Abstrakt

The transcription factor Nrf2 controls the expression of genes encoding cytoprotective enzymes and proteins. Its activation is related to conformational changes in the inhibitory protein Keap1 and/or Nrf2 phosphorylation by upstream kinases. Activation of Nrf2 can lead to the induction of phase II enzymes responsible for the inactivation of potential carcinogens. This may constitute an important strategy of chemoprevention. Moreover, these enzymatic systems participating in the biotransformation of drugs can reduce their therapeutic effects, contributing to drug resistance. For this reason, a clear understanding of the role of Nrf2 is essential to assess the beneficial and adverse effects of its up-regulation, particularly in relation to the prevention and treatment of cancer. This article summarizes the current state of knowledge on the significance of Nrf2 in tumorigenesis.

Wprowadzenie

Czynnik transkrypcyjny Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2), kontroluje ekspresję wielu genów, których produkty działają cytoprotekcyjnie. Są to m.in. geny zawierające w swych promotorach sekwencję ARE (element odpowiedzi antyoksydacyjnej), kodujące takie enzymy jak S-transferaza glutationowa (GST), reduktaza NAD(P)H:chinon 1 (NQO1), oksygenaza hemowa 1 (HO-1) i syntetaza γ-glutamylocysteinowa (γ-GCS) [13]. Aktywację czynnika Nrf2 wywołują czynniki prooksydacyjne, przede wszystkim reaktywne formy tlenu (RFT), a także związki o właściwościach elektrofilowych, najczęściej reaktywne metabolity chemicznych kancerogenów. Z tego względu zwiększona ekspresja Nrf2, to istotny element strategii chemioprewencyjnej nowotworów. Jednak układy enzymatyczne uczestnicząc w biotransformacji leków, mogą obniżać ich działanie terapeutyczne przyczyniając się do lekooporności [99].

W pracy przedstawiono aktualny stan wiedzy na temat mechanizmów aktywacji Nrf2 i indukcji enzymów II fazy zwracając szczególną uwagę na następstwa tych zjawisk w profilaktyce i terapii nowotworów.

Struktura białka Nrf2

Nazwa czynnika Nrf2 jest związana z badaniami prowadzonymi nad ekspresją genów α- i β-globiny w dojrzewających erytrocytach. Strukturę ludzkiego czynnika transkrypcyjnego Nrf2 określono w 1993 r., wyizolowano wówczas cDNA ludzkiego homologa mysiego białka nuclear factor -erythroid 2 NF-E2 [6]. Białko Nrf2 wyizolował rok później zespół Moi i wsp., który wykorzystując tandemowe powtórzenia rozpoznające sekwencje NF-E2 w bibliotece cDNA λgt11 z linii komórek K562, otrzymali kilka białek wiążących się z DNA. Jednym z otrzymanych białek był Nrf2, który w przeciwieństwie do NF-E2, ulega stałej ekspresji w większości komórek [62].

Nrf2 należy do rodziny białek zawierających w strukturze motyw zamka leucynowego (bZip). Ludzki Nrf2 zawiera 605 aminokwasów i  należy do podrodziny białek „cap ‘n’ collar” (CNC), zawierającej także bliźniacze czynniki NF-E2, Nrf1 oraz Nrf3 [19]. Wszystkie białka wchodzące w skład tej podrodziny charakteryzują się wysoce konserwatywną sekwencją, składającą się z 43 aminokwasów, a położoną blisko N-końca domeny odpowiedzialnej za wiązanie się z DNA, czyli tuż przed regionem zamka leucynowego [4]. Chan i wsp. wykazali, że u myszy pozbawionych nrf1 (-/-) występowała ciężka anemia i śmierć in utero, co sugeruje, że czynnik ten jest niezbędny do prawidłowego rozwoju komórek, zwłaszcza erytrocytów [7]. Natomiast myszy nrf2 (-/-) są zdolne do prawidłowego funkcjonowania, rozmnażania i nie zaobserwowano u nich anemii, co potwierdza, iż czynnik Nrf2 nie jest niezbędny do erytropoezy, wzrostu czy rozwoju [8]. W strukturze czynnika Nrf2 można wyróżnić kilka konserwatywnych domen: Neh1-Neh6 (ryc.1) [24]. Domena Neh1 zawiera region CNC oraz domenę zamka leucynowego (bZip), domena Neh2 jest N-końcową, natomiast Neh3 to C-końcowa domena. Kolejne dwie domeny Neh4 i Neh5 są to regiony kwaśne, a Neh6 to region bogaty w serynę.

Każdy z wyżej wymienionych elementów strukturalnych czynnika Nrf2 spełnia odrębne zadania. Domena Neh1 odpowiada za wiązanie DNA i dimeryzację z innymi czynnikami transkrypcyjnymi, takimi jak białka Maf. Domena Neh2 umożliwia interakcje z represorem – Keap1 [25]. Natomiast domena Neh3 działa jako domena transaktywacyjna, może też oddziaływać z elementami aparatu transkrypcyjnego i wpływać na aktywność Nrf2 [66]. Domeny Neh4 i Neh5 biorą udział w aktywacji czynnika Nrf2 [34]. Ostatni z  zidentyfikowanych dotąd regionów to Neh6, który wraz z Neh2, nazywany jest degronem. Degrony to swoiste sekwencje aminokwasów, które odpowiadają za degradację czynnika Nrf2. Domena Neh6 w przeciwieństwie do Neh2 nie jest podatna na zmiany potencjału redoks [60]. Właściwości strukturalne Nrf2, mają odzwierciedlenie w funkcji jaką pełni w komórkach, o której będzie mowa w następnym podrozdziale.

Mechanizmy aktywacji i regulacji funkcji czynnika transkrypcyjnego Nrf2

Ochrona przed stresem oksydacyjnym zależy od sprawnego systemu reagowania na zmiany poziomu RFT i aktywności enzymów antyoksydacyjnych, których ekspresja jest pod kontrolą m.in. czynnika Nrf2. W związku z zaburzeniem potencjału oksydo-redukcyjnego komórki, Nrf2 ulega aktywacji zwiększając transkrypcję genów kodujących m.in. enzymy II fazy i enzymy antyoksydacyjne, po uprzednim związaniu się z sekwencją ARE. Pierwsze doniesienia o istnieniu sekwencji modulującej transkrypcję tych genów, pochodzą z pracy Prochaska i wsp., którzy zaproponowali wspólny mechanizm aktywacji dla genów kodujących enzymy I i II fazy pod wpływem ksenobiotyków [70]. Następnie zidentyfikowano sekwencję nukleotydową ARE jako 5’-TGACnnnGC-3’, gdzie ‘n’ oznacza dowolny nukleotyd. Sekwencję opisano podczas badań nad 5’-regionem genu podjednostki Ya S-transferazy glutationowej u szczura na podstawie analizy mutacyjnej [72]. Tego rodzaju sekwencje w kolejnych latach stwierdzono w wielu genach kodujących m.in. enzymy detoksykacyjne.

Aktywacja Nrf2 z udziałem Keap1

Transkrypcja genów będących pod kontrolą ścieżki Nrf2 -ARE, zależy od wielu czynników, które wpływają na aktywację Nrf2 [59]. Jednym z takich czynników jest białko Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), znane jako inhibitor Nrf2 (INrf2). Jest to metaloproteina, z domeną palca cynkowego, która łącznie zawiera 624 aminokwasy [1]. Białko to jest związane z cytoszkieletem i podobne jest do białek wiążących aktynę, po raz pierwszy odkrytych u gatunku Drosophila [25,102]. Białko Keap1 jest podzielone na 5 domen, takich jak domena Kelch inaczej zwana regionem powtórzeń di-glicyny (double-glycine repeat – DGR), region N-końcowy (NTR), domena BTB/POZ (Bric–a-brac, tramtrac, broad complex/poxvirus zinc finger), interwencyjny region bogaty w cysteinę (cysteine-rich intervening region – IVR) oraz domena C-końcowa (CTR), przedstawione na ryc. 2 [87,93]. Każda z wymienionych domen jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania ścieżki sygnalizacyjnej Nrf2. Domena BTB/POZ odpowiada za tworzenie dimerów Keap1, prowadząc do sekwestracji Nrf2 w cytoplazmie. Potwierdziły to badania Zipper i Mulcahy, którzy wykazali, iż mutacja reszty seryny w pozycji 104 w domenie BTB/POZ uniemożliwiała dimeryzację Keap1 [87,109]. Białko Keap1 w postaci homodimeru nie może skutecznie wiązać Nrf2, co powoduje uwolnienie tego czynnika z kompleksu, wzrost jego stabilności oraz translokację do jądra komórkowego [108]. Region DGR/ Kelch umożliwia natomiast interakcję Keap1 z cytoszkieletem, a także z czynnikiem Nrf2, za pomocą jego domeny N-końcowej – Neh2 [25,93]. Domena Neh2 ludzkiego białka Nrf2 zawiera dwa, wysoce konserwatywne motywy – DLG oraz ETGE. Do motywu DLG należą aminokwasy od 29 do 31, przy czym główną rolę spełnia sekwencja Asp-Leu -Gly [33,55]. Drugi motyw, ETGE zawiera aminokwasy od 79 do 82 z charakterystyczną sekwencją Glu-Thr-Gly-Glu [41,90]. To właśnie te ugrupowania umożliwiają połączenie Nrf2 z Keap1. Zarówno motywy DLG, jak i ETGE białka Nrf2 wiążą się z dwoma identycznymi regionami DGR/ Kelch homodimeru Keap1. Wiązanie to jest prawie 100 razy silniejsze w przypadku motywu ETGE niż DLG [90]. Tong i wsp. zaproponowali tzw. „model zawiasu i zatrzasku” (hinge and latch mechanism) do scharakteryzowania tego wzajemnego oddziaływania [91]. Autorzy założyli, iż w warunkach homeostazy potencjału redoks w komórce, czynnik transkrypcyjny Nrf2 jest sekwestrowany w cytoplazmie przez połączenie motywami DLG i ETGE z białkiem inhibitorowym Keap1 (ryc. 2).

Jednak białko Keap1 w warunkach stresu oksydacyjnego, spełnia jednocześnie funkcje sensora potencjału oksydoredukcyjnego. Przez modyfikacje w regionach IVR i/lub BTB dochodzi do zerwaniu słabszego wiązania (tzw. „zatrzasku”) z motywem DLG [87]. Rozluźnienie wiązania między Keap1 a Nrf2 stabilizuje Nrf2, pozwala uniknąć ubikwitynacji i jego translokacji do jądra komórkowego. Swoistymi sensorami zmian potencjału redoks są sulfhydrylowe ugrupowania obecne w cysteinie. Ludzkie białko Keap1 zawiera 27 cząsteczek cysteiny, jednak tylko grupy SH będące częścią konserwatywnych cystein, takich jak Cys23, Cys151, Cys273 i Cys288 spełniają istotną rolę w interakcji z czynnikiem Nrf2 [18]. Dwie z nich, Cys273 oraz Cys288, znajdują się w  obrębie domeny IVR. W  prawidłowych warunkach grupy SH pozostają zredukowane, co jest niezbędne do sekwestrowania czynnika Nrf2 w cytoplazmie oraz jego dalszej ubikwitynacji. Pod wpływem induktorów stresu oksydacyjnego czy związków chemioprewencyjnych, obydwie grupy tworzą połączenie poprzez mostek disiarczkowy w obrębie homodimeru, co prowadzi do rozluźnienia wiązania oraz uwolnienia Nrf2, a następnie jego akumulacji w jądrze oraz indukcji enzymów II fazy [40,95]. Można więc stwierdzić, iż zarówno Cys273, jak i Cys288 po potencjalnym utlenieniu, spełniają rolę represorów w proteosomalnej degradacji czynnika Nrf2. Badania Zhanga i Hanninka wykazały, że komórki z nadekspresją Cys151 w Keap1 są bardziej wrażliwe na czynniki chemioprewencyjne, takie jak tert-bytylohydroksychinon (tBHQ) czy sulforafan, które wywołują zmiany strukturalne w grupach sulfhydrylowych białka Keap1. Tak więc Cys w pozycji 151 odgrywa istotną rolę w uwalnianiu i stabilizacji czynnika transkrypcyjnego Nrf2 z połączenia z białkiem Keap1. Dalsze badania tego zespołu wykazały również, iż modyfikacja w pozycji 151, polegająca na zamianie cysteiny na serynę i ekspozycja na induktory, nie wywołuje spodziewanej stabilizacji czynnika Nrf2, mimo niezmienionych Cys273 i Cys288 [107]. Może to wskazywać, iż zmiany konformacyjne w obrębie cysteiny w pozycji 151 białka Keap1, są niezbędne do jego uwolnienia z kompleksu, jaki tworzy z czynnikiem Nrf2. Odmienne znaczenie tej cysteiny wykazali Rachakonda i wsp., wykorzystując model, w któ- rym kowalencyjna rearanżacja w obrębie Cys w pozycji 151 doprowadziła do zerwania połączenia Keap1-Cul3 [71].

Innym mechanizmem wpływającym na aktywność Keap1 jest fosforylacja i defosforylacja tyrozyny w pozycji 141. Keap1 jest syntetyzowany de novo z ufosforylowaną Tyr141, co jest istotne dla jego stosunkowo długiego okresu półtrwania. W takiej też postaci Keap1 bierze udział w wiązaniu, ubikwitynacji i degradacji Nrf2. Stres oksydacyjny i elektrofile powodują jednak defosforylację Tyr141, co znacznie zmniejsza stabilność i przyspiesza degradację Keap1 [29].

Kolejna modyfikacja dotyczy treoniny w pozycji 55 białka Keap1. Badania wykazały, że białko szoku cieplnego, HSP90 (heat shock protein) aktywuje kinazę kazeinową CK2 (casein kinase 2), która fosforyluje treoninę w pozycji 55 białka INrf2, co powoduje wzmocnienie oddziaływania między HSP90 i Keap1 [67]. Opisane wyżej mechanizmy potwierdzają istotną rolę białka Keap1 w aktywacji czynnika Nrf2 w odpowiedzi na stres oksydacyjny i działanie potencjalnych induktorów Nrf2.

AktywacjaNrf2 przezfosforylacjęz udziałem kinaz

Wiele badań wykazało, że w aktywacji Nrf2, oprócz zmian w obrębie białka Keap1, są zaangażowane również inne mechanizmy, które wpływają na jego translokację do jądra. Wśród najważniejszych procesów wyróżnia się fosforylację Nrf2. Jednym z istotnych aminokwasów białka Nrf2 jest seryna 40 leżąca w obrębie domeny Neh2, której grupa hydroksylowa jest fosforylowana przez kinazę białkową C (PKC) (protein C kinase) [20]. Również kinaza białkowa umiejscowiona w  siateczce śródplazmatycznej (PERK) (RNA-dependent protein kinase (PKR)-like endoplasmic reticulum kinase) nasila translokację czynnika transkrypcyjnego Nrf2 przez osłabienie wiązania kompleksu białko inhibitor, co chroni komórkę przed stresem oksydacyjnym [9,10]. Podobnie kinaza kazeinowa 2 (CK2) (casein kinase 2), która katalizuje fosforylację w domenach Neh4 i Neh5 czynnika Nrf2, odgrywa istotną rolę w jego aktywacji [3].

Zmiany zachodzące w obrębie mikrofilamentów aktynowych w wyniku odpowiedzi na stres oksydacyjny doprowadzają do translokacji czynnika Nrf2 do jądra. W procesie tym bierze udział kinaza fosfatydylo-3-inozytolu (PI3K) (phosphoinositide 3-kinase) [32]. Inne badania wykazały, że w indukcję ścieżki Nrf2/ARE są zaangażowane kinazy aktywowane mitogenami (MAPK) (mitogen-activated protein kinase), takie jak kinazy ERK2 (extracellular signal–regulated kinase 2) i  JNK1 (Jun N-terminal kinase 1) [35,64,101]. Na podstawie powyższych przykładów wydawać się może, iż fosforylacja czynnika Nrf2 z udziałem kinaz koreluje z jego aktywacją i kumulacją w jądrze. Jednak nie wszystkie kinazy spełniają taką funkcję. W obrębie kinaz MAPK izoforma p38 hamuje dysocjację kompleksu Keap1–Nrf2, przez co nie dochodzi do aktywacji czynnika Nrf2. Potwierdziły to badania Keuma i wsp., w których wykazano indukcję HO-1 pod wpływem sulforafanu w komórkach nowotworowych HepG2 [36]. Badania Strachana i  wsp. dowiodły, że zbyt długa kumulacja Nrf2 w jądrze komórkowym prowadzić może do apoptotycznej śmierci komórki [80]. Przykładem są myszy keap1(-/-), które wykazały trwałą kumulację i aktywację Nrf2 w jądrze, co objawia się śmiertelnością poporodową spowodowaną niedożywieniem wynikającym ze zrogowacenia przełyku i żołądka [96]. Dalsze badania wskazały na istotną rolę kinazy Fyn, należącej do rodziny kinaz tyrozynowych Src, pełniącej rolę molekularnego przełącznika. Powoduje ona fosforylację Tyr568 w obrębie czynnika Nrf2, co reguluje eksport z jądra komórkowego, a następnie jego degradację [28]. Nadrzędną rolę w aktywacji kinazy Fyn spełnia kinaza 3β syntazy glikogenowej (GSK3β) (glycogen synthase kinase 3β), której aktywna postać fosforyluje kinazę Fyn w resztach treoninowych [27]. Istnieją także dane wskazujące, iż GSK3β może bezpośrednio fosforylować białkowy czynnik Nrf2, wyłączając komórkową odpowiedź na stres oksydacyjny, przez jego przeniesienie z jądra komórkowego [73].

Aktywacja Nrf2 z udziałem kinaz jest kolejną alternatywną ścieżką, mogącą prowadzić do indukcji enzymów II fazy w następstwie działania stresu oksydacyjnego i czynników chemioprewencyjnych. Jednak mechanizm aktywacji Nrf2 z udziałem kinaz wymaga przeprowadzenia dalszych badań w celu dokładnego wyjaśnienia.

Mechanizm regulacjiNrf2

Mimo zaawansowanego poznania procesu aktywacji Nrf2, mechanizmy leżące u podstaw jego regulacji nadal nie są do końca zrozumiałe. Wiele badań wykazało, że niezbędnymi elementami do translokacji czynnika do jądra są sekwencja lokalizacji jądrowej bNLS (bipartite nuclear localization signal) oraz sekwencja eksportu z  jądra NESzip (nuclear export signal) [26]. Obydwie sekwencje sygnałowe znajdują się w części C-końcowej a subkomórkowe umiejscowienie Nrf2 zależy od równowagi między eksportem a importem do jądra komórkowego [48]. Istnieją doniesienia o jeszcze jednym ważnym motywie, który może decydować, po której ze stron błony jądrowej ma być umiejscowiony czynnik transkrypcyjny Nrf2. Nazwano go NESTA (TA – transactivation domain) i znajduje się w domenie Neh5 [49]. Funkcją NESTA w warunkach stresu oksydacyjnego jest wzmaganie, a w przypadku jego braku hamowanie translokacji do jądra Nrf2. Spełnia tym samym dodatkową rolę regulacyjną w przekazywaniu sygnału. Pod wpływem działania stresu oksydacyjnego, czy też czynników chemioprewencyjnych, z wykorzystaniem analizy immunofluorescencyjnej oraz immunoblotu, wykazano iż czynnik Nrf2 zaczyna kumulować się już 15 minut po ekspozycji, natomiast eksport z jądra pojawia się po 8 godzinach [26].

Wszystkie dotychczas opisane mechanizmy regulacji czynnika Nrf2 prowadzą do kontroli jego zdolności łączenia się z  sekwencją ARE i  nasilenia transkrypcji genów kodujących enzymy II fazy. Aby było to możliwe czynnik transkrypcyjny Nrf2 musi najpierw połączyć się z małymi białkami Maf (sMaf), tworząc heterodimer, zdolny do pełnienia funkcji regulacyjnych [23]. Do białek sMaf zaliczają się: MafF, MafG i MafK, a ich wspólną cechą jest konserwatywny region zasadowy oraz motyw zamka leucynowego [63]. Tworzący się homodimer sMaf/sMaf nie ma możliwości wzmacniania transkrypcji i traktowany jest jako jej represor [88]. Utworzenie się heterodimeru Nrf2/sMaf wykazuje powinowactwo i zdolność do łączenia się z ARE oraz tym samym wzmacnianiem ekspresji całej grupy enzymów cytoprotekcyjnych [103].

Istotny jest także sposób oddziaływania koaktywatorów z Nrf2, które są niezbędne do interakcji z DNA. Należą do nich CBP (CREB-binding protein), a  także p300, CARM1, PRMT1, RAC3 oraz SRC3 [52]. Czynnik Nrf2 łączy się z białkami CBP za pomocą domen Neh4 oraz Neh5 [34]. Ponadto wykazano, że p300/CBP ma zdolność acetylowania reszt lizyny obecnych w  domenie Neh1, tym samym zwiększając wiązanie Nrf2 do promotorów genów, zawierających w swej sekwencji strukturę elementu odpowiedzi antyoksydacyjnej [82]. Choć białka z rodziny Maf i CBP są niezbędne do łączenia się z czynnikiem Nrf2, ponieważ prowadzą do wzmocnienia ochrony antyoksydacyjnej, opisano dotąd kilka jeszcze innych białek, których rola w tym procesie na poziomie jądra komórkowego jest nie mniej istotna. Warto w tym miejscu wymienić białko KAP1 (KRAB-associated protein 1). Dowiedziono, iż ułatwia ono aktywność transkrypcyjną Nrf2, przez łączenie się z jego N-końcową domeną transaktywacyjną, Neh3. Ponadto mutacja typu KAP1 knockdown powodowała wzrost wrażliwości na stres oksydacyjny [58]. Odmienne działanie wykazuje białko Bach1 w przypadku regulacji Nrf2. Jest ono jak gdyby antagonistą Nrf2, ponieważ łączy się z sekwencją ARE, ale oddziaływanie to nie prowadzi do ekspresji genów, wręcz przeciwnie, odpowiada za jej hamowanie [12]. Małe białka Maf mają zdolność łączenia się z Bach1. Tak więc w zależności od zaangażowania drugiego białka do dimeryzacji z sMaf, może mieć ono wpływ na aktywację lub represję ścieżki sygnalizacyjnej [63].

Nrf2 po odłączeniu od sekwencji ARE, ulega degradacji przez przyłączenie reszt ubikwityny przez zasocjowaną z Keap1 ligazę ubikwityny (E3). Zachodzi to w obrębie domeny Neh2 w wyniku Cul3-E3-zależnej ubikwitynacji, z udziałem następujących enzymów: E1-enzym aktywujący ubikwitynę, E2-enzym przenoszący zaktywowaną ubikwitynę i E3-enzym ligaza ubikwityny. Keap1 odgrywa istotną rolę w regulacji ubikwitynacji Nrf2, ponieważ kullina 3 (Cul3) (cullin 3) będąca podjednostką kompleksu ligazy E3 wiąże się bezpośrednio do tego białka. W kolejnym etapie Nrf2 ulega degradacji za pośrednictwem proteasomu 26S w  cytoplazmie. Wykazano, iż degradacja Nrf2 nie zachodzi wyłącznie w cytoplazmie, lecz może przebiegać także w jądrze komórkowym. Umożliwia to import kompleksu Keap1/Cul3-Rbx1 (ring-box protein-1) do jądra, który jest istotnym mechanizmem autoregulacji czynnika Nrf2. Kontroluje swoją degradację przez regulację ekspresji genów Cul3-Rbx1. Tak więc indukcja Cul3- -Rbx1 przez Nrf2 prowadzi do obniżenia poziomu tego czynnika [84,87].

Podobny wpływ ma protymozyna α (PTMα), peptyd wyizolowany z grasicy, może się łączyć z domeną DGR, podobnie jak czynnik Nrf2 [37]. Zawiera jednocześnie w  swej strukturze sygnał lokalizacji jądrowej (NLS), a tym samym więc może być w tym procesie swoistym przenośnikiem całego kompleksu [69]. Odkryto również, że małe białko karioferyna KPNA6, znana jako importyna alfa 7, także jest zdolne do przenoszenia przez błonę jądrową Keap1, dzięki interakcji z jego C-końcowym fragmentem [83]. Istnieją również doniesienia, że Keap1 ma zarówno sygnał lokalizacji jądrowej, jak i sygnał eksportu, przez co przenika do jądra, odłącza Nrf2 od sekwencji ARE, a cały taki kompleks powraca do cytoplazmy, gdzie następuje degradacja czynnika transkrypcyjnego [65]. W ramach odpowiedzi na stres oksydacyjny Jaiswal zaproponował teorię, na podstawie, której można wyróżnić dwie fazy odpowiedzi na stres. Wczesna odpowiedź na stres, powoduje translokację Nrf2 do jądra i aktywację ekspresji genów zależnych od ARE. Natomiast odpowiedź późna dotyczy przyłączania innych białek, takich jak Bach1:MafG, MafG/K/F:MafG/K/F, c-Jun:c-Fos oraz kompleksów c-Jun z powiązanym z Fos antygenem 1 (Fra-1) (Fos-related antygen-1), czy kinazy Fyn, które wiążąc się do ARE hamują ekspresję genów indukowaną przez Nrf2 [30].

Podsumowując, mechanizm aktywacji czynnika Nrf2 jest regulowany na wielu etapach, co w zarysie przedstawiono na ryc. 3. Mimo złożonego procesu aktywacji czynnika Nrf2, istnieje wiele potencjalnych miejsc do interwencji terapeutycznej. Jednocześnie indukcja Nrf2, może wywo-ływać niekorzystne zmiany na poziomie komórkowym i być powiązana z wieloma chorobami, takimi jak nowotwory czy choroby neurodegeneracyjne.

Nrf2 – korzystna rola w terapii ichemioprewencji

Chorobę nowotworową charakteryzuje bardzo często długi okres czasu od inicjacji, aż do pełnoobjawowego stanu chorobowego. Proces kancerogenezy może trwać kilka miesięcy czy nawet lat. Najistotniejszą przyczyną pojawiania się nowotworów są mutacje w obrębie genów, które poprzez różne mechanizmy prowadzą do nieprawidłowego rozwoju komórek. Wówczas prawidłowe komórki nabywają cechy komórek nowotworowych, takich jak: niekontrolowany wzrost, unikanie supresorowych sygnałów wzrostu, nieuleganie procesowi apoptozy, indukcji angiogenezy, zdolności do inwazji odległych tkanek i procesu metastazy oraz zmiany metabolizmu [16]. Uszkodzenia materiału genetycznego w  głównej mierze są spowodowane przez substancje kancerogenne i ich metabolity, które ulegają wprawdzie detoksykacji i eliminacji. Jednak w przypadku długotrwałego narażenia bądź jednorazowego kontaktu z silnym kancerogenem, mechanizmy naprawy mogą nie być wystarczające do zahamowania procesu nowotworowego. Leki przeciwnowotworowe w wielu przypadkach nie zawsze są skuteczne, co wynika często ze stosowania ich w bardzo zaawansowanych stadiach choroby [31]. Alternatywą do klasycznego podejścia do terapii nowotworów jest skoncentrowanie się na kontroli procesu kancerogenezy i próbie oddziaływania terapeutycznego na jego wczesnych stadiach. Takie podejście z wykorzystaniem naturalnych bądź syntetycznych, małocząsteczkowych substancji chemicznych w celu inhibicji czy odwrócenia procesu kancerogenezy na różnych jej etapach nazywane jest chemioprewencją [79]. Zaproponowanie takiej koncepcji walki z chorobą nowotworową sprawiło, iż w przeciągu ostatniego półwiecza przeprowadzono wiele badań, czego skutkiem są różne strategie chemioprewencyjne. Ze względu na punkty uchwytu i potencjalne cele, czynniki chemioprewencyjne można podzielić na dwie grupy: związki supresyjne, wpływające na już zainicjowane komórki nowotworowe i związki antyinicjujące (blokujące) [100]. Substancje blokujące proces nowotworzenia mogą działać przez zmiatanie wolnych rodników, pobudzanie naprawy uszkodzonego DNA, czy też wpływając na poziom enzymów I i II fazy metabolizmu. Natomiast związki należące do grupy supresorów oddziałują głównie na ekspresję genów odpowiedzialnych za proliferację i podziały komórek, zmniejszając je, a także przywracając prawidłowy poziom i przebieg apoptozy, tym samym nie doprowadzając do kumulacji uszkodzonych komórek [57].

Aktywacja czynnika Nrf2 w odpowiedzi na stres oksydacyjny i czynniki chemioprewencyjne jest więc jednym z  przykładów strategii w  chemioprewencji [47]. Przez indukcję tej ścieżki sygnalizacyjnej można doprowadzić do unieczynnienia substancji toksycznych w tym także wolnych rodników zdolnych do uszkodzenia DNA [15]. Skoro więc organizm dysponuje tak skutecznym mechanizmem ochrony, warto zadać sobie pytanie dlaczego istnieje potrzeba jego sztucznej stymulacji? Hybertson i wsp. sugerują, iż trzeba wspomóc system w odpowiednim czasie, np. w sytuacjach wysokiego narażenia oraz wpłynąć na odpowiedź, w chwili gdy poziom niekorzystnych czynników przerasta możliwości detoksykacyjne komórki [21]. Pojawiły się doniesienia o obniżeniu aktywacji ścieżki Nrf2 wraz z wiekiem, co może powodować słabszą odpowiedź antyoksydacyjną [89].

Zwraca się jednocześnie uwagę na zaangażowanie czynnika Nrf2 w hamowaniu procesów zapalnych oraz chorób neurodegeneracyjnych, np. choroba Alzheimera i Parkinsona [44,56,92]. Nrf2 zmniejsza poziom czynników prozapalnych, takich jak: cyklooksygenaza 2 (COX-2), syntaza tlenku azotu (iNOS), IL-1β, IL-6 oraz TNF-α [38]. Jednocze- śnie stanom zapalnym towarzyszy nadmierne powstawanie RFT, które mogą bezpośrednio oddziaływać z kinazami MAPK i tym samym wpływać na ścieżki zależne zarówno od Nrf2, jak i odgrywającego w tych procesach główną rolę czynnika transkrypcyjnego NF-κB. To sprzężenie między aktywacją Nrf2 i inhibicją NF-κB może być wykorzystane zarówno w projektowaniu leków przeciwzapalnych, jak i w poszukiwaniu związków chemioprewencyjnych i terapeutycznych [74].

Wśród induktorów enzymów II fazy znajduje się wiele związków występujących w jadalnych owocach i warzywach, a także przyprawach i ziołach. Stwarza to możliwości dostarczania ich w  codziennej diecie, a  dzięki regularnemu i odpowiednio długiemu okresowi przyjmowania, mogą pełnić funkcję czynników chemioprewencyjnych. Do powszechnie występujących w przyrodzie związków aktywujących enzymy II fazy należą m.in.: polifenole, izotiocyjaniany, flawonoidy, tiokarbaminiany, chinony, ditiolotiony [5,56] (tabela 1), a które zostały szerzej omówione wcześniej [42]. W wyniku syntezy chemicznej powstały syntetyczne modulatory aktywacji Nrf2, takie jak oltipraz, czy butylohydroksyanizol (BHA) [22]. Związki te są zdolne do zerwania wiązania między Nrf2 i Keap1, co umożliwia nasilenie ekspresji enzymów II fazy. Mechanizm oddziaływania dotyczy przede wszystkim reakcji z ugrupowaniami sulfhydrylowymi, w reaktywnych domenach białek Nrf2 i Keap1 zawierających cysteinę. Jednym z zaproponowanych mechanizmów przez Dinkova-Kostova i wsp. jest reakcja tio-Michaela [13]. Grupa –SH z niesparowaną parą elektronową na atomie siarki, odgrywa rolę słabej zasady Lewisa i przez to może ulec addycji nukleofilowej do nienasyconego związku karbonylowego. Induktory ścieżki Nrf2-ARE odgrywają więc w  tej reakcji rolę akceptorów. Przyłączenie induktora do grupy –SH zmniejsza powinowactwo Keap1 do Nrf2, powodując jednocześnie dysocjację i nasilenie ekspresji genów kodujących enzymy II fazy. Niżej przedstawiono reakcje Michaela jako mechanizm interakcji induktorów Nrf2 z ugrupowaniem sulfhydrylowym obecnym w cysteinie w białku Keap1 [56]:

Nieco odmienny charakter ma interakcja związków zawierających w swej strukturze atom siarki. Dzięki oddziaływaniu elektrofilowemu ugrupowania -N=C=S, a zwłaszcza atomu węgla, otoczonego przez dwa bardziej elektroujemne atomy siarki oraz azotu, następuje przekształcenie cząsteczki izotiocyjanianu w ditiokarbaminian, co jest równoznaczne ze zmniejszeniem wiązania Nrf2-Keap1 i tym samym indukcją genów enzymów II fazy zależnych od Nrf2 [56]:

Chemioprewencyjne właściwości związków chemicznych nie ograniczają się jedynie do bezpośredniego stymulowania enzymów detoksykacyjnych przez aktywację czynnika Nrf2. Badania wykazały, iż związki np. takie jak: EGCG, kurkumina, resweratrol czy genisteina mają również zdolność regulacji ekspresji genów poprzez mechanizmy epigenetyczne, takie jak metylacja DNA, modyfikacja chromatyny oraz zaangażowanie miRNA [50,51]. Wykazano, iż sulforafan ma zdolność regulowania demetylacji wysp CpG czynnika Nrf2 w komórkach nowotworowych, a tym samym indukowania odpowiedzi antyoksydacyjnej, co świadczy o jego chemioprewencyjnych właściwościach [106]. Prawie identyczny mechanizm opisano dla z-ligustilidu, związku wyizolowanego z  korzenia dzięgiela chińskiego (radix Angelica Sinensis) i jego wpływu na komórki raka stercza [81]. Wykorzystanie epigenetycznej modulacji indukcji odpowiedzi antyoksydacyjnej przez Nrf2 stwarza więc potencjalne nowe możliwości terapeutyczne w obrębie ścieżki sygnałowej regulowanej przez ten czynnik transkrypcyjny.

Mechanizmy leżące u podstaw regulacji oddziaływania Nrf2-Keap1 nadal pozostają niewyjaśnione. Chodź znamy bardzo wiele związków wpływających na ten szlak przekazywania sygnału, dalsze badania powinny być ukierunkowane na swoiste oddziaływania tych substancji na poziomie komórkowym. W przyszłości dokładniejsze poznanie molekularnych podstaw indukcji odpowiedzi antyoksydacyjnej pozwoli opracować preparaty farmaceutyczne mogące celowo i z dużą efektywnością indukować ścieżkę Nrf2-ARE. Być może dzięki temu możliwa będzie skuteczniejsza prewencja i walka z nowotworami, u których podstaw leżą zaburzenia homeostazy redoks.

Nrf2 – czynnik patogenny

Mimo pozytywnego znaczenia czynnika Nrf2 w hamowaniu procesu kancerogenezy zauważono również, że może być zaangażowany w procesy promocji i rozwoju nowotworów. Jak już wspomniano komórki nowotworowe charakteryzują się mutacjami w materiale genetycznym, co daje im swoistą niezależność, ale też pewnego rodzaju „nieśmiertelność”. W czasie intensywnego wzrostu komórek rośnie zapotrzebowanie energetyczne, którego źródłem są mitochondria. Jednak zwiększone wytwarzanie ATP, niezbędne do wzrostu i różnicowania komórek nowotworowych, sprzyja powstawaniu w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym znacznych ilości RFT. Jeśli nie będzie temu procesowi towarzyszyła wzmożona odpowiedź antyoksydacyjna lub sprawnie działający system enzymów antyoksydacyjnych może dojść do wyłączenia cyklu komórkowego i indukcji apoptozy.

Stymulując odpowiedź antyoksydacyjną, a tym samym doprowadzając do inhibicji apoptozy, czynnik Nrf2 promuje przetrwanie i rozwój komórek nowotworowych [18]. DeNicola i wsp. wykazali, że wiele onkogenów, takich jak: Myc, K-Ras oraz B-Raf, może się przyczyniać do wzmacniania ekspresji Nrf2, a tym samym zahamowania wewnątrzkomórkowego stresu oksydacyjnego, co w konsekwencji prowadzi do progresji onkogenezy [11].

Mutacje w obrębie Nrf2 opisano dla wielu nowotworów m.in. w raku przełyku, trzustki, skóry czy płuc, w których jednocześnie oszacowano częstość występowania mutacji dotyczących molekularnych interakcji Keap1-Nrf2 na około 25% [18,39,53]. Najczęściej opisywane zmiany dotyczą motywów ETGE i DLG domeny Neh2, jak również domeny Kelch/DGR, które odpowiadają za połączenie Nrf2 i Keap1. Objawiają się zwiększonym poziomem Nrf2 w komórce przez osłabienie interakcji ze swoistym inhibitorem, a tym samym pominięciem procesu degradacji. Głównym skutkiem tych somatycznych mutacji jest zwiększenie oddziaływania czynnika transkrypcyjnego na odpowiednie geny, a zarazem indukcja ich ekspresji [46,84].

Mutacje w obrębie omawianego czynnika transkrypcyjnego mogą dotyczyć również zjawisk epigenetycznych, które nie mają swojego odzwierciedlenia w  sekwencji jądrowego DNA. Wykazano bardzo małą ekspresję lub całkowity brak mRNA białka Keap1 w niektórych liniach komórkowych raka płuc. Było to związane z hipermetylacją wysp CpG promotorowego regionu genu Keap1. Dowiedziono również, że zastosowanie 5-aza-2’-deoksycytydyny przywraca prawidłowe ilości mRNA Keap1 [97]. Tym samym można stwierdzić, iż nadekspresja Nrf2 w komórkach nowotworowych może być związana m.in. ze zjawiskiem epigenetycznego wyciszania genu jego inhibitora.

Poważnym problemem w skutecznej chemioterapii nowotworów staje się coraz częściej oporność komórek na zastosowane leczenie. Jest to związane z farmakologicznymi właściwościami większości leków chemioterapeutycznych. Ich wąski indeks terapeutyczny, a więc różnica między dawką efektywną a toksyczną, powoduje, że często stężenie w miejscu działania, czyli w pobliżu komórek nowotworowych nie jest wystarczające. Może to być spowodowane np. zbyt nasilonym metabolizmem, ograniczonym poziomem aktywacji proleków, złą farmakokinetyką oraz wpływem mikrośrodowiska nowotworu [45].

Większym problemem staje się mechanizm powiązany z komórkową opornością wielolekową, MDR (multi-drug resistance). Zjawisko to najczęściej jest spowodowane przez refluks ksenobiotyków do przestrzeni pozakomórkowej. Pozwala to komórkom nowotworowym uniknąć toksycznego działania czy też ingerencji leku w molekularne procesy wewnątrzkomórkowe, a co za tym idzie zwiększyć swoją przeżywalność. Głównymi białkami, które odpowiadają za transport leków poza komórkę są transportery ABC (ATP-binding cassette transporter, ABC), stanowiące rodzinę białek zawierających kasetę wiążącą ATP. Najważniejszymi przedstawicielami tej grupy są glikoproteina P (zwana również MDR-1/P-gp lub ABCB1), białko MRP (multidrug resistance protein) (ABCC1) oraz BCRP (breast cancer resistance protein) (ABCG2) [104]. Badania wykazały, że czynnik Nrf2 wpływa aktywnie na wzmożenie ekspresji szczególnie dwóch ostatnich białek [17,75,94]. Wskazuje to, iż Nrf2 zwiększa oporność komórek nowotworowych na leczenie. Ponadto wykazano zależność między poziomem czynnika Nrf2 a opornością na leki, takie jak cisplatyna, doksorubicyna, etopozyd i 5-fluorouracyl [2,76,99]. Pacjenci z mutacją powodującą nadekspresję układu Keap1-Nrf2 mają gorsze rokowania, co się wiąże z tym, iż komórki nowotworowe są chronione przed chemioterapią na podobnej zasadzie jak funkcjonuje fizjologiczna obrona przed stresem oksydacyjnym [18]. W celu zwiększenia skuteczności terapii represja tej ścieżki sygnałowej może się okazać kluczowa. Dlatego w tym celu można wykorzystać inhibitory Nrf2, do których należy np. popularna witamina C. Zastosowanie witaminy C spowodowało spadek stężenia GSH i wzrost odpowiedzi na lek w linii komórkowej pochodzącej z ludzkiej przewlekłej białaczki szpikowej KCL22/SR odpornej na inhibitor kinazy tyrozynowej BCR/ABL – imatinib. Było to wynikiem zmniejszenia przez witaminę C, per se jako antyoksydanta, poziomu RFT i supresji wiązania Nrf2-DNA w regionie promotorowym genu syntetazy γ-glutamylocysteiny (γ-GCS) [86]. Zmiany potencjału redoks spowodowane antyoksydantami mogą więc wpływać hamująco na ekspresję genów zależną od Nrf2, a tym samym zmniejszyć oporność na leki. Istnieje także hipotetyczna możliwość ograniczenia ekspresji enzymów znajdujących się pod kontrolą czynnika Nrf2 przez takie środki jak: tiazolidinediony (doustne leki hipoglikemizujące, np. pioglitazon, rosiglitazon), kwas retinowy czy 17β-estradiol. Związki te indukują odpowiednio: receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów γ (PPARγ), receptor kwasu retinowego α (RARα) oraz receptor estrogenowy α (ERα) [18,54,78]. Badania wykazały, że w obecności kwasu retinowego, Nrf2 tworzy kompleks z receptorem RARα [98]. Kompleks taki nie ma zdolności przyłączenia się do sekwencji ARE i wzmacniania transkrypcji genów. Podobną zależność opisano dla receptorów PPARγ, dla których sugeruje się nawet, że połączenie tiazolidinedionów z lekami przeciwnowotworowymi może zmniejszyć oporność na leczenie komórek nowotworowych raka płuc [105]. Możliwości zahamowania ścieżki Nrf2 mają również związki małocząsteczkowe obecne w roślinach. Na przykład luteolina, należąca do flawonoidów, a występująca powszechnie w selerze, zielonej papryce, pietruszce czy rumianku, jest potencjalnym inhibitorem czynnika transkrypcyjnego z powodu redukowania jego ilości zarówno na poziomie białka jak i mRNA [85]. Podobne właściwości ma apigenina, która wykazuje zdolność uwrażliwienia pierwotnie opornych komórek raka wątroby na leczenie doksorubicyną [14]. Wykorzystanie inhibitorów Nrf2 może się okazać obiecującym elementem farmakoterapii, pozwalającym zmniejszyć oporność komórek rakowych na zastosowane środki cytotoksyczne, przyczyniając się tym samym do wzrostu skuteczności leczenia chorób nowotworowych. Jednak do pełnego zrozumienia wszystkich implikacji wynikających z udziału Nrf2 w promowaniu onkogenezy, a zwłaszcza oporności wielolekowej, konieczne jest przeprowadzenie dokładniejszych badań.

W przeciwieństwie do omówionego mechanizmu lekooporności komórek nowotworowych stymulowanych przez czynnik Nrf2 pojawia się idea wykorzystania zwiększonej ekspresji enzymów II fazy do celów terapeutycznych. Niektóre leki chemioterapeutyczne muszą zostać w organizmie aktywowane do farmakologicznie czynnej postaci, ponieważ podawane są w postaci proleków. Reakcje aktywacji najczęściej zachodzą z udziałem cytochromu P450, przykładem może być reakcja konwersji cyklofosfamidu do alkilujących metabolitów. Hayes i McMahon zauważyli, że w komórkach nowotworowych, które wykazują mutację w układzie Nrf2-Keap1, występuje jednocze- śnie zwiększony poziom ekspresji, takich enzymów jak NQO1, co umożliwia aktywację cytotoksycznych leków [18]. Stwarza to jednocześnie możliwość podania mniejszych dawek leków, a przez to zmniejszenie niepożądanych działań.

Czynnik Nrf2, oprócz stymulowania genów kodujących enzymy detoksykacyjne, ma zdolność indukowania wielu białek, które w sekwencji promotorowej swego genu mają tzw. element odpowiedzi antyoksydacyjnej. W fizjologicznych warunkach, dzięki ARE jest możliwe przetrwanie komórki przez wzmożenie transkrypcji białek ochronnych i promujących przetrwanie. Do takich białek należy m.in. antyapoptotyczne białko Bcl-xL. W  komórkach nowotworowych jego indukcja jest jednak niekorzystna, gdyż unikanie programowanej śmierci może prowadzić do progresji nowotworu. Badania wykazały, iż Nrf2 stymuluje ekspresję Bcl-xL przez łączenie się z sekwencją ARE [68]. Tym samym można przypuszczać, że komórki nowotworowe zyskują zdolność unikania apoptozy, jeśli dochodzi do aktywacji ścieżki Nrf2, czy to poprzez mutacje, czy terapie antyoksydantami.

Wzmożona proliferacja komórek, która jest charakterystyczna dla procesu onkogenezy, nie byłaby możliwa bez zapewnienia odpowiedniej ilości materiału budulcowego oraz energetycznego. Modyfikacja, czy też całkowite przeprogramowanie metabolizmu w kierunku optymalizacji wzrostu jest jedną z podstawowych cech we wszystkich nowotworach [16]. Sugeruje się, że dużą rolę w tym procesie może odgrywać czynnik Nrf2, który szczególnie pod wpływem szlaku sygnałowego kinazy PI3K-Akt, przekierowuje glukozę oraz glutaminę na anaboliczne ścieżki metaboliczne [61].

Podsumowanie

Rola czynnika Nrf2, pod którego kontrolą pozostaje wiele istotnych dla komórkowej homeostazy genów o działaniu cytoprotekcyjnym, jest przedmiotem wielu badań, które wskazują, że nie można jej jednoznacznie określić. Z jednej strony aktywacja czynnika Nrf2 wywołuje indukcję enzymów II fazy zależnych od ARE – elementu odpowiedzi na antyoksydanty, co sprzyja detoksykacji kancerogenów i elektrofilowych metabolitów, mogących indukować powstanie stresu oksydacyjnego. W inicjacji i progresji nowotworu stres oksydacyjny odgrywa istotną rolę, dlatego wpływ na aktywację czynnika Nrf2 przez zmiany konformacyjne w białku Keap1 oraz fosforylację z udziałem kinaz jest ważną strategią w chemioprewencji. Z drugiej strony pojawiły się doniesienia o nadekspresji Nrf2 w komórkach nowotworowych, co może chronić je przed cytotoksycznymi skutkami antynowotworowej terapii prowadząc do lekooporności. Aktywacja i inaktywacja Nrf2 chroni komórki przez RFT, apoptozą i sprzyja ich przeżywalności w niekorzystnych warunkach. Znajomość dualistycznego działania czynnika Nrf2 jest konieczna do oceny korzystnych i negatywnych skutków, szczególnie w profilaktyce i terapii nowotworów.

Podziękowanie

Dziękujemy prof. Wandzie Baer-Dubowskiej za krytyczne uwagi dotyczące manuskryptu.

Przypisy

• 1. Adams J., Kelso R., Cooley L.: The Kelch repeat superfamily of proteins:propellers of cell function. Trends Cell Biol., 2000; 10: 17-24
  Google Scholar
• 2. Akhdar H., Loyer P., Rauch C., Corlu A., Guillouzo A., Morel F.: Involvementof Nrf2 activation in resistance to 5-fluorouracil in human coloncancer HT-29 cells. Eur. J. Cancer, 2009; 45: 2219-2227
  Google Scholar
• 3. Apopa P.L., He X., Ma Q.: Phosphorylation of Nrf2 in the transcriptionactivation domain by casein kinase 2 (CK2) is critical forthe nuclear translocation and transcription activation functionof Nrf2 in IMR-32 neuroblastoma cells. J. Biochem. Mol. Toxicol.,2008; 22: 63-76
  Google Scholar
• 4. Biswas M., Chan J.Y.: Role of Nrf1 in antioxidant response elementmediatedgene expression and beyond. Toxicol. Appl. Pharmacol., 2010;244: 16-20
  Google Scholar
• 5. Bryan H.K., Olayanju A., Goldring C.E., Park B.K.: The Nrf2 cell defencepathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation.Biochem. Pharmacol., 2013; 85: 705-717
  Google Scholar
• 6. Chan J.Y., Han X.L., Kan Y.W.: Isolation of cDNA encoding the humanNF-E2 protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 90: 11366-11370
  Google Scholar
• 7. Chan J.Y., Kwong M., Lu R., Chang J., Wang B., Yen T.S., Kan Y.W.:Targeted disruption of the ubiquitous CNC-bZIP transcription factor, Nrf-1, results in anemia and embryonic lethality in mice. EMBO J., 1998;17: 1779-1787
  Google Scholar
• 8. Chan K., Lu R., Chang J.C., Kan Y.W.: NRF2, a member of the NFE2family of transcription factors, is not essential for murine erythropoiesis,growth, and development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 93:13943-13948
  Google Scholar
• 9. Cullinan S.B., Diehl J.A.: PERK-dependent activation of Nrf2 contributesto redox homeostasis and cell survival following endoplasmicreticulum stress. J. Biol. Chem., 2004; 279: 20108-20117
  Google Scholar
• 10. Cullinan S.B., Zhang D., Hannink M., Arvisais E., Kaufman R.J., DiehlJ.A.: Nrf2 is a direct PERK substrate and effector of PERK-dependent cellsurvival. Mol. Cell. Biol., 2003; 23: 7198-7209
  Google Scholar
• 11. DeNicola G.M., Karreth F.A., Humpton T.J., Gopinathan A., Wei C.,Frese K., Mangal D, Yu K.H., Yeo C.J., Calhoun E.S., Scrimieri F., WinterJ.M., Hruban R.H., Iacobuzio-Donahue C., Kern S.E., Blair I.A., TuvesonD.A.: Oncogene-induced Nrf2 transcription promotes ROS detoxificationand tumorigenesis. Nature, 2011; 475: 106-109
  Google Scholar
• 12. Dhakshinamoorthy S., Jain A.K., Bloom D.A., Jaiswal A.K.: Bach1competes with Nrf2 leading to negative regulation of the antioxidantresponse element (ARE)-mediated NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 gene expression and induction in response to antioxidants. J. Biol.Chem., 2005; 280: 16891-16900
  Google Scholar
• 13. Dinkova-Kostova A.T., Massiah M.A., Bozak R.E., Hicks R.J.,Talalay P.: Potency of Michael reaction acceptors as inducers ofenzymes that protect against carcinogenesis depends on their reactivitywith sulfhydryl groups. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001;98: 3404-3409
  Google Scholar
• 14. Gao A.M., Ke Z.P., Wang J.N., Yang J.Y., Chen S.Y., Chen H.: Apigeninsensitizes doxorubicin-resistant hepatocellular carcinoma BEL-7402/ADM cells to doxorubicin via inhibiting PI3K/Akt/Nrf2 pathway. Carcinogenesis,2013; 34: 1806-1814
  Google Scholar
• 15. Giudice A., Montella M.: Activation of the Nrf2-ARE signaling pathway:a promising strategy in cancer prevention. Bioessays, 2006; 28:169-181
  Google Scholar
• 16. Hanahan D., Weinberg R.A.: Hallmarks of cancer: the next generation.Cell, 2011; 144: 646-674
  Google Scholar
• 17. Hayashi A., Suzuki H., Itoh K., Yamamoto M., Sugiyama Y.: Transcriptionfactor Nrf2 is required for the constitutive and inducible expressionof multidrug resistance-associated protein 1 in mouse embryo fibroblasts.Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003; 310: 824-829
  Google Scholar
• 18. Hayes J.D., McMahon M.: NRF2 and KEAP1 mutations: permanentactivation of an adaptive response in cancer. Trends Biochem. Sci.,2009; 34: 176-188
  Google Scholar
• 19. Holtzclaw W.D., Dinkova-Kostova A.T., Talalay P.: Protection againstelectrophile and oxidative stress by induction of phase 2 genes: thequest for the elusive sensor that responds to inducers. Adv. EnzymeRegul., 2004; 44: 335-367
  Google Scholar
• 20. Huang H.C., Nguyen T., Pickett C.B.: Phosphorylation of Nrf2 at Ser- 40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediatedtranscription. J. Biol. Chem., 2002; 277: 42769-42774
  Google Scholar
• 21. Hybertson B.M., Gao B., Bose S.K., McCord J.M.: Oxidative stress inhealth and disease: the therapeutic potential of Nrf2 activation. Mol.Aspects Med., 2011; 32: 234-246
  Google Scholar
• 22. Iida K., Itoh K., Kumagai Y., Oyasu R., Hattori K., Kawai K., ShimazuiT., Akaza H., Yamamoto M.: Nrf2 is essential for the chemopreventiveefficacy of oltipraz against urinary bladder carcinogenesis. Cancer Res.,2004; 64: 6424-6431
  Google Scholar
• 23. Itoh K., Chiba T., Takahashi S., Ishii T., Igarashi K., Katoh Y., OyakeT., Hayashi N., Satoh K., Hatayama I., Yamamoto M., Nabeshima Y.: AnNrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifyingenzyme genes through antioxidant response elements. Biochem.Biophys. Res. Commun., 1997; 236: 313-322
  Google Scholar
• 24. Itoh K., Igarashi K., Hayashi N., Nishizawa M., Yamamoto M.: Cloningand characterization of a novel erythroid cell-derived CNC familytranscription factor heterodimerizing with the small Maf family proteins.Mol. Cell. Biol., 1995; 15: 4184-4193
  Google Scholar
• 25. Itoh K., Wakabayashi N., Katoh Y., Ishii T., Igarashi K., Engel J.D.,Yamamoto M.: Keap1 represses nuclear activation of antioxidant responsiveelements by Nrf2 through binding to the amino-terminalNeh2 domain. Genes Dev., 1999; 13: 76-86
  Google Scholar
• 26. Jain A.K., Bloom D.A., Jaiswal A.K.: Nuclear import and export signalsin control of Nrf2. J. Biol. Chem., 2005; 280: 29158-29168
  Google Scholar
• 27. Jain A.K., Jaiswal A.K.: GSK-3β acts upstream of Fyn kinase in regulationof nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J.Biol. Chem., 2007; 282: 16502-16510
  Google Scholar
• 28. Jain A.K., Jaiswal A.K.: Phosphorylation of tyrosine 568 controlsnuclear export of Nrf2. J. Biol. Chem., 2006; 281: 12132-12142
  Google Scholar
• 29. Jain A.K., Mahajan S., Jaiswal A.K.: Phosphorylation and dephosphorylationof tyrosine 141 regulate stability and degradation of INrf2:a novel mechanism in Nrf2 activation. J. Biol. Chem., 2008; 283: 17712-17720
  Google Scholar
• 30. Jaiswal A.K.: Nrf2 signaling in coordinated activation of antioxidantgene expression. Free Radic. Biol. Med., 2004; 36: 1199-1207
  Google Scholar
• 31. Johnson J.R., Wiliams G., Pazdur R.: End points and United StatesFood and Drug Administration approval of oncology drugs. J. Clin. Oncol.,2003; 21: 1404-1411
  Google Scholar
• 32. Kang K.W., Lee S.J., Park J.W., Kim S.G.: Phosphatidylinositol 3-kinaseregulates nuclear translocation of NF-E2-related factor 2 throughactin rearrangement in response to oxidative stress. Mol. Pharmacol.,2002; 62: 1001-1010
  Google Scholar
• 33. Katoh Y., Iida K., Kang M.I., Kobayashi A., Mizukami M., Tong K.I.,McMahon M., Hayes J.D., Itoh K, Yamamoto M.: Evolutionary conservedN-terminal domain of Nrf2 is essential for the Keap1-mediateddegradation of the protein by proteasome. Arch. Biochem. Biophys.,2005; 433: 342-350
  Google Scholar
• 34. Katoh Y., Itoh K., Yoshida E., Miyagishi M., Fukamizu A., YamamotoM.: Two domains of Nrf2 cooperatively bind CBP, a CREB bindingprotein, and synergistically activate transcription. Genes Cells,2001; 6: 857-868
  Google Scholar
• 35. Keum Y.S., Owuor E.D., Kim B.R., Hu R., Kong A.N.: Involvement ofNrf2 and JNK1 in the activation of antioxidant responsive element (ARE)by chemopreventive agent phenethyl isothiocyanate (PEITC). Pharm.Res., 2003; 20: 1351-1356
  Google Scholar
• 36. Keum Y.S., Yu S., Chang P.P., Yuan X., Kim J.H., Xu C., Han J., AgarwalA., Kong A.N.: Mechanism of action of sulforaphane: inhibition of p38mitogen-activated protein kinase isoforms contributing to the inductionof antioxidant response element-mediated heme oxygenase-1 inhuman hepatoma HepG2 cells. Cancer Res., 2006; 66: 8804-8813
  Google Scholar
• 37. Khan H., Cino E.A., Brickenden A., Fan J., Yang D., Choy W.Y.: Fuzzycomplex formation between the intrinsically disordered prothymosinα and the Kelch domain of Keap1 involved in the oxidative stress response.J. Mol. Biol., 2013; 425: 1011-1027
  Google Scholar
• 38. Khor T.O., Huang M.T., Kwon K.H., Chan J.Y., Reddy B.S., Kong A.N.:Nrf2-deficient mice have an increased susceptibility to dextran sulfatesodium-induced colitis. Cancer Res., 2006; 66: 11580-11584
  Google Scholar
• 39. Kim Y.R., Oh J.E., Kim M.S., Kang M.R., Park S.W., Han J.Y., Eom H.S.,Yoo N.J., Lee S.H.: Oncogenic NRF2 mutations in squamous cell carcinomasof oesophagus and skin. J. Pathol., 2010; 220: 446-451
  Google Scholar
• 40. Kobayashi A., Kang M.I., Watai Y., Tong K.I., Shibata T., Uchida K., YamamotoM.: Oxidative and electrophilic stresses activate Nrf2 throughinhibition of ubiquitination activity of Keap1. Mol. Cell. Biol., 2006;26: 221-229
  Google Scholar
• 41. Kobayashi M., Itoh K., Suzuki T., Osanai H., Nishikawa K., KatohY., Takagi Y., Yamamoto M.: Identification of the interactive interface and phylogenic conservation of the Nrf2-Keap1 system. Genes Cells,2002; 7: 807-820
  Google Scholar
• 42. Krajka-Kuźniak V.: Induction of phase II enzymes as a strategy in thechemoprevention of cancer and other degenerative diseases. PostępyHig. Med. Dośw., 2007; 61: 627-638
  Google Scholar
• 43. Krajka-Kuźniak V., Paluszczak J., Baer-Dubowska W.: Xanthohumolinduces phase II enzymes via Nrf2 in human hepatocytes in vitro. Toxicol.In Vitro, 2013; 27: 149-156
  Google Scholar
• 44. Kundu J.K., Surh Y.J.: Nrf2-Keap1 signaling as a potential target forchemoprevention of inflammation-associated carcinogenesis. Pharm.Res., 2010; 27: 999-1013
  Google Scholar
• 45. Lage H.: An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolvedproblem. Cell. Mol. Life Sci., 2008; 65: 3145-3167
  Google Scholar
• 46. Lee J.H., Khor T.O., Shu L., Su Z.Y., Fuentes F., Kong A.N.: Dietaryphytochemicals and cancer prevention: Nrf2 signaling, epigenetics, andcell death mechanisms in blocking cancer initiation and progression.Pharmacol Ther., 2013; 137: 153-171
  Google Scholar
• 47. Lee J.S., Surh Y.J.: Nrf2 as a novel molecular target for chemoprevention.Cancer Lett., 2005; 224: 171-184
  Google Scholar
• 48. Lee O.H., Jain A.K., Papusha V., Jaiswal A.K.: An auto-regulatory loopbetween stress sensors INrf2 and Nrf2 controls their cellular abundance.J. Biol. Chem., 2007; 282: 36412-36420
  Google Scholar
• 49. Li W., Yu S.W., Kong A.N.: Nrf2 possesses a redox-sensitive nuclearexporting signal in the Neh5 transactivation domain. J. Biol. Chem.,2006; 281: 27251-27263
  Google Scholar
• 50. Li Y., Kong D., Wang Z., Sarkar F.H.: Regulation of microRNAs bynatural agents: an emerging field in chemoprevention and chemotherapyresearch. Pharm. Res., 2010; 27: 1027-1041
  Google Scholar
• 51. Li Y., Tollefsbol T.O.: Impact on DNA methylation in cancer preventionand therapy by bioactive dietary components. Curr. Med. Chem.,2010; 17: 2141-2151
  Google Scholar
• 52. Lin W., Shen G., Yuan X., Jain M.R., Yu S., Zhang A., Chen J.D., KongA.N.: Regulation of Nrf2 transactivation domain activity by p160 RAC3/SRC3 and other nuclear co-regulators. J. Biochem. Mol. Biol., 2006; 39:304-310
  Google Scholar
• 53. Lister A., Nedjadi T., Kitteringham N.R., Campbell F., Costello E.,Lloyd B., Copple I.M., Williams S., Owen A., Neoptolemos J.P., GoldringC.E., Park B.K.: Nrf2 is overexpressed in pancreatic cancer: implicationsfor cell proliferation and therapy. Mol. Cancer, 2011; 10: 37
  Google Scholar
• 54. Lo R., Matthews J.: The aryl hydrocarbon receptor and estrogen receptoralpha differentially modulate nuclear factor erythroid-2-relatedfactor 2 transactivation in MCF-7 breast cancer cells. Toxicol. Appl.Pharmacol., 2013; 270: 139-148
  Google Scholar
• 55. Lo S.C., Li X., Henzl M.T., Beamer L.J., Hannink M.: Structure of theKeap1:Nrf2 interface provides mechanistic insight into Nrf2 signaling.EMBO J., 2006; 25: 3605-3617
  Google Scholar
• 56. Magesh S., Chen Y., Hu L.: Small molecule modulators of Keap1-Nrf2-ARE pathway as potential preventive and therapeutic agents. Med.Res. Rev., 2012; 32: 687-726
  Google Scholar
• 57. Manson M.M., Gescher A., Hudson E.A., Plummer S.M., Squires M.S.,Prigent S.A.: Blocking and suppressing mechanisms of chemopreventionby dietary constituents. Toxicol. Lett., 2000; 112-113: 499-505
  Google Scholar
• 58. Maruyama A., Nishikawa K., Kawatani Y., Mimura J., Hosoya T., HaradaN., Yamamato M., Itoh K.: The novel Nrf2-interacting factor KAP1regulates susceptibility to oxidative stress by promoting the Nrf2-mediatedcytoprotective response. Biochem. J., 2011; 436: 387-397
  Google Scholar
• 59. McMahon M., Itoh K., Yamamoto M., Chanas S.A., Henderson C.J.,McLellan L.I., Wolf C.R., Cavin C., Hayes J.D.: The Cap’n’Collar basic leucinezipper transcription factor Nrf2 (NF-E2 p45-related factor 2) controlsboth constitutive and inducible expression of intestinal detoxificationand glutathione biosynthetic enzymes. Cancer Res., 2001; 61:3299-3307
  Google Scholar
• 60. McMahon M., Thomas N., Itoh K., Yamamoto M., Hayes J.D.: Redoxregulatedturnover of Nrf2 is determined by at least two separate proteindomains, the redox-sensitive Neh2 degron and the redox-insensitiveNeh6 degron. J. Biol. Chem., 2004; 279: 31556-31567
  Google Scholar
• 61. Mitsuishi Y., Taguchi K., Kawatani Y., Shibata T., Nukiwa T., AburataniH., Yamamoto M., Motohashi H.: Nrf2 redirects glucose and glutamineinto anabolic pathways in metabolic reprogramming. CancerCell, 2012; 22: 66-79
  Google Scholar
• 62. Moi P., Chan K., Asunis I., Cao A., Kan Y.W.: Isolation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2), a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptionalactivator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of thebeta-globin locus control region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994;91: 9926-9930
  Google Scholar
• 63. Motohashi H., O’Connor T., Katsuoka F., Engel J.D., Yamamoto M.:Integration and diversity of the regulatory network composed of Mafand CNC families of transcription factors. Gene, 2002; 294: 1-12
  Google Scholar
• 64. Naidu S., Vijayan V., Santoso S., Kietzmann T., Immenschuh S.: Inhibitionand genetic deficiency of p38 MAPK up-regulates heme oxygenase-1gene expression via Nrf2. J. Immunol., 2009; 182: 7048-7057
  Google Scholar
• 65. Nguyen T., Sherratt P.J., Nioi P., Yang C.S., Pickett C.B.: Nrf2 controlsconstitutive and inducible expression of ARE-driven genes througha dynamic pathway involving nucleocytoplasmic shuttling by Keap1.J. Biol. Chem., 2005; 280: 32485-32492
  Google Scholar
• 66. Nioi P., Nguyen T., Sherratt P.J., Pickett C.B.: The carboxy-terminalNeh3 domain of Nrf2 is required for transcriptional activation. Mol.Cell. Biol., 2005; 25: 10895-10906
  Google Scholar
• 67. Niture S.K., Jaiswal A.K.: Hsp90 interaction with INrf2(Keap1) mediatesstress-induced Nrf2 activation. J. Biol. Chem., 2010; 285: 36865-36875
  Google Scholar
• 68. Niture S.K., Jaiswal A.K.: Nrf2-induced antiapoptotic Bcl-xL proteinenhances cell survival and drug resistance. Free Radic. Biol. Med.,2013; 57: 119-131
  Google Scholar
• 69. Niture S.K., Jaiswal A.K.: Prothymosin-α mediates nuclear importof the INrf2/Cul3 Rbx1 complex to degrade nuclear Nrf2. J. Biol. Chem.,2009; 284: 13856-13868
  Google Scholar
• 70. Prochaska H.J., De Long M.J., Talalay P.: On the mechanisms of inductionof cancer-protective enzymes: a unifying proposal. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 1985; 82: 8232-8236
  Google Scholar
• 71. Rachakonda G., Xiong Y., Sekhar K.R., Stamer S.L., Liebler D.C., FreemanM.L.: Covalent modification at Cys151 dissociates the electrophilesensor Keap1 from the ubiquitin ligase CUL3. Chem. Res. Toxicol., 2008;21: 705-710
  Google Scholar
• 72. Rushmore T.H., Morton M.R., Pickett C.B.: The antioxidant responsiveelement. Activation by oxidative stress and identification of theDNA consensus sequence required for functional activity. J. Biol. Chem.,1991; 266: 11632-11639
  Google Scholar
• 73. Salazar M., Rojo A.I., Velasco D., de Sagarra R.M., Cuadrado A.: Glycogensynthase kinase-3β inhibits the xenobiotic and antioxidant cellresponse by direct phosphorylation and nuclear exclusion of the transcriptionfactor Nrf2. J. Biol. Chem., 2006; 281: 14841-14851
  Google Scholar
• 74. Saw C.L., Kong A.N.: Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2as a chemopreventive target in colorectal cancer. Expert Opin. Ther.Targets, 2011; 15: 281-295
  Google Scholar
• 75. Singh A., Wu H., Zhang P., Happel C., Ma J., Biswal S.: Expressionof ABCG2 (BCRP) is regulated by Nrf2 in cancer cells that confers sidepopulation and chemoresistance phenotype. Mol. Cancer Ther., 2010;9: 2365-2376
  Google Scholar
• 76. Slocum S.L, Kensler T.W.: Nrf2: control of sensitivity to carcinogens.Arch. Toxicol., 2011; 85: 273-284
  Google Scholar
• 77. Sporn M.B., Liby K.T., Yore M.M., Fu L., Lopchuk J.M., Gribble G.W.:New synthetic triterpenoids: potent agents for prevention and treatmentof tissue injury caused by inflammatory and oxidative stress. J.Nat. Prod., 2011; 74: 537-545
  Google Scholar

Pełna treść artykułu