Abstrakt

Ponad połowa światowej populacji ludzi jest zakażona Helicobacter pylori (H. pylori) – Gram-ujemną bakterią, będącą przyczyną rozwoju wrzodów żołądka i dwunastnicy, a także jednym z istotnych czynników w etiopatogenezie raka żołądka. H. pylori występuje głównie w formie pałeczkowatej, która w zależności od liczby skrętów może przyjmować postać spiralną lub S-kształtną. Formy pałeczkowate H. pylori są głównie izolowane z bioptatów błony śluzowej żołądka lub dwunastnicy oraz ze świeżych hodowli prowadzonych na podłożach bakteriologicznych. Badania z użyciem mikroskopu elektronowego wykazały, że kilkudniowe hodowle H. pylori, oprócz klasycznych form pałeczkowatych, zawierają kuliste postacie ziarniakowate. Dalsze badania pozwoliły dokonać podziału form ziarniakowatych H. pylori na dwa podtypy: postać żywą, lecz nie hodowalną, tzw. VBnC (viable but non culturable) oraz formę degeneratywną, prawdopodobnie będącą przejawem śmierci komórki bakteryjnej. Transformacja formy spiralnej do kulistej jest indukowana czynnikami szkodliwymi m.in. obecnością antybiotyków. Jednak do dziś nie wykazano rewersji formy ziarniakowatej do żywej, zakaźnej formy pałeczkowatej. Udowodniono natomiast, że postać kokoidalna jest formą dominującą w biofilmach jedno- lub wielogatunkowych tworzonych z udziałem H. pylori. Nie wszystkie formy morfologiczne H. pylori charakteryzują się tym samym repertuarem antygenowym, właściwościami immunomodulującymi czy zakaźnymi, a różnice w powyższych właściwościach pozwalają na określenie typów morfologicznych, które potencjalnie mogą brać udział w transmisji zakażeń wywołanych przez H. pylori. Niniejsze opracowanie ma na celu ukazanie aktualnej wiedzy na temat zróżnicowania form morfologicznych H. pylori w zakresie właściwości antygenowych i zakaźnych z uwzględnieniem ich przypuszczalnego znaczenia w epidemiologii.

Wprowadzenie

Helicobacter pylori (H. pylori) to Gram-ujemna, biegunowo urzęsiona bakteria mikroaerofilna, zasiedlająca błonę śluzową żołądka i dwunastnicy ponad połowy populacji ludzi [2,6]. Izolacja H. pylori z błony śluzowej żołądka zapoczątkowała badania, które wykazały, że drobnoustrój ten jest głównym czynnikiem etiologicznym wrzodów żołądka. Odkrywcy, a zarazem autorzy pracy potwierdzającej związek zakażeń H. pylori z występowaniem choroby wrzodowej, zostali uhonorowani w 2005 roku Nagrodą Nobla w dziedzinie medycyny i fizjologii [41]. Udowodniono również, że H. pylori jest jedynym bakteryjnym karcynogenem klasy I, który może być przyczyną gruczolakoraka oraz chłoniaka żołądka typu MALT [3].

Szacuje się, że ponad połowa populacji ludzi jest zakażona H. pylori, co plasuje tę bakterię w czołówce listy patogenów bateryjnych człowieka [10,15]. Jednak tylko u 15-20% zakażonych infekcja przeradza się w postać objawową [17,21,40]. Przyczyną zróżnicowanego przebiegu zakażenia jest z jednej strony zmienność antygenowa H. pylori, a z drugiej osobniczo determinowana odpowiedź immunologiczna makroorganizmu, dodatkowo modulowana antygenami H. pylori [29,54,56]. Początkowo przyjmowano, iż jedyną formą morfologiczną H. pylori jest postać pałeczkowata. Jednak w niedługim czasie po opublikowaniu pracy na temat powiązania zakażenia H. pylori z  chorobą wrzodową żołądka, pojawiły się doniesienia o  istnieniu formy ziarniakowatej [7]. Odkrycie postaci ziarniakowatej H. pylori zapoczątkowało dyskusję na temat jej stanu fizjologicznego, aktywności metabolicznej oraz potencjalnych właściwości zakaźnych. Kontrowersje wokół istnienia formy alternatywnej H. pylori były dodatkowo podsycane brakiem naukowo potwierdzonego środowiskowego źródła zakażenia [10]. Wydaje się, że skoro część populacji ludzkiej jest bezobjawowo skolonizowana przez H. pylori, bakterie te wraz z wydalinami (kałem) lub jak postulują niektórzy autorzy, wydzielinami (śliną) mogą trafiać do środowiska i stanowić źródło kolejnych zakażeń [10,64]. Co ciekawe, do dziś nie przedstawiono niepodważalnego dowodu na rozwój H. pylori poza naturalną niszą tych drobnoustrojów, jaką jest błona śluzowa żołądka.

Forma pałeczkowata H. pylori

Forma pałeczkowata jest dominującą postacią H. pylori najczęściej izolowaną z bioptatów żołądka osób zakażonych, a stwierdzenie obecności helikalnie skręconych pałeczek tzw. Helicobacter Like Organisms (HLO), jest jednym z etapów diagnostyki H. pylori [13,42,52,53,58]. Przeciętna pałeczka ma około 5 μm długości oraz 0,5 μm średnicy i zawiera 5-7 biegunowo umiejscowionych rzęsek [2,16]. Zróżnicowanie liczby rzęsek pozwoliło na wyróżnienie dwóch podtypów: postaci spiralnej (helikalnej), o wysokim stopniu skręcenia komórki bakteryjnej oraz pałeczkowatej (zawierającej nieliczne osie skrętu lub całkowicie ich pozbawionej), która często przyjmuje tzw. postać S-kształtną (ryc. 1) [19,59].

Komórka otoczona jest typową dla bakterii Gram- -ujemnych ścianą, składającą się z błon: zewnętrznej i  wewnętrznej, przedzielonych przestrzenią periplazmatyczną. Struktura peptydoglikanu (PG) H. pylori jest mniej skomplikowana niż u innych bakterii Gram-ujemnych. Charakterystyczny dla H. pylori skład PG prawdopodobnie determinuje helikalną morfologię tej bakterii [6,22]. Przypuszcza się, że skręcenie komórki bakteryjnej jest związane ze zmniejszoną liczbą krzyżowych wiązań peptydowych w warstwie PG. W celu przystosowania się do warunków środowiska pałeczki H. pylori modyfikują skład peptydoglikanu [14]. W proces ten zaangażowane są m.in. endonukleazy oraz białko HP 0506. Peptydoglikan H. pylori zawiera liczne muropeptydy zakończone pięciopeptydowymi łańcuchami, zbudowanymi z kwasu (1–6)-anhydro-N-acetylomuramidowego i  glicyny. Ponadto peptydoglikan H. pylori jest pozbawiony cząsteczek typowych dla mureiny innych bakterii Gram-ujemnych, tj. trimerycznych i (L-D)-krzyżowo związanych muropeptydów [14,19]. Spiralny kształt pełni główną rolę w ruchliwości bakterii, która jest uznawana za czynnik patogenności pozwalający na przetrwanie H. pylori w zmieniającym się środowisku żołądka [14]. Mutanty pozbawione skrętów mają ograniczoną zdolność kolonizacji błony śluzowej żołądka. Przypuszcza się również, że morfologia formy spiralnej może mieć wpływ na rozmieszczenie białek zewnątrzbłonowych, co w przypadku adhezyn może wpływać na skuteczność przylegania bakterii do komórek nabłonka oraz komórek układu odpornościowego [15,17,18,39].

Ryc. 1.Zróżnicowanie form pałeczkowatych H. pylori: forma S-kształtna (z lewej strony), forma helikalna (z prawej strony) [aut. K. Rudnicka]

Skład błony komórkowej formy spiralnej H. pylori jest także unikatowy. Spośród kwasów tłuszczowych, największy odsetek stanowią kwas mirystynowy (31- 40%) i  19-węglowy kwas cyklopropanowy (20-24%). Ponadto komponentami błony komórkowej są kwasy: palmitynowy, stearynowy, linolenowy, oleinowy, β-hydroksypalmitynowy i β-hydroksystearynowy (stanowiące 12% wszystkich kwasów tłuszczowych). We frakcji fosfolipidowej dominują fosfatydyloetanoloamina, kardiolipiny, fosfatydyloglicerol oraz lipopolisacharydy (LPS) [4,8,19,43]. Formy spiralne H. pylori wytwarzają liczne białka pełniące rolę adhezyn, enzymów i toksyn. Do najważniejszych antygenów występujących na powierzchni form spiralnych H. pylori należą m.in.: enzymy (ureaza, katalaza, dysmutaza ponadtlenkowa), adhezyny (białka SabA, BabA, AlpA, AlpB), poryny (białka rodziny Hop), hemaglutyniny, flageliny oraz białka warunkujące inwazyjność, tj. toksyna wakuolizująca VacA i białka wyspy patogenności PAI (głównie CagA) [8,15,16,54].

Forma ziarniakowata H. pylori

Tworzenie form ziarniakowatych jest właściwością powszechnie występującą wśród drobnoustrojów Gram-ujemnych. Procesy te zachodzą zwykle w niesprzyjających warunkach, np. przy braku substancji odżywczych lub obecności antybiotyków w środowisku wzrostu [50,57]. Podejrzewa się, iż transformacji z formy pałeczkowatej do kokoidalnej towarzyszy utrata zdolności wzrostu na podłożach mikrobiologicznych [36,45]. Stąd, mimo wielu lat badań, środowisko naukowe nadal nie ma pewności, czy postać kokoidalną H. pylori należy zaliczyć do postaci żywych, w warunkach laboratoryjnych nie poddaje się hodowli VBnC (viable but non culturable), czy traktować je jako przejaw śmierci komórki bakteryjnej [13,37]. Dotychczasowe badania dostarczają dowodów potwierdzających zarówno pierwszą jak i drugą hipotezę [2,4,13,25,36,37,45,59].

VBnC to żywa postać bakterii niezdolna do wzrostu na znanych, klasycznych pożywkach hodowlanych, indukowana niesprzyjającymi warunkami środowiska. Co ważne, formy określane mianem VBnC, po zastosowaniu odpowiedniego induktora lub przy zmianie warunków hodowli mogą odzyskać zdolność wzrostu na podłożach sztucznych i zwykle powracają do swojej pierwotnej postaci morfologicznej. Istnienie form VBnC wykazano m.in. dla takich drobnoustrojów jak Escherichia coli, Legionella pneumophila, Vibrio vulnificus, Mycobacterium tuberculosis oraz u bakterii z rodzaju Campylobacter spp. (blisko spokrewnionych z Helicobacter) [36,50]. Właściwości form VBnC, tj. duża oporność na niesprzyjające warunki środowiska oraz zdolność konwersji do formy zakaźnej sprawiają, że rozpatruje się ich rolę w etiologii zakażeń latentnych oraz reinfekcji [50].

Formy VBnC są mniejsze od postaci natywnych, a  w  składzie ich błon komórkowych znajdują się liczne białka indukowane stresem, m.in. białka szoku cieplnego należące do grupy Hsp (heat shock protein). Ponadto zaobserwowano zmiany w budowie peptydoglikanu będące następstwem skracania łańcuchów glikanowych oraz wzrostem ilości mukopeptydów niosących kowalencyjnie związane lipoproteiny [6,19]. Do generacji form żywych, niehodowalnych dochodzi zazwyczaj w  warunkach niekorzystnych dla wzrostu drobnoustrojów. Do czynników indukujących tworzenie VBnC zalicza się m.in. długotrwałą hodowlę na podłożach płynnych lub stałych, stres oksydacyjny, niedobór substancji odżywczych, akumulację metabolitów w  środowisku wzrostu, obecność antybiotyków, jonów metali ciężkich, nagłą zmianę temperatury środowiska hodowlanego lub nawet ekspozycję na światło. Odpowiedzią bakterii na powyższe warunki stresowe jest utracenie zdolności wzrostu w postaci kolonii na podłożach sztucznych, nawet przy zachowaniu ich żywotności [4,7].

Zróżnicowanie i powstawanie form ziarniakowatych H. pylori

Istnienie form VBnC H. pylori nadal pozostaje w sferze przypuszczeń. Zgodnie z definicją, postać ta powinna spełniać warunek żywotności i mieć zdolność ponownej konwersji do formy pierwotnej, co w przypadku H. pylori nadal nie zostało jednoznacznie potwierdzone [2,4,7,11,13,45,50].

Podobnie jak w przypadku innych gatunków bakterii Gram-ujemnych, formy kokoidalne H. pylori są często izolowane z kilkudniowych hodowli prowadzonych na podłożach stałych lub płynnych. Ich obecność wykazano już w trzecim dniu hodowli. Natomiast odsetek form kokoidalnych w 7-dniowej hodowli osiąga nawet 99% [2,20,52]. Czynnikami inicjującymi transformację formy spiralnej H. pylori do ziarniakowatej są: pH środowiska, temperatura lub obecność antybiotyków w  pożywkach. Ostatni z  wymienionych czynników może tłumaczyć intensywne tworzenie form kokoidalnych H. pylori na podłożach referencyjnych ze względu na obecność suplementu Skirrow zawierającego zestaw antybiotyków hamujących wzrost mikroflory towarzyszącej zanieczyszczającej wycinki błony śluzowej żołądka pobierane podczas zabiegu gastroskopii [50]. Proces przekształcania pałeczek H. pylori w postać ziarniakowatą został dobrze udokumentowany zdjęciami z  elektronowego mikroskopu transmisyjnego [4,16] (ryc. 2). W pierwszym etapie transformacji na jednym z biegunów komórki, powstaje pęcherzyk wewnątrzkomórkowy wypełniony materiałem o większej gęstości elektronowej (ryc. 2a). Struktura ta zaczyna się rozrastać, co powoduje stopniowe wyginanie się komórki. Postępująca transformacja skutkuje utworzeniem tzw. komórek U-kształtnych (ryc. 2b), z których następnie tworzone są formy ziarniakowate (ryc. 2d). W  przebiegu transformacji formy U-kształtnej do ziarniakowatej, może powstawać postać tzw. donatshaped, czyli przypominająca obwarzanek forma połączonej biegunami pałeczki [59] (ryc. 2g). Należy nadmienić, że konwersja formy pałeczkowatej do postaci U-kształtnej lub formy L jest dwukierunkowa [31,66]. Transformacji morfologicznej towarzyszy wiele zmian wewnątrzkomórkowych. Nowo powstała postać sferyczna ma integralny system błon komórkowych i nienaruszoną ścianę komórkową oraz wykazuje obecność organelli i ziarnistości cytoplazmatycznych. Wraz z przedłużającą się hodowlą ich powierzchnia ulega pofałdowaniu, a ziarnistości wewnątrzkomórkowe zanikają. Następnie konsystencja cytoplazmy staje się jednolita, dochodzi do rozpadu organelli, utraty ciągłości błony komórkowej i postępującej wakuolizacji [6,59] (ryc. 2e). Przypuszczalnie są to oznaki obumierania żywej formy VBnC i jej przekształcania w postać degeneratywną (resztkową). Ostatecznym etapem w cyklu transformacji pałeczek do form kokoidalnych, początkowo żywych, a następnie degeneratywnych, jest śmierć komórki bakteryjnej (ryc. 2f, h). Cellini i wsp. dowiedli, że większość komórek kokoidalnych oraz nieliczne formy spiralne obumierają w wyniku apoptozy [13]. Sato i wsp. na podstawie obserwacji z użyciem mikroskopu elektronowego, proponują podział form kokoidalnch H. pylori na dwa podtypy: A (odpowiednik żywych form sferycznych) oraz B (odpowiednik form degeneratywnych) [59].

Ryc. 2.Przypuszczalne przemiany form morfologicznych H. pylori. Postać pałeczkowata (S-kształtna) może obumierać nie zmieniając się morfologicznie (a). Pierwszym etapem transformacji do formy ziarniakowatej jest utworzenie pęcherzyka na jednym z biegunów komórki (b), następnie pałeczka wygina się w kształt litery U (c) lub przyjmuje postać kokoidalną (d). Obumieranie zarówno postaci U-kształtnej, jak i ziarniakowatej może prowadzić do utworzenia formy degeneratywnej (resztkowej) (h,f). Procesowi obumierania komórki w formie kokoidalnej często towarzyszy silna wakuolizacją (g) [aut. K. Rudnicka]

Podobnie jak w  przypadku form helikalnych, istnienie postaci kokoidalnej jest determinowane procesami rearanżacji peptydoglikanu [8,19]. Transformacji towarzyszy ponadto nadekspresja genu kodującego białko Hp0506 oraz jedna z hydrolaz peptydoglikanu – produkt genu amiA. H. pylori z mutacją genu amiA ma ograniczoną zdolność transformacji do formy ziarniakowatej [14,19]. Niektórzy autorzy postulują istnienie tzw. form L H. pylori. Jest to postać indukowana głównie antybiotykami ingerującymi w syntezę peptydoglikanu. Osłabienie struktury PG prowadzi do deformacji komórki, która w efekcie wygina się w kształt litery L.

Żywotność i właściwości antygenowe form ziarniakowatych H. pylori

Kontrowersje związane z żywotnością form kokoidalnych H. pylori są wynikiem braku niepodważalnych dowodów potwierdzających ich aktywność metaboliczną. Dotychczas nie udało się przeprowadzić transformacji formy kokoidalnej w pałeczkowatą charakteryzującą się inwazyjnością, podczas gdy wielokrotnie wykazano możliwość konwersji postaci spiralnej do ziarniakowatej [4,6,7,19,58,59]. Trudność ze zbadaniem czy transformacja ta jest dwukierunkowa, wiąże się z dużym prawdopodobieństwem, iż w puli form kokoidalnych wygenerowanych do celów doświadczenia, znajdują się także pozostałości form spiralnych, które nie uległy konwersji morfologicznej [50,65]. Wyniki uzyskane przez dwie niezależne grupy badawcze wydają się wspierać tezę o odwracalności transformacji. W obu przypadkach, zastosowanie stosunkowo bogatych płynnych podłóż pozwalało, z materiału zawierającego >99% form ziarniakowatych po 7 dniach inkubacji, uzyskać hodowlę składającą się głównie z form spiralnych oraz licznych form resztkowych [2,45,58,59]. Nie można jednak wykluczyć, że uzyskana w  ten sposób populacja wywodzi się z kilku komórek spiralnych, które nie uległy konwersji do stanu kokoidalnego.

Odpowiedź na pytanie, czy istnienie formy kokoidalnej H. pylori jest sposobem na przetrwanie bakterii poza ustrojem człowieka, jest podstawą zrozumienia epidemiologii i  poznania potencjalnych środowiskowych rezerwuarów tego patogenu. W naturze zdolne do namnażania się pałeczki H. pylori wykrywane są wyłącznie w niszy kolonizacyjnej jaką jest błona śluzowa żołądka. Wysunięto hipotezę zakładającą, że bakterie opuszczające swoje naturalne środowisko są narażone na szkodliwe czynniki chemiczne i fizyczne, które indukują powstanie form ziarniakowatych. Jeśli rzeczywiście formy kokoidalne umożliwiają bakteriom przetrwanie w niesprzyjających warunkach, to zmiany morfologiczne prowadzące do utworzenia tej postaci są procesem celowym, wymagającym nakładu energii. Jeśli tak, to konwersja morfologiczna powinna wymagać aktywnego procesu transkrypcji i translacji prowadzącego do utworzenia białek swoistych dla form kokoidalnych. Jednak, transformacji towarzyszy utrata zdolności wzrostu na podłożach bakteriologicznych, stąd w badaniach nad żywotnością form kokoidalnych stosuje się metody alternatywne, polegające na pośrednim wykazaniu żywotności bakterii na podstawie: procesu syntezy białek, zawartości i integralności kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) oraz rybonukleinowego (RNA), aktywności enzymatycznej, obecności swoistych antygenów lub kodujących je genów, zdolności do infekowania zwierząt laboratoryjnych oraz wzbudzania odpowiedzi immunologicznej. Techniką najczęściej stosowaną w identyfikacji form kokoidalnych jest metoda reakcji łańcuchowej polimerazy-PCR (polimeraze chain reaction) i jej modyfikacje. Genami swoistymi dla H. pylori, znajdującymi zastosowanie w detekcji tych bakterii są m.in. chromosomalna sekwencja 16S rRNA, geny kodujące podjednostki A i C ureazy oraz białka CagA i VacA [12,14,38,46,62].

Badania nad transformacją form morfologicznych H. pylori pozwoliły ustalić dynamikę powstawania form kokoidalnych. W zależności od typu hodowli (płynna, stała), składu podłoża oraz warunków hodowli, formy kokoidalne pojawiają się w różnym czasie. Sisto i wsp. wykazali, że formy ziarniakowate zachowują zdolność do wzrostu na podłożach płynnych nawet po 4-tygodniowej hodowli w temperaturze 37oC, w warunkach mikroaerofilnych. Ich żywotność została potwierdzona wzrostem na podłożach stałych oraz jego zahamowaniem pod wpływem erytromycyny zaburzającej syntezę białek i metronidazolu powodującego zmiany w DNA. Formy kokoidalne były natomiast oporne na amoksycylinę ingerującą w  proces syntezy peptydoglikanu oraz podziały komórkowe. Udowodniono w  ten sposób nie tylko żywotność form kokoidalnych, ale obecność niezdegradowanego RNA oraz DNA tych bakterii [62]. Wyniki uzyskane z użyciem ilościowej metody PCR połączonej ze znakowaniem monoazydkiem propidyny (PMA-qPCR) wskazują natomiast, że wraz ze wzrostem odsetka form kokoidalnych spada liczba żywych komórek bakteryjnych. Technika ta umożliwia ilościową ocenę kopii określonych genów wyłącznie w komórkach martwych, których błona komórkowa uległa dezintegracji [25].

Analiza porównawcza form spiralnych i ziarniakowatych pozwoliła na wskazanie cech charakterystycznych dla każdej z trzech podstawowych form morfologicznych H. pylori (tabela 1). Wang i wsp. wykazali, że genomy obu postaci zawierały niezmienioną sekwencję kodującą białko CagA. Ponadto struktura DNA formy ziarniakowatej pozostawała nienaruszona, a zawartość kwasów nukleinowych porównywalna do tej, która jest obserwowana u postaci spiralnej. W  przypadku obu form wykazano aktywny proces syntezy białek [67]. Podobne wyniki uzyskali Sisto i wsp., którzy wykazali, że nawet po 31-dniowej hodowli H. pylori zarówno DNA, jak i RNA form kokoidalnych pozostają nienaruszone, a geny dla ureazy i białka CagA nadal ulegają ekspresji [62]. Jednak analiza zawartości DNA w formach spiralnych, w porównaniu do kokoidalnych, ujawniła zauważalny spadek DNA odpowiednio z 2,5 kopii genomu/komórkę do 0,23- 0,001 kopii przypadającej na jedną komórkę kokoidalną (w  zależności od warunków hodowli) [48]. Zarówno ilościowa analiza zawartości kwasów nukleinowych, jak i klasyczna metoda PCR pozwalają na stwierdzenie obecności genomu lub genów bakteryjnych, jednak nie pozwalają na ocenę żywotności bakterii [44]. Okres pół- trwania bakteryjnego mRNA wynosi 2-3 min. Po tym czasie cząsteczki mRNA są degradowane przez enzymy wewnątrzkomórkowe. Stąd wykazanie obecności nienaruszonych transkryptów UreA, UreI, CagA oraz HspA, zarówno po 10 jak i 21 dniach hodowli na podłożu stałym sugeruje zachowanie aktywności metabolicznej form kokoidalnych. Inni autorzy wykazali obecność nieuszkodzonych genów kodujących podjednostki UreA i białko CagA w formach kokoidalnych uzyskanych z 31-dniowej hodowli płynnej [46,62].

Analiza profilu antygenowego przeprowadzona z zastosowaniem elektroforezy SDS-PAGE i metody Trans blot ujawniła, że podczas konwersji do stanu kokoidalnego zmianie podlega ponad połowa antygenów H. pylori. Transformacji do formy ziarniakowatej towarzyszy ponadto utrata ekspresji poryn i adhezyn [8,39]. Mizoguchi i wsp. udowodnili związek między składem profilu białkowego form kokoidalnych a rodzajem czynnika użytego do indukcji procesu transformacji [45]. W zależności od czasu hodowli (20 lub 100 dni), pH środowiska (kwaśnego lub obojętnego) oraz podłoża (fizjologiczny roztwór soli lub woda destylowana) badacze uzyskiwali różne profile białkowe H. pylori. Co więcej, formy ziarniakowate po stu dniach przetrzymywania w wodzie destylowanej wykazały ekspresję białek na wyższym poziomie niż te inkubowane w fizjologicznym roztworze chlorku sodu [35,45]. Bumann i wsp. z użyciem elektroforezy dwukierunkowej przeprowadzili analizę porównawczą profili antygenowych dwóch postaci H. pylori. Spośród 1500 białek syntetyzowanych w obu typach morfologicznych wyselekcjonowano dwa nieulegające ekspresji w komórkach kokoidalnych: toksynę wakuolizująca VacA i proteinazę serynową HtrA. Autorzy sugerują, że białka wykrywane w formach kokoidalnych nie były identyczne z obecnymi w pałeczkach H. pylori. Uznano, że różnice te mogą świadczyć o zmianach potranslacyjnych zachodzących podczas konwersji [9]. Shahamat i wsp. badając reaktywność antygenów różnych form H. pylori z surowicami osób zakażonych tymi bakteriami dowiedli, że inkubacja powyższych surowic z antygenami form ziarniakowatych H. pylori nie pozwoliła na wyabsorbowanie przeciwciał, podczas gdy kompleksy antygen – przeciwciało powstawały w surowicach inkubowanych z mieszaninami antygenów pochodzących z form spiralnych. Powyższe wyniki wskazują na istnienie istotnych różnic w składzie antygenowym form ziarniakowatych i spiralnych H. pylori [60].

Ruchliwość H. pylori jest determinowana nie tylko przez helikalny kształt bakterii, ale także przez obecność rzę- sek. Mimo obniżenia lub utraty ekspresji licznych białek, formy ziarniakowate są zaopatrzone w struktury determinujące adhezję i ruch. Badania She i wsp. z użyciem mikroskopu elektronowego wykazały obecność rzęsek nie tylko u form pałeczkowatych, ale również na powierzchni komórek ziarniakowatych H. pylori [61]. Ponadto Couturier i wsp. zaobserwowali, że wraz z upływem czasu hodowli i zwiększającym się udziałem komórek kokoidalnych w populacji drobnoustrojów wzrasta liczba filamentów. Struktury te osiągają długość 59 µm i powodują agregację form kokoidalnych. Molekularną podstawą efektu agregacji może być zmiana w  eksponowanych na powierzchni strukturach cukrowych [20]. Khin i wsp. wykazali zróżnicowaną intensywność agregacji form kokoidalnych H. pylori zależną od liczby wiązań cukrowych występujących w oligosacharydach ściany komórkowej, przy czym w  interakcjach tych główną rolę odgrywały reszty fukozy, mannozy i N-acetyloglukozaminy [34].

Skróty: b. d.-brak danych; CagA-antygen związany z cytotoksyną; DNA-kwas dezoksyrybonukleinowy; IL-interleukina; RNA-kwas rybonukleinowy; UreA/Bpodjednostki ureazy; VacA-toksyna wakuolizująca

Właściwości zakaźne i immunomodulacyjne form kokoidalnych H. pylori

Obecność pałeczek H. pylori w organizmie nie jest warunkiem wystarczającym do wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej oraz wywołania zmian patologicznych. Niezbędna jest ekspresja czynników wirulencji m.in. ureazy, białek CagA i VacA oraz podstawowych adhezyn (BabA i SabA) umożliwiających przyleganie bakterii do komórek nabłonkowych żołądka i warunkujących interakcje z komórkami immunokompetentnymi gospodarza [16,17]. Formy kokoidalne nie wykazują ekspresji wielu antygenów, tj. VacA, niektórych adhezyn i poryn. Jednak wytwarzanie białka CagA, obecność rzęsek, filamentów oraz aktywność ureolityczna mogą wskazywać na zachowanie właściwości zakaźnych tych form drobnoustrojów [8,20,39]. Ponadto formy kokoidalne nie są wyłącznie izolowane z długoterminowych hodowli, ale także z bioptatów błony śluzowej żołądka osób zakażonych oraz zwierząt laboratoryjnych doświadczalnie zakażanych H. pylori [42,49].

Jednym z pierwszych etapów zakażenia jest adhezja bakterii do komórek gospodarza. Formy pałeczkowate dysponują różnorodnymi adhezynami umożliwiającymi ten proces [15,17]. Adhezyny obecne na powierzchni form kokoidalnych nie zostały jeszcze scharakteryzowane, jednak wiadomo, że ta postać bakterii wykazuje zdolność przylegania zarówno do powierzchni abiotycznych, jak i biotycznych [5,14,61,65,68]. Formy kokoidalne zachowują rzęski, aktywność ureolityczną oraz zdolność przylegania do komórek nabłonkowych. Stopień adhezji form kokoidalnych do komórek linii Hep-2 był dwukrotnie mniejszy w porównaniu do form pałeczkowatych, jednak ponad 30% komórek ziarniakowatych aktywnie przylegało do ich powierzchni [61]. Vijayakumari i wsp. potwierdzili przyleganie postaci kokoidalnych do komórek linii Kato III [65]. Badania z użyciem komórek nabłonkowych żołądka GES-1 wykazały, że formy kokoidalne mają zbliżone właściwości adhezji oraz ograniczoną zdolność do indukowania apoptozy, podczas gdy formy spiralne indukują zarówno apoptozę komórek nabłonkowych, jak i autofagię makrofagów [55,68]. Formy kokoidalne stymulowały limfocyty do wytwarzania IL-18 oraz surwiwiny, natomiast formy spiralne silniej wzbudzały ekspresję receptora TLR5 oraz wytwarzanie regulatorowej IL-17.

Jednym z głównych objawów aktywnego zakażenia H. pylori jest rekrutacja komórek odpornościowych do błony śluzowej żołądka. W proces ten zaangażowany jest jeden z  mediatorów wczesnej reakcji zapalnej – IL-8 [15,16,17]. Cole i wsp. porównali wytwarzanie IL-8 w odpowiedzi na formy spiralne i kokoidalne H. pylori [18]. Komórki nabłonkowe w obecności form kokoidalnych nie wydzielały IL-8 lub wytwarzały tę cytokinę na znacznie niższym poziomie niż w  odpowiedzi na formy spiralne H. pylori. Natomiast w badaniach z użyciem linii komórek AGS wykazano, że formy kokoidalne indukowały wytwarzanie IL-8 i że proces ten był hamowany mutacją w genie amiA [68].

Jisong i  wsp. wykazali, że po tygodniu od zakażenia myszy spiralnymi postaciami H. pylori w błonie śluzowej żołądka pojawiały się formy kokoidalne tej bakterii. Podobne obserwacje poczyniono w  przypadku bioptatów błon śluzowych żołądka osób z  przewlekłym zakażeniem H. pylori. W celu zbadania, czy obecność form kokoidalnych jest spowodowana śmiercią komórek bakteryjnych, czy też są to w pełni zakaźne formy H. pylori, przeprowadzono badania na modelach zwierzęcych. Wyniki doświadczeń przeprowadzonych na gnotobiotycznych, sterylnych prosiętach (germ- -free) wykluczyły zdolność zakażania i wywoływania reakcji zapalnej przez kokoidalne formy H. pylori [23]. Kolonizację tkanek stwierdzono u wszystkich osobników w grupie zwierząt zakażanych formami spiralnymi i u żadnego zwierzęcia z grupy zakażanej formami ziarniakowatymi. Przeciwciała IgM i  IgA anty-H. pylori wykryto wyłącznie w surowicach zwierząt zakażanych formami pałeczkowatymi H. pylori. Inokulum form kokoidalnych H. pylori, zastosowane do zakażenia prosiąt, zawierało prawie dwadzieścia razy więcej drobnoustrojów niż minimalna dawka form pałeczkowatych wywołująca objawy zakażenia, a mimo to nie stwierdzono kolonizacji tkanek gospodarza [23,24]. Badania przeprowadzone na modelu mysim przyniosły odmienne wyniki. Kolonizację tkanek i zapalenie błony śluzowej żołądka stwierdzono u wszystkich zwierząt zakażonych postacią pałeczkowatą oraz u połowy zwierząt zakażanych formami kokoidalnymi, przy czym forma ziarniakowata indukowała zapalenie o  słabym nasileniu, podczas gdy pałeczki H. pylori wzbudzały ostrą reakcję zapalną [11,61]. Z badań Wanga i wsp. wynika, że formy kokoidalne podobnie jak spiralne mają zdolność zakażania myszy BALB/c i wzbudzają ostrą reakcję zapalną [66]. Pomimo obniżonej aktywności form kokoidalnych H. pylori w zakresie wzbudzania stanu zapalnego, w ponad połowie (68,8%) próbek bioptatów błon śluzowych żołądka pobranych od myszy zakażonych formami ziarniakowatymi obserwowano kolonizację tkanek. Co więcej, z bioptatów żołądka pochodzących od zwierząt zakażonych formami kokoidalnymi izolowano postacie spiralne, co wskazywało na odwracalność procesu transformacji [66]. Wyniki badań Wanga i wsp, pozostają w zgodzie z obserwacjami She’a i wsp., którzy na 30 dni po zakażeniu myszy formami kokoidalnymi w bioptatach żołądka stwierdzili zmiany patologiczne błony śluzowej, tj. napływ komórek zapalnych oraz obecność form spiralnych [61].

Z  przytoczonych badań wynika, że formy kokoidalne wykazują słabsze właściwości immunomodulacyjne. Zakładając, że postać kokoidalna jest pewnego rodzaju formą „spoczynkową” H. pylori, brak indukcji reakcji zapalnej potwierdza jedynie ich funkcję, która sprowadzałaby się jedynie do przetrwania w organizmie gospodarza.

Biofilm Helicobacter pylori

Zgodnie z definicją, biofilm stanowi społeczność drobnoustrojów przytwierdzonych do powierzchni stałej (biotycznej lub abiotycznej), pokrytych zewnątrzkomórkową substancją polimerową tzw. EPS (extracellular polimer substance), komunikujących się za pomocą cząsteczek zewnątrzkomórkowych [57]. Podobnie jak większość drobnoustrojów patogennych, H. pylori wykazuje zdolność do tworzenia biofilmu [2,27,28,33,38,50,69]. Etapem rozpoczynającym formowanie tej struktury jest proces adhezji. Wykazano, że H. pylori ma zdolność przylegania nie tylko do powierzchni biotycznych (komórki Kato III, komórki GES-1), ale i abiotycznych (stal nierdzewna, szkło, polichlorek winylu) [5,61,67]. Azavedo i wsp. wykazali, że zarówno formy sferyczne, jak i pałeczki H. pylori przylegają do powierzchni abiotycznych, przy czym adhezja do szkła i polichlorku winylu była silniejsza w  porównaniu do powierzchni miedzianych czy żelaza [5]. Ocena dynamiki powstawania i analiza składu biofilmu H. pylori wymagała ustalenia specjalnego modelu badawczego polegającego na prowadzeniu hodowli w podłożu płynnym i generacji biofilmu na granicy faz. Wykazano, iż w składzie kilkudniowego biofilmu H. pylori początkowo dominowały formy spiralne następnie, po tygodniu struktura przyjmowała charakter mieszany (formy spiralne i ziarniakowate), a ostatecznie w dojrzałym, dwutygodniowym biofilmie występowały wyłącznie formy kokoidalne [2,69]. EPS wchodzący w skład biofilmu H. pylori zawiera głównie cząsteczki proteomannanu, a także silnie usieciowaną mannozę i alfa-(1,4)-glikan. Yang i wsp. sugerowali, że większość oligosacharydów biofilmu pochodzi z lipopolisacharydu H. pylori [69]. Ponadto w komórkach bakteryjnych budujących biofilm stwierdzono podwyższoną ekspresję białek syntetyzowanych w warunkach stresowych, w tym ureazy, białek Hsp60, peroksyreduktazy, ferrytyny i katalazy. Ci sami autorzy wykazali, że delecja genów luxS i cagE wzmagała tworzenie biofilmu H. pylori. Natomiast usunięcie genu napA skutkowało zahamowaniem procesu adhezji i agregacji komórek, przez co utworzony biofilm stawał się mniej spójny [2,27]. Poza wielkocząsteczkowymi substancjami cukrowymi biofilm H. pylori zawiera zewnątrzkomórkowe cząsteczki DNA. Nie pełnią one jednak funkcji strukturalnych. Traktowanie biofilmu H. pylori DNA-azami nie prowadziło do obniżenia jego kondycji, struktury ani żywotności [27,28]. Podejrzewa się, że DNA może być uwalniane przez formy kokoidalne w postaci pęcherzyków zewnątrzbłonowych OMV (outer membrane viscles). Zjawisko to może się przyczyniać do zwiększenia różnorodności genetycznej populacji [70]. Dowiedziono bowiem, że procesy transformacji, koniugacji lub uwalniania DNA prowadzi do stabilizacji struktury populacyjnej i trwałości biofilmu [27]. Badania z użyciem dwóch różnych szczepów H. pylori pozwalają sugerować, że utworzone przez nie biofilmy mieszane były bardziej stabilne, wykazywały większe zróżnicowanie antygenowe oraz zawierały więcej EPS, w porównaniu do biofilmów wyprowadzonych z jednego szczepu bakterii. H. pylori mogą stanowić także element biofilmu wielogatunkowego tworzonego z udziałem takich bakterii jak: Brevunolimonas spp., Mycobacterium chelonae, Sphingomonas spp., Legionella pneumophila [12,26,63]. Wykazano również współistnienie H. pylori w strukturach zasiedlanych przez ameby z rodzaju Acanthamoeba. Udowodniono, że w obecności tych ostatnich, biofilm H. pylori tworzony był szybciej i skuteczniej, co pozwala sugerować, że ameby mogą stanowić potencjalny środowiskowy rezerwuar H. pylori. Nie ma jednak danych świadczących o bezpośrednim wpływie obecności ameb na zwiększenie transmisji H. pylori [33].

Zdolność do tworzenia biofilmów jest właściwością wielu patogenów oportunistycznych i stanowi rodzaj czynnika patogenności, który ułatwia przetrwanie w niesprzyjającym środowisku, wymianę materiału genetycznego oraz wzmocnienie struktury populacyjnej bakterii. W kontekście przeżywalności H. pylori w postaci VBnC jak i biofilmu tworzonego na powierzchniach abiotycznych, woda pitna może być rozpatrywana jako potencjalny rezerwuar tych bakterii i  ważne zagrożenie epidemiologiczne przyczyniające się do rozprzestrzeniania H. pylori [1,10,32,47].

Podsumowanie

Praca jest przeglądem aktualnych doniesień na temat różnorodności, żywotności i dynamiki powstawania form morfologicznych H. pylori. Jak dotąd, mimo znajomości dróg transmisji i rozprzestrzeniania się, a także rezerwuarów H. pylori nadal nie udokumentowano obecności żywych, w pełni zakaźnych form tych bakterii w wodzie pitnej, która od wielu lat jest rozpatrywana jako przypuszczalny rezerwuar środowiskowy H. pylori. W ostatnich latach nastąpił jednak znaczny postęp w badaniach źródeł zakażenia H. pylori, z uwzględnieniem środowiska wodnego. Udział H. pylori w tworzeniu biofilmów oraz występowanie form VBnC należy uznać za ważne czynniki wirulencji, przyczyniające się do przeżycia i rozprzestrzeniania bakterii w środowisku. Formy kokoidalne typu VBnC są pozbawione części antygenów, jednak wykazują ekspresję licznych, istotnych czynników zakaźnych, które mogą wzbudzać reakcję zapalną oraz – zgodnie z badaniami przeprowadzonymi na modelach zwierzęcych, mogą wywoływać zmiany patologiczne w błonie śluzowej zwierząt, a także ulegać ponownej konwersji do pierwotnej formy pałeczkowatej. Odniesiono się do wyników badań poddających w wątpliwość oraz potwierdzających żywotność i  zdolności zakaźne alternatywnych form morfologicznych H. pylori. Podsumowano prace analizujące różnice w profilach antygenowych dwóch podstawowych postaci H. pylori. Praca zaopatrzona jest w autorskie ryciny obrazujące koncepcje m.in. Andersena i Celliniego, zgodnie z którą formy morfologiczne H. pylori stanowią poszczególne stadia rozwoju tych bakterii. Należy oczekiwać, iż dalsze badania wkrótce wskażą etap, na którym stadia te tracą żywotność i właściwości zakaźne, a także wyjaśnią czy ich przeżywanie w wodzie pitnej w formie VBnC oraz biofilmach środowiskowych stanowi zagrożenie epidemiologiczne i przyczynia się do rozprzestrzeniania H. pylori.

Przypisy

• 1. Ahmed K.S., Khan A.A., Ahmed I., Tiwari S.K., Habeeb A., Ahi J.D.,Abid Z., Ahmed N., Habibullah C.M.: Impact of household hygieneand water source on the prevalence and transmission of Helicobacterpylori: a South Indian perspective. Singapore Med. J., 2007; 48:543-549
  Google Scholar
• 2. Andersen L.P., Rasmussen L.: Helicobacter pylori-coccoid forms andbiofilm formation. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2009; 56: 112-115
  Google Scholar
• 3. Anonymous: Live flukes and Helicobacter pylori. IARC Working Groupon the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Lyon, 7-14June 1994. IARC Monogr. Eval. Carcinog. Risks Hum., 1994; 61: 1-241
  Google Scholar
• 4. Azevedo N.F., Almeida C., Cerqueira L., Dias S., Keevil C.W., VieiraM.J.: Coccoid form of Helicobacter pylori as a morphological manifestationof cell adaptation to the environment. Appl. Environ.Microbiol., 2007; 73: 3423-3427
  Google Scholar
• 5. Azevedo N.F., Pacheco A.P., Keevil C.W., Vieira M.J.: Adhesion ofwater stressed Helicobacter pylori to abiotic surfaces. J. Appl. Microbiol.,2006; 101: 718-724
  Google Scholar
• 6. Benaissa M., Babin P., Quellard N., Pezennec L., Cenatiempo Y.,Fauchere J.L.: Changes in Helicobacter pylori ultrastructure and antigensduring conversion from the bacillary to the coccoid form.Infect. Immun., 1996; 64: 2331-2335
  Google Scholar
• 7. Bode G., Mauch F., Malfertheiner P.: The coccoid forms of Helicobacterpylori. Criteria for their viability. Epidemiol. Infect., 1993;111: 483-490
  Google Scholar
• 8. Bumann D., Aksu S., Wendland M., Janek K., Zimny-Arndt U., SabarthN., Meyer T.F., Jungblut P.R.: Proteome analysis of secreted proteins ofthe gastrin patogen Helicobacter pylori. Infect. Immun., 2002; 70: 3396-3403
  Google Scholar
• 9. Bumann D., Habibi H., Kan B., Schmid M., Goosmann C., BrinkmannV., Meyer T.F., Jungblut P.R.: Lack of stage-specific proteins incoccoid Helicobacter pylori cells. Infect. Immun., 2004; 72: 6738-6742
  Google Scholar
• 10. Cave D.R.: How is Helicobacter pylori transmitted? Gastroenterology,1997; 113: S9-S14
  Google Scholar
• 11. Cellini L., Allocati N., Angelucci D., Lezzi T., Di Campli E., MarzioL., Dainelli B.: Coccoid Helicobacter pylori not culturable in vitro revertsin mice. Microbiol. Immunol., 1994; 38: 843-850
  Google Scholar
• 12. Cellini L., Grande R., Di Campli E., Di Bartolomeo S., Di GiulioM., Traini T., Trubiani O.: Characeterization of an Helicobacter pylorienvironmental strain. J Appl. Microbiol., 2008; 105: 761-769
  Google Scholar
• 13. Cellini L., Robuffo I., Maraldi N.M., Donelli G.: Searching the pointof no return in Helicobacter pylori life: necrosis and/or programmedcell death? J. Appl. Microbiol., 2001; 90: 727-732
  Google Scholar
• 14. Chaput C., Ecobichon C., Cayet N., Girardin S.E., Werts C., GuadagniniS., Prevost M.C., Mengin-Lecreulx D., Labigne A. Boneca I.G.:Role of amiA in the morphological transition of Helicobacter pyloriand in immune escape. PLoS Pathog., 2006; 2: e97
  Google Scholar
• 15. Chmiela M., Czkwianianc E., Wadstrom T., Rudnicka W.: Role ofHelicobacter pylori surface structures in bacterial interaction withmacrophages. Gut, 1997; 40: 20-24
  Google Scholar
• 16. Chmiela M., Michetti P.: Inflammation, immunity, vaccines forHelicobacter infection. Helicobacter, 2006; 11 (Suppl. 1): 21-26
  Google Scholar
• 17. Chmiela M., Wiśniewska M., Bąk-Romaniszyn L., Rechciński T.,Płaneta-Małecka I., Bielański W., Konturek S.J., Płonka M., Klink M.,Rudnicka W.: Serological differentiation of Helicobacter pylori CagA(+)and CagA(-) infections. Arch. Immunol. Exp. Ther., 2003; 51: 131-136
  Google Scholar
• 18. Cole S.P., Cirillo D., Kagnoff M.F., Guiney D. G., Eckmann L.: Coccoidand spiral Helicobacter pylori differ in their abilities to adhereto gastric epithelial cells and induce interleukin-8 secretion. Infect.Immun., 1997; 65: 843-846
  Google Scholar
• 19. Costa K., Bacher G., Allmaier G., Dominguez-Bello M.G., EngstrandL. Falk P., De Pedro M., Garcia Del Portillo F.: The morphologicaltransition of Helicobacter cells from spiral to coccoid is precededby a substantial modification of the cell wall. J. Bacteriol., 1999;181: 3710-3715
  Google Scholar
• 20. Couturier M.R., Stein M.: Helicobacter pylori produces unique filamentsupon host contact in vitro. Can. J. Microbiol., 2008; 54: 537-548
  Google Scholar
• 21. Cover T., Blaser M.J.: Helicobacter pylori in health and disease.Gastroenterology, 2009; 136: 1863-1873
  Google Scholar
• 22. Dworkin J.: Form equals function? Bacterial shape and its consequencesfor pathogenesis. Mol. Microbiol., 2010; 78: 792-795
  Google Scholar
• 23. Eaton K.A., Catrenich C.E., Makin K.M., Krakowka S.: Virulenceof coccoid and bacillary forms of Helicobacter pylori in gnotobioticpiglets. J. Infect. Dis., 1995; 171: 459-462
  Google Scholar
• 24. Figueroa G., Faundez G., Troncoso M., Navarrete P., Toledo M.S.:Immunoglobulin G antibody response to infection with coccoid formsof Helicobacter pylori. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2002; 9: 1067-1071
  Google Scholar
• 25. Gemma A., Codony F., Fittipaldi M., Adrados B., Morato J.: Viabilitydetermination of Helicobacter pylori using propidium monoazidequantitive PCR. Helicobacter, 2010; 15: 473-476
  Google Scholar
• 26. Gião M.S., Azevedo N.F., Wilks S.A., Vieira M.J., Keevil C.W.: Interactionof Legionella pneumophila and Helicobacter pylori with bacterial speciesisolated from drinking water biofilms. BMC Microbiol., 2011; 11: 57
  Google Scholar
• 27. Grande R., Di Campli E., Di Bartolomeo S., Verginelli F., Di GiulioM., Baffoni M., Bessa L.J., Cellini L.: Helicobacter pylori biofilm:a protective environment for bacterial recombination. J. Appl. Microbiol.,2012; 113: 669-676
  Google Scholar
• 28. Grande R., Di Giulio M., Bessa L.J., Di Campli E., Baffoni M., GuarnieriS., Cellini L.: Extracellular DNA in Helicobacter pylori biofilm:a backstairs rumor. J. Appl. Microbiol., 2010; 110: 490-498
  Google Scholar
• 29. Grębowska A., Moran A.P., Bielański W., Matusiak A., RechcińskiT., Rudnicka K., Baranowska A., Rudnicka W., Chmiela M.: H. pylorilipopolysaccharide activity in human peripheral blood mononuclearleukocytes cultures. J. Physiol. Pharmacol., 2010; 61: 437-442
  Google Scholar
• 30. Jiesong H., Ho B., Zheng P., Yeoh K.G., Ng H.C., Lim S.G.: Coexistenceof Helicobacter pylori spiral and coccoid forms in experimentalmice. World J. Gastroenterol., 1998; 4: 485-488
  Google Scholar
• 31. Joseleau-Petit D., Liebart J.C., Ayala J.A., D’Ari R.: Unstable Escherichiacoli L-forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis.J. Bacteriol., 2007; 189: 6512-6520
  Google Scholar
• 32. Karita M., Teramukai S., Matsumoto S.: Risk of Helicobacter pyloritransmission from drinking well water is higher than that from infectedintrafamilial members in Japan. Dig. Dis. Sci., 2003; 48: 1062-1067
  Google Scholar
• 33. Kawaguchi K., Matsuo J., Osaki T., Kamiya S., Yamaguchi H.:Prevalence of Helicobacter and Acanthamoeba in natural environment.Lett. Appl. Microbiol., 2009; 48: 465-471
  Google Scholar
• 34. Khin M.M., Hua J.S., Ng H.C., Wadstrom T., Bow H.: Agglutinationof Helicobacter pylori coccoids by lectins. World J. Gastroenterol.,2000; 6: 202-209
  Google Scholar
• 35. Konishi K., Sato N., Shoji E., Takeda H., Kato M., Asaka M., OoiH.K.: Helicobacter pylori: longer survival in deep ground water andsea water than in a nutrient-rich environment. APMIS, 2007; 115:1285-1291
  Google Scholar
• 36. Kurokawa M., Nukina N., Nakanishi H., Tomita S., Tamura T.,Shimoyama T.: Resuscitation from viable but nonculturable state ofHelicobacter pylori. Kansenshogaku Zasshi, 1999; 73: 15-19
  Google Scholar
• 37. Kusters J.G., Gerrits M.M., Van Strijp J.A., Vandenbroucke-GraulsC.M.: Coccoid forms of Helicobacter pylori are the morphologic manifestationof cell death. Infect. Immun., 1997; 65: 3672-3679
  Google Scholar
• 38. Linke S., Lenz J., Gemein S., Exner M., Gebel J.: Detection of Helicobacterpylori in biofilms by real-time PCR. Int. J. Hyg. Environ.Health, 2010; 213: 176-182
  Google Scholar
• 39. Liu Z.F., Chen C.Y., Tang W., Zhang J.Y., Gong Y.Q., Jia J.H.: Geneexpressionprofiles in gastric epithelial cells stimulated with spiraland coccoid Helicobacter pylori. J. Med. Microbiol., 2006; 55: 1009-1015
  Google Scholar
• 40. Łaszewicz W.: Wyniki badań nad zakażeniem Helicobacter pylori.Klinika Gastroenterologii i Chorób Wewnętrznych Akademii Medycznejw Białymstoku, Trans Humana. Białystok, 2004
  Google Scholar
• 41. Marshall, B.J., Warren, J.R.: Unidentified curved bacilli in thestomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet,1984; 16: 1311-1315
  Google Scholar
• 42. Metzger J., Styger S., Sieber C., Von Flue M., Vogelbach P., HarderF.: Prevalence of Helicobacter pylori infection in peptic ulcer perforations.Swiss Med. Wkly, 2001; 131: 99-103
  Google Scholar
• 43. Miszczyk E., Rudnicka K., Moran A.P., Fol M., Kowalewicz-KulbatM., Druszczyńska M., Matusiak A., Walencka M., Rudnicka W., ChmielaM.: Interaction of Helicobacter pylori with C-type lectin dendriticcell-specific ICAM grabbing nonintegrin. J. Biomed. Biotechnol.,2012; 2012: 206463
  Google Scholar
• 44. Mitsushige S., Wu J.Y., Abudayyeh S., Hoffman J., Brahem H., ALKhatibK., Yamaoka Y., Graham D.Y.: Unreliability of results of PCRdetection of Helicobacter pylori in clinical or environmental samples,2009; 47: 738-742
  Google Scholar
• 45. Mizoguchi H., Fujioka T., Nasu M.: Evidence for viability of coccoidforms of Helicobacter pylori. J. Gastroenterol., 1999; 34, Suppl.11: 32-36
  Google Scholar
• 46. Monstein H. J., Jonasson J.: Differential virulence-gene mRNAexpression in coccoid forms of Helicobacter pylori. Biochem. Biophys.Res. Commun., 2001; 285: 530-536
  Google Scholar
• 47. Moreno Y., Piqueres P., Alonso J.L., Jiménez A., González A., FerrúsM.A.: Survival and viability of Helicobacter pylori after inoculationinto chlorinated drinking water. Water Res., 2007; 41: 3490-3496
  Google Scholar
• 48. Narikawa S., Kawai S., Aoshima H., Kawamata O., Kawaguchi R.,Hikiji K., Kato M., Ino S., Mizushima Y.: Comparison of the nucleidacids of helical and coccoid forms of Helicobacter pylori. Clin. Diagn.Lab. Immunol., 1997; 4: 285-290
  Google Scholar
• 49. Ng B.L., Quak S.H., Aw M., Goh K.T., Ho B.: Immune responses todifferential forms of Helicobacter pylori in children with epigastricpain. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2003; 10: 866-869
  Google Scholar
• 50. Oliver J.D.: Recent findings on the viable but non culturablestate in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev., 2010; 34: 415-425
  Google Scholar
• 51. O’Toole P.W., Clyne M.: Physiology and Genetics. Cell envelopeof Helicobacter pylori. Mobley H.L.T., Mendz G.L., Hazell S.L. (red.),ASM Press. Washington, 2001
  Google Scholar
• 52. Richards C.L., Brittany J.B., Ford T.E., Broadway S.C., Pyle B.H.,Camper A.K.: Optimizing the growth of stressed Helicobacter pylori.J. Microbiol. Methods., 2011; 84: 174-182
  Google Scholar
• 53. Roe I.H., Son S.H., Oh H.T., Choi J., Shin J.H., Lee J.H., Hah Y.C.:Changes in the evolution of the antigenic profiles and morphologyduring coccoid conversion of Helicobacter pylori. Korean J. Intern.Med., 1999; 14: 9-14
  Google Scholar
• 54. Rudnicka K., Grębowska A., Moran A.P., Matusiak A., WalenckaM., Miszczyk E., Bąk-Romaniszyn L., Czkwianianc E., Płaneta-MałeckaI., Rudnicka W., Chmiela M.: Odmienna skuteczność lipopolisacharydówHelicobacter pylori różniących się ekspresją determinantówantygenowych LewisXY w pobudzaniu leukocytów jednojądrzastychkrwi obwodowej do wydzielania cytokin prozapalnych: IL-8 i TNF-α.Prz. Gastroenterol., 2011; 6: 401-408
  Google Scholar
• 55. Rudnicka K., Szczęsna E., Miszczyk E., Mikołajczyk-Chmiela M.:Apoptoza i autofagia-mechanizmy i metody detekcji. Postńępy Biol.Komórki, 2011; 38: 247-265
  Google Scholar
• 56. Rudnicka K., Włodarczyk M., Moran A.P., Rechciński T., MiszczykE., Matusiak A., Szczęsna E., Walencka M., Rudnicka W. Chmiela M.:Helicobacter pylori antigens as potential modulators of lymphocytes’cytotoxic activity. Microbiol. Immunol., 2012; 56: 62-75
  Google Scholar
• 57. Sadowska B., Walencka E., Więckowska-Szakiel M., Różalska B.:Bacteria competing with the adhesion and biofilm formation byStaphylococcus aureus. Folia Microbiol., 2010; 55: 497-501
  Google Scholar
• 58. Saito N., Konishi K., Sato F., Kato M., Takeda H., Sugiyama T.,Asaka M.: Plural transformation-processes from spiral to coccoidHelicobacter pylori and its viability. J. Infect., 2003; 46: 49-55
  Google Scholar
• 59. Sato F., Saito N., Konishi K., Shoji E., Kato M., Takeda H., SugiyamaT., Asaka M.: Ultrastructural observation of Helicobacter pyloriin glucose-supplemented culture media. J. Med. Microbiol., 2003;52: 675-679
  Google Scholar
• 60. Shahamat M., Alem N., Asalkhou M., Hamedi N., Alem N., MorshedizadehK., Alem M.: IgM antibody response to antigens preparedfrom vegetative and coccoid forms of Helicobacter pylori. Exp. Mol.Pathol., 2006; 81: 171-175
  Google Scholar
• 61. She F.F., Liu J.Y., Huang C,. Su D.H.: Virulence of water-inducedcoccoid Helicobacter pylori and its experimental infection in mice.World J. Gastroenterol., 2003; 9: 516-520
  Google Scholar
• 62. Sisto F., Brenciaglia M I., Scaltrito M.M., Dubini F.: Helicobacterpylori: ureA, cagA and vacA expression during conversion to the coccoidform. Int. J. Antimicrob. Agents, 2000; 15: 277-282
  Google Scholar
• 63. Twing K.I., Kirchman D.L., Campbell B.J.: Temporal study of Helicobacterpylori presence in coastal freshwater, estuary and marinewaters. Water Res., 2010; 45: 1897-1905
  Google Scholar
• 64. Van Duynhoven Y.T, de Jonge R.: Transmission of Helicobacterpylori: a role for food? WHO Bull., 2001; 79: 455-460
  Google Scholar
• 65. Vijayakumari S., Khin M.M., Jiang B., Ho B.: The pathogenic roleof the coccoid form of Helicobacter pylori. Cytobios., 1995; 82: 251-260
  Google Scholar
• 66. Wang K.X., Li C.P., Cui Y.B., Tian Y., Yang Q.G.: L-forms of H. pylori.World J. Gastroenterol., 2003; 9: 525-528
  Google Scholar
• 67. Wang X., Willén R., Svensson M., Ljungh A., Wadström T.: Twoyearfollow-up of Helicobacter pylori infection in C57BL/6 and Balb/cA mice. APMIS, 2003; 111: 514-522
  Google Scholar
• 68. Williams J.C., McInnis K.A., Testerman T.L.: Adherence of Helicobacterto abiotic surfaces is influenced by serum. Appl. Environ.Microbiol., 2008; 74: 1255-1258
  Google Scholar
• 69. Yang F.L., Hassanbhai A.M., Chen H.Y., Huang Z.Y., Lin T.L., WuS.H., Ho B.: Proteomannans in biofilm of Helicobacter pylori ATCC 43504 Helicobacter, 2011; 16: 89-98
  Google Scholar
• 70. Yonezawa H., Osaki T., Kurata S., Fukuda M., Kawakami H., OchiaiK., Hanawa T., Kamiya S.: Outer membrane vesicles of Helicobacterpylori TK1402 are involved in biofilm formation. BMC Microbiol.,2009; 15: 197-209
  Google Scholar

Pełna treść artykułu