Grzyby z rodzaju Malassezia jako oportuniści ludzi i zwierząt
Urszula Czyżewska 1 , Magdalena Siemieniuk 1 , Marek Bartoszewicz 2 , Adam Tylicki 1Abstrakt
Drożdżaki z rodzaju Malassezia to zazwyczaj komensale i patogeny ludzi oraz zwierząt odpowiedzialne za grzybice. Ze względu na swoistą budowę komórek, mogą być oporne na działanie czynników zewnętrznych i trudne do zwalczania przez układ odpornościowy gospodarza. Mimo wielu znanych czynników wirulencji, chorobotwórczość Malassezia sp. oraz ich interakcje z organizmami żywicielskimi nadal budzą ogromne zainteresowanie.
W ostatnich latach zsekwencjonowano genomy pojedynczych przedstawicieli większości gatunków z rodzaju Malassezia. Podjęto też próby rekonstrukcji filogenezy w oparciu o sekwencje fragmentów ITS oraz IGS. Analizy biochemiczne pozwoliły lepiej zrozumieć ekologię i wirulencję tych grzybów. Opisanie właściwości profili lipidowych i białkowych, aktywności fosfolipaz i enzymów zewnątrzkomórkowych rzuciło nowe światło na genezę i przebieg różnorodnych chorób, w tym łupieżu pstrego, łojotokowego zapalenia skóry, atopowego zapalenia skóry, zapalenia mieszków włosowych, łuszczycy oraz grzybic systemowych. Na szczególną uwagę zasługuje M. pachydermatis – potencjalny model organizmu uznawanego za typowo zoofilny, który coraz częściej jednak powoduje grzybice u ludzi. Ponadto badania in vitro wskazują na możliwą lekooporność tego gatunku.
Przedstawiciele rodzaju Malassezia to poważne wyzwanie medyczne i terapeutyczne. Trudności w ocenie ich patogenności, zróżnicowanie genetyczne i biochemiczne, a także skomplikowana ewolucja wymagają dalszych badań. Zastosowanie analiz genomowych i proteomicznych, wspartych właściwościami biochemicznymi i danymi epidemiologicznymi, zapewne przyczyni się w niedalekiej przyszłości do pełniejszego poznania biologii i zjawiska oportunizmu wśród grzybów.
Wstęp
Grzyby, mimo powszechnego występowania w środowisku, są jedną z najmniej poznanych grup organizmów żywych. Ze względu na zasiedlanie różnych nisz ekologicznych jest to grupa bardzo zróżnicowana, wśród której znajdują się zarówno jednokomórkowe mikroorganizmy, jak i organizmy o złożonej budowie, których plechy osiągają pokaźne rozmiary. Według szacunków Ziemię zasiedla około 1,5 mln gatunków grzybów, z których sklasyfikowano około 5% [46]. Z klinicznego punktu widzenia, grzyby – ze względu na cechy związane głównie ze zdolnością do wytwarzania enzymów, takich jak lipazy i proteazy wydzielane do środowiska, jak też mikotoksyny – są poważnym problemem. Organizmy te wykorzystując naturalne predyspozycje mogą wywołać wiele chorób u zwierząt i ludzi, począwszy od niegroźnych zakażeń powierzchniowych, poprzez zapalenia płuc, układu moczowo-płciowego, na śmiertelnych w skutkach zakażeniach ogólnoustrojowych i zatruciach kończąc. Spośród znanych 70 tys. gatunków grzybów jedynie około 200 uznaje się za potencjalnie niebezpieczne dla zdrowia ludzi. Wśród nich jedynie kilkanaście gatunków odpowiada za 90% grzybic. Z klinicznego punktu widzenia patogeny grzybowe dzieli się na dermatofity odpowiedzialne przede wszystkim za choroby skóry, grzyby pleśniowe, które oprócz dermatoz mogą być odpowiedzialne za choroby płuc i zatrucia mikotoksynami, dimorficzne endemity występujące w niektórych rejonach świata odpowiedzialne za choroby skóry i układu oddechowego oraz drożdżaki powodujące różnego rodzaju infekcje oportunistyczne. Do tej ostatniej grupy zalicza się grzyby z rodzaju Malassezia [34, 81, 93].
Drożdżaki te już od ponad 170 lat znane są jako składnik mikroflory skóry ludzi i zwierząt. Historia dotycząca obserwacji oraz odkryć nowych gatunków z rodzaju Malassezia rozpoczęła się w połowie XIX w. (tabela 1). Należy podkreślić, że systematyka tego rodzaju jest nadal obiektem intensywnych badań, a jej aktualny stan przedstawiono w tabeli 2.
| Rok | Wydarzenie |
| 1846 | Eichstedt po raz pierwszy obserwuje komórki, które określa jako Pityrosporum |
| 1874 | Malassez potwierdza obserwacje Eichstedta; nadanie rodzajowi tych grzybów nazwy: Malassezia |
| 1913 | Castellani i Chalmers opisują gatunek Pityrosporum ovale |
| 1951 | Gordon izoluje od pacjentów z łupieżem pstrym oraz od osób zdrowych drożdżaki, które nazywa Pityrosporum orbiculare |
| 1977 | stwierdzono, że P. ovale i P. orbiculare to odrębne formy morfologiczne tego samego gatunku |
| 1984 | zatwierdzenie gatunku Malassezia furfur |
| 1925 | Weidmann opisuje nowy gatunek: Malassezia pachydermatis |
| 1995 | Guillot i Gueho za pomocą technik biologii molekularnej wyodrębniają 7 gatunków w rodzaju Malassezia (M. furfur, M. pachydermatis, Malassezia sympodialis, Malassezia globosa, Malassezia obtusa, Malassezia restricta, Malassezia slooffiae) |
| 2002 | Sugita opisuje Malassezia dermatis, a Nell – Malassezia equine |
| 2003 | Sugita opisuje Malassezia japonica |
| 2004 | Sugita opisuje Malassezia nana, a następnie Malassezia yamotoensis |
| 2007 | Cabañes wyodrębnia Malassezia capraeuzyskano sekwencje nukleotydowe genomów Malassezia globosa i Malassezia restricta |
| 2011 | Cabañes opisuje Malassezia cuniculi |
| 2013 | uzyskano sekwencje nukleotydowe genomu Malassezia sympodialis |
| 2015 | zsekwencjonowano genom Malassezia pachydermatisWu i wsp. publikują pracę prezentującą porównanie 14 gatunków z rodzaju Malassezia |
| 2016 | Cabañes odkrywa Malassezia brasiliensis, Malassezia psittaci, z kolei Honnavar – Malassezia arunalokei |
Tabela 1. Historia odkryć związanych z poznawaniem rodzaju Malassezia
Na podstawie [13, 14, 15, 37, 40, 43, 47, 48, 68, 87, 88, 89, 94, 105, 108, 110, 111, 115].
| Jednostka systematyczna | Nazwa łacińska jednostki | |
| Królestwo: | Fungi | |
| Typ: | Basidiomycota | |
| Podtyp: | Ustilaginomycotina | |
| Klasa: | Malasseziomycetes | |
| Rząd: | Malasseziales | |
| Rodzina: | Malasseziaceae | |
| Rodzaj: | Malassezia | |
| Gatunki: | antropofilne:M. dermatisM. furfurM. globosaM. japonicaM. obtusaM. restrictaM. sympodialisM. yamotoensisM. arunalokei | zoofilne:M. capraeM. equinaM. nanaM. pachydermatisM. slooffiaeM. cuniculiM. brasiliensisM. psittaci |
Tabela 2. Systematyka grzybów z rodzaju Malassezia
Na podstawie [13, 48 ,103, 108].
Poszczególne gatunki z rodzaju Malassezia różnią się od siebie pod względem morfologicznym, fizjologicznym, jak również biochemicznym (tabela 3). Jedną z cech charakterystycznych tego rodzaju jest lipofilność. Inną cechą jest nietypowa, wielowarstwowa, gruba (około 0,12 μm), zawierająca dużo lipidów ściana komórkowa, stanowiąca aż 26-37% całkowitej objętości komórki. Jej składnikami poza wspomnianymi lipidami (20%) są również wielocukry (70%) oraz białka (10%). Charakterystyczna budowa oraz skład ściany komórkowej Malassezia są przyczyną dużej odporności tych drożdżaków na działanie różnego rodzaju czynników fizycznych i chemicznych [2, 42, 86]. Ściana komórkowa ułatwia im także adhezję do komórek gospodarza, utrudnia fagocytozę komórek grzyba, hamuje odpowiedź zapalną, dzięki czemu może być uznana za niezwykle istotny czynnik wirulencji Malassezia [56, 66].
| Cecha | Gatunek | ||||
| M. furfur | M. sympodialis | M. pachydermatis | M. globosa | M. restricta | |
| morfologia kolonii | gładkie, miękkie, kruche | gładkie, płaskie, miękkie | gładkie, miękkie kruche, wypukłe | szorstkie, serowate, kruche | gładkie, nieregularne, kruche |
| barwa kolonii | kremowa | kremowa do beżowej | kremowa | kremowa do beżowej | kremowa |
| kształt komórki | wydłużone, owalne, sferyczne | jajowate, kuliste | cylindryczne | sferyczne | sferyczne, owalne |
| długość komórki | ok. 6 μm | 2,5-5 μm | 2,5-5 μm | 6-8 μm | 2-4 μm |
| typ pączkowania | szeroka podstawa | sympodialne | szeroka podstawa | wąska podstawa | wąska podstawa |
| % G+C | 66,4 | 62,2 | 55,6 | 53,5 | 59,9 |
| synteza katalazy | + | + | zmienne | + | – |
| redukcja DBB | + | + | + | + | + |
| synteza ureazy | + | + | + | + | + |
| wzrost 37o C | dobry | dobry | dobry | słaby | słaby |
| maksymalna temperatura wzrostu °C | 40-41 | 40-41 | 40-41 | 38 | 38 |
| wzrost na podłożu bez lipidów | – | – | + | – | – |
| asymilacja Tween 20 | + | – | + | – | – |
| asymilacja Tween 40 lub Tween 60 | + | + | + | – | – |
| asymilacja Tween 80 | + | + | + | – | – |
| hydroliza eskuliny | – | + | zmienne | – | – |
Tabela 3. Charakterystyka pięciu wybranych gatunków Malassezia
‘+’ – obecność cechy, ‘–‘ – brak cechy, DBB – diazonium blue B – związek wykorzystywany w wykrywaniu podstawczaków, G+C – sumaryczna zawartość guaniny i cytozyny; wg [51] – zmodyfikowano.
Stwierdzono, że drożdżaki z rodzaju Malassezia nie fermentują cukrów (jednak wykorzystują je w procesach tlenowych [97]), preferują lipidy jako źródło energii, metioninę jako źródło siarki (mogą także korzystać z cystyny i cysteiny), a do wzrostu i rozwoju nie wymagają obecności witamin w podłożu. Mimo iż preferują warunki tlenowe, tolerują warunki mikroaerofilne [25]. Drożdżaki Malassezia należą do naturalnej mikroflory skóry ludzi i niektórych zwierząt (za typowo zoofilie uznaje się m.in. M. pachydermatis, M. nana i M. cuniculi; tabela 2). Grzyby z rodzaju Malassezia są uważane za typowych oportunistów. Izolowane ze skóry różnych gatunków zdrowych ssaków, również człowieka, nie wywołują przy tym żadnych objawów choroby. Wystąpienie objawów chorób kojarzonych z infekcją Malassezia korelowane jest głównie z zaburzeniami metabolicznymi, hormonalnymi lub immunologicznymi gospodarza. W takich korzystnych dla tych drożdżaków warunkach, mogą być przyczyną lub czynnikiem etiologicznym wielu schorzeń, w tym nawet fungemii [1, 19, 34, 41, 93]. Przykładem może być gatunek M. pachydermatis, który jest stwierdzany w 30-80% przypadków zapalenia ucha zewnętrznego, a w 30% przypadków łojotokowego i atopowego zapalenia skóry u psów [61, 64]. Badania wskazują również, że gatunek ten jest obecny na skórze 20-80% zdrowych zwierząt [38, 67]. M. globosa i M. restricta są przyczyną natomiast prawie 60% przypadków atopowego zapalenia skóry u ludzi [34]. Wiele problemów z wczesną diagnozą grzybic wywoływanych przez Malassezia wiąże się z tym, że grzyby te występują również na skórze zdrowych ludzi jako komensale [76].
Wobec zwiększającej się liczby różnych dermatoz, jak również problemów w diagnostyce i leczeniu zyskują na znaczeniu badania wyjaśniające, czy wśród oportunistów są szczepy typowo patogenne i jakie są możliwości ich identyfikacji. Dotyczy to także gatunków z rodzaju Malassezia. Jest to szczególnie ważne z powodu wzrastającej liczby przypadków grzybic, trudności w ich leczeniu i nawrotowości [115]. Coraz częściej obserwuje się także zmniejszenie wrażliwości grzybów na dotychczas stosowane leki [16, 104]. Zaobserwowano również, że gatunki, które do niedawna uznawano za typowo zoofilne, pojawiają się w izolatach pobranych od chorych i zdrowych ludzi [19, 76].
Na podstawie wyników najnowszych badań znaczenia nabiera pytanie, czy patogenność uwarunkowana jest wyłącznie czynnikami zależnymi od gospodarza, czy też szczepy patogenne mają niezależne mechanizmy wirulencji, a inne czynniki jedynie wyzwalają ich ekspresję. Pojawia się coraz więcej doniesień o różnicach między szczepami w zależności od źródła pochodzenia [18, 69, 70]. Identyfikacja takich różnic może mieć znaczenie w diagnostyce i leczeniu chorych. W związku z tym poszukiwanie cech charakterystycznych dla poszczególnych grup szczepów jest uzasadnione zarówno z czysto poznawczego, jak i utylitarnego punktu widzenia.
W artykule podsumowano dane o różnorodności wśród grzybów z rodzaju Malassezia ze szczególnym uwzględnieniem M. pachydermatis na poziomie biologii molekularnej i biochemii wskazując na istotne różnice między szczepami izolowanymi od chorych i zdrowych zwierząt i ludzi dotyczące również wrażliwości na powszechnie stosowane leki przeciwgrzybiczne. Zebrane informacje mogą być użyteczne w wytyczaniu kierunków badań służących sprawniejszej diagnostyce i zwalczaniu chorób spowodowanych przez grzyby z rodzaju Malassezia.
Genetyczne zróżnicowanie grzybów z rodzaju Malassezia
Mimo że przedstawiciele rodzaju Malassezia budzą nieustanne zainteresowanie lekarzy, weterynarzy i biologów, do niedawna wiedza na temat organizacji ich genomów oraz pokrewieństwa filogenetycznego była bardzo ograniczona. Dopiero na początku XXI w. uzyskano sekwencje nukleotydowe genomów M. globosa, M. restricta i M. sympodialis [37, 110]. Następnie zsekwencjonowano genom M. pachydermatis [94], a w 2015 r. opublikowano obszerną pracę, w której przeprowadzono porównanie genomów pozostałych przedstawicieli rodzaju Malassezia [108]. Niemniej jednak dane, którymi dysponujemy, nadal mają często charakter prowizoryczny, bowiem dla większości gatunków opierają się na pojedynczych szczepach, dla których ponadto nie zidentyfikowano wszystkich genów bądź nie przypisano ich do określonych chromosomów. Informacje dotyczące porównania właściwości genomów drożdżaków z rodzaju Malassezia w stosunku do Saccharomyces cerevisiae i Candida albicans przedstawia tabela 4.
| Gatunek | Wielkość genomu (Mbp) | Zawartość G+C (%) | Liczba genów | Liczba chromosomów | Zsekwencjonowane genomy |
| M. caprae | 7,58 | 59,8 | 3925 | (-) | CBS104341 |
| M. cuniculi | 7,46 | 59,0 | 4112 | (-) | CBS117211 |
| M. dermatis | 7,55 | 59,1 | 3890 | (-) | JCM113481, CBS91691 |
| M. equine | 7,66 | 58,0 | 4109 | (-) | CBS99691 |
| M. furfur | 7,7-14,8 | 64,1 | 5357-10980 | 7-11 | CBS79821, CBS77101, CBS70192, CBS41721, CBS18781, JPLK232 |
| M. globosa | 8,84 | 52,1 | 4207-4598 | 8 | CBS79661, CBS79901, CBS78741 |
| M. japonica | 8,35 | 62,4 | 4715 | (-) | JCM119631, CBS94311 |
| M. nana | 7,58 | 58,0 | 4242 | (-) | JCM120851, CBS95571 |
| M. obtusa | 7,84 | 62,2 | 5028 | 6 | CBS78761 |
| M. pachydermatis | 8,15 | 55,1 | 4202-4328 | 5 | CBS18791 |
| M. restricta | 7,25 | 55,8 | 4001-4122 | 9 | CBS87421, CBS78771 |
| M. slooffiae | 8,43 | 65,9 | 5617 | 7 | CBS79561 |
| M. sympodialis | 7,73 | 59,6 | 3507-4663 | 8 | ATCC421322, KS2922, KS0242, KS3272, KS0042, ATCC968061, ATCC443401, ATCC421321 |
| M. yamotoensis | 8,11 | 49,7 | 4361 | (-) | MY97251 |
| C. albicans | 14,8-16,0 | 33,7 | 6101-6679 | 8 | 36 sekwencji1 |
| S. cerevisiae | 12,12 | 38,4 | 5409 | 16 | 481 sekwencji, w tym 2 kompletne |
Tabela 4. Wybrane cechy molekularne gatunków z rodzaju Malassezia w porównaniu z drożdżakami Saccharomyces cerevisiae i Candida albicans
1szczepy, dla których uzyskane sekwencje mają charakter częściowy, 2szczepy, dla których uzyskane sekwencje mają charakter całkowity; (rodzaj Malassezia – [37, 41, 51, 94, 108, 110]; C. albicans i S. cerevisiae – [9, 55], www.yeastgenome.org, www.candidagenome.org, www.ncbi.nlm.nih.gov).
Należy zauważyć, że wielkość genomów wśród przedstawicieli rodzaju Malassezia jest stosunkowo niewielka i waha się przeważnie w zakresie 6,4-8,5 Mpz. Wyjątkiem są niektóre szczepy M. furfur (m.in. CBS 7710. CBS 7019, CBS 4172 oraz CBS 1878), u których stwierdzono genom osiągający nawet 15,23 Mpz. Niemniej genomy tych grzybów są stosunkowo niewielkie, porównywalne z wielkością genomów bakteryjnych, z których najmniejszy opisany dotychczas miał wielkość 0,13 Mpz (Candidatus Pelagibacter ubique), zaś największy (u Sorangium cellulosum) aż 13 Mpz [27]. Co więcej, są też małe w porównaniu z innymi przedstawicielami drożdżaków i innych grzybów, zawierają stosunkowo niewiele genów i większy odsetek regionów kodujących białka (tabela 4). Małe rozmiary genomu, ograniczona wielkość sekwencji niekodujących i liczba genów mogą wynikać ze skrajnego przystosowania tych grzybów do zajmowania przez nie wąskiej niszy ekologicznej rozumianej jako skóra organizmów stałocieplnych.
Najmniejszą liczbę genów stwierdzono u M. caprae (prawie 4000), co stanowi około 70% liczby genów stwierdzanych u S. cerevisiae i C. albicans. Najliczniejsze geny, około 11000 opisano zaś u niektórych szczepów M. furfur. Należy podkreślić, że wartość ta przekracza liczbę genów notowanych u dobrze poznanych drożdżaków S. cerevisiae oraz C. albicans. Średnia liczba genów u gatunków Malassezia wynosi około 4700 [108].
Obserwacje dotyczące horyzontalnego transferu genów oraz różnorodnych delecji dostarczają istotnych informacji, które pozwalają lepiej zrozumieć biologię i ewolucję rodzaju Malassezia. Na podstawie zestawienia zsekwencjonowanych genomów ustalono, że rodzaj Malassezia nabył prawdopodobnie co najmniej 64 różne geny związane ze skutecznym wykorzystywaniem dostępnego środowiska. Jeden ze wspomnianych genów (domena PFam PF06742, hydrolaza o nieznanej funkcji) jest obecny u wszystkich gatunków z rodzaju Malassezia w 1-2 kopiach. Co ważne, wspomnianego genu nie odnotowano u żadnego innego przedstawiciela podstawczaków, natomiast homologiczne sekwencje opisano u patogennych bakterii i grzybów, co może świadczyć o horyzontalnym transferze genów między odległymi filogenetycznie organizmami. Choć rola wspomnianej hydrolazy nie jest dokładnie poznana, może mieć ona znaczenie w adaptacji do zajmowanej niszy ekologicznej, gdyż stwierdzono podwyższoną ekspresję kodującego ją genu w warunkach niedoboru składników odżywczych w środowisku. Zjawisko horyzontalnego transferu genów od Blastomonas i Sphingomonas tłumaczy także obecność genu kodującego katalazę (PFam, domena PF00199) u wszystkich Malassezia oprócz M. restricta i M. pachydermatis [54]. Biorąc pod uwagę to, że oba wspomniane gatunki drożdżaków żyją w środowisku tlenowym bytując na powierzchni skóry, muszą więc dysponować innymi mechanizmami obronnymi przeciw reaktywnym formom tlenu. I tak u M. pachydermatis potwierdzono aktywność katalazy, lecz jej właściwości okazały się odmienne w stosunku do pozostałych przedstawicieli rodzaju Malassezia [54]. U M. slooffiae zanotowano obecność genu kodującego katalazę, który wykazuje bardzo dużą homologię w stosunku do genów bakteryjnych. Grzyby te zawierają także gen katalazy o sekwencji wykazującej wiele podobieństw do genów stwierdzanych u innych grzybów. Dowodzi to, poza możliwością horyzontalnego transferu genów, pośrednio także dużego znaczenia aktywności katalazy w adaptacji do warunków środowiska.
Inne ważne informacje uzyskano o genach warunkujących biosyntezę charakterystycznych dla Malassezia proteaz (PFam, domena PF13367). Ich obecność wykazano w genomach wszystkich gatunków znajdowanych na skórze ludzi. Co zaskakujące, u zoofilnych przedstawicieli wspomnianego rodzaju, jak i pozostałych podstawczaków sekwencji takich nie stwierdzono. Stąd przypuszcza się, że może występować swoisty pod względem niszowym horyzontalny transfer genów do gatunków antropofilnych [108].
Inne istotne obserwacje wynikające z porównania genomów Malassezia dotyczą 741 genów, które zostały zapewne utracone w trakcie różnicowania się i ewolucji przedstawicieli całego rodzaju. Wśród utraconych genów, dominowały przede wszystkim odpowiedzialne za metabolizm węglowodanów. Jest to prawdopodobnie związane z adaptacją do ubogiego w tę grupę związków organicznych siedliska, jakim jest skóra homeotermów. Jednak bardzo duże jest znaczenie przystosowawcze genów warunkujących biosyntezę lipaz i fosfolipaz, a także proteaz aspartylowych i innych peptydaz [108]. W związku z tym szczególnie ciekawie wypada jedyny w całym rodzaju lipidoniezależny gatunek M. pachydermatis, u którego stwierdzono obecność 50 genów kodujących enzymy degradujące lipidy (35 lipaz i 15 esteraz). Nie stwierdzono natomiast u tego gatunku właściwej grzybom syntazy kwasów tłuszczowych przy jednoczesnej obecności syntazy poliketydowej [94] powiązanej z syntezą lipidów. Droga, na której M. pachydermatis syntetyzuje kwas mirystynowy, będący prekursorem innych długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, jest nadal niewyjaśniona.
Ze względu na to, że sekwencjonowanie całych genomów jest czaso- i kosztochłonne, wiele wcześniejszych prac dotyczących właściwości genetycznych Malassezia opierało się na sekwencjonowaniu nukleotydowym pojedynczych genów oraz na analizach struktury populacyjnej techniką RAPD-PCR (random amplification of polymorfic DNA). Analizy szczepów M. pachydermatis wyizolowanych od psów zdrowych i ze zmianami skórnymi ujawniły stosunkowo niewielkie zróżnicowanie genetyczne na poziomie sekwencji chs-2 (gen kodujący syntazę chityny 2) i ITS-1 (internal transcribed spacer 1). Zidentyfikowano 3 typy sekwencyjne względem chs-2 i 8 typów względem ITS-1 w populacji 180 przebadanych szczepów. Jeden z opisanych genotypów grupował szczepy od zdrowych zwierząt charakteryzujące się obniżoną aktywnością fosfolipaz [18]. Natomiast grzyby pozyskane od zwierząt chorych charakteryzowały się podwyższoną aktywnością fosfolipaz. Analizy polimorfizmu sekwencji nukleotydowych odcinka IGS-1 (intergenic spacer 1) pozwoliły na wyróżnienie 3 głównych grup genotypów M. pachydermatis, podzielonych dodatkowo na 10 podtypów [90]. Zaobserwowano także korelację między profilami genetycznymi grzybów, a ich pochodzeniem od zwierząt cierpiących na atopowe zapalenie skóry (dominujące podtypy 3C i 3D) bądź zdrowych (pozostałe podtypy). Może to wskazywać na różnicowanie się M. pachydermatis na izolaty o naturze komensalnej i patogennej pod wpływem działania doboru oczyszczającego pod postacią presji środowiskowej. Wykazano ponadto, że podtypy charakterystyczne dla psów chorych efektywniej proliferowały w pożywkach o wyższym pH (8,0), podczas gdy pozostałe szczepy najlepiej rosły w pożywce o pH w zakresie 6,0-7,0. To także może być wynikiem odpowiednich przystosowań, bowiem w przypadkach atopowego zapalenia skóry u psów obserwuje się podwyższone pH skóry do wartości 8,2-9,0 [59]. Wyniki analiz zróżnicowania genetycznego oraz filogenezy szczepów M. pachydermatis oraz ich korelacja ze stanem zdrowia zwierząt, od których zostały wyizolowane sugerują istnienie cech dziedzicznych, które mogą warunkować patogenność szczepów. Ich wykrycie oraz precyzyjne opisanie mogłoby stworzyć fundamenty pod opracowanie szybkich i skutecznych molekularnych testów diagnostycznych do badań przesiewowych w kierunku schorzeń wywoływanych przed drożdżaki z rodzaju Malassezia także u ludzi.
Biochemiczne zróżnicowanie grzybów z rodzaju Malassezia
Znaczącą rolę w procesie patogenezy grzybów odgrywają enzymy związane z metabolizmem wewnątrzkomórkowym. Już w 2001 r. Lorenz i Fink wskazywali na bardzo istotną rolę cyklu glioksalanowego w procesie infekcji wywoływanych przez C. albicans. Później zespół ten, również na przykładzie C. albicans, wykazał wzrost ekspresji genów kodujących enzymów związanych z procesem β-oksydacji kwasów tłuszczowych, cyklem glioksalanowym, glukoneogenezą i glikolizą. Wzrost ekspresji tych genów następował po wniknięciu komórek grzyba do makrofagów [62]. W literaturze można znaleźć nieliczne doniesienia dotyczące badań nad enzymami metabolizmu wewnątrzkomórkowego u grzybów z rodzaju Malassezia. Jedynym do tej pory badanym enzymem u M. pachydermatis jest dehydrogenaza jabłczanowa [85, 97]. Wyniki tych badań wskazały na dużą aktywność tego enzymu u M. pachydermatis w porównaniu do S. cerevisiae i C. albicans. Dodatkowo stwierdzono brak aktywności dekarboksylazy pirogronianowej u M. pachydermatis, a następnie elektroforetycznie potwierdzono brak obecności tego białka. Wspomniane różnice w ekspresji genów i aktywnościach enzymów podczas infekcji, jak również wśród różnych gatunków drożdżaków, sugerują istnienie pewnych przystosowań metabolicznych ułatwiających proces infekcji z pominięciem uwarunkowań ze strony gospodarza.
Białka syntetyzowane przez mikroorganizmy, m.in. enzymy, antygeny, wiążą się z ich patogennością. Za główny czynnik wirulencji uznaje się sekrecję enzymów zewnątrzkomórkowych [83]. Coutinho w 2005 r. porównał sekrecję sulfatazy chondroityny i hialuronidazy u szczepów M. pachydermatis pochodzących od psów zdrowych i chorych [23]. Nie stwierdził żadnych różnic ani w aktywnościach, ani w sekrecji wspomnianych enzymów. Inni badacze również podejmowali próby poszukiwania czynników patogenności M. pachydermatis. W 2013 r. Nowakiewicz i Ziółkowska porównały profile białkowe szczepów M. pachydermatis różnego pochodzenia, tzn. od psów zdrowych oraz chorych na otitis externa [69]. Wyniki, które uzyskały wykazały istotne różnice między badanymi grupami szczepów. Wskazały 8 białek, których obecność była charakterystyczna tylko dla szczepów M. pachydermatis izolowanych od psów chorych. Otrzymane dane mogą świadczyć o różnicach w ekspresji informacji genetycznej bądź też różnicach genotypów badanych grup szczepów. Skutkiem tego może być zróżnicowanie struktury antygenowej w obrębie szczepów różnych gatunków z rodzaju Malassezia [45, 113]. Chen i wsp. w 2002 r. stwierdzili u M. pachydermatis obecność białka wywołującego reakcję immunologiczną u ponad 50% psów z atopowym zapaleniem skóry [20]. Natomiast u psów zdrowych reakcja nie była aż tak silna. Podobnych obserwacji dotyczących reakcji immunologicznej u psów spowodowanej swoistymi białkami M. pachydermatis dokonali Bond i Lloyd w 2002 r. [8], jak również Kim i wsp. w 2010 r. [58].
Metabolizm lipidów jest bardzo ważny dla gatunków z rodzaju Malassezia, które charakteryzują się bardzo wieloma i różnorodnymi enzymami lipolitycznymi. W szczególności gatunki lipidozależne wykazują znaczną zmienność metabolizmu lipidów [74]. Na przykład M. sympodialis do wzrostu wykorzystuje wyłącznie wolne kwasy tłuszczowe, podczas gdy M. furfur asymiluje triacyloglicerole [65]. Mimo że M. pachydermatis jest mikroorganizmem lipofilnym, w przeciwieństwie do innych gatunków z rodzaju Malassezia charakteryzuje się zdolnością syntezy de novo kwasu mirystynowego [53]. Cecha ta pozwala mu wzrastać na pożywce bez suplementacji długołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi. Jednak wielu autorów wykazuje, że suplementacja pożywki lipidami (oliwa z oliwek, Tween 40, 60, 80) ma stymulujący wpływ na proliferację M. pachydermatis [7, 60]. Powyższe obserwacje wskazują, że metabolizm lipidów ma zasadnicze znaczenie dla grzybów z rodzaju Malassezia, a profile lipidowe tych gatunków mogą się różnić w zależności od właściwości szczepów. W 2012 r. określono profil lipidowy M. pachydermatis, jednak badania dotyczyły jedynie szczepu referencyjnego [96]. Profile lipidowe były dotychczas wykorzystywane do rozróżniania różnych gatunków grzybów lub szczepów. W 1991 r. Bendová i wsp. podjęli próbę scharakteryzowania profili kwasów tłuszczowych laboratoryjnych i przemysłowych szczepów S. cerevisiae [4]. Określono również profile lipidowe m.in. C. neoformans, Trichosporon spp., Aspergillus fumigatus, Histoplasma capsulatum oraz wielu gatunków z rodzaju Candida, które mogą być wykorzystywane w celach diagnostycznych [29, 71, 72, 114].
Lipolityczne zdolności Malassezia zaobserwowano zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. Grzyby te mają zdolność syntetyzowania fosfolipaz, wskutek aktywności których z komórek uwalniany jest kwas arachidonowy. Sądzi się, że jego metabolity mają związek z procesami zapalnymi skóry jako czynniki inicjujące proces zapalenia [12]. Lipoperoksydaza jest enzymem, który również może być wydzielany przez Malassezia, skutkiem czego są uszkadzane błony komórkowe gospodarza i następnie rozwój infekcji. Zmiany w pigmentacji skóry są jednym z objawów działania tego enzymu [24]. Teramoto i wsp. prowadzili badania dotyczące genotypowania z wykorzystaniem sekwencji ITS-1 i IGS-1 [92]. W tym celu wykorzystali 27 szczepów M. pachydermatis izolowanych od psów zdrowych i 32 szczepy pochodzące od psów chorych na otitis externa. Jednak uzyskane przez nich wyniki nie wykazały istotnego zróżnicowania. Zaobserwowali również, że aktywność lipaz w obu badanych grupach szczepów była zbliżona, natomiast u szczepów pochodzących od psów chorych stwierdzili podwyższoną aktywność fosfolipaz. Natomiast Park i wsp. wykazali większą aktywność wydzielanych pozakomórkowo fosfolipaz u szczepów M. pachydermatis uzyskanych od psów zdrowych w porównaniu ze szczepami uzyskanymi ze skóry ludzi [70]. Potwierdzili także, że otitis externa wywoływane przez M. pachydermatis koreluje z podwyższoną sekrecją fosfolipaz przez tego drożdżaka. Związek fosfolipazy D z procesem patogenezy chorób wywoływanych przez te drożdżaki wykazano z wykorzystaniem swoistych inhibitorów poszczególnych rodzajów fosfolipaz [92]. Rolę fosfolipazy D stwierdzono również w procesach chorobowych powodowanych przez C. albicans [49]. Mutanty pozbawione aktywności fosfolipazy D wykazywały ograniczoną wirulencję wobec myszy infekowanych doustnie.
Choroby związane z zakażeniem grzybami z rodzaju Malassezia u ludzi i zwierząt
Łupież pstry (pityriasis versicolor)
Związek drożdżaków Malassezia z łupieżem pstrym jest bezsprzeczny. Ich szybki wzrost na powierzchni skóry oraz przechodzenie z fazy drożdżopodobnej do fazy strzępkowej obserwuje się w klinicznym przebiegu choroby. Zwykle, mimo intensywnej kolonizacji skóry przez grzyby, chorobie nie towarzyszą stany zapalne lub są minimalne. Do czynników zewnętrznych prowadzących do rozwoju łupieżu pstrego zalicza się wysoką temperaturę i wilgotność powietrza (schorzenie najczęściej diagnozowane w klimacie tropikalnym), natomiast do czynników endogennych zalicza się nadmierną czynność gruczołów łojowych, nadmierne pocenie się, wrodzone predyspozycje, niedobory odporności i stosowanie kortykosteroidów (w klimacie umiarkowanym). Najczęściej występującymi objawami łupieżu pstrego są zmiany pigmentacji skóry. M. globosa odgrywa ważną rolę w patogenezie tej choroby, gdyż jest izolowana od pacjentów w 14-97% przypadków [34]. Wśród wielu opisywanych metod leczenia łupieżu pstrego dużą skuteczność wykazuje miejscowe lub doustne stosowanie ketokonazolu. Niestety problemem pozostaje wysoki odsetek nawrotów sięgający 60-80% [32, 115].
Łojotokowe zapalenie skóry (seborrheic dermatitis)
Łojotokowe zapalenie skóry jest stanem zapalnym, który może występować u niemowląt, nastolatków i dorosłych, u wszystkich grup etnicznych i ras. Zachorowalność jest najwyższa w okresie neonatalnym oraz podczas piątej i szóstej dekady życia [57]. Jest to schorzenie ograniczone do miejsc charakteryzujących się dużą liczbą gruczołów łojowych, np. klatka piersiowa, plecy czy skóra głowy. Jednym z dowodów na związek drożdżaków Malassezia z łojotokowym zapaleniem skóry jest synteza przez te grzyby bioaktywnych indoli, lipaz oraz indukcja syntezy cytokin przez keratynocyty [35]. Patogeneza łojotokowego zapalenia skóry nie jest w pełni poznana, ale związek między chorobą a proliferacją drożdżaków z rodzaju Malassezia oraz odpowiedź kliniczna na leki przeciwgrzybicze (m.in. ketokonazol i cyklopiroks) wskazuje na ich ważną rolę w tym procesie chorobowym. W łojotokowym zapaleniu skóry stosowanie preparatów przeciwgrzybiczych znacznie ogranicza objawy kliniczne; skuteczność leczenia ocenia się na 75% [32, 115]. Najczęściej izolowanym gatunkiem z rodzaju Malassezia od chorych na łojotokowe zapalenie skóry jest M. globosa, rzadziej M. sympodialis, M. furfur i M. restricta [34].
Atopowe zapalenie skóry (atopic dermatitis)
Atopowe zapalenie skóry jest przewlekłą chorobą zapalną ludzi, której towarzyszy świąd. Najczęściej występuje u dzieci, ale może pojawiać się także u dorosłych [11]. Jest chorobą wieloczynnikową, w której istotną rolę odgrywają bakterie [75], a podaje się coraz więcej dowodów potwierdzających udział drożdżaków z rodzaju Malassezia w patogenezie tej choroby, np. stymulacja syntezy swoistych przeciwciał u gospodarza [35]. Innym dowodem na dużą rolę gatunków z rodzaju Malassezia w tej chorobie jest liczba stwierdzanych izolacji sięgająca 50-70% przypadków klinicznych z przewagą M. sympodialis, M. globosa i M. obtusa (tabela 5). Ponieważ drożdżaki stanowią fizjologiczny składnik skóry, wysunięto hipotezę, że działają one jako alergeny u pacjentów wrażliwych, a nie jako czynniki zakaźne [3].
Zapalenie mieszków włosowych (Malassezia folliculitis)
Zmiany skórne w przebiegu zapalenia mieszków włosowych u ludzi są związane ze wzrostem drożdżaków z rodzaju Malassezia w skórze, a także z kolonizacją przez te drożdżaki mieszków włosowych, co objawia się rumieniowymi grudkami i krostami, zwłaszcza na tułowiu i ramionach [79]. Powodem wystąpienia zapalenia mieszków włosowych może być niedrożność gruczołów łojowych lub immunosupresja. Badania histologiczne wykazały przewagę grzybów z rodzaju Malassezia w zniszczonych jednostkach łojowych. Z powodu wielu podobieństw objawów tego rodzaju stanów zapalnych z innymi, choroba ta stwarza problemy przy właściwej diagnozie i leczeniu [35]. Najczęściej izolowanym gatunkiem Malassezia ze zmian skórnych związanych z zapaleniem mieszków włosowych jest M. furfur [78].
Łuszczyca (psoriasis)
Łuszczyca jest przewlekłą chorobą zapalną skóry, na którą cierpi 1-5% Europejczyków. Infekcja paciorkowcami beta-hemolizującymi oraz grzybami z rodzaju Candida są częstym czynnikiem etiologicznym tej choroby. Poza wyżej wymienionymi czynnikami wielu badaczy potwierdza wpływ drożdżaków z rodzaju Malassezia na rozwój zmian łuszczycowych, szczególnie w przypadku łuszczycy owłosionej skóry głowy i okolic narządów płciowych. W eksperymentach na zwierzętach zaobserwowano pojawienie się grudek łuszczycowych w miejscach, w których zaaplikowano ekstrakt z komórkami Malassezia, a także zmniejszenie objawów łuszczycy po zastosowaniu leków przeciwgrzybiczych stosowanych do zwalczania tych drożdżaków (ketokonazol, bifonazol). Gatunkami z rodzaju Malassezia najczęściej izolowanymi ze zmian łuszczycowych są M. sympodialis, rzadziej M.globosa i M. furfur [34, 79].
Grzybice systemowe
Grzybice systemowe są heterogenną grupą infekcji spowodowanych przez różne gatunki grzybów u pacjentów z pierwotnymi lub wtórnymi zmianami odporności [36]. Bardzo ważne jest szybkie rozpoznanie i leczenie tego rodzaju grzybic, ze względu na znaczną śmiertelność zbyt późno zdiagnozowanych przypadków [30]. Wciąż wzrasta liczba doniesień o systemowych zakażeniach grzybiczych, w których rolę odgrywają grzyby z rodzaju Malassezia. Grzybicze infekcje układowe mogą występować u pacjentów dializowanych otrzewnowo, pacjentów po immunosupresji, chorych odżywianych pozajelitowo, noworodków z cewnikami dożylnymi [1, 19, 41, 98]. Możliwe, że bogate w lipidy odżywki podawane pozajelitowo powodują zmianę struktury ściany komórkowej grzybów, tym samym zwiększając ich adhezyjność, przez co ułatwiają kolonizację cewników wprowadzanych do organizmu żywiciela [3].
Po raz pierwszy przypadek infekcji systemowej spowodowanej przez grzyby z rodzaju Malassezia opisano w 1979 r. Dotyczył pacjenta z przewlekłą niewydolnością nerek dializowanego otrzewnowo w warunkach ambulatoryjnych [102]. Natomiast przypadek pierwszego chorego noworodka opisano w 1981 r. Dziecko urodziło się w 28 tygodniu ciąży, miało bardzo małą masę i było odżywiane wyłącznie pozajelitowo. Wspólnymi cechami charakterystycznymi ogólnoustrojowych zakażeń wywołanych przez Malassezia u ludzi dorosłych są założony centralny cewnik żylny i całkowite żywienie pozajelitowe [5, 82, 84]. Objawami towarzyszącymi infekcjom są zapalenia: mięśnia sercowego, płuc, kości i szpiku oraz opon mózgowych [22, 82, 84, 109]. Zaobserwowano również przypadki posocznicy i fungemii wywołanych przez grzyby z rodzaju Malassezia u pacjentów ze znacznie obniżoną odpornością [31].
Grzyby z rodzaju Malassezia to lipofilni oportuniści izolowani najczęściej od ludzi i zwierząt stałocieplnych, gdzie są składnikiem komensalnej bioty skóry [77]. Wśród ludzi zdrowych stwierdza się gatunki z rodzaju Malassezia u przeszło połowy przebadanych. Najczęściej izolowane są M. globosa i M. sympodialis [34]. W razie istotnego obniżenia sprawności układu immunologicznego grzyby te mogą być przyczyną wielu chorób dermatologicznych, jak i zakażeń ogólnoustrojowych. Mogą być zarówno czynnikiem etiologicznym infekcji, jak również nasilać zmiany powstałe z powodu innych mechanizmów [51]. Najczęstszymi chorobami skóry wiązanymi z gatunkami Malassezia u ludzi są łupież pstry (gdzie najczęściej wykrywa się M. globosa i M. furfur), łojotokowe zapalenie skóry (z przewagą M. globosa, w mniejszej liczbie przypadków M. restricta i M. sympodialis), atopowe zapalenie skóry (najczęściej izoluje się M. sympodialis i M. globosa), a także łuszczyca z przewagą izolacji M. globosa, a w mniejszej liczbie przypadków także M. sympodialis i M. furfur [34, 107]. Dane dotyczące epidemiologii chorób skóry wywoływanych przez gatunki z rodzaju Malassezia u ludzi przedstawia tabela 5. Najwięcej doniesień o chorobach wywoływanych przez Malassezia sp. pochodzi z obszarów Azji, co zapewne jest uwarunkowane panującym tam klimatem. Natomiast analiza dostępnych w literaturze danych pozwala stwierdzić, że najczęściej izolowanym gatunkiem z rodzaju Malassezia w Ameryce Północnej i Południowej jest M. sympodialis, natomiast w Europie, Azji i Afryce – M. globosa (tabela 6).
| Liczba pacjentów | % pozytywnych izolacjiśrednia(zakres) | % poszczególnych gatunków wśród pozytywnych izolacjiśrednia (zakres) | |||||||
| M. globosa | M. restricta | M. sympodialis | M. furfur | M. slooffiae | M. obtusa | M. dermatis | |||
| Ludzie zdrowi | 907 | 70,1(31-95) | 36,4(0-78) | 6,5(0-32) | 30,5(0-69) | 10,5(0-23) | 7,2(0-50) | 1,5(0-15) | 0,4(0-4) |
| Łupież pstry | 1843 | 74,5(45-100) | 51,3(14-97) | 1,6(0-9) | 23,0(0-63) | 19,3(0-41) | 4,4(0-16) | 1,9(0-8) | 0,04(0-0,5) |
| Łojotokowe zapalenie skóry | 331 | 78,5(52-87) | 36,6(17-58) | 17,5(0-48) | 19,4(1-43) | 13,1(2-32) | 6,3(0-15) | 6,1(0-43) | 1,6(0-8) |
| Atopowe zapalenie skóry | 215 | 56,7(51-71) | 20,7(18-28) | 11,0(3-22) | 43,0(32-51) | 11,7(4-21) | 4,3(3-7) | 13,3(0-30) | 2,2(0-6) |
| Łuszczyca | 138 | 63,7(63-68) | 51,5(45-58) | 5,5(0-11) | 21,0(11-31) | 19,0(0-38) | 5,8(0-11) | (-) | (-) |
Tabela 5. Dane epidemiologiczne dotyczące rozpowszechnienia gatunków Malassezia wśród ludzi zdrowych i chorych na wybrane grzybice skóry (według [34])
| Kontynent | Kraj | Choroba | % pacjentów | Najczęściej izolowane gatunki (%) |
| Europa | Hiszpania | PV, SD, P | 9,39 | 67 M. globosa13 M. restricta |
| Bośnia i Hercegowina | PV, SD, P | 4,76 | 43 M. globosa6 M. restricta | |
| Polska | AD, P | 0,31 | 33 M. furfur33 M. sympodialis | |
| Szwecja | SD, AD | 3,60 | 41 M. sympodialis5 M. obtusa | |
| Grecja | PV, SD | 2,80 | 64 M. globosa | |
| Włochy | PV | 1,90 | 60 M. globosa | |
| Serbia | SD | 2,03 | 32 M. globosa | |
| Azja | Indie | PV, P | 17,52 | 55 M. globosa5 M. furfur |
| Japonia | PV, MF, SD, AD, P | 5,89 | 47 M. globosa17 M. restricta7 M. furfur | |
| Korea Pd. | MF, SD, AD | 4,12 | 19 M. restricta6 M. sympodialis | |
| Iran | PV, SD, P | 9,59 | 46 M. globosa | |
| Chiny | PV, SD | 4,37 | 88 M. globosa | |
| Turcja | PV, MF | 5,02 | 66 M. globosa | |
| Indonezja | PV | 2,52 | 43 M. furfur | |
| Afryka | Tunezja | PV | 4,06 | 58 M. globosa |
| Ameryka Północna | Kanada | PV, SD, AD, P | 6,15 | 45 M. sympodialis12 M. globosa |
| USA | SD | 1,80 | 41 M. restricta | |
| Meksyk | P | 0,51 | 38 M. sympodialis | |
| Ameryka Południowa | Brazylia | PV | 2,24 | 30 M. sympodialis |
| Argentyna | PV, SD | 11,42 | 22 M. globosa18 M. sympodialis |
Tabela 6. Udział poszczególnych gatunków z rodzaju Malassezia w dermatozach w różnych rejonach świata
PV – łupież pstry (pityriasis versicolor), SD – łojotokowe zapalenie skóry (seborrhoeic), P – łuszczyca (psoriasis), AD – atopowe zapalenie skóry (atopic dermatitis), MF – zapalenie mieszków włosowych (Malassezia folliculitis); badania dotyczą 3888 pacjentów; na podstawie [75].
Stwierdzono, że miejscami najczęstszego występowania gatunków z rodzaju Malassezia są: skóra klatki piersiowej, okolice międzyłopatkowe, włosy, uszy, czoło i policzki. U mężczyzn grzyby te częściej występują w dolnej części tułowia i na górnej części ud. Ustalono także, że obecność Malassezia spada wraz z wiekiem, co wiąże się z redukcją zawartości lipidów w skórze. Grzyby te mogą w różny sposób oddziaływać na układ immunologiczny gospodarza. W niektórych warunkach wspomagają aktywację dopełniacza nasilając komórkową i humoralną odpowiedź immunologiczną. Mogą jednak obniżać sprawność układu immunologicznego [25]. Wśród chorób z potwierdzoną i domniemaną etiologią związaną z Malassezia wyróżnia się dwie grupy: pierwszą, w której wzrost grzyba bezpośrednio powoduje rozwój zmian skórnych (np. łupież pstry oraz zapalenie mieszków włosowych) i drugą, do której należą atopowe zapalenie skóry, łojotokowe zapalenie skóry i łuszczyca, gdzie zmiany skórne są jedynie nasilane w wyniku obecności tych grzybów [115].
Na skórze zdrowych psów stwierdza się najczęściej występowanie M. pachydermatis nawet do 80% przypadków [17, 67]. Gatunek ten jest również stwierdzany, najczęściej spośród Malassezia, w chorobach skóry u tych zwierząt (30-80% przypadków zapalenia ucha zewnętrznego i około 30% przypadków atopowego i łojotokowego zapalenia skóry [61]).
Choroby wywoływane przez Malassezia pachydermatis
M. pachydermatis jest powszechnie występującym komensalem skóry i błon śluzowych zwierząt, głównie psów. Jest izolowany z 30-80% przypadków zapalenia ucha zewnętrznego u psów oraz z 30% przypadków łojotokowego i atopowego zapalenia skóry u tych zwierząt [61, 64, 116]. Badania przesiewowe wskazują, że gatunek ten zasiedla również skórę 20-80% zdrowych zwierząt [38, 67].
Zapalenie ucha zewnętrznego (otitis externa) jest chorobą występującą często, szczególnie u młodych kotów oraz psów w każdym wieku. Objawia się patologicznymi zmianami skórnymi w zewnętrznym przewodzie słuchowym, co może być spowodowane przez różne czynniki etiologiczne, wśród których M. pachydermatis zajmuje ważne miejsce [91]. Do najczęściej występujących objawów zapalenia ucha zewnętrznego zalicza się: wysięk charakteryzujący się często nieprzyjemnym zapachem, świąd oraz ból ucha. Niektóre rasy psów są bardziej podatne na wystąpienie tej choroby, co może być spowodowane m.in. budową anatomiczną uszu – wąskie przewody słuchowe, obfite owłosienie czy duża liczba gruczołów łojowych [80]. Dodatkowym czynnikiem związanym z objawami zapalenia ucha zewnętrznego może być reakcja na alergeny wytwarzane przez grzyby z rodzaju Malassezia [100]. Obecność M. pachydermatis u człowieka jest raczej przemijająca, a ze zdrowej ludzkiej skóry jest rzadko izolowany. Tym niemniej M. pachydermatis może być przykładem zoofilnego oportunisty, który coraz częściej jest wiązany z przypadkami chorób u ludzi. U ludzi poza zmianami skórnymi może być przyczyną układowych infekcji, gdy odporność gospodarza jest upośledzona oraz u noworodków hospitalizowanych na oddziałach intensywnej terapii, odżywianych pozajelitowo [1, 19, 26, 39, 41]. Pierwszy przypadek grzybicy systemowej, której przyczyną był M. pachydermatis, opisali Fine i wsp. w 1983 r. u pacjenta chorego na cukrzycę typu 1 ambulatoryjnie dializowanego otrzewnowo [33]. W literaturze wskazuje się, że zdrowi ludzie (np. personel medyczny posiadający psy) mogą być wektorami przenoszącymi M. pachydermatis na pacjentów szpitali. Grupą szczególnie narażoną na takie zakażenia są osoby leczone immunosupresyjnie i noworodki [19, 41].
Mimo stosowania bardzo silnie działających farmaceutyków, nie zawsze uzyskuje się pozytywne wyniki leczenia grzybic skóry. Przeszkody w zwalczaniu infekcji grzybiczych mogą wynikać z utrudnionego przenikania leku do miejsca rozwoju drożdżaków, gdzie zalegająca wydzielina lub nabłonek będący w fazie przerostowej utrudniają dostęp leku do głębszych warstw skóry. Istnieją również problemy w odpowiednio wczesnej diagnozie choroby i stwierdzaniu jej czynników etiologicznych. Stan ten może być spowodowany powszechnym występowaniem grzybów Malassezia również wśród zdrowych ludzi i zwierząt, co znacząco utrudnia ustalenie przyczyn choroby i podjecie właściwego leczenia. Być może skutkiem takiego stanu jest duży procent nawrotowości notowany wśród chorych na grzybice związane z Malassezia wśród zwierząt i ludzi. Z powodu zwiększającej się liczby różnych dermatoz, problemów w diagnostyce i leczeniu zyskują na znaczeniu badania służące opracowaniu metod identyfikacji potencjalnie patogennych szczepów wśród organizmów oportunistycznych, takich jak gatunki z rodzaju Malassezia.
Problem zróżnicowanej odpowiedzi na antybiotyki wśród szczepów Malassezia pachydermatis
Obecnie arsenał leków przeciwgrzybiczych składa się z pięciu głównych grup, do których zalicza się: polieny, azole, echinokandyny, antymetabolity i alliloaminy.
Polieny (np. amfoterycyna B) zbudowane z dużego pierścienia laktonowego, lipofilnego łańcucha zawierającego 3-7 wiązań podwójnych i fragmentu hydrofilowego z grupami hydroksylowymi. Do tej grupy nalezą leki o szerokim zakresie działania, stosowane w ciężkich grzybicach zagrażających życiu. Uszkadzają błony komórek grzybów i przyspieszają generowanie wolnych rodników [44, 50].
Azole dzielą się na imidazole (dwa atomy azotu w pierścieniu azolowym, np. ketokonazol) i triazole (trzy atomy azotu w pierścieniu azolowym np. flukonazol). Leki tej grupy działają na poziomie hamowania syntezy ergosterolu, który jest ważnym składnikiem błony komórkowej grzybów. Azole są stosowane głównie w zakażeniach wywołanych przez drożdżaki. Echinokandyny (np. kaspofungina) są wysoce selektywnymi lipopeptydami hamującymi syntezę glukanów ściany komórkowej grzybów. Stosowane są dożylnie głównie przeciwko Candida i Aspergillus.
Inną grupą związków o znaczeniu klinicznym są antymetabolity, wśród których jako lek przeciwgrzybiczny zastosowanie znalazła 5-fluorocytozyna (flucytozyna), będąca analogiem cytozyny. Jest przekształcana w komórkach do 5-fluorouracylu i kwasu 5-fluorourydylowego wbudowywanych w strukturę RNA. Powstający nieprawidłowy RNA zawierający fluorowe pochodne nukleotydów hamuje syntezę białek. Flucytozyna jest skuteczna przeciwko Candida, Cryptococcus i Rhodotorula. Powoduje supresję szpiku i jest hepatotoksyczna dla ludzi. W praktyce klinicznej lek ten często podaje się z innymi farmaceutykami o działaniu grzybobójczym (flukonazol, amfoterycyna B).
Alliloaminy (np. terbinafina) hamują syntezę ergosterolu i podwyższają stężenie skwalenu w błonach. Są to leki o szerokim działaniu przeciwgrzybicznym, zwalczające dermatofity, drożdżaki i grzyby pleśniowe. Są stosowane głównie w grzybicach skóry i paznokci, są stosunkowo mało toksyczne dla ludzi [6].
W literaturze pojawia się coraz więcej informacji na temat różnic we wrażliwości na leki szczepów M. pachydermatis izolowanych od zdrowych i chorych zwierząt (tabela 7).
Analizując wyniki badań zestawionych w tabeli 7 wyraźnie widać tendencję do obniżenia wrażliwości na powszechnie stosowane antymikotyki wśród szczepów izolowanych od chorych zwierząt. Wartości MIC (minimal inhibitory concentration) wyznaczone dla tych szczepów są w przypadku niektórych antybiotyków od kilku do nawet 100 razy wyższe niż oznaczone dla szczepów uzyskanych od zwierząt zdrowych. Dane te mogą świadczyć o nasilającym się zjawisku lekooporności wśród tych grzybów. Stwierdzono oporność na flucytozynę szczepów M. pachydermatis uzyskanych zarówno od chorych, jak i od zdrowych psów [112], podczas gdy szczepy izolowane od psów chorych wykazywały podwyższoną oporność na terbinafinę, ketokonazol i itrakonazol. Badania przeprowadzone na materiale wyizolowanym od chorych i zdrowych psów z Japonii, Korei i Tajwanu wykazały nawet 10-krotnie wyższą wartość MIC dla ketokonazolu u szczepów izolowanych od psów chorych w porównaniu ze szczepami od psów zdrowych. Jeszcze większą oporność wykazano dla itrakonazolu [104]. Podobne wyniki uzyskano w badaniach oporności M. pachydermatis na azole przeprowadzanych wśród psów we Włoszech [16]. Dane te mogą wskazywać, że obserwowane zjawisko ma zasięg ogólnoświatowy, a powszechne stosowanie środków przeciwgrzybiczych w dużych stężeniach sprzyja nabywaniu oporności działając jako swoisty czynnik selekcyjny. W badaniach in vitro wyindukowano oporność na flukonazol wskazując, że M. pachydermatis mogą nabywać oporność w wyniku wydłużonej terapii z wykorzystaniem tego leku [52]. Podobny efekt uzyskali Nakano i wsp. w 2005r. po 30 pasażach M. pachydermatis na pożywkach zawierających nystatynę, ketokonazol i terbinafinę [67]. W tych badaniach nie stwierdzono nabywania oporności na β-tujaplicynę, gdzie średnia wartość MIC nie uległa zmianie po 30 pasażach na pożywce zawierającej ten antybiotyk. Interesujące wyniki uzyskano porównując wrażliwość szczepów M. pachydermatis na mikonazol i klotrimazol od psów chorych na ostre i chroniczne zapalenie ucha zewnętrznego. Okazało się, że szczepy od psów z chronicznym zapaleniem ucha wykazywały dwukrotnie wyższe wartości MIC w stosunku do obu antybiotyków w porównaniu ze szczepami od psów z ostrym zapaleniem ucha [21]. Wynik ten może świadczyć o ewolucji oporności grzybów na antybiotyki, gdzie czynnikiem selekcyjnym jest proces długotrwałej terapii antybiotykowej. Istotne byłyby badania przesiewowe szczepów innych gatunków z rodzaju Malassezia pochodzących od zdrowych i chorych ludzi, w celu sprawdzenia, czy w takim układzie wystąpią podobne efekty.
| Antybiotyk | Wartość MIC (μg/ml) | ||
| Szczepy od psów zdrowych Średnia (zakres) | Szczepy od psów chorych Średnia (zakres) | Wartość średnia dla obu grup szczepów | |
| Amfoterycyna B | 0,08 | 0,18 | 0,13 |
| Clotrimazol | 0,07 | 2,08 (0,21 – 4,0) | 1,41 |
| Flukonazol | 0,07 | 7,05 (0,22 – 13,9) | 8,76 |
| Itrakonazol | 0,04 (0,03 – 0,06) | 0,95 (0,03 – 3,12) | 0,73 |
| Ketokonazol | 0,05 (0,03 – 0,09) | 0,47 (0,02 – 1,35) | 0,18 |
| Mikonazol | 0,22 (0,06 – 0,37) | 0,92 (0,12 – 2,0) | 0,57 |
| Nystatyna | 0,08 | 1,62 (0,18 – 3,13) | 1,24 |
| Posakonazol | 0,02 | 0,02 | 0,02 |
| Terbinafina | 0,99 | 0,82 (0,11 – 1,56) | 0,86 |
| Vorikonazol | 0,31 (0,03 – 0,60) | 0,10 (0,04 – 0,15) | 0,21 |
Tabela 7. Porównanie wartości MIC (minimal inhibitory concentration) dla wybranych antybiotyków w stosunku do szczepów Malassezia pachydermatis izolowanych od psów zdrowych i chorych na różne grzybice skóry (według [16, 21, 67, 104, 106,112])
W badaniach klinicznych stwierdzono również inne zjawisko oporności krzyżowej wśród szczepów M. pachydermatis. Szczepy oporne na flukonazol były również oporne na inne azole [16]. Podobne zjawisko stwierdzono wcześniej u Candida glabrata [101]. Oporność M. pachydermatis na flukonazol wśród przeszło 4% badanych szczepów wykazali również Lyskova i wsp. w 2007 r. [63], a wcześniej Eichenberg i wsp. dla 2,4% wyizolowanych szczepów [28]. Wśród szczepów M. pachydermatis izolowanych od psów stwierdzono również oporność na amfoterycynę B wśród ponad 30% izolatów. Szczepy wrażliwe charakteryzowały się wartością MFC (minimal fungicidal concentration) rzędu 0,1-0,5 μg/ml podczas, gdy MFC dla szczepów opornych wynosił 2-8 μg/ml [10]. Podobnie wartości MFC rzędu 8-32 μg/ml dla amfoteryczny B stwierdzano u różnych gatunków Malassezia izolowanych od ludzi i zwierząt [99]. Powyższe wyniki wskazują, że zjawisko lekooporności wśród Malassezia nie dotyczy tylko powszechnie stosowanych antybiotyków, takich jak np. ketokonazol, ale również środków stosowanych rzadziej, głównie przy leczeniu szpitalnym w przypadkach zakażeń ogólnoustrojowych, takich jak amfoteryczna B. Porównanie danych dotyczących wrażliwości szczepów M. pachydermatis uzyskanych od ludzi i zwierząt w stosunku do niektórych antybiotyków (tabela 8) wskazuje, że ludzkie szczepy wykazywały dużą oporność na flucytozynę, flukonazol i kaspofunginę. Amfoterycyna B, posakonazol i vorikonazol wykazywały porównywalną aktywność w stosunku do szczepów od ludzi i zwierząt.
| Antybiotyk | Wartość MIC (μg/ml) | |
| szczepy izolowane od ludzi | szczepy izolowane od zwierząt | |
| Amfoterycyna B | 0,22 | 0,18 |
| Flucytozyna | ≥32 | – |
| Flukonazol | ≥256 | 7,05 |
| Kaspofungina | ≥32 | – |
| Posakonazol | 0,02 | 0,02 |
| Vorikonazol | 0,10 | 0,10 |
Tabela 8. Porównanie wartości MIC (minimal inhibitory concentration) dla wybranych antybiotyków w stosunku do szczepów Malassezia pachydermatis izolowanych od zwierząt [16, 21, 67, 104, 106, 112] i ludzi chorych na grzybice [1]
Wyżej przytoczone dane na przykładzie M. pachydermatis wskazują, że zjawisko lekooporności lub obniżającej się podatności na leki dotyczy również grzybów z rodzaju Malassezia. W nasilaniu tego zjawiska ogromne znaczenie ma powszechne stosowanie antybiotyków, co jest swego rodzaju czynnikiem selekcyjnym faworyzującym oporne genotypy. Zjawisko to obecnie nie ma zasadniczego znaczenia klinicznego, gdyż terapeutyczne dawki antybiotyków są nawet 1000 razy wyższe niż wartości MIC dla poszczególnych antybiotyków [21]. Tym niemniej zjawisko rozwoju lekooporności wśród grzybów powinno być stale monitorowane.
Ważne jest to, że szczepy izolowane od zwierząt zdrowych i chorych wykazywały różną wrażliwość na stosowane leki. Wartości MIC dla szczepów M. pachydermatis pochodzących od psów chorych były wyższe niż dla szczepów od psów zdrowych w większości stosowanych antybiotyków. Taka sytuacja może świadczyć o możliwości występowania cech charakterystycznych dla różnych szczepów grzybów (w zależności od źródła pochodzenia) na poziomie genetycznym i biochemicznym. Biorąc to pod uwagę, wyodrębnienie takich cech może być ważne w postawieniu właściwej diagnozy, a następnie terapii. Odpowiednio wcześnie postawiona prawidłowa diagnoza może wyeliminować nadmierne i nie zawsze do końca uzasadnione stosowanie antybiotyków, a co za tym idzie przyczynić się do ograniczenia lekooporności.
Prócz monitorowania zjawiska i badań nad genezą lekooporności należy prowadzić prace nad nowymi farmaceutykami o aktywności przeciwgrzybicznej. Przykładem takiego działania mogą być badania β-tujaplicyny jako środka przeciwgrzybicznego. Innym sposobem walki z grzybami w obliczu nasilającej się lekooporności mogą być próby wykorzystywania addytywnego lub synergistycznego działania różnych środków. Przykładem może być wykazana wcześniej skuteczniejsza kombinacja polimiksyny B i mikonazolu w stosunku do Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli i M. pachydermatis [73]. W formułowaniu nowych leków przeciwgrzybicznych można również wykorzystywać kombinacje znanych antymikotyków z antymetabolitami hamującymi rozwój grzybów, które wcześniej nie były wykorzystywane w praktyce klinicznej jak np. antywitaminy. Kombinacje takie mogą być równie skuteczne jak pojedynczo stosowane substancje, ale w niższych stężeniach, co nie jest bez znaczenia zarówno z powodu lekooporności jak również zapobiegania działaniom niepożądanym leków stosowanych w dużych dawkach. Nadzieje wiąże się także z przeciwgrzybiczą synergistyczną aktywnością ketokonazolu i oksytiaminy, co stało się przedmiotem patentu złożonego w 2016 [95]. Opublikowano także wyniki badań dotyczące hamującego wpływu samej oksytiaminy (antymetabolit tiaminy) na komórki grzybów M. pachydermatis, S. cerevisiae i C. albicans [85].
Podsumowanie
Grzyby z rodzaju Malassezia są poważnym wyzwaniem diagnostycznym, jak i terapeutycznym, ponieważ nie ma jednoznacznych kryteriów oceny patogenności tych grzybów. Nie wiadomo również, czy patogenność uwarunkowana jest wyłącznie czynnikami zależnymi od gospodarza, czy też szczepy patogenne mają niezależne mechanizmy wirulencji, a inne czynniki jedynie wyzwalają ich ekspresję. Brak również precyzyjnych informacji o cechach, z wykorzystaniem których można rozróżnić formę komensalną i patogenną. Przytoczone przykłady mogą świadczyć o tym, że wśród grzybów z rodzaju Malassezia widać wyraźne zróżnicowanie w obrębie szczepów tego samego gatunku izolowanych od pacjentów zdrowych i chorych. Występuje również odmienność genetyczna gatunków z tego rodzaju, która może być skutkiem horyzontalnego transferu genów, a także eliminacji pewnych sekwencji, które są charakterystyczne dla innych podstawczaków, na drodze ewolucji i adaptacji do specyficznej niszy ekologicznej zajmowanej przez te drożdżaki. Znajduje to odzwierciedlenie w swoistych cechach biochemicznych (np. strukturze antygenowej czy aktywności fosfolipaz), które różnią obie grupy szczepów. Może to świadczyć o tym, że wśród gatunków z rodzaju Malassezia istnieją szczepy komensalne i potencjalnie patogenne. Jeśli taka hipoteza zostałaby potwierdzona badaniami, mogłoby to spowodować weryfikację dotychczas uznawanej definicji oportunizmu wśród grzybów. W związku z tym zasadne jest poszukiwanie różnic między szczepami Malassezia, które można by wykorzystać jako potencjalne markery patogenności tych grzybów.