2012; 65: 73-77
  Google Scholar
• 30. Karatan E., Watnick P.: Signals, regulatory networks, and materialsthat build and break bacterial biofilms. Microbiol. Mol. Biol.Rev., 2009; 73: 310-347
  Google Scholar
• 31. Koo H., Falsetta M.L., Klein M.I.: The exopolysaccharide matrix:a virulence determinant of cariogenic biofilm. J. Dent. Res., 2013;92: 1065-1073
  Google Scholar
• 32. Krzyściak W., Jurczak A., Kościelniak D., Bystrowska B., SkalniakA.: The virulence of Streptococcus mutans and the ability to form biofilms.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2014; 33: 499-515
  Google Scholar
• 33. Lembre P., Lorentz C., di Martino P.: Exopolysaccharides of thebiofilm matrix: a complex biophysical world. W: The complex worldof polysaccharides, red.: D.N. Karunaratne. InTech, 2012, 371-392
  Google Scholar
• 34. Li B., Dobruchowska J.M., Hoogenkamp M.A., Gerwig G.J.: Structuralinvestigation of an extracellular polysaccharide produced by thecariogenic bacterium Streptococcus mutans strain UA159. Carbohydr.Polym., 2012; 90: 675-682
  Google Scholar
• 35. Longhi C., Scoarughi G.L., Poggiali F., Cellini A., CarpentieriA., Seganti L., Pucci P., Amoresano A., Cocconcelli P.S., Artini M.,Costerton J.W., Selan L.: Protease treatment affects both invasionability and biofilm formation in Listeria monocytogenes. Microb. Pathog.,2008; 45: 45-52
  Google Scholar
• 36. Lu X., Skurnik D., Pozzi C., Roux D., Cywes-Bentley C., RitchieJ.M., Munera D., Gening M.L., Tsvetkov Y.E., Nifantiev N.E., WaldorM.K., Pier G.B.: A poly-N-acetylglucosamine-Shiga toxin broad-spectrumconjugate vaccine for Shiga toxin-producing Escherichia coli.MBio, 2014; 5: e00974-14
  Google Scholar
• 37. Ma L., Conover M., Lu H., Parsek M.R., Bayles K., Wozniak D.J.:Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilmmatrix. PLoS Pathog., 2009; 5: e1000354
  Google Scholar
• 38. Mack D., Davies A.P., Harris L.G., Jeeves R., Pascoe B., KnoblochJ.K., Rohde H., Wilkinson T.S.: Staphylococcus epidermidis in biomaterialassociated infections. W: Biomaterials associated infection:immunological aspects and antimicrobial strategies, red. T.F. Moriarty,S.A. Zaat, H.J. Busscher, Springer Science + Buisness Media,New York 2013, 25-56
  Google Scholar
• 39. Mann E.E., Wozniak D.J.: Pseudomonas biofilm matrix compositionand niche biology. FEMS Microbiol. Rev., 2012; 36: 893-916
  Google Scholar
• 40. Marvasi M., Visscher P.T., Casillas Martinez L.: Exopolymericsubstances (EPS) from Bacillus subtilis: polymers and genes encodingtheir synthesis. FEMS Microbiol. Lett., 2010; 313: 1-9
  Google Scholar
• 41. Messiaen A.S., Nelis H., Coenye T.: Investigating the role of matrixcomponents in protection of Burkholderia cepacia complex biofilmsagainst tobramycin. J. Cyst. Fibros., 2014; 13: 56-62
  Google Scholar
• 42. Moryl M., Kaleta A., Strzelecki K., Różalska S., Różalski A.: Effectof nutrient and stress factors on polysaccharides synthesis in Proteusmirabilis biofilm. Acta Biochim. Pol., 2014; 61: 133-139
  Google Scholar
• 43. Nwodo U.U., Green E., Okoh A.I.: Bacterial exopolysaccharides:functionality and prospects. Int. J. Mol. Sci., 2012; 13: 14002-14015
  Google Scholar
• 44. Oduwole K.O., Glynn A.A., Molony D.C., Murray D., Rowe S.,Holland L.M., McCormack D.J., O’Gara J.P.: Anti-biofilm activity ofsub-inhibitory povidone-iodine concentrations against Staphylococcusepidermidis and Staphylococcus aureus. J. Orthop. Res., 2010;28: 1252-1256
  Google Scholar
• 45. Paes Leme A.F., Bellato C.M., Bedi G., Cury A.A., Koo H., CuryJ.A.: Effects of sucrose on the extracellular matrix of plaque-likebiofilm formed in vivo, studied by proteomic analysis. Caries Res.,2008; 42: 435-443
  Google Scholar
• 46. Paes Leme A.F., Koo H., Bellato C.M., Bedi G., Cury J.A.: The roleof sucrose in cariogenic dental biofilm formation – new insight. J.Dent. Res., 2006; 85: 878-887
  Google Scholar
• 47. Pamp S.J., Tolker-Nielsen T.: Multiple roles of biosurfactants instructural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol.,2007; 189: 2531-2539
  Google Scholar
• 48. Petry S., Furlan S., Crepeau M.J., Cerning J., Desmazeaud M.: Factorsaffecting exocellular polysaccharide production by Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus grown in a chemically defined medium.Appl. Environ. Microbiol., 2000; 66: 3427-3431
  Google Scholar
• 49. Pleszczyńska M, Wiater A., Szczodrak J.: Mutanase from Paenibacillussp. MP-1 produced inductively by fungal α-1,3-glucan and its potential for the degradation of mutan and Streptococcus mutansbiofilm. Biotechnol. Lett., 2010; 32: 1699-1704
  Google Scholar
• 50. Razack S.A., Velayutham V., Thangavelu V.: Influence of variousparameters on exopolysaccharide production from Bacillus subtilis.Int. J. Chem. Tech. Res., 2013; 5: 2221-2228
  Google Scholar
• 51. Ribeiro C.C., Tabchoury C.P., Del Bel Cury A.A., Tenuta L.M., RosalenP.L., Cury J.A.: Effect of starch on the cariogenic potential ofsucrose. Br. J. Nutr., 2005; 94: 44-50
  Google Scholar
• 52. Roche F.M., Meehan M., Foster T.J.: The Staphylococcus aureussurface protein SasG and its homologues promote bacterial adherenceto human desquamated nasal epithelial cells. Microbiology,2003; 149: 2759-2767
  Google Scholar
• 53. Różalski A., Kwil I., Torzewska A., Baranowska M., Stączek P.: Bakteriez rodzaju Proteus – cechy i czynniki chorobotwórczości. PostępyHig. Med. Dośw., 2007; 61: 204-219
  Google Scholar
• 54. Ryder C., Byrd M., Wozniak D.J.: Role of polysaccharides in Pseudomonasaeruginosa biofilm development. Curr. Opin. Microbiol., 2007;10: 644-648
  Google Scholar
• 55. Sadovskaya I., Vinogradov E, Li J., Jabbouri S.: Structural elucidationof the extracellular and cell-wall teichoic acids of Staphylococcusepidermidis RP62A, a reference biofilm-positive strain. Carbohydr.Res., 2004; 339: 1467-1473
  Google Scholar
• 56. Schooling S.R.; Beveridge T.J.: Membrane vesicles: an overlookedcomponent of the matrices of biofilms. J. Bacteriol., 2006,188: 5945-5957
  Google Scholar
• 57. Seneviratne C.J., Zhang C.F., Samaranayake L.P.: Dental plaquebiofilm in oral health and disease. Chin. J. Dent. Res., 2011; 14: 87-94
  Google Scholar
• 58. Sharma G., Rao S., Bansal A., Dang S., Gupta S., Gabrani R.: Pseudomonasaeruginosa biofilm: potential therapeutic targets. Biologicals,2014; 42: 1-7
  Google Scholar
• 59. Stapper A.P., Narasimhan G., Ohman D.E., Barakat J., HentzerM., Molin S., Kharazmi A., Høiby N., Mathee K.: Alginate productionaffects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture,but is not essential for biofilm formation. J. Med. Microbiol.,2004; 53: 679-690
  Google Scholar
• 60. Starkey M., Gray K., Chang S., Parsek M.: A sticky business: theextracellular polymeric substance matrix of bacterial biofilms. W:Microbial Biofilms, red. M. Ghannoum, G.A. O’Toole. ASM Press,Washington DC, 2004, 174-192
  Google Scholar
• 61. Steinberger R.E., Holden P.A.: Extracellular DNA in single- andmultiple-species unsaturated biofilms. Appl. Environ. Microbiol.,2005; 71: 5404-5410
  Google Scholar
• 62. Sugimoto S., Iwamoto T., Takada K., Okuda K., Tajima A., Iwase T.,Mizunoe Y.: Staphylococcus epidermidis Esp degrades specific proteinsassociated with Staphylococcus aureus biofilm formation and hostpathogeninteraction. J. Bacteriol., 2013; 195: 1645-1655
  Google Scholar
• 63. Sutherland I.W.: Biofilm exopolysaccharides: a strong and stickyframework. Microbiology, 2001; 147: 3-9
  Google Scholar
• 64. Swartjes J.J., Das T., Sharifi S., Subbiahdoss G., Sharma P.K., Krom B.P., Busscher H.J, van der Mei H.C.: A functional DNase I coatingto prevent adhesion of bacteria and the formation of biofilm. Adv.Funct. Mater., 2013; 23: 2843-2849
  Google Scholar
• 65. Takenaka S., Ohshima H., Ohsumi T., Okiji T.: Current and futurestrategies for the control of mature oral biofilms – shift froma bacteria – targeting to a matrix – targeting approach. J. Oral Biosc.,2012; 54: 173-179
  Google Scholar
• 66. Thompson R., Creavin A., O’Connell M., O’Connor B., ClarkeP.: Optimization of the enzyme-linked lectin assay for enhancedglycoprotein and glycoconjugate analysis. Anal. Biochem., 2011;413: 114-122
  Google Scholar
• 67. Toyofuku M.; Roschitzki B.; Riedel K.; Eberl L.: Identification ofproteins associated with the Pseudomonas aeruginosa biofilm extracellularmatrix. J. Proteome Res., 2012; 11: 4906-4915
  Google Scholar
• 68. Valle J., Latasa C., Gil C., Toledo-Arana A., Solano C., PenadésJ.R., Lasa I.: Bap, a biofilm matrix protein of Staphylococcus aureusprevents cellular internalization through binding to GP96 host receptor.PLoS Pathog. 2012; 8: e1002843
  Google Scholar
• 69. Vergara-Irigaray M., Maira-Litrán T., Merino N., Pier G.B., PenadésJ.R., Lasa I.: Wall teichoic acids are dispensable for anchoring thePNAG exopolysaccharide to the Staphylococcus aureus cell surface.Microbiology, 2008; 154: 865-877
  Google Scholar
• 70. Vu B., Chen M., Crawford R.J., Ivanova E.P.: Bacterial extracellularpolysaccharides involved in biofilm formation. Molecules,2009;14: 2535-2554
  Google Scholar
• 71. Walker T.S., Tomlin K.L., Worthen G.S., Poch K.R., Lieber J.G.,Saavedra M.T., Fessler M.B., Malcolm K.C., Vasil M.L., Nick J.A.: EnhancedPseudomonas aeruginosa biofilm development mediated byhuman neutrophils. Infect. Immun., 2005; 73: 3693-3701
  Google Scholar
• 72. Whitchurch C.B., Tolker-Nielsen T., Ragas P.C., Mattick J.S.: ExtracellularDNA required for bacterial biofilm formation. Science,2002; 295: 1487
  Google Scholar
• 73. Wiater A., Szczodrak J., Rogalski J.: Hydrolysis of mutan andprevention of its formation in streptococcal films by fungal α-Dglucanases.Process Biochem., 2004; 39: 1481-1489
  Google Scholar
• 74. Xiao J., Klein M.I., Falsetta M.L., Lu B., Delahunty C.M., Yates J.R.3rd, Heydorn A., Koo H.: The exopolysaccharide matrix modulatesthe interaction between 3D architecture and virulence of a mixedspeciesoral biofilm. PLoS Pathog., 2012; 8: e1002623
  Google Scholar
• 75. Yakandawala N., Gawande P.V., LoVetri K., Cardona S.T., RomeoT., Nitz M., Madhyastha S.: Characterization of the poly-β-1,6-Nacetylglucosaminepolysaccharide component of Burkholderia biofilms.Appl. Environ. Microbiol., 2011; 77: 8303-8309
  Google Scholar
• 76. Yang L., Liu Y., Wu H., Song Z., Høiby N., Molin S., Givskov M.:Combating biofilms. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2012; 65: 146-157
  Google Scholar

Pełna treść artykułu