Abstrakt

Bakteriofagi zostały odkryte prawie 100 lat temu i ciągle budzą zainteresowanie; intensywnie prowadzi się badania nad dwiema grupami enzymów fagowych uszkadzających komórkę bakteryjną. Pierwszą są lizyny odpowiedzialne za niszczenie bakterii i uwolnienie wirusów. Druga grupa to depolimerazy polisacharydów (DP) degradujące otoczkowe i strukturalne polisacharydy, w tym egzopolisacharydy (EPS) będące dominującym składnikiem biofilmu. Depolimerazy polisacharydów mogą być związane z fagiem lub występować w postaci wolnej, a ich wytwarzanie odbywa się konstytutywnie lub jest indukowane obecnością polisacharydu. Pod względem aktywności DP dzielą się na hydrolazy (polisacharazy) lub liazy polisacharydów. Enzymy te są bardzo zróżnicowaną grupą pod względem swoistości substratowej, masy cząsteczkowej czy wrażliwości na czynniki fizykochemiczne. Fagi i wytwarzane przez nie DP wykazują ogromny potencjał jako środki do zwalczania bakterii otoczkowych powodujących ciężkie infekcje – posocznicę, zapalenie opon mózgowych, płuc oraz jako nowa grupa preparatów antybiofilmowych. Pozbawiając bakterie otoczki, obniżają ich zjadliwość, czyniąc je bardziej podatnymi na działanie układu odpornościowego makroorganizmu. Różnorodność bakterii i wytwarzanych przez nie egzopolisacharydów tworzących biofilmy wymaga stosowania swoistych fagów wytwarzających specyficzne DP. Problem swoistości DP i samych bakteriofagów można rozwiązać, stosując koktajle fagowe lub wprowadzając do genomu wirusów geny kodujące enzymy degradujące różne egzopolisacharydy bakteryjne istotne w tworzeniu biofilmu lub poszerzające zakres gospodarzy. Obiecujące wyniki przynosi łączne stosowanie DP lub fagów je wytwarzających z innymi środkami przeciwbiofilmowymi. Ukierunkowuje to dalsze badania zmierzające do opracowania skutecznej metody walki z biofilmami bakteryjnymi. Fagowe DP mogą być również wykorzystane do typowania bakterii lub do określania struktury wytwarzanych przez nie polisacharydów.

Wprowadzenie

Bakteriofagi (fagi) – wirusy niszczące bakterie – zostały odkryte niezależnie przez Fredericka W. Tworta w 1915 oraz Felixa d’Herelle’a w 1917 roku. Bakteriofagi są szeroko rozpowszechnione w  środowisku naturalnym, występują również w  organizmach ludzi i  zwierząt. Liczbę cząstek fagowych na świecie szacuje się na 1031 [1]. Wirusy bakteryjne są zbudowane z kwasu nukleinowego (jedno- lub dwuniciowego DNA lub RNA) otoczonego białkowym kapsydem, w  przypadku niektórych fagów również białkowo-lipidową osłonką. The International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) w 2009 r. zaklasyfikował fagi do 10 rodzin: Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Microviridae, Corticoviridae, Tectiviridae, Leviviridae, Cystoviridae, Inoviridae i Plasmaviridae. Pierwsze trzy rodziny tworzą rząd Caudovirales, do którego należy 96% dotychczas opisanych fagów zbudowanych z główki i ogonka, mających dwuniciowe DNA. Pozostałe 4% fagów ma budowę wielościenną, nitkowatą lub pleomorficzną [1].

Bakteriofagi namnażają się wyłącznie w żywych i wrażliwych na wirusa bakteriach; proces ten może przebiegać na kilka sposobów. Dotychczas wyróżniono 4 cykle rozwojowe fagów – lityczny, lizogenny, pseudolizogenny oraz przewlekłej infekcji [17,97]. Do celów terapeutycznych są przydatne tylko fagi lityczne, ponieważ bakteriofagi łagodne mogą powodować zmianę właściwości bakterii, np. przez transfer genów bakterie mogą nabyć oporność na antybiotyki lub zwiększyć swoją wirulencję [59,61]. Intensywny rozwój fagoterapii trwający do lat 40 ubiegłego stulecia został zahamowany w chwili odkrycia przez Fleminga penicyliny. Rozkwit antybiotykoterapii i niejednoznaczne wyniki leczenia bakteriofagami, wynikające z ówczesnych ograniczeń metod badawczych, znacznie zmniejszyły przeprowadzanie leczenia fagami. Jednak masowe i często nieuzasadnione stosowanie antybiotyków przez ostatnie dziesięciolecia doprowadziło do pojawiania się wielolekoopornych szczepów bakterii, takich jak metycylinooporne szczepy S. aureus (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus, MRSA) czy wankomycynooporne szczepy Enterococcus (Vancomicin-Resistant Enterococcus, VRE) [3,15,85,94]. Problemem też jest wzrastająca oporność na leki grupy bakterii określonej skrótem ESKAPE: Enterococcus faecalis, S. aureus, Klebsiella, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa i Escherichia coli [16,50]. Opisane problemy spowodowały ponowne zainteresowanie się bakteriofagami i możliwością ich wykorzystania w terapii infekcji bakteryjnych [59,62,70,94]. Dwa główne ośrodki na świecie zajmujące się fagoterapią to wrocławski Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN [14,61,62] oraz Instytut Bakteriofagów, Mikrobiologii i Wirusologii im. George Eliava w Tbilisi (Gruzja) [50,80].

Bakteriofagi mają wiele cech, które czynią je użytecznym narzędziem terapeutycznym [58,89,94]. Jedną z ważniejszych jest duża swoistość fagów – zdolność do zainfekowania jednego lub rzadziej kilku rodzajów różnych szczepów bakterii. Dzięki tej właściwości nie niszczą naturalnej flory człowieka. Oporność bakterii na fagi jest mniejszym problemem niż na antybiotyki, ponieważ fagi jako organizmy żywe również mogą ewoluować, przez co powstają nowe genotypy zdolne do ponownego infekowania danego szczepu. Inną ważną zaletą bakteriofagów jest ich szybka i stosunkowo tania metoda izolacji, w przeciwieństwie do antybiotyków, których uzyskanie i wprowadzenie do lecznictwa zajmuje kilka lat i jest kosztowne. Jedną z bardziej znaczących cech fagów jako czynnika antybakteryjnego jest zdolność do wykładniczego wzrostu, co oznacza, że wraz z nasileniem wzrostu bakterii wzrasta liczba wirusów, natomiast w chwili zmniejszania się liczby komórek gospodarza maleje liczba fagów [18,80]. Doniesienia literaturowe z ostatnich kilku lat wskazują na możliwość stosowania bakteriofagów w zapobieganiu lub zwalczaniu biofilmów bakteryjnych [4,12,19,23,27,28,36,69,76]. Jest to niezwykle ważne odkrycie, ponieważ biofilmy przez to, że powstają na różnych powierzchniach stałych, takich jak: tkanki, biomateriały, w tym cewniki dożylne czy urologiczne, endoprotezy, instalacje przemysłowe czy powierzchnia roślin uprawnych stanowią ogromny problem kliniczny, przemysłowy i ekonomiczny [31,77,78,99].

Niestety metoda zwalczania bakterii z użyciem naturalnego wroga, jakim są fagi nie jest pozbawiona wad [59,61]. Podstawowym problemem jest wybór fagów, które można użyć tak, by potencjalne patogeny były na nie wrażliwe oraz odpowiednie dobranie miana fagów i  sposób ich aplikacji. Ze względu na dużą swoistość fagów jest konieczna dokładna identyfikacja czynnika chorobotwórczego oraz określenie jego fagowrażliwości, co jest czasochłonne i ogranicza komercyjne stosowanie fagów. Ponadto swoistość fagów jest poważnym utrudnieniem w przypadku zwalczania infekcji czy biofilmów mieszanych. Rozwiązaniem jest stosowanie koktajli fagowych, czyli mieszanek kilku fagów zwalczających bakterie powodujące dany typ zakażenia. Można również poszukiwać fagów o szerokim zakresie gospodarzy lub modyfikować je genetycznie przez wprowadzenie w ich genom genów poszerzających zakres gospodarzy [57,74]. Problem, który napotyka fagoterapia to szybkie usuwanie fagów z organizmu związane głównie z nieswoistym wychwytywaniem wirusów przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego wątroby i  śledziony [61]. Wykazano jednak, że wielokrotne pasażowanie fagów u myszy, pozwala na uzyskanie wariantów fagów charakteryzujących się wydłużonym okresem pół- trwania w surowicy [60]. Z badań przeprowadzonych na myszach wynika ponadto, że pokrywanie kapsydów glikolem polietylenowym (PEG) [48] lub wprowadzanie za pośrednictwem mutacji niewielkiej zmiany w sekwencji aminokwasów w białku strukturalnym kapsydu, wydłużają czas trwania fagów w układzie krążenia myszy [95]. Na skuteczność terapii fagowej mają wpływ również powstające w czasie kuracji przeciwciała antyfagowe, które ją obniżają [61]. Możliwe jest wyeliminowanie tego przez stosowanie większych dawek fagów lub zamianę na faga o innej swoistości antygenowej, ale podobnym zakresie działania antybakteryjnego. Przed zastosowaniem faga w terapii należy wykluczyć obecność w jego genomie genów kodujących bakteryjne czynniki wirulencji czy warunkujących oporność na antybiotyki [89]. Zaleca się więc stosowanie w leczeniu infekcji fagów, których genom został poznany. Bardzo ważne jest tworzenie bibliotek fagowych zawierających pełną informację na temat poszczególnych wirusów [55]. Ponieważ stosowanie bakteriofagów nadal budzi wiele kontrowersji, jednocześnie prowadzi się badania nad wykorzystaniem enzymów fagowych niszczących komórkę bakteryjną jako potencjalnych czynników leczniczych lub środków dezynfekcyjnych [13,14,32,34,35].

Badania nad enzymami wydzielanymi przez fagi koncentrują się na lizynach wytwarzanych podczas ostatniej fazy cyklu, odpowiedzialnych za lizę bakterii i uwolnienie wirusów potomnych oraz depolimerazach polisacharydów (DP), które degradują otoczkowe i strukturalne polisacharydy, w tym egzopolisacharydy (EPS) będące dominującym składnikiem biofilmu bakteryjnego. Lizyny znalazły zastosowanie głównie w  zwalczaniu bakterii Gram-dodatnich, ponieważ błona zewnętrzna bakterii Gram-ujemnych zapobiega ich aktywności [13,14,34,35]. Pojawiające się doniesienia literaturowe wskazują jednak, że problem można rozwiązać, stosując np. EDTA jako czynnik destabilizujący błonę, a uzyskane w pracach nad endolizynami aktywnymi wobec bakterii Gram-ujemnych wyniki są bardzo obiecujące [96]. Dwa rodzaje białek – holiny i endolizyny są zaangażowane w degradację powłok bakteryjnych i uwolnienie fagów potomnych. Holiny to niskocząsteczkowe hydrofobowe białka degradujące błonę cytoplazmatyczną, przez co umożliwiają endolizynom dostęp do peptydoglikanu, który jest przez nie trawiony. Endolizyny wykazują różną aktywność enzymatyczną: N-acetylomuraminidazy (lizozym lub lityczna transglikozylaza) i endo- β-N-acetyloglukozamidazy – rozcinających wiązanie β1,4-glikozydowe w peptydoglikanie, endopeptydazy – tnącej mostki peptydowe, amidazy N-acetylomuramylo- -L-alaninowe – odcinającej wiązanie amidowe między L-alaniną a resztą N-acetylomuramylową. Oprócz dwóch ostatnich pozostałe można zaliczyć do depolimeraz polisacharydów (DP).

Fagowe depolimerazy polisacharydów to badane obecnie na szeroką skalę enzymy rozkładające wielocukry zarówno wchodzące w skład osłon komórkowych bakterii (otoczki, LPS, peptydoglikan), jak i  wydzielane przez bakterie do środowiska (polisacharydy stanowiące macierz biofilmu). Szczególne zainteresowanie budzą DP degradujące polisacharydy otoczkowe i  macierzy biofilmu. Są grupą potencjalnych środków do zwalczania trudnych infekcji związanych z tworzeniem biofilmu oraz bakterii otoczkowych powodujących ciężkie zakażenia, takie jak posocznica, zapalenie opon mózgowych, płuc, szpiku, septyczne zapalenie stawów i odmiedniczkowe zapalenie nerek. Zdolność bakteriofaga mającego DP do degradacji bakteryjnych egzopolisacharydów stwierdzono już prawie 60 lat temu [2]. Od tego czasu opisano wiele depolimeraz polisacharydów wykrytych u fagów infekujących, m.in. E. coli [11,24,39,51,67,75,84], P. aeruginosa [6,7,37], Pseudomonas agglomerans [44], Pseudomonas putida [27], Klebsiella [43,47,54,82], Streptococcus [33,52], Rhizobium trifolii [5], Erwinia amylovara [90], Azotobacter vinelandii [29] czy Vibrio cholerae O139 [53].

Charakterystyka fagowych depolimeraz polisacharydów

Fagowe depolimerazy polisacharydów są najczęściej umiejscowione na płytce podstawowej faga lub na jego włóknie, mogą również występować w postaci wolnej dyfundującej do podłoża [20]. Przykładowo bakteriofagi F1 i 29 zakażające bakterie E. coli wytwarzają depolimerazy w postaci wolnej i związanej z wirusem, natomiast fag infekujący P. aeruginosa wytwarza tylko depolimerazę związaną z cząstką wirusa [2,8,11]. Wytwarzanie DP może być konstytutywne lub indukowane obecnością substratu – polisacharydu. Adams i Park zaobserwowali, iż badany bakteriofag wytwarza depolimerazę podczas infekcji wszystkich wrażliwych na niego szczepów Klebsiella pneumoniae [2]. Sutherland i  Wilkinson opisali faga F1, który wytwarzał DP tylko podczas namnażania na szczepie E. coli s53 wydzielającym śluz [84]. Po zakażeniu fagiem bakterii E. coli s23 niewytwarzających śluzu, w hodowli nie stwierdzono obecności enzymu. Gdy do hodowli E. coli s23 dodano oczyszczony polisacharyd szczepu s53, zaobserwowano wytwarzanie przez faga F1 depolimerazy, przy czym na znacznie niższym poziomie niż w hodowli szczepu s53. Oznacza to, że jeśli bakteria nie wytwarza egzopolisacharydu, depolimeraza jest zbędna podczas zakażenia komórki gospodarza i w związku z tym bakteriofag F1 jej nie wytwarza. Na podstawie badań Sutherland i Wilkinson stwierdzili, że DP odgrywa rolę w uwalnianiu wirusów potomnych i infekowaniu większej liczby następnych bakterii [84].

Łysinki fagów wytwarzających depolimerazy polisacharydów są otoczone strefą opalizującego halo (ryc. 1), która powstaje w wyniku nadmiernego wydzielania depolimerazy dyfundującej do podłoża i pozbawiającej bakterie otoczek [47]. W obszarze halo stwierdzono występowanie zarówno fagów, jaki i  żywych bakterii. Zaobserwowano, że w chwili, gdy bakterie wchodzą w fazę stacjonarną, namnażanie fagów spowalnia, jednocześnie ich depolimerazy nadal rozkładają EPS, powodując tworzenie halo, które powiększa się w czasie wskutek dyfundowania fagów ze strefy pierwotnej lizy bakterii. Zatem na wielkość halo ma wpływ ilość wytwarzanego enzymu i liczba fagów powstałych w pojedynczej łysince, a to zależy od wydajności adsorpcji danego wirusa, okresu latencji i liczby wyrzutu fagów [27].

Uzyskanie depolimeraz polisacharydów jest pierwszym etapem badań mających na celu ich charakterystykę. DP bardzo często są związane z fagiem dlatego stosowano różne metody oparte na działaniu związków chemicznych (kwasów, zasad czy DMSO) na faga w celu oddzielenia enzymu od wirusa [71]. Natomiast Kassa i Chhibber, wykorzystując stosunkowo dużą oporność depolimeraz fagowych na działanie wysokiej temperatury, zaproponowali sposób izolacji tych enzymów oparty na inkubacji fagów w temperaturze 60°C przez 30 minut [47]. Technika ta okazała się równie skuteczna jak wcześniej stosowana wykorzystująca kwas jako czynnik odłączający enzym od faga, a  w  przeciwieństwie do niej nie wymaga stosowania niebezpiecznych odczynników chemicznych. Ponadto jej prostota, niskie koszty wykonania i  niezawodność, czynią tę metodę użytecznym narzędziem do izolacji różnych depolimeraz polisacharydów. Bakteriofagowe enzymy degradujące bakteryjne egzopolisacharydy stanowią bardzo zróżnicowaną grupę pod względem swoistości substratowej, masy cząsteczkowej czy wrażliwości na czynniki fizykochemiczne (tabela 1). Masa cząsteczkowa poszczególnych DP jest bardzo różna, np. depolimeraza faga ERA103 ma masę 21 kDa, natomiast DP faga K1F, będąca trimerem, aż 328 kDa (tabela 1) [39,90]. Zakres pH, w którym DP wykazują aktywność jest stosunkowo szeroki i mieści się między 5,0 a 9,0, natomiast optymalne pH na ogół jest zbliżone do obojętnego lub lekko kwaśne. Optymalna temperatura działania DP zależy m.in. od zakażanego przez faga gospodarza. Wrażliwość fagowych depolimeraz polisacharydów na działanie wysokiej temperatury jest również bardzo zróżnicowana. Aktywność DP faga 2 Pseudomonas pozostawała na poziomie 50% po inkubacji w temperaturze 70°C przez 5 minut, podczas gdy DP faga infekującego E. coli ulegała w tych warunkach całkowitej inaktywacji [6,84]. Ciekawym przykładem pod względem oporności na wysoką temperaturę jest DP wytwarzana przez faga P13 infekującego szczep Klebsiella K13, która po inkubacji faga przez 30 minut w temperaturze 70°C zachowała 90% aktywności, podczas gdy bakteriofag ulegał całkowitej inaktywacji [54]. Podczas oczyszczania tej depolimerazy z użyciem złoża Q-Sepharose Fast Flow otrzymano dwie frakcje białek zdolnych do degradacji EPS. Jednak tylko jedna frakcja E2, po poddaniu ultrafiltracji z punktem odcięcia białek 100 kDa, zachowała aktywność depolimerazy w przesączu. Autorzy założyli, że depolimeraza faga P13 występuje w postaci wolnej i związanej z cząsteczką faga lub ewentualnie fag wytwarza dwie depolimerazy [54].

Depolimerazy fagowe pod względem aktywności można podzielić na dwie grupy: hydrolazy, inaczej zwane polisacharazami oraz liazy polisacharydów [81]. Polisacharazy (najczęściej endoglukozydazy, endogalaktozydazy lub endoramnozydazy) hydrolitycznie rozkładają charakterystyczne dla danego polisacharydu wiązania glikozydowe. Natomiast liazy rozszczepiają wiązanie między monosacharydem przy czwartym atomie węgla (C4 ) kwasu uronowego, z jednoczesnym wprowadzeniem podwójnego wiązaniem między czwartym a piątym atomem węgla tego kwasu [81]. Ponieważ depolimerazy fagowe mogą wykazywać endo- i egzoaktywność, odpowiednio szybko lub wolno degradują EPS. Większość fagowych DP, podobnie jak wytwarzające je fagi, charakteryzuje się dużą swoistością. Oznacza to, że działają na polisacharydy bakterii, dla których je pierwotnie wyizolowano. Powstające w  wyniku działania DP produkty zależą od budowy trawionego substratu oraz od charakteru wiązania, które jest przez nie przecinane. Niekiedy pod wpływem działania DP obserwuje się zmniejszenie lepkości śluzu wytwarzanego przez bakterie, przy czym nie powstają żadne konkretne produkty, takie jak oligosacharydy czy cukry redukujące. Wskazuje to na niszczenie wewnętrznych wiązań polisacharydu, przy czym powstające produkty są stosunkowo duże [41]. Bartell i  Orr, badając depolimerazy PDB2 , PDB6 , PDB7 , PDB9 , PDB10 wyizolowane z hodowli różnych szczepów P. aeruginosa zakażonych innymi fagami, wykazali, że wszystkie hydrolizowały jeden typ śluzu z trzech badanych, uwalniając przy tym heksozoaminy [8]. Jednak uzyskane wyniki z zastosowaniem ówczesnych metod nie wykluczały powstawania innych produktów. Jedną z najintensywniej obecnie badanych depolimeraz – ze względu na specyfikę działania – jest endosialidaza lub endo-N-acetyloneuraminidaza (endoN). Do 2012 r., kiedy Park i wsp. po raz pierwszy opisali wytwarzanie endosialidazy przez bakterie Pseudomonas fluorescens JK-0412 [68], enzym ten wykrywano tylko u fagów swoistych wobec E. coli K1, a jego obecności nie stwierdzono u żadnego innego organizmu żywego [79]. Endosialidaza swoiście rozpoznaje i hydrolizuje wewnętrzne wiązanie α-2,8 polimeru kwasu sialowego (polySia) tworzącego otoczkę bakterii E. coli K1. Dotychczas opisano ponad 20 fagów mających gen depolimerazy degradującej otoczkę E. coli K1 [32]. Ze względu na specyficzne działanie enzym jest bardzo użytecznym narzędziem wykorzystywanym w neurobiologii, onkobiologii oraz inżynierii tkankowej [45]. Depolimeraza wytwarzana przez faga F40 infekującego szczep K. pneumoniae serotyp 2 jest natomiast mannozydazą hydrolizującą wiązanie D-mannoza-1→4-D-glukoza, przez co oddziela z polisacharydu tetrasacharyd, będący podstawową jednostką tego wielocukru [82]. Obecność grup acetylowych w polisacharydzie nie wpływała na aktywność enzymu. Następnym przykładem jest depolimeraza polisacharydów wytwarzana przez bakteriofaga 29 będąca glukanazą [11]. Enzym ten działa swoiście na polisacharyd otoczkowy E. coli Bi161/42 (O9:K29[A]:H- ), rozkładając wiązanie β-D-glukozydo-(1→3)-D-kwas glukuronowy uwalniając oligosacharydy z powtórzonych 1-, 2 – lub 3-krotnie heksasacharydów. Bardzo interesujące są fagi, które zawierają dwa różne enzymy będące DP, np. fag φK1-5 zakażający dwóch różnych gospodarzy, ponieważ na włóknach ogonka ma endosialidazę, która pozwala na infekcję szczepów E. coli wytwarzają- cych polisacharyd K1 oraz drugi enzym – liazę K5 tnącą wiązanie N-acetylo-heparosan-4-GlcA-(β1,4)GlcNAc(α1) [75]. Innymi przykładami fagów wytwarzających dwie depolimerazy polisacharydów są φK5 rozkładające otoczki wytwarzane przez szczepy E. coli K5 i K95 oraz fag φK20 wykazujący aktywność enzymatyczną wobec antygenów K20 i K5 E. coli [66,67,87].

Aktywność DP wobec bakterii otoczkowych

W postaciach planktonowych bakterii wytwarzających wielocukrowe otoczki, fagowa depolimeraza polisacharydów wiąże się z polimerem otoczkowym, powodując jego rozkład i dotarcie faga do powierzchni komórki. Wtedy bakteriofag łączy się z receptorem występują- cym na powierzchni ściany komórkowej i zakaża bakterię [44]. Potem może nastąpić cykl lityczny lub lizogenny w zależności od typu faga i panujących warunków. Depolimerazy polisacharydów wytwarzane przez różne fagi mogą hydrolizować EPS innych szczepów bakterii niewrażliwych na wirusy wytwarzające dany enzym [84]. Zjawisko takie zaobserwowano m.in. u fagów infekujących różne szczepy E. coli oraz Aerobacter cloacae. Okazało się, że EPS badanych szczepów E. coli s17, s53 i K12 oraz A. cloacae 5920 wykazywały duże podobieństwo pod względem budowy chemicznej, wszystkie zawierały fukozę, glukozę, galaktozę i kwas glukuronowy w porównywalnych ilościach [84]. Bartell i Orr porównywali swoistość działania 6 wyizolowanych depolimeraz polisacharydów: PDB2 , PDB6 , PDB7 , PDA8 , PDB9 , PDB10, wytwarzanych przez fagi zakażające różne szczepy P. aeruginosa [8]. Bakterie te wytwarzały trzy typy zewnątrzkomórkowych polisacharydów oznaczone A, B i C. Autorzy wykazali, że żadna z badanych depolimeraz nie działała na wytwarzany przez część szczepów polisacharyd C, tylko PDA8 rozkładała polisacharyd A, a pozostałe 5 polisacharyd B. Były to jedne z pierwszych badań wskazujące na różnorodność pod względem budowy chemicznej polisacharydów P. aeruginosa. Oznacza to, że DP fagowe mogą być wykorzystywane w pracach nad określaniem struktury polisacharydów bakteryjnych.

Fagi wytwarzające DP mogą być również użytecznym narzędziem w typowaniu bakterii otoczkowych. Przykładem jest fag 0507-KN2-1, który swoiście rozpoznaje polisacharyd otoczkowy KN2 K. pneumoniae, przy jednoczesnym braku reakcji ze szczepami reprezentującymi 78 innych serotypów polisacharydów otoczkowych tych bakterii [43]. Stwierdzono również oporność otrzymanego mutanta K. pneumoniae Ca0507 CSP– niewytwarzającego polisacharydu KN2 na tego faga. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że bakteriofag 0507-KN2-1 może być wykorzystywany do rozróżniania szczepu zawierającego otoczkę KN2 od pozostałych serotypów K. pneumoniae.

Szczepy E. coli K1, mające otoczkę zbudowaną z polimeru kwasu sialowego, odpowiadają za około 85% przypadków posocznicy i zapalenia opon mózgowych u noworodków wywoływanych przez E. coli, charakteryzujących się wysokim wskaźnikiem śmiertelności. Mushtaq i wsp., wykorzystując model zwierzęcy (noworodki szczurów) wykazali, że pojedyncza dawka fagowej endosialidazy E (endoE) podana 24 godziny po zakażeniu zwierząt, obniżała współczynnik śmiertelności w ciągu 7 dni eksperymentu z 80-100% do 0-10% [65]. Autorzy sugerowali, że endoE przez pozbawienie E. coli K1 otoczki, obniża zjadliwość tych bakterii i czyni je bardziej podatnymi na działanie układu odpornościowego, np. fagocytozę przez makrofagi. Depolimerazy fagowe znajdują również zastosowanie w walce z patogenami roślin, np. Erwinia amylovora, odpowiedzialnymi za wywoływanie zarazy ogniowej. Wykazano, że DP, niszcząc wytwarzane przez bakterie E. amylovora otoczki, pozbawiają je głównego czynnika wirulencji i przez to przyczyniają się do ich eliminacji z roślin [90]. Innym przykładem są fagowe liazy hialuronianu, które degradują zbudowane tylko z tego związku otoczki Streptococcus pyogenes i Streptococcus equi [33,52]. Większość genów kodujących hialuronidazy jest umiejscowiona w profagach. Obecnie duże zainteresowanie budzą depolimerazy degradujące polisacharydy otoczkowe bakterii z rodzajów Klebsiella – bakterii powodujących wielolekooporne zakażenia szpitalne i alginian otaczający komórki śluzowych szczepów Pseudomonas odpowiedzialnych za groźne zakażenia w  przebiegu mukowiscydozy [37,43,47,91].

Fagi wytwarzające DP kontra biofilm

Uważa się, że większość bakterii w środowisku naturalnym występuje w postaci biofilmu. Biofilm tworzy się wtedy, kiedy bakterie wolno pływające osiadają na powierzchni stałej, np. błonach śluzowych, implantach medycznych, cewnikach, roślinach, rurach itp. i tworzą wielokomórkowe skupiska otoczone zewnątrzkomórkowym polimerem, stanowiącym prawie 90% całej biomasy [49]. Składa się głównie z  egzopolisacharydów (EPS), ponadto w jego skład wchodzą białka, tłuszcze, kwasy nukleinowe, części bakterii, np. pile czy fragmenty powierzchni, na której tworzy się biofilm. Macierz chroni bakterie przed działaniem czynników zewnętrznych, takich jak antybiotyki, środki dezynfekcyjne czy składniki układu odpornościowego. Oporność bakterii w biofilmie na antybiotyki jest nawet kilka tysięcy razy większa w porównaniu do postaci planktonowych [21,64]. Zjawisko jest związane ze zmniejszonym metabolizmem, hamowaniem dyfuzji antybiotyków przez egzopolimery, syntezą enzymów rozkładających antybiotyki. W biofilmie pojawiają się komórki przetrwałe, tzw. persisters cells, które pozwalają na odtworzenie biofilmu po zakończeniu działania na niego środkiem bakteriobójczym [42]. Zwalczając infekcje związane z wytworzeniem biofilmu, koniecznie należy długotrwale stosować wysokie dawki antybiotyków, co nie zawsze przynosi pożądany skutek. Inaczej sytuacja przedstawia się w przypadku stosowania fagów, które przemieszczają się w biofilmie kanałami wodnymi, a posiadane przez nie depolimerazy polisacharydów degradują EPS, przez co fagi docierają do wszystkich warstw biofilmu (ryc. 2) [4,30,44,83]. W związku z samopowielaniem się wirusa teoretycznie do zwalczania biofilmu wystarczy jedna dawka faga. Carson i wsp. wykazali zdolność bakteriofagów do niszczenia dojrzałego biofilmu E. coli i Proteus mirabilis oraz zapobiegania jego powstawaniu na cewnikach urologicznych [19]. Autorzy uważali, że wiek biofilmu nie wpływa na aktywność lityczną fagów. Dotychczas przedstawiono dwie strategie walki z biofilmem z wykorzystaniem fagów [30]. Pierwsza dotycząca zapobiegania tworzeniu biofilmu na biomateriale jest oparta na pokrywaniu cewników obojętnym hydrożelem, który następnie jest „impregnowany” fagami. Druga dotyczy zwalczania już wytworzonego biofilmu przez traktowanie go zawiesiną faga lub fagów. Inna koncepcja walki z biofilmem bakteryjnym, obecnie intensywnie sprawdzana, opiera się na stosowaniu reprezentujących nową grupę środków antybiofilmowych: fagach wytwarzających depolimerazy polisacharydów lub na samych tych enzymach (tabela 2).

W  1998 r. Hughes i  wsp., badając wpływ faga SF153b wytwarzającego wolną depolimerazę polisacharydów na biofilm Enterobacter agglomerans 53b, wykazali zdolność DP do niszczenia biofilmu [44]. Zaobserwowali, że bakteriofag wraz z DP powodował 1992-krotny spadek liczby komórek wrażliwego szczepu po 180 min od dodania faga i enzymu do biofilmu. Jednocześnie po tym czasie sam enzym spowodował 120-krotny spadek liczby komórek w biofilmie. Oceniając wpływ faga SF153b i jego DP na szczep M53b oporny na tego wirusa, ale wytwarzający EPS wrażliwy na badaną depolimerazę, autorzy zaobserwowali 61-krotne zmniejszenie liczby bakterii w biofilmie. Obecnie, dzięki zaawansowanym metodom molekularnym, możliwe jest poznanie sekwencji całych genomów bakteriofagowych. Analiza sekwencji pozwala określić czy w genomie danego faga znajdują się geny kodujące depolimerazy polisacharydów. Takim przykładem są fagi vB_SepiS-phiIPLA5 i vB_SepiS-phiIPLA7 swoiste wobec Staphylococcus epidermidis, u których wykryto obecność domen kodujących enzymy podobne do liaz pektynowych, potencjalnie zaangażowane w degradację EPS [38]. Przypuszczenie to potwierdzała obecność halo otaczającego ich łysinki. Badając wpływ faga vB_SepiS- -phiIPLA7 na 7-dniowy biofilm szczepów niewrażliwego i  wrażliwego S. epidermidis, oceniano liczbę bakterii planktonowych i  w  biofilmie. W  przypadku szczepu wrażliwego całkowita liczba żywych bakterii została zredukowana do 5% po 3 godzinach inkubacji. Natomiast fag ten nie wpływał na liczbę komórek zarówno planktonowych, jak i w biofilmie szczepu niewrażliwego. W przypadku szczepu CJBP1, który wytwarzał EPS wrażliwy na działanie DP, nie zmieniła się całkowita liczba bakterii w hodowli, natomiast drastycznie zmieniły się proporcje między liczbą bakterii planktonowych i w biofilmie. Tylko 2% komórek pozostało w biofilmie, co sugeruje, że fagowa liaza zniszczyła EPS, uwalniając bakterie do podłoża [38]. Podobnie w przypadku Campylobacter jejuni bakterii tworzących biofilmy w rurach wodnych i instalacjach przemysłowych zaobserwowano, że bakteriofagidegradowały macierz zewnątrzkomórkową i powodowały lizę bakterii w obrębie biofilmu [76]. Hanlon i wsp. zaobserwowali, że enzymatyczna degradacja alginianu ułatwiała dyfuzję fagów w biofilmie P. aeruginosa [41].

Badania dotyczące wpływu bakteriofagów na biofilm bakteryjny wykazały, że odpowiednio dobrane dawki faga z właściwą depolimerazą egzopolisacharydów są podstawowe dla powodzenia terapii fagowej. Biofilm P. putida wykazywał największą wrażliwość na faga T7-like mającego DP po 8 godzinach inkubacji, natomiast po 24 zaobserwowano powstawanie oporności biofilmu na tego wirusa [27]. Podobnie stosowanie bakteriofaga T7 na biofilm E. coli w pierwszym etapie powodowało zmniejszenie liczby bakterii w biofilmie, niestety nie dochodziło do ich całkowitej eradykacji [63]. Wskazuje to na osiągnięcie w biofilmie pewnego rodzaju równowagi między wirusem a gospodarzem, co ze względów terapeutycznych jest zjawiskiem niekorzystnym. Z czasem mogą się pojawić komórki bakterii oporne na faga i warianty faga zdolne do infekowania opornych szczepów, z których dalej mogą powstać mutanty oporne na nie [46]. Przy ocenie zdolności bakteriofagów zawierają- cych DP do eradykacji biofilmu trzeba pamiętać, że biofilmy występujące w przyrodzie przeważnie są mieszane [84]. Całkowitą eradykację biofilmu tworzonego przez szczep Enterobacter cloace NCTC 5920 uzyskano dopiero po zastosowaniu mieszaniny trzech różnych bakteriofagów. Natomiast próby zniszczenia biofilmu tworzonego przez dwa gatunki E. cloace NCTC 5920 i E. agglomerans Ent okazały się bezskuteczne nawet po zastosowaniu koktajlu trzech bakteriofagów [86]. Wyniki wskazują na potencjał terapeutyczny fagów litycznych w walce z biofilmami i zarazem konieczność stosowania odpowiednio dobranych fagów wytwarzających DP swoiście wobec egzopolisacharydów tworzących macierz danego biofilmu. Jednak zdarza się, że stosowanie samych fagów nie jest wystarczające do całkowitej eradykacji biofilmu. Proponowanym rozwiązaniem tego problemu przez wielu badaczy jest terapia skojarzona, polegająca na łączeniu bakteriofagów z innymi środkami przeciwbiofilmowymi.

Fagi wytwarzające DP jako „wspomagacze” w walce z biofilmem – terapia skojarzona

Ponieważ sposoby oparte na stosowaniu bakteriofagów jako jedynego środka antybiofilmowego nie są w pełni skuteczne, podejmowanych jest wiele prób mających na celu opracowanie skutecznych metod skojarzonych w zwalczaniu biofilmu bakteryjnego. Polegają one na łączeniu bakteriofagów lub wytwarzanych przez nie depolimeraz EPS z takimi preparatami jak antybiotyki, środki dezynfekujące, np. związki chloru czy antagoniści żelaza (tabela 2).

Comeau i wsp. zaobserwowali, że niewielkie stężenie cefotaksymu (20 ng/ml) powodowało 7-krotne zwiększenie liczby fagów potomnych uwolnionych podczas lizy zakażonego szczepu E. coli MFP w porównaniu do liczby fagów uzyskanych podczas zakażenia bakterii hodowanych w podłożu bez dodatku antybiotyku [25]. Autorzy zjawisko to określili mianem Phage-Antibiotic Synergy (PAS). Rayan i wsp. wykazali synergistyczne działanie fagów w połączeniu z antybiotykami w stosunku do biofilmu [73]. Zaobserwowali, że jednoczesne zastosowanie faga T4 i cefotaksymu spowodowało skuteczniejsze niszczenie biofilmu E. coli ATCC 11303 w porównaniu do samego antybiotyku. Ponadto fagi o mianie 104 PFU/ml i 107 PFU/ml powodowały obniżenie minimalnego stężenia potrzebnego do eradykacji biofilmu MBEC (the Minimum Biofilm Eradication Concentration) z 256 mg/ ml na odpowiednio 128 i 32 mg/ml. Porównując nawet największe zastosowane stężenie faga T4 107 PFU/ml, powodowało najwyżej 0,9 log redukcję biofilmu E. coli. Również jednoczesne potraktowanie biofilmu K. pneumoniae B5055 amoksycykliną i fagami, przyniosło lepsze rezultaty w zwalczaniu biofilmu niż sama antybiotykoterapia czy fagoterapia [9]. Zaobserwowano, że amoksycyklina w porównaniu do fagów lepiej działała na biofilm do 4 dnia inkubacji, natomiast później skuteczniejsze w eradykacji biofilmu okazały się bakteriofagi. Może to być spowodowane słabą dyfuzją antybiotyku w dojrza- łym biofilmie i w związku z tym ograniczonym jego działaniem. Połączone działanie fagów z ciprofloksacyną na biofilm K. pneumoniae również okazało się skuteczniejsze niż stosowanie samego antybiotyku [91,92]. Wytwarzane przez fagi depolimerazy polisacharydów mogą powodować zniszczenie struktury biofilmu, przez co umożliwiają fagom swobodny dostęp do bakterii [44]. W terapii skojarzonej natomiast fagi niejako torują drogę antybiotykowi, przez co dyfunduje do głębszych warstw biofilmu, uzyskując bakteriobójcze stężenie, nieosiągalne w przypadku samej antybiotykoterapii. Terapia skojarzeniowa znacząco ogranicza powstawanie wariantów opornych w porównaniu z metodami opartymi na stosowaniu jednego czynnika antybiofilmowego [92].

Jednym z  powszechnie stosowanych do dezynfekcji czynników chemicznych jest chlor. Jednak w zwalczania biofilmów metoda ta nie zawsze przynosi pożądane skutki, ponieważ bakterie są otoczone EPS stanowiącym barierę ochronną. Zhang i Hu wykazali, że zastosowanie chloru w stężeniu 21 i 210 mg/l hamowało tworzenie biofilmu P. aeruginosa odpowiednio w 53 i 86%, nie powodowało jednak eradykacji 72-godzinnego biofilmu [99]. Dla porównania zastosowanie swoistego bakteriofaga hamowało tworzenie biofilmu P. aeruginosa w 80% i powodowało niszczenie dojrzałego biofilmu w 52%. Natomiast zastosowanie swoistych fagów w połączeniu z chlorem w obu wymienionych stężeniach zahamowało formowanie biofilmu P. aeruginosa powyżej 90%. Fagi w połączeniu z zastosowanym środkiem dezynfekcyjnym również bardziej niszczyły dojrzały biofilm, zaobserwowano jego ubytek w 60 i 88% odpowiednio przy stężeniu chloru 21 i 210 mg/l. Niestety w opisanej metodzie problemem jest właściwe dostosowanie stężenia chloru w zależności od rodzaju dezynfekowanej powierzchni lub przedmiotu, a co za tym idzie odpowiedni wybór faga niewrażliwego na określone stężenie chloru. Przykładem próby wykorzystania fagów, a konkretnie wytwarzanej przez nie depolimerazy polisacharydów do walki z biofilmem są badania Taita i wsp. [86]. Autorzy wykazali, że zastosowanie DP faga φEnt w połączeniu z różnymi środkami dezynfekcyjnymi, takimi jak: preparat zawierający podchloryn, niejonowy i amfoteryczny środek odkażający, czwartorzędowe związki amoniowe powodowało całkowitą lub prawie całkowitą eradykację biofilmu E. agglomerans Ent. Z zastosowanych środków osobno najsilniej niszczyła biofilm DP, a najsłabiej amfoteryczny środek odkażający i  czwartorzędowe związki amoniowe (4-5 razy słabiej w porównaniu do DP).

Inna proponowana metoda skojarzona opiera się na stosowaniu z  fagami czynników limitujących bakteriom dostęp do pierwiastków biogennych, np. żelaza. Udowodniono, że żelazo jest pierwiastkiem niezbędnym do życia bakterii i tworzenia przez nie biofilmu. Jony żelaza odpowiadają za przejście bakterii z postaci planktonowej w osiadłą i stabilizację polisacharydów w macierzy biofilmu [10]. Hancock i wsp. [40] wykazali, że dodanie do podłoża jonów Zn (II) lub Co (II), pierwiastków wykazujących większe niż żelazo powinowactwo do białka Fur – głównego kontrolera wychwytu żelaza, hamowało tworzenie przez E. coli biofilmu [40]. Zastosowanie w metodzie skojarzonej CoSO4 i faga KPO1K2 wytwarzającego DP spowodowało całkowitą eradykację jedno- i 2-dniowego biofilmu K. pneumoniae B5055, czego nie obserwowano w przypadku użycia CoSO4 albo faga [22]. Zaobserwowana w niewielkim stopniu eradykacja biofilmu w przypadku działania na niego fagiem NDP niewytwarzającym DP w obecności jonów kobaltu wskazuje na istotną rolę depolimerazy w niszczeniu biofilmu K. pneumoniae B5055. Prawdopodobnie depolimeraza degradując macierz biofilmu, ułatwia dyfuzję jonów kobaltu do jego głębszych warstw. Niestety terapia skojarzona nie powodowała lub tylko częściową eradykację starszego biofilmu tych bakterii.

Terapie skojarzone budzą wielkie nadzieje w walce z biofilmami bakteryjnymi, jednak w związku z bardzo zło- żoną strukturą i funkcjonowaniem biofilmów konieczne są dalsze badania nad możliwymi do wykorzystania w terapii czynnikami antybakteryjnymi, takimi jak: różnego typu antybiotyki, związki chelatujące lub antagoniści pierwiastków biogennych, środki odkażające, bakteriocyny, związki pochodzenia roślinnego, np. polifenole czy peptydy o właściwościach antybakteryjnych.

Doskonalenie fagów za pomocą inżynierii genetycznej

Mimo obiecujących wyników badań nad zastosowaniem fagów wytwarzających DP czy samych enzymów w  zwalczaniu bakterii otoczkowych czy biofilmów bakteryjnych, wykorzystanie ich na szeroką skalę jest ograniczone w związku z dużą swoistością depolimeraz. Nawet mała zmiana lub różnica w budowie polisacharydu między szczepami bakterii, powoduje niewrażliwość na działanie danej depolimerazy [72]. Jednak problem można rozwiązać, wykorzystując metody inżynierii genetycznej, które pozwalają na wprowadzenie do genomu faga określonych genów nadają- cych wirusom pożądane właściwości [57]. Scholl i wsp., wprowadzając do genomu faga T7 – swoistego wobec szczepów E. coli B i K12 – gen kodujący K1-5 endosialidazę, poszerzyli zakres jego gospodarzy, umożliwiając mu zakażanie szczepów E. coli wytwarzających polisacharyd otoczkowy K1 [74]. Lu i Collins w wyniku modyfikacji genetycznej uzyskali faga T7DspB wytwarzającego enzym – dyspersynę B (naturalnie wytwarzaną przez Actinobacillus actinomycetemcomitans) hydrolizującą polimer β-1,6-N-acetyl-D-glukozoaminy, adhezynę bakteryjną istotną w tworzeniu biofilmu i utrzymaniu jego integracji przez takie bakterie, jak Staphylococcus czy E. coli [55]. Okazało się, że fag T7DspB jest skuteczniejszy w niszczeniu biofilmu niż fag T7. Ci sami badacze otrzymali z łagodnego faga M13mp18 mutanta φlexA3 charakteryzującego się nadekspresją białka lexA3, będącego represorem bakteryjnego systemu naprawy DNA – SOS [56]. Fag φlexA3 zwiększał skuteczność antybiotyków z  trzech powszechnie stosowanych grup: chinolonów – ofloksacyny, aminoglikozydów – gentamycyny i β-laktamów – ampicyliny w stosunku do bakterii wykazujących na nie oporność oraz bakterii występujących w biofilmie. Obecnie dostępne metody biologii molekularnej stwarzają w zasadzie nieograniczone możliwości komponowania bakteriofagów o  pożądanych właściwościach. Z  tego względu bardzo ważne jest poznawanie genomów znanych i nowo odkrywanych fagów oraz tworzenie bibliotek fagowych.

Podsumowanie

Fagi wytwarzające depolimerazy polisacharydów lub same te enzymy mogą stanowić nową klasę środków antybiofilmowych i/lub leków przeciwko patogennym bakteriom wytwarzającym otoczki. Fagowe enzymy rozkładające egzopolisacharydy, mimo że same nie zabijają bakterii, to degradując otoczki bakteryjne czy macierz biofilmu, umożliwiają dostęp do drobnoustrojów środkom bakteriobójczym czy czynnikom układu odpornościowego makroorganizmu, które działając pojedynczo, często okazują się nieskuteczne. W związku z różną aktywnością enzymatyczną fagowe depolimerazy polisacharydów mogą również być użytecznym narzędziem w badaniach struktury chemicznej polisacharydów, wytwarzaniu oligosacharydów z  polisacharydów czy diagnostyki bakterii. Izolacja nowych fagów i  wytwarzanych przez nie enzymów jest stosunkowo prosta i tania w porównaniu do procesu otrzymania nowego antybiotyku. Zaletą i zarazem wadą fagów i wytwarzanych przez nie DP jest duża swoistość. Pozytywne jest, że nie niszczą w  przeciwieństwie do antybiotyków naturalnej flory gospodarza. Jednak swoistość fagów i DP ogranicza ich szerokie stosowanie. Problem można rozwiązać przez stosowanie odpowiednio przygotowanych koktajli fagowych lub za pośrednictwem modyfikacji genetycznej poszerzać zakres gospodarzy fagów. W związku z powyższym bardzo ważne jest tworzenie bibliotek fagowych. Bardziej obiecujące wyniki w zwalczaniu biofilmów uzyskiwano, wykorzystując terapię skojarzoną w porównaniu do stosowania samych bakteriofagów czy ich depolimeraz. Wskazuje to kierunek dalszych badań mających na celu opracowanie skutecznej metody wykorzystującej bakteriofagi w walce z biofilmami bakteryjnymi.

Przypisy

• 1. Ackermann H.W.: Bacteriophage taxonomy. Microbiol. Australia,2011; 32: 90-94
  Google Scholar
• 2. Adams M.H., Park B.H.: An enzyme produced by a phage-hostcell system. II. The properties of the polysaccharide depolymerase.Virology, 1956; 2: 719-736
  Google Scholar
• 3. Antibiotic Resistance Threats in the United States, 2013; http://www.cdc.gov/drugresistance/threat-report-2013/pdf/ar-threats-2013-508.pdf(18.06.2014)
  Google Scholar
• 4. Azeredo J., Sutherland I.W.: The use of phages for the removalof infectious biofilms. Curr. Pharm. Biotechnol., 2008; 9: 261-266
  Google Scholar
• 5. Barnet Y.M., Humphrey B.: Exopolysaccharide depolymerasesinduced by Rhizobium bacteriophages. Can. J. Microbiol., 1975, 21:1647-1650
  Google Scholar
• 6. Bartell P.F., Lam G.K., Orr T.E.: Purification and properties of polysaccharidedepolymerase associated with phage-infected Pseudomonasaeruginosa. J. Biol. Chem., 1968; 243: 2077-2080
  Google Scholar
• 7. Bartell P.F., Orr T.E.: Origin of polysaccharide depolymerase associatedwith bacteriophage infection. J. Virol., 1969, 3: 290-296
  Google Scholar
• 8. Bartell P.F., Orr T.E.: Distinct slime polysaccharide depolymerasesof bacteriophage-infected Pseudomonas aeruginosa: evidenceof close association with the structured bacteriophage particle. J.Virol., 1969; 4: 580-584
  Google Scholar
• 9. Bedi M.S., Verma V., Chhibber S.: Amoxicillin and specific bacteriophagecan be used together for eradication of biofilm of Klebsiellapneumoniae B5055. World J. Microbiol. Biotechnol., 2009; 25:1145-1151
  Google Scholar
• 10. Berlutti N., Morea C., Battistoni A., Sarli S., Cipriani P., Superti F.,Ammendolia M.G., Valenti P.: Iron availability influences aggregation,biofilm, adhesion and invasion of Pseudomonas aeruginosa and Burkholderiacenocepacia. Int. J. Imunopathol. Pharmacol., 2005; 18: 661-670
  Google Scholar
• 11. Bessler W., Fehmel F., Freund-Mölbert E., Knüfermann H., SirimS.: Escherichia coli capsule bacteriophages IV. Free capsule depolymerase 29 J. Virol., 1975; 15: 976-984
  Google Scholar
• 12. Betts A., Vasse M., Kaltz O., Hochberg M.E.: Back to the future:evolving bacteriophages to increase their effectiveness against thepathogen Pseudomonas aeruginosa PAO1. Evol. Appl., 2013; 6: 1054-1063
  Google Scholar
• 13. Borysowski J., Łobocka M., Międzybrodzki R., Weber-DąbrowskaB., Górski A.: Potential of bacteriophages and their lysins in thetreatment of MRSA. Current status and future perspectives. Biodrugs,2011; 25: 347-355
  Google Scholar
• 14. Borysowski J., Weber-Dąbrowska B., Górski A.: Bacteriophageendolysins as a novel class of antibacterial agents. Exp. Biol. Med.,2006; 231: 366-377
  Google Scholar
• 15. Boucher H.W., Corey G.R.: Epidemiology of methicillin-resistantStaphylococcus aureus. Clin. Infect. Dis. 2008; 46: S344-S349
  Google Scholar
• 16. Boucher H.W., Talbot G.H., Bradley J.S., Edwards J.E.Jr, Gilbert D.,Rice L.B., Scheld M., Spellberg B., Bartlett J.: Bad bugs, no drugs: noESKAPE! An update from the infectious diseases Society of America.Clin. Infect. Dis, 2009; 48: 1-12
  Google Scholar
• 17. Brzozowska E., Bazan J., Gamian A.: Funkcje białek bakteriofagowych.Postępy Hig. Med. Dośw., 2011; 65: 167-76
  Google Scholar
• 18. Carlton R.M.: Phage therapy: past history and future prospects.Arch. Immunol. Ther. Exp., 1999; 47: 267-274
  Google Scholar
• 19. Carson L., Gorman S.P., Gilmore B.F.: The use of lytic bacteriophagesin the prevention and eradication of biofilms of Proteusmirabilis and Escherichia coli. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2010;59: 447-455
  Google Scholar
• 20. Castillo F.J., Bartell P.F.: Localization and functional role of thePseudomonas bacteriophage 2 depolymerase. J. Virol., 1976; 18: 701-708
  Google Scholar
• 21. Chen L., Wen Y.: The role of bacterial biofilm in persistent infectionsand control strategies. Int. J. Oral. Sci., 2011; 3: 66-73
  Google Scholar
• 22. Chhibber S., Nag D., Bansal S.: Inhibiting biofilm formation byKlebsiella pneumoniae B5055 using an iron antagonizing molecule anda bacteriophage. BMC Microbiol., 2013; 13: 174
  Google Scholar
• 23. Chibeu A., Lingohr E.J., Masson L., Manges A., Harel J., AckermannH.W., Kropinski A.M., Boerlin P.: Bacteriophages with theability to degrade uropathogenic Escherichia coli biofilms. Viruses,2012; 4: 471-487
  Google Scholar
• 24. Clarke B.R., Esumeh F., Roberts I.S.: Cloning, expression, andpurification of the K5 capsular polysaccharide lyase (KflA) fromcoliphage K5A: evidence for two distinct K5 lyase enzymes. J. Bacteriol.,2000; 182: 3761-3766
  Google Scholar
• 25. Comeau A.M., Tétart F., Trojet S.N., Prére M.F., Krisch H.M.:Phage-antibiotic synergy (PAS): β-lactam and quinolone antibioticsstimulate virulent phage growth. PLoS One, 2007; 2: e799
  Google Scholar
• 26. Cornelissen A., Ceyssens P.J., Krylov V.N., Noben J.P., VolckaertG., Lavigne R.: Identification of EPS-degrading activity with in thetail spikes of the novel Pseudomonas putida phage AF. Virology, 2012;434: 251-256
  Google Scholar
• 27. Cornelissen A., Ceyssens P.J., T’Syen J., Van Praet H., Noben J.P.,Shaburova O.V., Krylov V.N., Volckaert G., Lavigne R.: The T7-relatedPseudomonas putida phage φ15 displays virion-associated biofilmdegradation properties. PLoS One, 2011; 6: e18597
  Google Scholar
• 28. Curtin J.J., Donlan R.M.: Using bacteriophages to reduce formationof catheter-associated biofilms by Staphylococcus epidermidis.Antimicrob. Agents Chemother., 2006; 50: 1268-1275
  Google Scholar
• 29. Davidson I.W., Lawson C.J., Sutherland I.W.: An alginate lyasefrom Azotobacter vinelandii phage. J. Gen. Microbiol., 1977; 98: 223-229
  Google Scholar
• 30. Donlan R.M.: Preventing biofilms of clinically relevant organismsusing bacteriophage. Trends Microbiol., 2009; 17: 66-72
  Google Scholar
• 31. Donlan R.M.: Biofilm elimination on intravascular catheters:important considerations for the infectious disease practitioner.Clin. Infect. Dis., 2011; 52: 1038-1045
  Google Scholar
• 32. Drulis-Kawa Z., Majkowska-Skrobek G., Maciejewska B., DelattreA.S., Lavigne R.: Learning from bacteriophages – advantages andlimitations of phage and phage-encoded protein applications. Curr.Protein Pept. Sci., 2012; 13: 699-722
  Google Scholar
• 33. El-Safory N.S., Lee G.C., Lee C.K.: Characterization of hyaluronatelyase from Streptococcus pyogenes bacteriophage H4489A. CarbohydratePolymers, 2011; 84: 1182-1191
  Google Scholar
• 34. Fenton M., Ross P., McAuliffe O., O’Mahony J., Coffey A.: Recombinantbacteriophage lysins as antibacterials. Bioeng. Bugs.,2010; 1: 9-16
  Google Scholar
• 35. Fischetti V.A.: Bacteriophage endolysins: a novel anti-infectiveto control Gram-positive pathogens. Int. J. Med. Microbiol., 2010;300: 357-362
  Google Scholar
• 36. Fu W., Forster T., Mayer O., Curtin J.J., Lehman S.M., Donlan R.M.:Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation byPseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system.Antimicrob. Agents Chemother., 2010; 54: 397-404
  Google Scholar
• 37. Glonti T., Chanishvili N., Taylor P.W.: Bacteriophage-derivedenzyme that depolymerizes the alginic acid capsule associated withcystic fibrosis isolates of Pseudomonas aeruginosa. J. Appl. Microbiol.,2010; 108: 695-702
  Google Scholar
• 38. Gutiérrez D., Martínez B., Rodríguez A., García P.: Genomic characterizationof two Staphylococcus epidermidis bacteriophages withanti-biofilm potential. BMC Genomics, 2012; 13: 228
  Google Scholar
• 39. Hallenbeck P.C., Vimr E.R., Yu F., Bassler B.O., Troy F.A.: Purificationand properties of a bacteriophage-induced endo-N-acetylneuraminidasespecific for poly-α-2,8-sialosyl carbohydrate units.J. Biol. Chem., 1987; 262: 3553-3561
  Google Scholar
• 40. Hancock V., Dahl M., Klemm P.: Abolition of biofilm formationin urinary tract Escherichia coli and Klebsiella isolates by metal interferencethrough competition for Fur. Appl. Environ. Microbiol.,2010; 76: 3836-3841
  Google Scholar
• 41. Hanlon G.W., Denyer S.P., Olliff C.J., Ibrahim L.J.: Reduction inexopolysaccharide viscosity as an aid to bacteriophage penetrationthrough Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol.,2001; 67: 2746-2753
  Google Scholar
• 42. Hoiby N., Bjarnsholt T., Givskov M., Molin S., Ciofu O.: Antibioticresistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents,2010; 35: 322-332
  Google Scholar
• 43. Hsu C.R., Lin T.L., Pan Y.J., Hsieh P.F., Wang J.T.: Isolation ofa bacteriophage specific for a new capsular type of Klebsiella pneumoniaeand characterization of its polysaccharide depolymerase.PLoS One, 2013; 8: e70092
  Google Scholar
• 44. Hughes K.A., Sutherland I.W., Jones M.V.: Biofilm susceptibilityto bacteriophage attack: the role of phage-borne polysaccharidedepolymerase. Microbiology, 1998; 144: 3039-3047
  Google Scholar
• 45. Jakobsson E., Schwarzer D., Jokilammi A., Finne J.: Endosialidases:versatile tools for the study of polysialic acid. Top. Curr.Chem., 2012
  Google Scholar
• 46. Kashiwagi A., Yomo T.: Ongoing phenotypic and genomic changesin experimental coevolution of RNA bacteriophage Qβ and Escherichiacoli. PLoS Genetics, 2011; 7: e1002188
  Google Scholar
• 47. Kassa T., Chhibber S.: Thermal treatment of the bacteriophagelysate of Klebsiella pneumoniae B5055 as a step for the purification ofcapsular depolymerase enzyme. J. Virol. Methods , 2012; 179: 135-141
  Google Scholar
• 48. Kim K.P., Cha J.D., Jang E.H. Klumpp J., Hagens S., Hardt W.D.,Lee K.Y., Loessner M.J.: PEGylation of bacteriophages increases bloodcirculation time and reduces T-helper type 1 immune response. Microb.Biotechnol., 2008; 1: 247-257
  Google Scholar
• 49. Kostakioti M., Hadjifrangiskou M., and Hultgren S.J.: Bacterialbiofilms: development, dispersal, and therapeutic strategies in thedawn of the postantibiotic era. Cold Spring Harb. Perspect. Med.,2013; 3: a010306
  Google Scholar
• 50. Kutateladze M., Adamia R.: Bacteriophages as potential newtherapeutics to replace or supplement antibiotics. Trends Biotechnol.,2010; 28: 591-595
  Google Scholar
• 51. Legoux R., Lelong P., Jourde C., Feuillerat C., Capdevielle J., SureV., Ferran E., Kaghad M., Delpech B., Shire D., Ferrara P., Loison G.,Salomé M.: N-acetyl-heparosan lyase of Escherichia coli K5: gene cloningand expression. J. Bacteriol. 1996; 178: 7260-7264
  Google Scholar
• 52. Lindsay A.M., Zhang M., Mitchell Z., Holden M.T., Waller A.S.,Sutcliffe I.C., Black G.W.: The Streptococcus equi prophage-encodedprotein SEQ2045 is a hyaluronan-specific hyaluronate lyase that isproduced during equine infection. Microbiology, 2009; 155: 443-449
  Google Scholar
• 53. Linnerborg M., Weintraub A., Albert M.J., Widmalm G.: Depolymerizationof the capsular polysaccharide from Vibrio cholerae O139by a lyase associated with the bacteriophage JA1. Carbohydr. Res.,2001; 333: 263-269
  Google Scholar
• 54. Liu Y., Li G., Mo Z., Chai Z., Shang A., Mou H.: Properties of Klebsiellaphage P13 and associated exopolysaccharide depolymerase.J. Ocean Univ. China, 2014; 13: 163-168
  Google Scholar
• 55. Lu T.K., Collins J.J.: Dispersing biofilms with engineered enzymaticbacteriophage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007; 104: 11197-11202
  Google Scholar
• 56. Lu T.K., Collins J.J.: Engineered bacteriophage targeting genenetworks as adjuvants for antibiotic therapy. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 2009; 106: 4629-4634
  Google Scholar
• 57. Lu T.K., Koeris M.S.: The next generation of bacteriophage therapy.Curr. Opinion Microbiol., 2011; 14: 524-531
  Google Scholar
• 58. Łysiak K.: Bakteriofagi jako alternatywa dla antybiotyków – moż-liwości praktycznego ich zastosowania w chirurgii stomatologicznej– przegląd piśmiennictwa. Dent. Med. Probl., 2004; 41: 761-768
  Google Scholar
• 59. Maura D., Debarbieux L.: Bacteriophages as twenty-first centuryantibacterial tools for food and medicine. Appl. Microbiol. Biotechnol.,2011; 90: 851-859
  Google Scholar
• 60. Merril C.R., Biswas B., Carlton R., Jensen N.C., Creed G.J., ZulloS., Adhya S.: Long-circulating bacteriophage as antibacterial agents.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 93: 3188-3192
  Google Scholar
• 61. Międzybrodzki R., Borysowski J., Fortuna W., Weber-DąbrowskaB., Górski A.: Terapia fagowa jako alternatywa w leczeniu zakażeńwywołanych przez bakterie antybiotykooporne. Kardiochir. Torakochir.Pol., 2006; 3: 201-205
  Google Scholar
• 62. Międzybrodzki R., Borysowski J., Weber-Dabrowska B., LetkiewiczS., Szufnarowski K., Pawelczyk Z., Rogoz P., Klak M., Wojtasik E., GorskiA.: Clinical aspects of phage therapy. Adv. Virus Res., 2012; 83:73-121
  Google Scholar
• 63. Moons P., Faster D., Aertsen A.: Lysogenic conversion and phageresistance development in phage exposed Escherichia coli biofilms.Viruses, 2013; 5: 150-161
  Google Scholar
• 64. Moryl M., Torzewska A., Jałmużna P., Różalski A.: Analysis ofProteus mirabilis distribution in multi-species biofilms on urinarycatheters and determination of bacteria resistance to antimicrobialagents. Pol. J. Microbiol., 2013; 62: 377-384
  Google Scholar
• 65. Mushtaq N., Redpath M.B., Luzio J.P., Taylor P.W.: Treatment ofexperimental Escherichia coli infection with recombinant bacteriophage-derivedcapsule depolymerase. J. Antimicrob. Chemother.,2005; 56: 160-165
  Google Scholar
• 66. Nimmich W.: Detection of Escherichia coli K95 strains by bacteriophages.J. Clin. Microbiol., 1994; 32: 2843-2845
  Google Scholar
• 67. Nimmich W., Schmidt G., Krallmann-Wenzel U.: Two differentEscherichia coli capsular polysaccharide depolymerases each associatedwith one of the coliphage φK5 and φK20. FEMS Microbiol.Lett., 1991; 82: 137-141
  Google Scholar
• 68. Park J.K., Choi D.J., Kim S.M., Choi H.N., Park J.W., Jang S.J., ChooY.K., Lee C.G., Park Y.I.: Purification and characterization of a polysialicacid-specific sialidase from Pseudomonas fluorescens JK-0412. Biotechnol.Bioprocess Eng., 2012; 17: 526-537
  Google Scholar
• 69. Pires D., Sillankorva S., Faustino A., Azeredo J.: Use of newly isolatedphages for control of Pseudomonas aeruginosa PAO1 and ATCC 10145 biofilms. Res. Microbiol., 2011; 162: 798-806
  Google Scholar
• 70. Potera C.: Phage renaissance: new hope against antibiotic resistance.Environ. Health Perspect., 2013; 121: a48-a53
  Google Scholar
• 71. Rieger D., Freund-Molbert E., Stirm S.: Escherichia coli capsulebacteriophages. III. Fragments of bacteriophage 29. J. Virol., 1975;15: 964-975
  Google Scholar
• 72. Rieger-Hug D., Stirm S.: Comparative study of host capsule depolymerasesassociated with Klebsiella bacteriophages. Virology,1981; 113: 363-378
  Google Scholar
• 73. Ryan E.M., Alkawareek M.Y., Donnelly R.F., Gilmore B.F.: Synergisticphage-antibiotic combinations for the control of Escherichia colibiofilms in vitro. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2012; 65: 395-398
  Google Scholar
• 74. Scholl D., Adhya S., Merril C.: Escherichia coli K1’s capsule is a barrierto bacteriophage T7. Appl. Environ. Microbiol., 2005; 71: 4872-4874
  Google Scholar
• 75. Scholl D., Rogers S., Adhya S., Merril C.R.: Bacteriophage K1-5encodes two different tail fiber proteins, allowing it to infect andreplicate on both K1 and K5 strains of Escherichia coli. J. Virol., 2001;75: 2509-2515
  Google Scholar
• 76. Siringan P., Connerton P.L., Payne R.J., Connerton I.F.: Bacteriophage-mediateddispersal of Campylobacter jejuni biofilms. Appl.Environ. Microbiol., 2011; 77: 3320-3326
  Google Scholar
• 77. Srey S., Jahid I.K., Ha S.D.: Biofilm formation in food industries:a food safety concern. Food Control, 2013; 31: 572-585
  Google Scholar
• 78. Stickler D.J.: Bacterial biofilms in patients with indwelling urinarycatheters. Nat. Clin. Pract. Urol., 2008; 5: 598-608
  Google Scholar
• 79. Stummeyer K., Schwarzer D., Claus H., Vogel U., Gerardy-SchahnR., Mühlenhoff M.: Evolution of bacteriophages infecting encapsulatedbacteria: lessons from Escherichia coli K1-spesific phages. Mol.Microbiol., 2006; 60: 1123-1135
  Google Scholar
• 80. Sulakvelidze A., Alavidze Z., Morris J.G.Jr.: Bacteriophage therapy.Antimicrob. Agents Chemother., 2001; 45: 649-659
  Google Scholar
• 81. Sutherland I.W.: Polysaccharases for microbial exopolysaccharides.Carbohydr. Polym., 1999; 38: 319-328
  Google Scholar
• 82. Sutherland I.W.: The exopolysaccharides of Klebsiella serotype 2strains as substrates for phage-induced polysaccharide depolymerases.J. Gen. Microbiol., 1971; 70: 331-338
  Google Scholar
• 83. Sutherland I.W., Hughes K.A., Skillman L.C., Tait K.: The interactionof phage and biofilms. FEMS Microbiol. Lett., 2004; 232: 1-6
  Google Scholar
• 84. Sutherland I.W., Wilkinson J.F.: Depolymerases for bacterialexopolysaccharides obtained from phage-infected bacteria. J. Gen.Microbiol., 1965; 39: 373-383
  Google Scholar
• 85. Szymanek-Majchrzak K., Młynarczyk A., Młynarczyk G.: OpornośćStaphylococcus aureus na glikopeptydy. Post. Mikrobiol., 2013;52: 171-184
  Google Scholar
• 86. Tait K., Skilmann L.C., Sutherland I.W.: The efficacy of bacteriophageas a method of biofilm eradication. Biofouling, 2002; 18:305-311
  Google Scholar
• 87. Thompson J.E., Pourhossein M., Waterhouse A., Hudson T., GoldrickM., Derrick J.P., Roberts I.S.: The K5 lyase KflA combines a viraltail spike structure with a bacterial polysaccharide lyase mechanism.J. Biol. Chem., 2010; 285: 23693-23969
  Google Scholar
• 88. Tomlinson S., Taylor P.W.: Neuraminidase associated with coliphageE that specifically depolymerizes the Escherichia coli KI capsularpolysaccharide. J. Virol., 1985; 55: 374-378
  Google Scholar
• 89. Vandamme E.J.: Phage therapy and phage control: to be revisitedurgently!! J. Chem. Technol. Biotechnol., 2014; 89: 329-333
  Google Scholar
• 90. Vandenbergh P.A., Wright A.M., Vidaver A.K.: Partial purificationand characterization of a polysaccharide depolymerase associatedwith phage-infected Erwinia amylovora. Appl. Environ. Microbiol.,1985; 49: 994-996
  Google Scholar
• 91. Verma V., Harjai K., Chhibber S.: Characterization of a T7-likelytic bacteriophage of Klebsiella pneumoniae B5055: a potential therapeuticagents. Curr. Microbiol., 2009; 59: 274-281
  Google Scholar
• 92. Verma V., Harjai K., Chhibber S.: Restricting ciprofloxacin inducedresistant variant formation in biofilm of Klebsiella pneumoniaeB5055 by complementary bacteriophage treatment. J. Antimicrob.Chemother., 2009; 64: 1212-1218
  Google Scholar
• 93. Verma V., Harjai K., Chhibber S.: Structural changes induced bya lytic bacteriophage make ciprofloxacin effective against older biofilmof Klebsiella pneumoniae. Biofouling, 2010; 26: 729-737
  Google Scholar
• 94. Viertel T.M., Ritter K., Horz H.P.: Viruses versus bacteria – novelapproaches to phage therapy as a tool against multidrug-resistantpathogens. J. Antimicrob. Chemother., 2014; 69: 2326-2336
  Google Scholar
• 95. Vitiello C.L., Merril C.R., Adhya S.: An amino acid substitutionin a capsid protein enhances phage survival in mouse circulatorysystem more than a 1000-fold. Virus Res., 2005; 114: 101-103
  Google Scholar
• 96. Walmagh M., Boczkowska B., Grymonprez B., Briers Y., Drulis–Kawa Z., Lavigne R.: Characterization of five novel endolysins fromGram-negative infecting bacteriophages. Appl. Microbiol. Biotech.,2013; 97: 4369-4375
  Google Scholar
• 97. Weinbauer M.G.: Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiol.Rev., 2004; 28: 127-181
  Google Scholar
• 98. Yurewicz E.C., Ghalambor M. A., Duckworth D.H., Heath E.C.:Catalytic and molecular properties of a phage-induced capsularpolysaccharide depolymerase. J. Biol. Chem., 1971; 246: 5607-5616
  Google Scholar
• 99. Zhang Y., Hu Z.: Combined treatment of Pseudomonas aeruginosabiofilms with bacteriophages and chlorine. Biotechnol. Bioeng.,2013; 110: 286-295
  Google Scholar

Pełna treść artykułu