Streszczenie

Actinobacteria (promieniowce) wywołują wiele chorób, m.in. gruźlicę, promienicę, zakaże­nia układu oddechowego oraz patologiczne zmiany skórne, zaliczane są też do szkodliwych czynników biologicznych w środowisku pracy. Wysoki poziom aktynobakterii stwierdzano na stanowiskach pracy w kompostowniach, w zakładach gospodarki odpadami, a także bibliote­kach i muzeach.
Prawidłowa identyfikacja aktynobakterii wymaga zastosowania wieloetapowej diagnostyki, obejmującej badanie cech morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych i chemiotak­sonomicznych oraz genotypowania, w tym analizę sekwencji 16S rRNA i hybrydyzację DNA­-DNA. Komercyjnie dostępne zestawy diagnostyczne często nie uwzględniają wielu gatunków izolowanych ze środowiska, dlatego poleca się ich uzupełnienie analizą markerów chemio­taksonomicznych: składników peptydoglikanu, kwasów tłuszczowych, lipidów polarnych (fosfo- i glikolipidów) oraz chinonów izoprenowych.
W pracy omówiono metody izolacji i identyfikacji aktynobakterii, ze szczególnym uwzględ­nieniem metod chemiotaksonomicznych. Postępowanie diagnostyczne przedstawiono na przykładzie izolatów środowiskowych – szczepów pochodzących z kompostowni i biblioteki.

Słowa kluczowe:Actinobacteria • bioaerozol • biologiczne czynniki zagrożenia środowiska pracy • identyfikacja aktynobakterii • chemiotaksonomia

Summary

Actinobacteria, the etiologic agents of tuberculosis, actinomycosis, respiratory infections and pathological skin lesions, are also classified as hazardous biological agents at the workplace. An increased number of Actinobacteria primarily occurs at the workplaces in composting plants, agriculture, waste management facilities, libraries and museums. Robust identification of Actinobacteria requires a polyphasic diagnostic strategy including an assessment of morphological, physiological, biochemical and chemotaxonomic features as well as genotyping. Commercially available diagnostic kits often do not include bacteria isolated from the environment and therefore analyses of chemotaxonomic markers – components of peptidoglycan, fatty acids, polar lipids (phospho- and glycolipids) and isoprenoid quinones are recommended.
The paper discusses a comprehensive approach to the isolation and identification of Actino­bacteria, with emphasis on chemotaxonomic methods. A diagnostic procedure is exemplified by environmental strains obtained from composting plants and libraries.

Key words:Actinobacteria • bioaerosol • biological occupational risk • Actinobacteria identification • chemotaxonomic methods

Wstęp

Zagrożenie związane z zawodową ekspozycją na mikro­organizmy dotyczy wielu miejsc pracy i zakładów produkcji żywności, występuje w rolnictwie, służbie zdrowia, w zakładach gospodarki odpadami, w oczysz­czalniach ścieków, a także w muzeach, archiwach i bibliotekach. Po wejściu w życie Dyrektywy Parlamentu Europejskiego i Rady Unii Europejskiej 2000/54/WE [11] w sprawie ochrony pracowników przed ryzykiem zwią­zanym z narażeniem na działanie czynników biologicz­nych w miejscu pracy, powstała konieczność doboru metod oznaczania drobnoustrojów i ich szkodliwych produktów, odpowiednich do różnych środowisk zawo­dowych [9,14,40].

Narażenie zawodowe na czynniki mikrobiologiczne pro­wadzi głównie do schorzeń dróg oddechowych i płuc, ponieważ drobnoustroje wchodzące w skład bioaerozolu dostają się do organizmu drogą inhalacji, a także poprzez infekcje bezpośrednie, przebiegające w wyniku zanie­czyszczenia uszkodzonej skóry drobnoustrojami pato­gennymi [17].

Wśród szkodliwych czynników biologicznych są aktyno­bakterie, czyli drobnoustroje należące do klasy Actino­bacteria, tradycyjnie nazywane także promieniowcami [42]. Promieniowce wykazują typową budowę komórek mikroorganizmów należących do domeny Bacteria, tj. obecność nukleoidu, strukturę ściany komórkowej zbu­dowanej z peptydoglikanu, w ścianie komórkowej nie stwierdza się obecności steroli.

Podwyższony poziom aktynobakterii był oznaczany w obiektach kompostowania odpadów i w rolnictwie [36]. Wykazano, że podczas kompostowania (w fazie termofilnej) liczba aktynobakterii w kompoście może wynosić 1,7×10⁶ jtk/g (jtk – jednostka tworząca kolonię), a ich koncentracja w powietrzu dochodzi do 6,8×10⁵ jtk/ m³ [24]. Wszechstronny aparat enzymatyczny, umożli­wiający wykorzystywanie różnych substancji odżyw­czych, pozwala promieniowcom na zasiedlanie m.in. pomieszczeń archiwalnych, muzealnych i bibliotecz­nych, zwłaszcza o znacznym zawilgoceniu. Następuje biodeterioracja przechowywanych obiektów i infestacja promieniowcami, przejawiająca się zwykle charaktery­stycznym zapachem [20,43], pochodzącym od geosminy (1,10-dimetylodeka-9-ol), alkoholu bicyklicznego o wzo­rze sumarycznym C₁₂H₂₂O.

Ze względu na zdolność fragmentacji pseudogrzybni powietrznej oraz wytwarzanie zarodników aktynobak­terie wchodzą w skład aerozolu w środowisku pracy i w konsekwencji mogą bardzo negatywnie oddziały­wać na zdrowie pracowników. Actinobacteria są czynni­kami etiologicznymi gruźlicy, trądu, błonicy, promienicy, zakażeń układu oddechowego oraz patologicznych zmian skórnych [22,23]. Za zakażenia oportunistyczne u osób z dysfunkcją układu odpornościowego mogą być odpowiedzialne bakterie z rodzajów Mycobacterium, Nocardia, Gordonia, Tsukamurella, Corynebacterium, Actino­myces, Propionibacterium, Nocardiopsis, Rothia i innych.

Identyfikacja aktynobakterii, niezwykle ważna w ustale­niu etiologii zakażeń oportunistycznych, nie jest zada­niem prostym i wymaga zastosowania wieloetapowej strategii diagnostycznej. Kompleksowa diagnostyka tych drobnoustrojów obejmuje ocenę cech morfologicznych, fizjologicznych i biochemicznych, różnicowanie skład­ników osłon komórkowych oraz genotypowanie (analiza sekwencji 16S rRNA, hybrydyzacja DNA-DNA).

Ponieważ komercyjnie dostępne zestawy diagnostyczne (np. Vitek i API firmy bioMérieux) często nie uwzględ­niają drobnoustrojów izolowanych ze środowiska, ana­liza markerów chemiotaksonomicznych, która obejmuje oznaczanie wybranych składników peptydoglikanu, kwasów tłuszczowych, lipidów polarnych (fosfo- i gli­kolipidów) oraz chinonów izoprenowych [32] umożli­wia identyfikację drobnoustrojów do poziomu rodzaju, a w niektórych przypadkach nawet gatunku.

W pracy przedstawiono przegląd metod stosowanych w diagnostyce środowiskowych izolatów aktynobakte­rii oraz praktyczną procedurę postępowania ze szcze­pami pochodzącymi z powietrza pobranego na terenie kompostowni, prób kompostu, jak i materiału zebranego z powierzchni sprzętów w bibliotece.

Metody izolacji aktynobakterii ze środowiska

Analiza mikrobiologiczna powietrza

Analiza mikrobiologiczna powietrza znajduje szero­kie zastosowanie w badaniach środowiska pomieszczeń w różnych gałęziach przemysłu farmaceutycznego, spo­żywczego, w szpitalach i innych miejscach pracy.

Techniki izolacji aktynobakterii z powietrza oparte są na hodowli drobnoustrojów na odpowiednich podłożach mikrobiologicznych. Najprostszą metodą poboru prób powietrza jest metoda sedymentacji (metoda Kocha). Polega ona na grawitacyjnym osiadaniu mikroorgani­zmów na powierzchni pożywek agarowych na płytkach Petriego.

W metodzie syfonizacji powietrze przepuszczane jest przez aparat, a zassana próba rozpyla ciecz zawartą w zbiorniku. Następuje w ten sposób wychwytywanie zanieczyszczeń pyłowych, w tym mikroorganizmów znajdujących się w badanym powietrzu. W zbiorniku adsorpcyjnym powietrze i część płynu zawierającego mikroorganizmy są dodatkowo filtrowane. Pobrane próby płynu ze zbiornika syfonizacyjnego i adsorpcyj­nego miesza się i wykonuje posiewy na podłoża hodow­lane [15].

Metoda zderzeniowa (impakcyjna), obecnie najczęściej stosowana w badaniach terenowych, polega na zderze­niu zassanego przez próbnik strumienia powietrza wraz z drobnoustrojami z powierzchnią zestalonej pożywki. Wyróżnia się dwie odmiany próbników powietrza, które cechuje inny sposób przepuszczania i kierowania powie­trza na pożywkę: jedne działają na zasadzie wirowania zassanego powietrza, inne na zasadzie zasysania powie­trza przez szczeliny w głowicy próbnika [15].

Pobieranie prób powietrza metodą filtracji polega na przepuszczeniu określonej objętości powietrza przez jałowy filtr membranowy lub inny czynnik (piasek, węgiel, bulion itp.). Najczęściej stosuje się sterylne fil­try żelatynowe, które osadza się w głowicy próbnika. Po pobraniu prób powietrza filtr przenosi się na płytkę z pożywką i inkubuje. W przypadku dużego zanieczysz­czenia powietrza filtr można rozpuścić (np. w wodzie lub roztworze soli fizjologicznej) i kilka razy rozcieńczyć przed wysiewem na podłoża stałe.

Z punktu widzenia higieny pracy ważne jest określenie liczby mikroorganizmów stanowiących frakcję respira­bilną, które mogą wnikać do oskrzeli i płuc powodując zagrożenie zdrowia u pracowników. Przykładem aparatu pozwalającego na taki rozdział bioaerozolu jest 6-stop­niowy impaktor Andersena (6STG Sampler) [1,10].

Do izolacji aktynobakterii z powietrza najczęściej sto­suje się podłoża bogate w składniki odżywcze, np. agar z hydrolizatem kazeinowo-sojowym (TSA) i podłoże tio­glikolanowe. Dodatek nystatyny do wymienionych pod­łoży pozwala zahamować wzrost grzybów i umożliwia izolację promieniowców, wymagających inkubacji przez 3-5 dni w temperaturze 37 i 44°C.

Izolacja aktynobakterii z powierzchni i z kompostu

Najczęściej stosowanym sposobem izolacji aktynobakte­rii z powierzchni jest metoda wymazów. Przeznaczona jest do pobierania prób z powierzchni o różnych kształ­tach, sprawdza się także w warunkach wysokiej kon­taminacji, ponieważ umożliwia wykonanie kolejnych rozcieńczeń przed dalszą hodowlą na podłożach stałych.

Metoda odciskowa (płytki kontaktowe, testy łopatkowe) sprawdza się w przypadku powierzchni płaskich, gład­kich, o niewielkich wymiarach i niskim lub średnim stopniu zanieczyszczenia.

Aktynobakterie z kompostu izoluje się metodą roz­cieńczeń: materiał zawieszony w podłożu hodowlanym podlega wielokrotnemu rozcieńczeniu, po czym jest wysiewany na odpowiednie podłoża stałe.

Metody identyfikacji aktynobakterii środowiskowych

Wstępna identyfikacja morfologiczna

Czyste kultury drobnoustrojów otrzymane w wyniku izolacji z materiału wyjściowego należy przesiać na podłoże stałe i poddać inkubacji. Otrzymane pojedyn­cze kolonie różnicuje się klasycznymi metodami makro-i mikroskopowymi. W obrazie makroskopowym zwrócić należy uwagę na charakterystyczne cechy aktynobak­terii: występowanie pseudogrzybni powietrznej i pseu­dospor. Istotna jest ocena morfologiczna preparatu mikroskopowego, ponieważ obecność polimorficznych, rozgałęzionych komórek może świadczyć o przynależno­ści szczepu do aktynobakterii. Należy jednak pamiętać, że do mikroorganizmów tej klasy należą także maczu­gowce i prątki, więc również takie formy morfologiczne powinny być brane pod uwagę we wstępnej identyfikacji izolatów środowiskowych [39].

Morfologia aktynobakterii

Do hodowli aktynobakterii zaleca się podłoże z wyciągiem mózgowo-sercowym (BHI) oraz pod­łoże z wyciągiem drożdżowym i glukozą (podłoże 79). Określenie cech morfologicznych wzrostu promie­niowców wykonuje się na podłożach stałych: agarze odżywczym (NA), ekstrakcie słodowo-drożdżowym z dodatkiem glukozy (GYM), agarze owsianym (ISP 3), agarze skrobiowym z dodatkiem soli nieorganicznych (ISP 4), agarze glukozowo-ziemniaczanym (PDA), pod­łożu tryptozowo-drożdżowym (TSA), ekstraktach trypto­zowo-drożdżowym (TYE), drożdżowo-słodowym (MYE), drożdżowym z dodatkiem peptonu i glukozy (YPG) [51].

W morfologii kolonii należy określić cechy kolonii: barwę, strukturę (gładkie, woskowate, śliskie, pofałdo­wane, pokryte meszkiem), strukturę brzegów (regu­larne, nieregularne), ich wielkość oraz formę (płaskie, wypukłe) i barwę od spodniej strony płytki. Aktynobak­terie tworzą charakterystyczne kolonie: gładkie i błysz­czące, albo skórzaste, garbowane, membranowe, pokryte pseudogrzybnią powietrzną z zarodnikami (tab. 1, ryc. 1, 2, 3, 4).

Tabela 1. Charakterystyka fenotypowa wybranych rodzajów aktynobakterii i bakterii termofilnych Thermoactinomyces – morfologia [2,3,13,21,30,33,34,35,41,45,47,48,49,50,52]

Ryc. 1. Kolonie Streptomyces albus; podłoże 79, wzrost 7 dni

Ryc. 2. Kolonie Streptomyces flavisclerotis; podłoże 79, wzrost 7 dni

Ryc. 3. Kolonie Streptomyces griseus; podłoże 79, wzrost 7 dni

Ryc. 4. Kolonie Streptomyces hiroshimensis; podłoże 79, wzrost 7 dni

Niektóre rodzaje aktynobakterii wytwarzają pseudo­spory zdolne do ruchu za pomocą wici [37]. Pseudo­grzybnia powietrzna tworzy łańcuszki spor [4].

Podstawowym kryterium morfologicznym jest obraz mikroskopowy po barwieniu metodą Grama. Promie­niowce należą do bakterii Gram-dodatnich, ale ze względu na budowę ściany komórkowej niektóre barwią się Gram-zmiennie (tab. 2). Komórki promieniowców przypominają zwykle kształtem proste lub lekko zakrzy­wione formy o długości 10-15 µm oraz średnicy 1-1,5 µm. W obrazie mikroskopowym należy zwracać uwagę na obecność wydłużonych form – prostych lub rozga­łęzionych oraz pseudospor o różnej wielkości, różnym kształcie i sposobie tworzenia [6]. Warto również wyko­nać barwienie bakterii metodą Ziehla-Neelsena, w której wybarwiają się zbudowane z grubej warstwy lipidowej prątki i inne kwasooporne aktynobakterie, zawierające kwasy mikolowe w ścianie komórkowej

Tabela 2. Charakterystyka fenotypowa wybranych rodzajów aktynobakterii i bakterii Thermoactinomyces – cechy fizjologiczne i biochemiczne [2,3,13,21,30,33,34,35,41,45,47,48,49,50,52]

W artykule przedstawiono morfologiczne cechy wybra­nych aktynobakterii; są to mikroorganizmy typowo tlenowe, często izolowane ze środowiska naturalnego, wśród których klasyfikuje się wiele gatunków patogen­nych dla człowieka (tab. 1).

Oznaczanie cech fizjologicznych i biochemicznych

Do istotnych cech fizjologicznych i biochemicznych, pomocnych w identyfikacji aktynobakterii należy pro­dukcja pigmentów, określenie optymalnej temperatury i pH wzrostu oraz rozkład azotanów, skrobi, żelatyny, kazeiny (przydatne zwłaszcza w diagnostyce rodzaju Micromonospora). W przypadku rodzajów Nocardia i Rho­dococcus zwrócić należy uwagę na zdolność degradacji fenolu, naftalenu, benzyny, ropy naftowej, krezolu lub cytrynianów oraz wytwarzanie indolu, tworzenie kata­lazy i kwasów z glukozy, laktozy, sacharozy i glicerolu [17,27,33,45,48].

Przynależność do rodzaju Streptomyces określa się po uwzględnieniu rozkładu eskuliny i tyrozyny; hydroliza tłuszczów jest cechą diagnostyczną rodzaju Thermoacti­nomyces [18].

Dostępne są testy fizjologiczno-biochemiczne, różnicujące rodzajowe i/lub gatunkowe właściwości fenotypowe niektórych taksonów, np. test API Coryne (bioMérieux). W tabeli 2 zestawiono wybrane cechy fizjologiczne i biochemiczne przydatne w diagnostyce aktynobakterii.

Identyfikacja aktynobakterii – metody chemiotaksonomiczne

Analiza chromatograficzna ekstraktów surowych lipidów bak­teryjnych

Aktynobakterie namnaża się na bogatych podłożach płynnych w hodowli podpowierzchniowej w celu uzyska­nia biomasy bakteryjnej, która posłuży do przeprowadze­nia szczegółowych badań markerów chemicznych ściany i błony komórkowej. Przyjmuje się, że 2-10 g mokrej biomasy jest wystarczająca, aby uzyskać dokładną informację o właściwościach chemiotaksonomicznych badanego szczepu.

Zasadniczym badaniem jest analiza surowych lipidów, otrzymywanych przez dwukrotne wytrząsanie ok. 500 mg mokrej biomasy w mieszaninie chloroform-metanol (2:1, v/v) w temperaturze pokojowej. Ekstrakt przesącza się, aby odrzucić debris komórkowe, po czym odparo­wuje, waży, a następnie rozpuszcza w chloroformie (50 mg/ml).

Profil lipidowy bakterii uzyskuje się przez naniesienie ekstraktu (ok. 20 µl) na płytki do chromatografii cien­kowarstwowej (TLC) z żelem krzemionkowym, rozwijane standardowo w układzie rozpuszczalników chloroform­-metanol-woda (65:25:4, v/v/v).

Do wywołania rozdzielonych w TLC substancji stosuje się odczynniki [32]:
• wanilinowy: 0,5% roztwór waniliny w 3% kwasie siarko­wym w etanolu, wywołujący pełny profil lipidów polar­nych i niepolarnych w badanych ekstrakcie;
• ninhydrynowy: 0,25% roztwór ninhydryny w acetonie – związki lipidowe zawierające grupę aminową;
• molibdenowy Dittmera i Lestera – fosfolipidy;
• orcynolowy: 0,5% roztwór orcynolu w 3% kwasie siar­kowym w etanolu – związki lipidowe zawierające cukry, glikolipidy.

Na tym etapie badania właściwości izolatu środowi­skowego porównuje się ze znanymi, kolekcyjnymi szczepami aktynobakterii z rodzajów najczęściej wystę­pujących, np. Saccharopolysopra, Nocardia, Nocardiopsis, Streptomyces, Rothia, Rhodococcus. W przypadku fosfoli­pidów nanosi się standardy tych związków, które mają znaczenie chemiotaksonomiczne, tj. fosfatydyloetano­laminę (PE), fosfatydylocholinę (PC), fosfatydyloglicerol (PG), difosfatydyloglicerol (DPG), fosfatydyloinozytol (PI). Izolaty aktynobakterii zaklasyfikować można do jednego z pięciu typów fosfolipidowych: P I – niezawie­rające fosfolipidów, a zawierających azot; P II – zawiera­jące PE; P III – zawierające PC; P IV – zawierające GlcNU (fosfolipid o nieznanej strukturze zawierający glukoza­minę) i PE; P V – zawierające GlcNU i PG [25,28].

Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych

Identyfikacja taksonomiczna bakterii z zastosowaniem analizy profilu estrów metylowych kwasów tłuszczo­wych (fatty acid methyl esters, FAMES) jest szeroko stosowana dla przedstawicieli wszystkich poziomów systematycznych. Niektóre kwasy tłuszczowe, jako uni­kalne w przyrodzie markery biochemiczne, służą do bezpośredniego jakościowego i ilościowego oznaczania drobnoustrojów danej grupy wprost w pobranej pró­bie środowiskowej lub w materiale klinicznym meto­dami analitycznymi, bez konieczności izolacji szczepu i namnażania na podłożach mikrobiologicznych. Przy­kładem jest analiza 3-hydroksylowych kwasów tłusz­czowych, składników lipopolisacharydu budującego osłony komórkowe bakterii Gram-ujemnych; związki te oznaczano w bioaerozolu, m.in. w badaniach środowiska pracy, za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GCMS) [44].

Oznaczanie profilu FAMES przebiega w dwóch etapach: bakterie (2 mg suchej lub około 50 mg mokrej biomasy bakteryjnej) poddaje się metanolizie w 4M metanolo­wym roztworze HCl, w temp. 80°C przez 1 godz., następ­nie poddaje ekstrakcji do mieszaniny heksan-woda (1:1), po czym fazę organiczną zawierającą uwolnione estry metylowe kwasów tłuszczowych suszy się pod strumie­niem azotu. W drugim etapie uzyskaną próbkę anali­zuje się za pomocą GCMS. Identyfikacja poszczególnych kwasów tłuszczowych na ogół nie nastręcza trudności, ponieważ dostępne są biblioteki ich widm masowych, a w przypadkach wątpliwych widmo i czas retencji danego związku porównuje się ze standardami chemicz­nymi. W wyniku analizy bakteryjnych FAMES otrzymuje się zestawienie składu procentowego kwasów tłuszczo­wych.

W identyfikacji aktynobakterii ważną rolę pełnią kwasy mikolowe – długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, swo­iste składniki budujące ścianę komórkową promie­niowców, m.in. Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Dietzia, Tsukamurella, Corynebacterium. Kwasy mikolowe są α-rozgałęzione, podstawione grupą hydroksylową w pozycji β; zawierają 30-90 atomów węgla w łańcuchu. Najkrótsze łańcuchy występują w komórkach Coryne­bacterium, a najdłuższe u Mycobacterium, gdzie odpowia­dają za kwasooporność komórek. Większość z nich jest estrowo związana z arabinogalaktanem, polisacharydem wchodzącym w skład osłon komórkowych, inne wystę­pują w stanie wolnym. Istnieje wiele metod oznacza­nia kwasów mikolowych. Występowanie w komórkach mikroorganizmów i długość łańcuchów kwasów mikolo­wych można oznaczać w zależności od dostępnej apara­tury (po przeprowadzeniu w estry metylowe) za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC), jako estry p-bromofenacylowe w HPLC [7] lub za pomocą spektro­metrii MALDI-TOF [26].

Oznaczanie chinonów izoprenoidowych

Chinony izoprenoidowe występują w błonie cytopla­zmatycznej większości bakterii. Zalicza się do nich menachinony (oznaczane początkowo jako witamina K2) i ubichinony (koenzym Q). Taksonomicznie ważna jest liczba jednostek izoprenowych w łańcuchu poli­prenylowym; u aktynobakterii najczęściej występują menachinony zawierające 8-9 jednostek izoprenowych. Zakres swoistości taksonomicznej chinonów bywa sze­roki i cecha ta powinna być rozpatrywana wraz z innymi właściwościami chemiotaksonomicznymi.

Chinony ekstrahuje się z suchej masy komórkowej mie­szaniną chloroform-metanol i oczyszcza za pomocą TLC. Analiza tych związków wymaga użycia HPLC, kolumn z odwróconym układem faz i spektrometrii mas [8].

Analiza składników ściany komórkowej aktynobakterii

Analiza składu aminokwasowego i cukrowego peptydo­glikanu, głównego składnika ściany komórkowej bak­terii Gram-dodatnich, do jakich należą aktynobakterie, pozwala na określenie typu ściany komórkowej, charak­terystycznej dla każdego rodzaju.

Izomery kwasu diaminopimelinowego (DAP), jednego z istotnych aminokwasów budujących mostki peptydowe w peptydoglikanie, wykrywane są w hydrolizatach komór­kowych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Izomery LL- i mezo-DAP charakteryzują się niższym niż inne aminokwasy współczynnikiem retencji w TLC oraz oliw­kowo-zieloną barwą po wywołaniu odczynnikiem ninhy­drynowym (ryc. 10). Wykrycie i określenie izomerii kwasu diaminopimelinowego w szczepie środowiskowym znacznie ułatwia jego identyfikację. W tabeli 3 zestawiono markery chemiotaksonomiczne wybranych rodzajów aktynobakterii.

Tabela 3. Markery chemiotaksonomiczne wybranych rodzajów aktynobakterii i bakterii termofilnych Thermoactinomyces [2,3,13,21,30,33,34,35,41,45,47,48,49,50,52]

Genotypowanie aktynobakterii

Analiza 16S rRNA i hybrydyzacja DNA-DNA

Identyfikacja aktynobakterii za pomocą analizy cech genetycznych obejmuje określenie podobieństwa sekwencji 16S rDNA/rRNA, pomiędzy szczepami o róż­nym pokrewieństwie oraz hybrydyzację DNA-DNA, wykazującą stopień podobieństwa (w procentach) mię­dzy pojedynczymi nićmi DNA szczepów reprezentują­cych pokrewne gatunki [46].

W celu uzyskania informacji o występowaniu konkret­nego gatunku aktynobakterii przeprowadza się badanie z wykorzystaniem swoistych primerów, które po ampli­fikacji za pomocą PCR porównuje się z posiadanymi wzorcami szczepów kolekcyjnych [38].

Identyfikacja szczepów środowiskowych – przykłady

Materiał biologiczny

Szczepy bakteryjne KM1, KM2, KM3, KM4, KM5 oraz KM31 były izolowane z miejskich kompostowni pryzmo­wych, wytwarzających kompost z organicznej frakcji odpadów komunalnych oraz odpadów zielonych pocho­dzących z targowisk miejskich i giełd warzywno-owoco­wych. Izolat KM5 pozyskano z powietrza z bioaerozolu w hali załadunkowej, w czasie pracy urządzenia ładu­jącego kompost. Szczepy KM1, KM2, KM3, KM4 i KM31 pochodziły z prób kompostu na różnych etapach kom­postowania – odpowiednio był to kompost 7-, 6-, 4-, 7- i 12-tygodniowy.

Szczep BI10 wyizolowano z powierzchni drewnia­nej półki znajdującej się w magazynie bibliotecznym – pomieszczeniu bez wentylacji, gdzie zniszczone książki leżały na podłodze, na ścianach widoczne były ślady zalania i łuszcząca się farba.

Izolacja szczepów środowiskowych

Izolaty KM1, KM2, KM3, KM4 oraz KM31 z kompostowni miejskiej uzyskano z prób kompostu (10 g) przeniesio­nego do sterylnej soli fizjologicznej (90 ml) i poddanego wytrząsaniu (15 min). Z tak przygotowanego materiału wykonano rozcieńczenia w soli fizjologicznej (10^-2 i 10^-3), które wysiewano na stałe podłoże tryptozowo-sojowe (TSA) i inkubowano w temp. 28 i 55°C przez 4 dni.

Izolat KM 5 uzyskano z próby powietrza pobranej metodą zderzeniową, z użyciem aparatu MAS100 (Merck­-Millipore, Niemcy). Do analizy pobrano 100 l powietrza, a drobnoustroje zatrzymane na powierzchni pożywki TSA inkubowano w temperaturze 28 i 55°C przez 4 dni.

Szczep BI10 został wyizolowany w bibliotece z użyciem płytek odciskowych RODAC Envirocheck z podłożem TSA i neutralizatorami (Merck-Millipore, Niemcy) (inkubacja w temp. 28 i 55°C przez 4 dni).

Morfologia kolonii

Na rycinach 5 i 6 przedstawiono morfologię komórek i kolonii szczepów środowiskowych na podłożach 79 i BHI.

Ryc. 5. Szczep BI10, wyizolowany z powierzchni półki bibliotecznej; a – kolonie na podłożu 79, inkubacja w 37°C, 15 dni; b – obraz mikroskopowy z hodowli płynnej w podłożu 79, inkubacja 37°C, 48 h, barwienie metodą Grama, powiększenie 1500×

Ryc. 6. Szczep KM31, wyizolowany z prób 12-tygodniowego kompostu; a – kolonie na podłożu BHI, inkubacja 37°C, 14 dni; b – obraz mikroskopowy z hodowli płynnej w podłożu 79, inkubacja 37°C, 48 h, barwienie metodą Grama, powiększenie 1500×

W obrazie mikroskopowym wszystkie badane szczepy cechowały się wytwarzaniem pseudogrzybni powietrz­nej oraz nitkowatymi komórkami Gram-dodatnimi z roz­gałęzieniami.

Izolat KM31 charakteryzował się wytwarzaniem brązo­wego pigmentu dyfundującego do podłoża.

Analiza chemiotaksonomiczna

Analizę chromatograficzną ekstraktów lipidowych sied­miu izolatów promieniowców przedstawiono na ryc. 7 – 9. Surowe ekstrakty lipidowe (50 mg/ml) nanoszono na płytki TLC Silica gel 60 (Merck-Millipore) i rozwijano w układzie chloroform-metanol-woda (65:25:4, v/v). Rozdziały chromatograficzne wywoływano odczynni­kami pozwalającymi na detekcję lipidów zawierających grupę -NH2, fosfolipidów, lipidów zawierających cukier i obrazujących pełny profil związków lipidowych (ryc. 7).

Ryc. 7. Chromatogram TLC ekstraktu lipidowego pochodzącego ze szczepów środowiskowych: a – KM1; b – KM3; układ rozwijający: chloroform- -metanol-woda (65:25:4, v/v/v); Wywoływacz: 1 – 0,5% ninhydryna, temp. pokojowa; 2 – odczynnik molibdenowy, temp. pokojowa; 3 – 0,5% wanilina, temp. 120°C; 4 – 0,5% orcynol; temp. 120°C

Analiza chromatograficzna ekstraktu lipidowego pozy­skanego ze szczepów KM1 (ryc. 7, 8) oraz KM2, KM4, KM5, BI10 i KM31 wykazała obecność fosfatydyletano­laminy, co świadczy o przynależności analizowanych szczepów do typu fosfolipidowego PII. W przypadku eks­traktu uzyskanego z biomasy szczepu KM3 nie stwier­dzono fosfatydyletanolaminy, zatem należy on do typu fosfolipidowego PIII (ryc. 9).

Ryc. 8. Cienkowarstwowa chromatografia dwukierunkowa ekstraktu lipidowego szczepu KM 1: a – wywołany odczynnikiem Dittmera-Lestera obrazującym związki zawierające fosfor; b – wywołany odczynnikiem ninhydrynowym obrazującym związki zawierające grupy aminowe. 1 – ekstrakt lipidowy szczepu KM1; 2 – fosfatydylocholina; 3 – fosfatydyloetaloamina [31]

Ryc. 9. Cienkowarstwowa chromatografia dwukierunkowa ekstraktu lipidowego szczepu KM3: a – wywołany odczynnikiem Dittmera-Lestera obrazującym związki zawierające fosfor; b – wywołany odczynnikiem ninhydrynowym obrazującym związki zawierające grupy aminowe. 1 – ekstrakt lipidowy szczepu KM3; 2 – fosfatydylocholina; 3 – fosfatydyloetaloamina [31]

Kwasy tłuszczowe proste i rozgałęzione (izo i anteizo) oraz kwas tuberkulostearynowy (10-metylostearynowy) wykryte w identyfikowanych szczepach zestawiono w tab. 4.

Tabela 4. Skład procentowy kwasów tłuszczowych w biomasie wyizolowanych środowiskowych szczepów aktynobakterii

Ocena ilościowa kwasów tłuszczowych w biomasie akty­nobakterii wykazała w przypadku wszystkich rozpatry­wanych szczepów (z wyjątkiem izolatu KM3) dominację kwasów rozgałęzionych anteizo, szczególnie C15 i C17. Cechą charakterystyczną w przypadku szczepu KM3 okazało się występowanie w komórkach kwasu tuber­kulostearynowego, który nie występował w pozostałych szczepach (tab. 4).

W izolatach aktynobakterii oznaczano obecność kwasów mikolowych, w odniesieniu do szczepu referencyjnego Nocardia sp., zawierającego te związki. Żaden ze szcze­pów nie zawierał kwasów mikolowych.

Przeprowadzono analizę izomerów kwasu diamino­pimelinowego (DAP). Izomery DAP charakteryzują się mniejszą ruchliwością chromatograficzną niż pozostałe aminokwasy i mają charakterystyczną oliwkowo-zieloną barwę. Szczepy KM1, KM2, KM5, BI10 oraz KM31 zawie­rały w ścianie komórkowej kwas LL-DAP, natomiast KM3 wykazał obecność mezo-DAP (ryc. 10).

Ryc. 10. Analiza izomerów kwasu diaminopimelinowego (DAP). 1 – KM1; 2 – KM2; 3 – KM3; 4 – standard LL- i mezo-DAP; 5 – KM4; 6 -KM5; 7 -BI10; 8 -KM31; 9 – standard LL- i mezo-DAP. Układ rozwijający: metanol-pirydyna-10M HCl-woda (80: 10: 2,5:17,5; v/v/v/v), wywoływacz: ninhydryna

Na podstawie cech morfologicznych oraz charaktery­styki chemiotaksonomicznej stwierdzono, że aktyno­bakterie badanych środowisk pracy należą do rodzajów Streptomyces (szczepy KM1, KM2, KM4, KM5, BI10, KM31) i Nocardiopsis (KM3) (tab. 5).

Tabela 5. Zestawienie cech diagnostycznych promieniowców izolowanych z badanych miejsc pracy

Podsumowanie

Ekspozycja pracowników na występujące w środo­wisku pracy drobnoustroje prowadzić może do scho­rzeń o różnym podłożu; opisywano infekcje o ostrym przebiegu [16], alergie wywoływane przez zarodniki grzybów pleśniowych [35], podrażnienia skóry i oczu w wyniku działania lotnych związków organicznych wytwarzanych przez mikroorganizmy (MVOC) [19] oraz prawdopodobne zaburzenia funkcjonowania układu immunologicznego w wyniku kontaktu z mikotoksy­nami i β-glukanem, metabolitami grzybów [5]. Dlatego oznaczanie przynależności taksonomicznej mikroorga­nizmów izolowanych z tych środowisk jest zadaniem podejmowanym przez mikrobiologów i specjalistów medycyny pracy.

Specyfika promieniowców jako grupy bakterii dominu­jących w rolnictwie i kompostowniach przemysłowych dotyczy możliwości zakażenia przewlekłego lub (rza­dziej) o ostrym przebiegu, jednak częstsze i ważniejsze są chroniczne stany chorobowe spowodowane stałym narażeniem na wysokie stężenia pseudospor i fragmen­tów bakterii wchodzących w skład bioaerozolu. Znane są związki aktynobakterii ze schorzeniami dróg odde­chowych, np. Saccharopolyspora rectivirgula jest jed­nym z czynników powodujących alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych [12], Nocardia spp. i inne promie­niowce tlenowe wywołują nokardiozę płucną oraz akty­nomicetozy zlokalizowane w płucach [17,29]. Izolowano także Nocardiopsis dassonvillei z ropnia w przebiegu cięż­kiego zapalenia płuc [31].

Identyfikacja aktynobakterii środowisk zawodowych powinna klasyfikować drobnoustrój co najmniej na poziomie rodzaju. Metody hodowlane i chemiotaksono­miczne, zwłaszcza analizy chromatograficzne ekstrak­tów surowych lipidów bakteryjnych, estrów metylowych kwasów tłuszczowych i składników ściany komórkowej aktynobakterii umożliwiają skuteczne przeprowadze­nie takiej procedury. Szczegółowa klasyfikacja gatun­kowa jest w niektórych przypadkach celowa i polega na przeprowadzeniu identyfikacji za pomocą 16S rRNA i hybrydyzacji DNA-DNA szczepów podejrzewanych o wywołanie poważnych negatywnych skutków zdro­wotnych u eksponowanych osób.

PIŚMIENNICTWO

[1] Andersen A.A.: New sampler for the collection, sizing, and enumeration of viable airborne particles. J. Bacteriol., 1958; 76: 471-484
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[2] Arenskötter M., Bröker D., Steinbüchel A.: Biology of the metabolically diverse genus Gordonia. Appl. Environ. Microbiol., 2004; 70: 3195-3204
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Beau F., Bollet C., Coton T, Garnotel E., Drancourt M.: Molecular identification of a Nocardiopsis dassonvillei blood isolate. J. Clin. Microbiol., 1999; 37: 3366-3368
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[4] Bibb M.J., Molle V., Buttner M.J.: ζ^B1dN, an extracytoplasmic function RNA polymerase sigma factor required for aerial mycelium format in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol., 2000; 182: 4606-4616
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[5] Bönisch U., Böhme A., Kohajda T., Mögel I., Schütze N., von Bergen M., Simon J.C., Lehmann I, Polte T.: Volatile organic compounds enhance allergic airway inflammation in an experimental mouse model. PLoS One, 2012; 7: e39817
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[6] Breed R.S., Murray E.G., Smith N.R.: Bergey’s manual of determinative bacteriology, seventh edition. The Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md. 1957

[7] Butler W.R., Guthertz L.S.: Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of Mycobacterium species. Clin. Microbiol. Rev., 2001; 14: 704-726
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[8] Collins M.D.: Isoprenoid quinones. W: Chemical methods in prokaryotic systematics, red.: M. Goodfellow, A.O’Donnell. John Wiley & Sons, Chicester. New York 1994, 265-310

[9] Dutkiewicz J.: Dyrektywa 2000/54 WE a strategia wykonywania pomiarów czynników biologicznych zakładach pracy. Podstawy i Metody Oceny Środowiska Pracy, 2004; 3: 9-16

[10] Dutkiewicz J., Śpiewak R., Jabłoński L., Szymańska J.: Biologiczne Czynniki Zagrożenia Zawodowego. Klasyfikacja, Narażone Grupy Zawodowe, Pomiary, Profilaktyka. Lublin, Ad punctum, 2007

[11] Dyrektywa 2000/54/WE Parlamentu Europejskiego oraz Rady Unii Europejskiej z dnia 18 września 2000 r. w sprawie ochrony pracowników przed ryzykiem związanym z narażeniem na działanie czynników biologicznych w miejscu pracy (siódma dyrektywa szczegółowa w rozumieniu art. 16 ust. 1 dyrektywy 89/391/EWG) (2002) Official Journal of the European Communities, L. 262/21, Bruksela

[12] Ferri F., Dottori M., Bedogni L., Perini S., Ligabue M.: Exposure to Saccharopolyspora rectivirgula among cattle breeders in the province of Reggio Emilia and the risk of extrinsic allergic alveolitis (farmer’s lung). Med. Lav., 2003; 94: 207-215
[PubMed]  

[13] Goodfellow M., Lacey J., Athalye M., Embley T.M., Bowen T.: Saccharopolyspora gregorii and Saccharopolyspora hordei: two new actinomycete species from fodder. J. Gen. Microbiol., 1989; 135: 2125-2139

[14] Górny R.L.: Biologiczne czynniki szkodliwe: normy, zalecenia i propozycje wartości dopuszczalnych, Podstawy i Metody Oceny Środowiska Pracy 2004; 3: 17-39

[15] Gutarowska B.: Metody oceny zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza – zalety i wady. LAB, 2002; 2: 6-10
[Abstract]  

[16] Haagsma J.A., Tariq L., Heederik D.J., Havelaar A.H.: Infectious disease risks associated with occupational exposure: a systematic review of the literature. Occup. Environ. Med., 2012; 69: 140-146
[PubMed]  

[17] Hidri N., Farina C., Mordarska H., Szponar B., Paściak M., Grzegorzewicz A., Gamian A., Boiron P.: Nocardia, nokardioza i nokardiomikoza. Mikrobiologia Medycyna, 2000; 24/25: 10-17

[18] Iny D., Grossman S., Pinsky A.: Lipoxygenase of the thermophilic bacteria Thermoactinomyces vulgaris – properties and study on the active site. Int. J. Biochem., 1993; 25: 1325-1330

[19] Jumpponen M., Rönkkömäki H., Pasanen P., Laitinen J.: Occupational exposure to gases, polycyclic aromatic hydrocarbons and volatile organic compounds in biomass-fired power plants. Chemosphere, 2013; 90: 1289-1293
[PubMed]  

[20] Karbowska-Berent J.: Znaczenie promieniowców w biodeterioracji zabytków. Ochrona przed Korozją, 2012; 9s/A: 114-118

[21] Kattar M.M., Cookson B.T., Carlson L.C., Stiglich S.K., Schwartz M.A., Nguyen T.T., Daza R., Wallis C.K., Yarfitz S.L., Coyle M.B.: Tsukamurella strandjordae sp. nov., a proposed new species causing sepsis, J. Clin. Microbiol., 2001; 39: 1467-1476
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[22] Kumar V., Abbas A.K., Fausto N., Mitchell R.: Robbins Basic Pathology. Elsevier Ltd, Oxford 2007

[23] Kumar V., Fausto N., Abbas A.: Robbins & Cotran Pathologic Basis of Disease, Seventh Edition. Elsevier 2004

[24] Kutzner H.J., Kempf A.: Emissions of actinomycete spores in composting plants and other waste treatment industries. Forum Städte-Hyg., 1994; 45: 326-330

[25] Labeda D.P.: Actinomycete taxonomy: generic characterization. J. Ind. Microbiol. Suppl., 1987; 2: 115-121

[26] Laval F., Lanéelle M.A., Déon C., Monsarrat B., Daffé M.: Accurate molecular mass determination of mycolic acids by MALDI-TOF mass spectrometry. Anal. Chem., 2001; 73: 4537-4544
[PubMed]  

[27] Lechevalier H.A.: Nocardioforms. W: Bergey’s Manual of Systematics Bacteriology. red. Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G., Williams and Wilkins, Baltimore, 1986, 1458-1506

[28] Lechevalier M.P., Stern A.E., Lechevalier H.A.: Phospholipids in the taxonomy of actinomycetes. W: Actinomycetes, red.: K.P., Schaal, G., Pulverer. Zentbl. Bakteriol. Hyg., 1 Abt. Suppl. 11, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Germany 1981, 111-116

[29] McNeil M.M., Brown J.M.: The medically important aerobic actinomycetes: epidemiology and microbiology. Clin. Microbiol. Rev., 1994; 7: 357-417
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[30] Meyer J.: Nocardiopsis, a new genus of the order Actinomycetales. Int. J. Syst. Bacteriol., 1976; 26: 487-493

[31] Mordarska H., Zakrzewska-Czerwińska J., Paściak M., Szponar B., Rowiński S.: Rare, suppurative pulmonary infection caused by Nocardiopsis dassonvillei recognized by glycolipid markers. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1998; 21: 47-55
[PubMed]  

[32] Paściak M., Mordarska H., Szponar B., Gamian A.: Metody chemiotaksonomiczne w rozpoznawaniu zakażeń wywoływanych przez aktynobakterie. Postępy Hig. Med. Dośw., 2007; 61: 403-412
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[33] Prescott J.F.: Rhodococcus equi: an animal and human pathogen. Clin. Microbiol. Rev., 1991; 4: 20-34
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[34] Qin S., Li J., Zhao G.Z., Chen H.H., Xu L.H., Li W.J.: Saccharopolyspora endophytica sp. nov., an endophytic actinomycete isolated from the root of Maytenus austroyunnanensis. Syst. Appl. Microbiol., 2008; 31: 352-357
[PubMed]  

[35] Rainey F.A., Ward-Rainey N., Kroppenstedt R.M., Stackebrandt E.: The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage: Proposal of Nocardiopsaceae fam. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1996; 46: 1088-1092
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[36] Reponen T.A., Gazenko S.V., Grinshpun S.A., Willeke K., Cole E.C.: Characteristics of airborne Actinomycete spore. Appl. Environ. Microbiol., 1998; 64: 3807-3812
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[37] Salomon E.P., Berg A., Berg J., Martin M., Villee D.: Biologia. Wyd. Multico, Warszawa 2000

[38] Schäfer J., Jäckel U., Kämpfer P.: Development of a new PCR primer system for selective amplification of Actinobacteria. FEMS Microbiol. Lett., 2010; 311: 103-112
[PubMed]  

[39] Shlegel H.G.: Mikrobiologia ogólna, Wyd. Naukowe PWN, Warszawa 2008, 131-133

[40] Skóra J., Zduniak K., Gutarowska B., Rembisz D.: Szkodliwe czynniki biologiczne na stanowiskach pracy w muzeach. Med. Pr., 2012; 63: 153-165
[Full Text PDF]  

[41] Soriano F., Zapardiel J., Nieto E.: Antimicrobial susceptibilities of Corynebacterium species and other non-spore-forming gram-positive bacilli to 18 antimicrobial agents. Antimicrob. Agents Chemother., 1995; 39: 208-214
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[42] Stackebrandt E.: Proposal for a new hierarchic classification system, Actinobacteria classis nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1997; 47: 479-491

[43] Strzelczyk A.B.: Observations on aesthetic and structural changes induced in Polish historic objects by microorganisms. Int. Biodeterior. Biodegrad., 2004; 53: 151-156

[44] Szponar B., Larsson L.: Use of mass spectrometry for characterising microbial communities in bioaerosols. Ann. Agric. Environ. Med., 2001; 8: 111-117
[PubMed]  

[45] Takai S., Ohbushi S., Koike K., Tsubaki S., Oishi H., Kamada M.: Prevalence of virulent Rhodococcus equi in isolates from soil and feces of horses from horse-breeding farms with and without endemic infections. J. Clin. Microbiol., 1991; 29: 2887-2889
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[46] Tonjum T., Welty D.B., Jantzen E., Small P.L.: Differentiation of Mycobacterium ulcerans, M. marinum, and M. haemophilum: mapping of their relationships to M. tuberculosis by fatty acid profile analysis, DNA-DNA hybridization, and 16S rRNA gene sequence analysis. J. Clin. Microbiol., 1998; 36: 918-925
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[47] Vimal V., Rajan B.M., Kannabiran K.: Antimicrobial activity of marine Actinomycete, Nocardiopsis sp. VITSVK 5 (FJ973467). Asian J. Med. Sci., 2009; 1: 57-63

[48] Weinstock D.M., Brown A.E.: Rhodococcus equi: an emerging pathogen, emerging infections. Clin. Infect. Dis., 2002; 34: 1379-1385
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[49] Xu J., Rao J.R., Cherie Millar B., Stuart Elborn J., Evans J., Barr J.G., Moore J.E.: Improved molecular identification of Thermoactinomyces spp. associated with mushroom worker’s lung by 16S rDNA sequence typing. J. Med. Microbiol., 2002; 51: 1117-1127
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[50] Yallop C.A., Edwards C., Williams S.T.: Isolation and growth physiology of novel thermoactinomycetes. J. Appl. Microbiol., 1997; 83: 685-692
[PubMed]  

[51] Yassin A.F., Rainey F.A., Burghardt J., Gierth D., Ungerechts J., Lux I., Seifert P., Bal C., Schaal K.P.: Description of Nocardiopsis synnemataformans sp. nov., elevation of Nocardiopsis alba subsp. prasina to Nocardiopsis prasina comb. nov., and designation of Nocardiopsis antarctica and Nocardiopsis alborubida as later subjective synonyms of Nocardiopsis dassonvillei. Int. J. Syst. Bacteriol., 1997; 47: 983-988
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[52] Zhou Z.H., Liu Z.H, Qian Y.D., Kim S.B., Goodfellow M.: Saccharopolyspora spinosporotrichia sp. nov., a novel actinomycete from soil, Int. J. Sys. Bacteriol., 1998; 48: 53-58
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

Autorki deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu