Abstrakt

Prawidłowe odróżnienie egzogennych kwasów nukleinowych od własnych jest czynnikiem warunkującym przetrwanie całego organizmu, dlatego komórki wykształciły wiele receptorów, które pozwalają na identyfikację obcego DNA lub RNA. Wykrycie egzogennych kwasów nukleinowych jest swoistym „sygnałem niebezpieczeństwa” i mobilizuje komórki do walki ze źródłem zagrożenia, jakim najczęściej jest patogen. Proces rozpoznania egzogennego RNA jest skomplikowany ze względu na obecność w cytoplazmie komórek własnego RNA, dlatego w komórkach są obecne różne sensory kwasu nukleinowego. Pierwszą grupę tworzą receptory obecne w endosomie, zaliczane do receptorów Toll-podobnych: TLR3, TLR7, TLR8 i TLR13. Receptory wiążą RNA uwalniany z patogenów, które uległy endocytozie. Drugą ważną grupą receptorów RNA są receptory umiejscowione w cytoplazmie, takie jak PKR oraz receptory z grupy RLR, np. RIG-I, MDA5 i LGP2. Cytoplazmatyczne receptory rozpoznają RNA mikroorganizmów, które dostają się do wnętrza komórki, omijając endosomy. W każdym przypadku związanie RNA przez rozpoznający go receptor uruchamia kaskady sygnałowe prowadzące do wytwarzania interferonu i innych cytokin.

Wstęp

Organizmy wielokomórkowe są stale narażone na kontakt z różnymi czynnikami patogennymi. Wykształciły nieswoiste systemy rozpoznawania takiego zagrożenia, które można podzielić na dwie nadrzędne grupy. Pierwsza grupa wykorzystuje mechanizmy detekcji cząsteczek zwanych wzorcami molekularnymi związanymi z zagro- żeniem (DAMP, Danger Associated Molecular Pattern), druga bazuje na detekcji cząsteczek pochodzących od patogenów zwanych wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP, Pathogen Associated Molecular Patterns).

DAMP to endogenne elementy zdolne do aktywacji pierwotnej odpowiedzi odpornościowej, pojawiające się w chwili występowania fizycznego uszkodzenia organizmu. Można wśród nich wyróżnić: cząsteczki pochodzące z macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak fibronektyna czy kwas hialuronowy, związane ze stresem komórkowym, np. HSP (Heat Shock Protein, białka szoku cieplnego), HMGB1 (High-Mobility Group Box 1) lub endogenne kwasy nukleinowe, a także białka immunomodulujące, np. β-defensyna [11,78].

Do PAMP zalicza się cząstki pochodzenia egzogennego zdolne do aktywacji odpowiedzi odpornościowej. Należą do nich m.in. komponenty osłon komórek bakteryjnych, np. lipopolisacharydy, peptydoglikany, białka bakteryjne, np. flagelina oraz białka kapsydów wirusowych [1,11]. Ze względu na powszechność występowania szczególną rolę w obrębie tej grupy pełnią egzogenne kwasy nukleinowe.

Inwazja patogenów na organizm wiąże się często z wprowadzeniem do komórki obcego materiału genetycznego. Może się to odbywać w wyniku bezpośredniego wnikania patogenów do wnętrza komórki gospodarza lub za pośrednictwem endocytozy mikroorganizmów zewną- trzkomórkowych.

W komórce zwierzęcej DNA jest umiejscowiony jedynie w obrębie jądra komórkowego i w mitochondriach. Pojawienie się kwasu deoksyrybonukleinowego w cytoplazmie jest zatem sygnałem świadczącym o uszkodzeniu komórki lub inwazji patogenu i uruchamia procesy obronne w komórce [50]. W przypadku cytosolowego receptora AIM2 (Absent in Melanoma 2), rozpoznającego cytoplazmatyczny dsDNA, jego aktywacja prowadzi do rekrutacji inflamasomów oraz programowanej śmierci komórki w  wyniku pyroptozy zależnej od aktywacji kaspzy 1 [29]. Wykrycie DNA przez białko cGAS (cGAMP synthase, syntaza cGAMP) prowadzi do syntezy cGAMP (cykliczny guanozynomonofosforan-adenozynomonofosforan), co wywołuje aktywację białka adaptorowego STING (Stimulator of Interferon Genes) i  wytwarzanie interferonów (IFN) typu I [76]. W przypadku umiejscowionego w  endosomie TLR9, wykrywającego DNA o dużej zawartości nisko metylowanych wysp CpG, jego aktywacja pobudza zainfekowaną komórkę do wytwarzania interferonu typu I i cytokin prozapalnych [66].

Rozpoznanie egzogennego RNA jest dużo bardziej skomplikowane, ponieważ w cytoplazmie komórek ssaków jest obecny endogenny RNA. Większość kwasu nukleinowego występuje w postaci jednoniciowego RNA (ssRNA), którego drugorzędowa struktura często przypomina fragmenty dwuniciowego RNA (dsRNA). W odróżnieniu od pozostałych mikroorganizmów, wirusy do budowy genomu wykorzystują zarówno dsRNA, jak i ssRNA. Dlatego w toku ewolucji organizmy wyższe wykształciły wiele mechanizmów rozpoznawania i eliminacji egzogennego RNA z komórek przez specjalne oznakowanie i ochronę „swojego” RNA.

Białka opiekuńcze chronią endogenne RNA przed rozpoznaniem przez receptory układu odpornościowego i zapobiegają także jego degradacji. Innym sposobem na ukrycie własnego RNA jest modyfikacja zasad, jak na przykład metylacja lub synteza czapeczki na 5’końcu mRNA. Struktury wyższego rzędu obserwowane w tRNA czy rRNA pozwalają na odróżnienie endogennych czą- steczek od obcego RNA. RNA pochodzący od patogenów jest rozpoznawany przez wyspecjalizowane grupy receptorów związanych z błonami endosomów i receptory umiejscowione w cytoplazmie.

Pierwszą grupą receptorów dla RNA są umiejscowione w endosomach receptory Toll podobne, TLR (Toll Like Receptors): dsRNA jest rozpoznawany przez TLR3, ssRNA przez TLR7 i  8, natomiast sekwencje CGGAAAGACC w  podjednostce 23sRNA bakteryjnego rybosomu są ligandem dla TLR13. Kolejna grupa receptorów RNA to receptory umiejscowione w cytoplazmie i rozpoznające egzogenny dsRNA (ryc.1) [17,26,38]. Należą do nich: kinaza białkowa zależna od RNA (PKR, RNA Dependent Protein Kinase) oraz grupa receptorów RIG-I podobnych (RLR, RIG-I Like Receptors) obejmująca trzy białka: RIG-I (Retinoic acid- -Inducible Gene I), MDA5 (Melanoma Differentiation- -Associated Protein 5) oraz LGP2 (Laboratory of Genetics and Physiology 2).

Endosomalne receptroy rozpoznające rna

Znajdujące się na błonach endosomu receptory TLR, rozpoznające RNA, mają podobny plan budowy. Receptory te zawierają trzy główne domeny: od strony światła endosomu domenę (N-końcową) bogatą w motywy LRR (Leucine Rich Repeat, powtórzenia bogate w leucynę), krótką domenę przezbłonową, złożoną z pojedynczej α-helisy oraz cytoplazmatyczną (C-końcową) domenę TIR (Toll-interleukin 1 receptor). N-końcowa domena jest zaangażowana w rozpoznanie oraz wiązanie odpowiedniej cząsteczki RNA, natomiast domena TIR przekazuje sygnał na białka adaptorowe. Większość receptorów TLR wykorzystuje białko adaptorowe MyD88, wyjątkiem jest TLR3, który angażuje białko TRIF. Różnice w sekwencjach aminokwasowych domen N-końcowych poszczególnych receptorów TLR skutkują rozpoznawaniem różnych sekwencji i struktur kwasów nukleinowych, natomiast różnice w sekwencjach domen TIR w tych receptorach determinują swoistość aktywacji różnych szlaków sygnałowych [31].

TLR3

TLR3 to receptor, który w procesie ewolucji został wyselekcjonowany w  kierunku rozpoznania egzogennego dsRNA i jest zaangażowany głównie w odpowiedź przeciwwirusową [2,80]. Wykazano, że w  ludzkich fibroblastach pochodzenia płucnego linii MRC5, TLR3 jest umiejscowiony zarówno w  błonie endosomów, jak i na powierzchni komórki [28]. Komórki dendrytyczne (DC), makrofagi, limfocyty B, jak również komórki MEF (Mouse Embryonic Fibroblasts) odpowiadają na stymulację syntetycznym ligandem dla TLR3 – poly(I:C) (Polyinosinic:polycytidylic acid) tylko w obecności czynnika transfekującego, co wskazuje na wewnątrzkomórkową lokalizację TLR3 w tych komórkach [51]. Potwierdzono również występowanie TLR3 w komórkach układu nerwowego, takich jak: mikroglej czy neurony (model komórkowy NT2-N). Komórki te po stymulacji poly(I:C) wytwarzały IFN-β (interfeon β), RANTES (Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted), IP-10 (Interferon gamma-induced Protein 10), TNF (Tumor Necrosis Factors) oraz IL-6; nie wykluczono jednak udziału w tym procesie cytoplazmatycznych receptorów RNA [41].

TLR3 odróżnia endogenny dsRNA od egzogennego RNA na podstawie struktury i  długości ligandu. TLR3 jest aktywowany przez dsRNA o minimalnej długości 45pz, przy czym dsRNA dłuższe niż 90 pz znacznie mocniej indukuje wytwarzanie cytokin prozapalnych [10]. Endogenny RNA, taki jak tRNA tworzy skomplikowane drugorzędowe struktury uniemożliwiające wiązanie się do TLR3, a rybosomalny RNA występuje w kompleksach z białkami budującymi rybosom, które blokują dostęp receptora do RNA.

Endosomalna, zaangażowana w rozpoznawanie i wiązanie dsRNA, część TLR3 ma kształt podkowy i składa się z dwudziestu jeden motywów LRR oraz dodatkowych domen LRR na N– oraz C– końcu zwanych odpowiednio LRR-NT i LRR-CT. Zidentyfikowano obecność piętnastu miejsc glikozylacji, z których jedna bierze udział w wią- zaniu RNA. Inną częścią białka jest pojedyncza α-helisa przezbłonowa, warunkująca kotwiczenie receptora w błonie endosomu. Częścią cytosolową jest domena TIR odpowiadająca za dokowanie białek adaptorowych oraz za przekazywanie sygnału [15].

W badaniach in vitro nad tym receptorem do stymulacji wykorzystuje się syntetyczny odpowiednik dsRNA, poly- (I:C). W warunkach fizjologicznych jest aktywowany przez RNA pochodzenia wirusowego, np. Influenza typu A [28,52].

Badania nad mechanizmem rozpoznawania dsRNA przez TLR3 wykazały, że funkcjonalny receptor jest dimerem [77]. Gdy dsRNA trafia do endosomu, najczęściej w czasie infekcji wirusowej, wchodzi między dwie cząsteczki receptora, formując kompleks w kształcie litery M. RNA w tym kompleksie oddziałuje z obydwoma monomerami TLR3, a w wiązanie liganda są zaangażowane m.in. histydyny, które w kwaśnym środowisku endosomu są naładowane dodatnio i mogą łatwo oddziaływać z ujemnie naładowanym szkieletem RNA. Wiązanie liganda przez TLR3 powoduje utworzenie wiązań wodorowych mię- dzy C-końcowymi domenami LRR, zmianę konformacji białka, a co za tym idzie dimeryzację domen TIR i przekazanie sygnału na białko adaptorowe TRIF [15,43].

Jak już wspomniano, przekazywanie sygnału aktywacji TLR3, w przeciwieństwie do pozostałych receptorów należących do grupy TLR, nie zależy od białka adaptorowego MyD88, a analogiczną funkcję pełni białko TRIF. Najczęściej zaktywowane białko TRIF rekrutuje TRAF3, które uruchamia proces przekazywania sygnału na kolejne białka TBK1 i IKKε, powodując aktywację czynnika transkrypcyjnego IRF-3 i ekspresje genu dla IFN typu I [28,52,72]. W przypadku zależnej od TRIF aktywacji kompleksu Rip1-TRAF6 dochodzi do aktywacji czynników transkrypcyjnych NF-κB i AP1 oraz indukcji mRNA dla cytokin prozapalnych [2].

TLR7/8

TLR7 i TLR8 są ważnymi receptorami zaangażowanymi w prawidłową odpowiedź organizmu na jednoniciowy RNA głównie pochodzenia wirusowego. Do komórek charakteryzujących się wysokim poziomem ekspresji TLR7 należą: plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC-Plasmacytoid Dendritic Cells) oraz makrofagi. Jego obecność potwierdzono również w limfocytach B oraz w monocytach. TLR8 jako funkcjonalny receptor jest obecny jedynie w komórkach ludzkich, głównie w monocytach [23,30].

Główną cechą wspólną kwasu nukleinowego rozpoznawanego przez TLR7 i TLR8 jest jego jednoniciowa struktura. Wykazano, że sekwencje bogate w  urydynę wydajniej aktywują odpowiedź odpornościową za pośrednictwem tych receptorów. Różnice w sekwencji oraz strukturze drugorzędowej ssRNA również wpływają na poziom indukowanej odpowiedzi. Trudno przewidzieć, która cząsteczka RNA będzie zdolna do stymulacji TLR7/8, a która będzie traktowana jak cząsteczka endogenna [19,23,69]. Na immunogenność cząsteczki ssRNA wpływają także modyfikacje budujących go nukleotydów, a wśród nich metylacja. Potwierdzono, że jest czynnikiem znacznie obniżającym zdolność rozpoznania RNA przez TLR7/8, a liczba metylowanych zasad jest odwrotnie proporcjonalna do zdolności RNA do aktywacji odpowiedzi odpornościowej. Innym przykładem modyfikacji jest syntetyczny LNA (Locked Nucleic Acid), RNA zbudowany z nukleotydów ze zmodyfikowaną rybozą, w której tlen w pozycji 2’ tworzy dodatkowe wiązanie z węglem w pozycji 4’. Charakteryzuje się znacznie obniżoną zdolnością do wywołania odpowiedzi odpornościowej [69].

W warunkach laboratoryjnych do badaniach nad TLR7/8 bardzo często są wykorzystywane ligandy syntetyczne, m.in. imidazochinolina (R848, Gardiquimod), tiazochinolina, które nie wykazują swoistości gatunkowej. Kolejną grupą ligandów są analogi zasad adeniny, guanozyny (loxorybina) oraz analog pirymidyn (bropirymina) czy homodimery tymidyny (Poly(dT)), które wydajnie aktywują odpowiedź odpornościową zależną od TLR7/8 [25,32,33].

Dotychczas potwierdzono udział TLR7/8 w odpowiedzi na różnego pochodzenia infekcje wirusowe. Receptory te są zaangażowane przede wszystkim w rozpoznawanie wirusowego ssRNA pochodzącego m.in. z retrowirusów, na przykład HIV-1, HFV (Human Foamy Virus) i mysiego gammaretrowirusa [8,64], a także pochodzą- cego od pikornawirusów, np. HPeV (Human Parechovirus) [79]. Udowodniono również udział TLR7 w rozpoznawaniu DNA pochodzenia wirusowego, np. z MCMV (Murine Cytomegalovirus) [90]. Pojawiają się także doniesienia o zaangażowaniu tych receptorów w rozpoznanie RNA pochodzenia bakteryjnego Helicobacter i Borelia, a nawet pasożytniczych pierwotniaków z  rodzaju Plasmodium [3,13]. Badania wykazały, że w monocytach (linia komórkowa THP-1) receptory TLR7 i TLR8 są zaangażowane w odpowiedź przeciwbakteryjną. Wykazano, że fagocytoza Helicobacter pylori czy Borelia burgdorferi prowadzi do aktywacji receptorów TLR7/8, a w jej wyniku do wytwarzania IFN-β [23]. Zaobserwowano również powiązanie polimorfizmu genu kodującego TLR8 z podatnością na zakażenia Mycobacterium bovis. Przez pomiar wytwarzania IFN typu I, IL-12 oraz IFN-γ wykazano zdolność receptora TLR7 do regulacji odpowiedzi przeciw Plasmodium chabaudi i P. falciparum [13]. TLR7 i TLR8 są zakotwiczone w błonie endosomu, co umożliwia im rozpoznawanie RNA niezależnie od replikacji patogenów. Domena N-terminalna, odpowiedzialna za wiązanie odpowiedniego PAMP, znajduje się w świetle endosomu, natomiast C-terminalna domena TIR, przekazująca sygnał na kolejne białka szlaku sygnałowego, w cytoplazmie [31]. Kompletna struktura krystalograficzna receptorów TLR7/8 nie jest jak dotąd poznana, wykazano jednak, że w obrębie domeny N-terminalnej TLR7/8 znajduje się region łącznikowy, podatny na trawienie proteolityczne. Jego cięcie tworzy strukturę w kształcie łuku, która jest funkcjonalna i pozwala na rozpoznawanie liganda i  rekrutację białka adaptorowego MyD88. Przypuszcza się również, że podobnie jak w przypadku receptorów TLR o dokładnie scharakteryzowanej budowie, również TLR7/8 tworzy w endosomie homodimery [6,31,82].

Szlak sygnałowy uruchamiany po wiązaniu liganda przez TLR7/8 wymaga białka adaptorowego MyD88. Zaangażowane jest w rekrutację i przekazanie sygnału z receptora na kinazę IRAK4, która razem z IRAK2 oraz TRAF6 tworzą kompleks oddysocjowujący od TLR7/8. IRAK/TRAF aktywują TAK1, która pośredniczy w przekazaniu sygnału na kompleks NEMO/IKKα/IKKβ, prowadząc do translokacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB do jądra komórkowego, co uruchomia wytwarzanie cytokin prozapalnych w komórce. Alternatywna bądź równoległa droga sygnalizacyjna, aktywowana przez TLR7, prowadzi do indukcji ekspresji interferonu typu I. W szlaku tym, sygnał od receptora jest przekazywany na kompleks złożony z białek IRAK4, IRAK1 oraz TRAF6. Następnie z udziałem kinazy IKKα zostaje aktywowany czynnik transkrypcyjny IRF7, który tworzy homodimer i aktywuje transkrypcję IFN typu I [4,19,23,58,79].

TLR13

Odkryty w ostatnich latach TLR13 charakteryzuje się wysokim poziomem ekspresji w  konwencjonalnych komórkach dendrytycznych (cDC) śledzony. Ten nowo scharakteryzowany, umiejscowiony w endosomie receptor jest zaangażowany w rozpoznawanie ssRNA tworzą- cego podjednostkę 23S bakteryjnego rybosomu [57].

Szlak sygnałowy aktywowany przez TLR13 nie jest jeszcze dobrze scharakteryzowany. Wiadomo, że sygnał przekazywany jest za pośrednictwem białka MyD88 i kinazy TAK1, następnie uaktywnia NF-κB [73]. Badania wykazały, że makrofagi zawierające TLR13, a pozbawione genów kodujących pozostałe receptory z grupy TLR, były zdolne do aktywacji odpowiedzi odpornościowej przeciw inaktywowanym termicznie Staphylococcus aureus (itSa), a preinkubacja itSa z rybonukleazą A znosiła tę odpowiedź. Potwierdzono również, że TLR13 rozpoznaje zdeterminowaną sekwencję w rybosomalnym RNA, której konsensus ustalono na CGGAAAGACC [57]. Receptor TLR 13 wydaje się ważnym komórkowym sensorem bakteryjnego ssRNA. Wiadomo, że sekwencja rozpoznawana przez ten receptor znajduje się na pętli przenoszącej peptyd w podjednostce 23S rRNA, która jest również miejscem działania antybiotyków z grupy MLS (makrolidy, linkozamidy, streptograminy B). Zatem nieprawidłowa terapia antybiotykowa, powodująca powstanie opornych szczepów bakterii, może spowodować powstanie bakterii nierozpoznawanych przez receptor TLR13 [57,74].

Potwierdzono również udział TLR13 w odpowiedzi na infekcję wirusową i wytwarzanie IFN typu I za pośrednictwem IRF7. Nie ustalono jednak, które komponenty wirusowe są odpowiedzialne za pobudzenie TLR13 [73].

Receptory rig-i podobne

Jak już wspomniano grupę receptorów RLR tworzą trzy białka: RIG-I, MDA5 oraz LGP2. Należą do rodziny helikaz zawierających motyw DEAD/DEAH (kwas asparaginowy- -kwas glutaminowy-alanina-kwas asparaginowy/kwas asparaginowy-kwas glutaminowy-alanina-histydyna). W  organizmach istnieje wiele helikaz zawierających motyw DEAD. Są to enzymy zdolne do rozplatania RNA, zaangażowane w bardzo różnorodne procesy w komórce, takie jak np. transkrypcja, translacja, wycinanie intronów, degradacja RNA oraz jak obserwuje się w RLR udział w mechanizmach odpowiedzi odpornościowej [5].

Geny kodujące receptory RLR ulegają ekspresji w większości typów tkanek. Obserwuje się ich stałą ekspresję na niskim poziomie w komórkach szpiku kostnego, nabłonka oraz ośrodkowego układu nerwowego. Przykładami mogą być komórki pDC, MEF (mysie fibroblasty płodowe) lub linii A549 (linia komórek nowotworowych płuc), ale również komórki mózgu, takie jak mikroglej i astrocyty, w których poziom ekspresji mRNA dla RLR jest podwyższony w następstwie kontaktu z wirusowym dsRNA oraz poly(I:C) [34,88,89].

Receptory RLR mają znaczny udział w nieswoistej odpowiedzi odpornościowej. Wynika to ze zdolności tych bia- łek do rozpoznawania i wiązania wirusowego dsRNA, a następnie przekazywania sygnału, który prowadzi do wytwarzania IFN i/lub cytokin prozapalnych.

RLR, jako cytoplazmatyczny receptor wykrywający RNA musi być zdolny do odróżnienia kwasu rybonukleinowego komórki gospodarza od obcego. Dlatego RNA wytwarzane w komórce przez polimerazy RNA jest „niewidoczne” dla RLR. RIG-I rozpoznaje 5’pppRNA w cytoplazmie, odróżniając je od RNA syntetyzowanego przez polimerazę I oraz polimerazę III ze względu na obecność pojedynczej reszty fosforanowej na 5’ końcu, a także od cząsteczki RNA wytwarzanej przez polimerazę II, która ma czapeczkę z 7-metylo-guanozyną (Cap) przyłączoną do reszty fosforanowej na 5’ końcu. Jednak w komórkach eukariotycznych jest obecne także endogenne RNA zawierające trzy reszty fosforanowe [18]. Przykładem może być 7 SL RNA, wchodzące w skład cząstki rozpoznającej sygnał (SRP RNA, Signal Recognition Particle RNA), rybonukleoproteiny odpowiedzialnej za wiązanie peptydu sygnałowego białek wydzielniczych oraz kierowanie rybosomu do ER. Cząsteczki 7 SL RNA są powszechnie obecne w komórce, jednak nie wiążą się z RIG-I, co wskazuje, że musi istnieć dodatkowy mechanizm zapobiegający aktywacji receptorów RLR przez endogenny RNA [49]. Może nim być modyfikacja zasad w  RNA, np. 2’-O-metylacja. Modyfikacje zasad mogą spowodować zmiany w konformacji i/lub ładunku elektrostatycznym, które uniemożliwiają rozpoznanie RNA przez receptor RLR. Ponieważ wszystkie modyfikacje nukleotydów wchodzących w skład RNA odbywają się w obrębie jądra komórkowego, powoduje to, że endogenne, niezmodyfikowane cząsteczki nie mają styczno- ści z receptorami. Wszystkie procesy, którym podlega egzogenny RNA zachodzą w cytoplazmie, dlatego nie pozwala to na jego modyfikacje przez enzymy jądrowe i tym samym ukrycie przed receptorami RLR [18].

Wszystkie trzy białka z grupy receptorów RLR (RIG-I, MDA5 i LGP2) w swojej strukturze mają dwie domeny helikazy zawierające motyw DEAD, które od N-końca są zorganizowane w następujący sposób: pierwsza domena HEL1 ma za sobą mniejszą domenę HEL2i, za którą znajduje się druga domena helikazy HEL2. Domeny odpowiadają za wiązanie nici RNA. RIG-I  oraz MDA5, w  N-końcowej części białka, zawierają dwie domeny CARD1 i CARD2 (Caspase Activation and Recruitment Domains, domeny rekrutujące i aktywujące kasapazę) odpowiadające za przekazanie sygnału z receptora na białko adaptorowe MAVS (Mitochondrial Antiviral- -Signaling Protein), które w komórce jest umiejscowione głównie na błonach mitochondrialnych [87]. Wykazano również, wykorzystując RNA Tar (Trans-Activation Response Ęlement, element transaktywujący) wirusa HIV, że możliwe jest umiejscowienie białka MAVS na powierzchni peroksysomów [20]. Białka RIG-I oraz LGP2 zawierają w C-końcowej części domenę CTD (C-Terminal Domain, C-końcowa domena) wiążącą reszty fosforanowe na 5’-końcu dsRNA [87].

RIG-I

RIG-I  jest receptorem wiążącym krótkie, do 1000 pz odcinki dsRNA. W warunkach laboratoryjnych używa się fragmentów złożonych z  19-24 pz mających tzw. tępe końce. W  obu przypadkach cząsteczki dsRNA, które dodatkowo na 5’-końcu zawierają trzy reszty fosforanowe (5’pppdsRNA) wydajniej aktywują odpowiedź odpornościową [7]. Wykazano, że nie tylko 5’pppdsRNA, ale również 5’pppssRNA jest zdolny do oddziaływania z RIG-I, a następnie do aktywacji odpowiedzi odporno- ściowej. W znacznie słabszym stopniu, ale wystarczają- cym do pobudzenia kaskady sygnałowej, do aktywacji RIG-I jest zdolny także 5’ppdsRNA. Jednoniciowy RNA z dwiema resztami fosforanowymi na 5’-końcu (5’ppssRNA) nie pobudza jednak odpowiedzi odpornościowej. Natomiast 5’pdsRNA jest niezdolny do aktywacji odpowiedzi odpornościowej za pośrednictwem RIG-I. Pozwala to wnioskować, że RIG-I silnie oddziałuje z resztami fosforanowymi w pozycji α oraz β, a odziaływanie z resztą fosforanową w pozycji γ nie jest niezbędne [27].

Wiązanie liganda przez RIG-I  odbywa się z  udziałem trzech domen HEL1, HEL2 oraz CTD. Polega na licznych odziaływaniach grup 2’hydroksylowymi RNA z grupami amidowymi białka znajdującymi się w łańcuchu głównym oraz bocznym konserwatywnie zachowywanych aminokwasów, takich jak asparagina i glutamina. Na wią- zanie liganda wpływają jeszcze elektrostatyczne oddzia- ływania między tlenem na resztach fosforanowych RNA a  dodatnio naładowanymi aminokwasami jak lizyna. Molekularny wzór odziaływania RIG-I i RNA wskazuje na brak wpływu pH na to wiązanie oraz sugeruje większą swoistość receptora względem dsRNA. RIG-I zdolny jest również do wiązania dłuższych sekwencji dsRNA mię- dzy 200 pz a 2000 pz, niemających reszt fosforanowych, lecz bez wywołania odpowiedzi odpornościowej [47]. Wykazano, że RIG-I rozpoznaje materiał genetyczny lub produkty pośrednie replikacji wirusów, m.in. z rodziny Flaviviridae, Paramyxoviridae, Ortomyxoviridae, Rhabdoviridae oraz Reoviridae [46].

Receptor RIG-I  w  komórce, w  której nie ma wirusowego 5’pppdsRNA występuje w  postaci nieaktywnej, domeny helikaz są w  luźnej konformacji i  mają niewielkie powinowactwo do ATP oraz dsRNA. W tym stanie domeny CARD są zablokowane przez bezpośrednie odziaływanie CARD2 z HEL2i, co uniemożliwia wiązanie ubikwityny do domen CARD, a dodatkowo blokuje domenom helikaz dostęp do RNA [47]. W stanie autorepresji domena CTD jest dodatnio naładowana i luźno wystaje poza główną strukturę białka, umożliwia to rozpoznanie trzech reszt fosforanowych znajdujących się na 5’ końcu RNA. Domena CTD ma bardzo duże powinowactwo do 5’pppdsRNA, wiążąc ligand zwiększa miejscowe stężenie RNA w obrębie receptora, które prowadzi do zmian konformacji helikaz. Zmiany te umożliwiają wią- zanie ATP przez helikazy i zwiększenie ich powinowactwa do RNA. Wywołuje to dalsze zmiany konformacyjne i uwalnia domenę CARD, która uzyskuje możliwość luź- nego usytuowania się poza główną strukturą receptora, natomiast RNA, związane z domeną CTD, tworzy bardzo silne odziaływania z helikazami. Uwolniona domena CARD ma teraz wolny dostęp do K63-ubikwityny, która po przyłączeniu się do RIG-I  umożliwia przekazanie sygnału na białko adaptorowe MAVS [39]. Ubikwitynacja RIG-I jest przeprowadzana głównie przez E3 ligazę ubikwityny TRIM25. Do aktywacji RIG-I przez ubikwitynę jest potrzebny łańcuch złożony, z co najmniej czterech cząsteczek K63-ubikwityny [22]. W tej konformacji RIG-I zyskuje również aktywność hydrolazy ATP. Wydaje się, że hydroliza ATP pozwala na przemieszczanie się receptora po cząsteczce RNA oraz ułatwia tworzenie tetramerów RIG-I, w celu zwielokrotnienia siły sygnału pochodzącego z jednej cząsteczki RNA [55]. RIG-I może inicjować odpowiedź odpornościową tak długo, jak długo jest ubikwitynowane (ryc. 2). Nawet po hydrolizie ATP i dysocjacji RNA od domeny helikaz, białko RIG-I nie może wrócić do postaci nieaktywnej. Dopiero po utracie łańcucha ubikwitynowego i całkowitym odłączeniu się RNA od RIG-I, receptor może zostać skierowany do degradacji lub zostać wykorzystany ponownie [39,47].

Istnieje również możliwość wiązania białka RIG-I  do dłuższych cząsteczek dsRNA pozbawionych 5’ppp reszt fosforanowych, lecz proces ten zachodzi ze znacznie mniejszym powinowactwem i jest niezależny od domeny CTD [39].

MDA5

MDA5 jest kolejnym białkiem grupy RLR, które rozpoznaje dsRNA. Do aktywacji odpowiedzi odpornościowej przez MDA5 konieczny jest długi, dwuniciowy RNA składający się z ponad 1000 pz, przy czym niepotrzebna jest obecność reszt fosforanowych na 5’-końcu RNA [36]. Do badań in vitro nad receptorem MDA5 najczęściej jest wykorzystywany syntetyczny analog dsRNA poly(I:C). Uważa się, że jest możliwe rozpoznawanie przez ten receptor struktur wyższego rzędu obecnych w wirusowym RNA, na przykład swoistego regionu mRNA wirusa PIV5 (Parainfluenza virus 5) kodującego białko L (Large Protein). Wykazano, że receptor MDA5 jest najsilniej stymulowany przez wirusy z rodziny Picornaviridae [46,65].

Jak już wspomniano białko MDA5 jest pozbawione domeny CTD, dlatego nie może rozpoznawać dsRNA na podstawie reszt fosforanowych na 5’-końcu. MDA5 wydajnie wiąże się do długich odcinków dsRNA bogatych w zasady A i U. Po związaniu się do dsRNA, białko MDA5 tworzy na powierzchni RNA długie, helikalnie skręcone filamenty, złożone co najmniej z jedenastu cząsteczek receptora. Rozpoznawanie przez MDA5 sekwencji dsRNA bogatych w adeninę i uracyl jest związane ze zmniejszonym poziomem hydrolizy ATP, a więc ze zmniejszoną translokacją receptora na powierzchni RNA. Ułatwia to tworzenie polimerów przez MDA5.

LGP2

Trzecim z grupy receptorów RLR jest LGP2, receptor zdolny do odziaływania i wiązania dsRNA o podobniej strukturze do tego wiązanego przez RIG-I. W przypadku LGP2 nie obserwuje się aktywacji odpowiedzi odporno- ściowej, a jedynie modulację działania RIG-I. Do hamowania RIG-I przez LGP2 dochodzi najprawdopodobniej z powodu konkurencji o ten sam ligand, mogącej doprowadzić do sekwestracji 5’pppRNA i uniemożliwieniu jego rozpoznania przez RIG-I [61,88].

W  szlaku sygnałowym aktywowanym przez receptor MDA5 białko LGP2 pełni rolę regulatora pozytywnego. Wiążąc się do dsRNA ułatwia jego rozpoznanie przez receptor MDA5. Wysuwa się hipotezę, że białko LGP2 wpływa na równowagę między odpowiedziami inicjowanymi przez receptory MDA5 i RIG-I [14,18].

W przypadku białka LGP2, które jest pozbawione domen CARD, rozpoznanie cząsteczki RNA przebiega w podobny sposób jak w białku RIG-I. Brak domeny CARD jednak uniemożliwia przekazywanie sygnału z LGP2 na MAVS, dlatego proponuje się udział białka LGP2 w regulacji szlaków sygnałowych pozostałych receptorów RLR [68,70].

Szlak sygnałowy zależny od RLR

Sygnał, który powstaje po związaniu RNA przez receptory z grupy RLR jest przekazywany na białko adaptorowe MAVS. Tworzenie polimerów MDA5 na cząsteczce RNA i/lub wiązanie RNA z  RIG-I  powoduje składanie kompleksów MAVS na powierzchni mitochondrium, co umożliwia wydajniejsze odbieranie sygnału przez białko adaptorowe MAVS [84,86].

Wykazano, że synteza białek RLR zwiększa się po stymulacji komórek interferonem i w następstwie infekcji wirusowej. Szlak sygnałowy aktywowanego receptora RLR powoduje aktywację ligazy ubikwitynowej TRAF3, która tworzy kompleks z białkiem NAP1, umożliwiając fosforylację białka TANK. Następnym krokiem jest fosforylacja kompleksu kinaz TBK1 oraz IKKε. Sygnał jest przenoszony na czynniki transkrypcyjne IRF3 oraz IRF7, które dimeryzują i są translokowane z cytoplazmy do jądra komórkowego. W jądrze IRF3/7 aktywuje ekspresję genu dla IFN typu I [45,59,89].

Inna ścieżka sygnałowa aktywowana po związaniu RNA przez receptor RLR pobudza ekspresję cytokin prozapalnych. Szlak rozpoczyna się od białka TRAF2, które umoż- liwia aktywację TAK1, co ostatecznie doprowadza do translokacji NF-κB do jądra komórkowego. Możliwa jest również fosforylacja kompleksu kinaz białkowych IKKγ, α oraz β skutkująca fosforylacją i degradacją IκBα oraz aktywacją czynnika transkrypcyjnego NF-κB [45,54,89].

Wyniki doświadczeń potwierdzają, że komórki MEF RIG-I–/– oraz pDC RIG-I–/– poddane stymulacji syntetycznym 5’pppdsRNA lub infekowane wirusami SeV (Sendai virus), VSV (Vesicular stomatitis virus) lub JEV (Japanese encephalitis) czy wirusem grypy typu A  nie wykazują wzrostu poziomu ekspresji IFN typu I w odpowiedzi na stymulację [27,40,63,65]. W przypadku komórek Huh7 traktowanych HIV Tar, który jest cząsteczką wirusowego RNA biorącą udział w aktywacji wirusowych promotorów oraz replikacji ich genomów, obserwuje się zwiększone wytwarzanie IP-10, podczas gdy w  komórkach z inaktywowanym genem RIG-I ekspresja tej cytokiny jest zahamowana [9].

W podobnych badaniach przeprowadzonych na mysich homozygotach z delecją genu kodującego RIG-I obserwowano obniżony poziom IFN-α w surowicy. W komórkach MEF i pDC z inaktywowanym genem MDA5 zauważono również obniżenie poziomu syntezy IFN typu I po stymulacji genomowym RNA wirusa EMCV. Te same linie komórkowe poddane stymulacji poly(I:C) charakteryzują się brakiem syntezy IFN-α/β oraz obniżonym poziomem syntezy IL-6 oraz IL-12. W obydwu receptorach wykazano, że do wywołania odpowiedzi odpornościowej przeciwwirusowej, konieczna jest obecność w komórce cząstek wirusowych zdolnych do replikacji, gdyż w czasie infekcji wirusami inaktywowanymi światłem ultrafioletowym nie obserwowano aktywacji ścieżki sygnałowej receptora RLR [24,37].

Aktywacja receptora RLR może być kontrolowana przez fosforylację zależną od kinaz PKCα/β. Przy braku obecności obcego RNA w komórce, RIG-I jest fosforylowany na Ser8 oraz Tre170, natomiast MDA5 na Ser88, co powoduje utrzymanie receptorów w  postaci nieaktywnej. W chwili pojawienia się egzogennego RNA w komórce receptory RLR są defosforylowane przez fosfatazy biał- kowe PP1α/γ, umożliwiając prawidłowe działanie receptorów [48,83].

Wiele wirusów wykształciło mechanizmy swoistej dezaktywacji receptorów RLR lub sygnału następującego po ich aktywacji. Przykładem może być białko US11, pochodzące z wirusa Herpes simplex virus, które wiąże się do receptorów RLR w domenie helikaz, uniemożliwiając oddziaływanie receptora z RNA wirusa [85]. Podobnie białka NS1 i NS2 wirusa RSV oddziałują z RLR, przy czym wykazano, że NS2 wiąże się do domeny CARD receptora RIG-I, uniemożliwiając przekazanie sygnału na białko MAVS [42]. Inne wirusy, takie jak: Poliovirus, Rihinovirus, Echovirus czy Encephalomyocarditisvirus kodują proteazy C3 tnące receptor RIG-I. Istnieją również białka wirusowe E3L (Vaccina virus), VP35 (Ebola virus) oraz TRS1 czy m142/m143 (Human cytomegalovirus), które wiążą się do dsRNA, zapobiegając jego wykryciu przez receptor RLR [12,21,62].

PKR

PKR jest kinazą serynowo-treoninową wiążącą dsRNA. Podlega konstytutywnej ekspresji w większości rodzajów komórek, przy czym poziom ekspresji jest najwyższy w  komórkach grasicy, śledziony oraz szpiku kostnego, może też być indukowany na skutek ekspozycji komórek na IFN typu I [44,53]. Głównym substratem PKR w komórce jest podjednostka α eukariotycznego czynnika inicjacji translacji (eIF2α). Fosforylacja eIF2α uniemożliwia jego działanie i hamuje inicjację translacji w komórce, a tym samym zatrzymuje syntezę wszystkich białek, zarówno endogennych, jak i wirusowych [67]. Oprócz procesów związanych z odpowiedzią przeciwwirusową kinaza jest zaangażowana w regulację procesu wzrostu komórki oraz jej różnicowania [44].

Wykazano, że stymulacja komórek polyI:C prowadzi do wzrostu poziomu postaci ufosforylowanej oraz całkowitej ilości PKR. W następstwie stymulacji poly(I:C) dochodzi także do aktywacji ścieżki sygnałowej p38 MAPK oraz wytwarzania IL-8 [75]. Zastosowanie inhibitora PKR, 2-aminopuryny (2-AP), powoduje zahamowanie aktywacji p38 oraz znaczące obniżenie wytwarzania IL-8 [81]. Obserwacje te sugerują, że działanie PKR w  układzie odpornościowym nie ogranicza się jedynie do zahamowania translacji białek. Potwierdza to również, że obserwowano bezpośrednie odziaływanie PKR z MKK6, która jest aktywatorem p38 [75].

Jak już wspominano, poziom ekspresji PKR w komórce może być regulowany przez IFN typu I. W czasie infekcji wirusem PKR rozpoznaje i wiąże się do dsRNA patogenu za pomocą N-końcowego motywu wiążącego RNA [16]. Po związaniu kinazy do RNA następuje jej autofosforylacja i dimeryzacja, które powodują powstanie aktywnej postaci PKR. Udowodniono, że dsRNA krótszy niż 30 pz nie jest rozpoznawane przez PKR, a dłuższe fragmenty dsRNA mają większą zdolność do aktywacji PKR. Spowodowane jest to tym, że umożliwiają one dimeryzację kinazy na jednym fragmencie dsRNA [56].

Podczas infekcji wirusem HCV (Hepatitis C virus, wirus zapalenia wątroby typu C) dochodzi do fosforylacji PKR i wzrostu fosforylacji eIF2α o 50% oraz do obniżenia ekspresji białka NS5A (niestrukturalne białko 5A wirusa HCV) o 40%. Wyciszenie ekspresji PKR za pomocą siRNA zwiększa wytwarzanie białek wirusowych [35]. W wyniku infekcji wirusem odry pozbawionym białka C (MeVC–/–), którego dsRNA gromadzi się w komórce, dochodzi do akumulacji PKR w miejscu replikacji wirusa. W pobliżu obserwuje się również granule stresowe (SG), które formują się po aktywacji eIF2α, tam również występuje wzmożona fosforylacja PKR i IRF3 [60].

Eksperymenty z wirusem SFV na komórkach z inaktywowanym genem kodującym PKR wykazały znaczny spadek wytwarzania IFN-β przy jednoczesnym braku obniżenia poziomu mRNA dla IFN-β. Sugeruje to udział PKR w posttranskrypcyjnej regulacji ekspresji genu dla IFN typu I [71].

Podsumowanie

Rozpoznanie egzogennych kwasów nukleinowych przez komórkę jest istotnym elementem obrony organizmu przed drobnoustrojami. Duża różnorodność rozpoznawanych cząsteczek wymusiła na organizmach wyższych wykształcenie, w toku ewolucji, wiele wyspecjalizowanych receptorów zdolnych do wykrywania obcego RNA i DNA, co umożliwiło im skuteczną obronę przed wieloma rodzajami patogenów (tab.1). Proces rozróżnienia własnego i obcego kwasu nukleinowego jest złożony, ale można wyodrębnić w nim dwa główne etapy. W pierwszym etapie dochodzi do prezentacji egzogennych kwasów nukleinowych określonym receptorom, a następnie do aktywacji systemów wrodzonej odpowiedzi odpornościowej. W dalszych etapach, w zależności od rodzaju aktywowanego receptora, dochodzi do pobudzenia swoistej odpowiedzi komórek na atakujący patogen. W świetle przedstawionych danych na temat mechanizmów rozpoznawania RNA pochodzenia egzogennego najważ- niejszym elementem wydaje się współpraca między róż- nego typu receptorami oraz wzajemne przenikanie się mechanizmów rozpoznawania poszczególnych komponentów bakteryjnych i wirusowych, np.: kwasów nukleinowych, lipopolisacharydów czy białek wirusowych. Ważnym kierunkiem badań powinny więc być próby dogłębnego zrozumienia mechanizmów, w wyniku których poszczególne grupy receptorów regulują procesy odpornościowe. Wiadomo jednak, że mikroorganizmy wykształciły wiele mechanizmów adaptacyjnych i  są zdolne do wytwarzania czynników hamujących receptory rozpoznające ich materiał genetyczny oraz maskujących obecność ich RNA w komórce. Badania powinny również zmierzać w kierunku identyfikacji konkretnych rodzajów, sekwencji i  struktur RNA rozpoznawanych przez receptory komórkowe podczas infekcji. Określenie ich właściwości, jako naturalnych ligandów oraz wpływu na wrodzone i  nabyte procesy odpornościowe może doprowadzić do identyfikacji nowych środków terapeutycznych wspomagających eliminację czynników chorobotwórczych z organizmu.

Przypisy

• 1. Akira S., Hemmi H.: Recognition of pathogen-associated molecularpatterns by TLR family. Immunol. Lett., 2003; 85: 85-95
  Google Scholar
• 2. Alexopoulou L., Holt A.C., Medzhitov R., Flavell R.A.: Recognition ofdouble-stranded RNA and activation of NF-κB by Toll-like receptor 3.Nature, 2001; 413: 732-738
  Google Scholar
• 3. Baccarella A., Fontana M.F., Chen E.C., Kim C.C.: Toll-like receptor 7mediates early innate immune responses to malaria. Infect. Immun.,2013; 81: 4431-4442
  Google Scholar
• 4. Bao M., Liu Y.J.: Regulation of TLR7/9 signaling in plasmacytoid dendriticcells. Protein Cell, 2013; 4: 40-52
  Google Scholar
• 5. Barral P.M., Sarkar D., Su Z.Z., Barber G.N., DeSalle R., RacanielloV.R., Fisher P.B.: Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I andMDA-5: key regulators of innate immunity. Pharmacol. Toxicol., 2009;124: 219-234
  Google Scholar
• 6. Bauer S., Pigisch S., Hangel D., Kaufmann A., Hamm S.: Recognitionof nucleic acid and nucleic acid analogs by Toll-like receptors 7, 8 and 9 Immunobiol., 2008; 213: 315-328
  Google Scholar
• 7. Baum A., Sachidanandam R., Garcia-Sastre A.: Preference of RIG-I forshort viral RNA molecules in infected cells revealed by next-generationsequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010; 107: 16303-16308
  Google Scholar
• 8. Beignon A.S., McKenna K., Skoberne M., Manches O., DaSilva I., KavanaghD.G., Larsson M., Gorelick R.J., Lifson J.D., Bhardwaj N.: Endocytosisof HIV-1 activates plasmacytoid dendritic cells via Toll-like receptorviralRNA interactions. J. Clin. Invest., 2005; 115: 3265-3275
  Google Scholar
• 9. Berg R.K., Melchjorsen J., Rintahaka J., Diget E., Soby S., Horan K.A.,Gorelick R.J., Matikainen S., Larsen C.S., Ostergaard L., Paludan S.R.,Mogensen T.H.: Genomic HIV RNA induces innate immune responsesthrough RIG-I-dependent sensing of secondary-structured RNA. PloSOne, 2012; 7: e29291
  Google Scholar
• 10. Berke I.C., Li Y., Modis Y.: Structural basis of innate immune recognitionof viral RNA. Cell. Microbiol., 2013; 15: 386-394
  Google Scholar
• 11. Bianchi M.E.: DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to knowabout danger. J. Leukoc. Biol., 2007; 81: 1-5
  Google Scholar
• 12. Cardenas W.B., Loo Y.M., Gale M. Jr., Hartman A.L., Kimberlin C.R.,Martinez-Sobrido L., Saphire E.O, Basler C.F.: Ebola virus VP35 proteinbinds double-stranded RNA and inhibits a/b interferon production inducedby RIG-I signaling. J. Virol., 2006; 80: 5168-5178
  Google Scholar
• 13. Cervantes J.L., Weinerman B., Basole C., Salazar J.C.: TLR8: the forgottenrelative revindicated. Cell. Mol. Immunol., 2012; 9: 434-438
  Google Scholar
• 14. Childs K.S., Randall R.E., Goodbourn S.: LGP2 plays a critical rolein sensitizing mda-5 to activation by double-stranded RNA. PloS One,2013; 8: e64202
  Google Scholar
• 15. Choe J., Kelker M.S., Wilson I.A.: Crystal structure of human Toll-likereceptor 3 (TLR3) ectodomain. Science, 2005; 309: 581-585
  Google Scholar
• 16. Cole J.L.: Activation of PKR: an open and shut case? Trends Biochem.Sci., 2007; 32: 57-62
  Google Scholar
• 17. Creagh E.M., O’Neill L.A.J.: TLRs, NLRs and RLRs: a trinity of pathogensensors that co-operate in innate immunity. Trends Immunol.,2006; 27: 352-357
  Google Scholar
• 18. Deddouche S., Goubau D., Rehwinkel J., Chakravarty P., Begum S.,Maillard P.V., Borg A., Matthews N., Feng Q., van Kuppeveld F.J., Reis eSousa C.: Identification of an LGP2-associated MDA5 agonist in picornavirus-infected cells. Elife, 2014; 3: e01535
  Google Scholar
• 19. Diebold S.S., Kaisho T., Hemmi H., Akira S., Reis e Sousa C.R: Innateantiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of singlestrandedRNA. Science, 2004; 303: 1529-1531
  Google Scholar
• 20. Dixit E., Boulant S., Zhang Y., Lee A.S., Odendall C., Shum B., HacohenN., Chen Z.J., Whelan S.P., Fransen M., Nibert M.L., Superti-FurgaG., Kagan J.C.: Peroxisomes are signaling platforms for antiviral innateimmunity. Cell, 2010; 141: 668-681
  Google Scholar
• 21. Gack M.U., Albrecht R.A., Urano T., Inn K-S., Huang I.C., Carnero E.,Farzan M., Inoue S., Jung J.U., García-Sastre A.: Influenza A virus NS1targets the ubiquitin ligase TRIM25 to evade recognition by the hostviral RNA sensor RIG-I. Cell Host Microbe, 2009; 5: 439-449
  Google Scholar
• 22. Gack M.U., Shin Y.C., Joo C.H., Urano T., Liang C., Sun L., TakeuchiO., Akira S., Chen Z., Inoue S., Jung J.U.: TRIM25 RING-finger E3 ubiquitinligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature,2007; 446: 916-920
  Google Scholar
• 23. Gantier M.P., Tong S., Behlke M.A., Xu D., Phipps S., Foster P.S.,Williams B.R.: TLR7 is involved in sequence-specific sensing of singlestrandedRNAs in human macrophages. J. Immunol., 2008; 180: 2117-2124
  Google Scholar
• 24. Gitlin L., Barchet W., Gilfillan S., Cella M., Beutler B., Flavell R.A., DiamondM.S., Colonna M.: Essential role of mda-5 in type I IFN responsesto polyriboinosinic: polyribocytidylic acid and encephalomyocarditispicornavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 8459-8464
  Google Scholar
• 25. Gorden K.B., Gorski K.S., Gibson S.J., Kedl R.M., Kieper W.C., QiuX.H., Tomai M.A., Alkan S.S., Vasilakos J.P.: Synthetic TLR agonists revealfunctional differences between human TLR7 and TLR8. J. Immunol.,2005; 174: 1259-1268
  Google Scholar
• 26. Goubau D., Deddouche S., Reis e Sousa C.: Cytosolic sensing of viruses.Immunity, 2013; 38: 855-869
  Google Scholar
• 27. Goubau D., Schlee M., Deddouche S., Pruijssers A.J., Zillinger T.,Goldeck M., Schuberth C., Van der Veen A.G., Fujimura T., RehwinkelJ., Iskarpatyoti J.A., Barchet W., Ludwig J., Dermody T.S., Hartmann G.,Reis e Sousa C.: Antiviral immunity via RIG-I-mediated recognition ofRNA bearing 5 ‚-diphosphates. Nature, 2014; 514: 372-375
  Google Scholar
• 28. Guillot L., Le Goffic R., Bloch S., Escriou N., Akira S., Chignard M., Si-Tahar M.: Involvement of toll-like receptor 3 in the immune responseof lung epithelial cells to double-stranded RNA and influenza A virus.J. Biol. Chem., 2005; 280: 5571-5580
  Google Scholar
• 29. Hornung V., Ablasser A., Charrel-Dennis M., Bauernfeind F., HorvathG., Caffrey D.R., Latz E., Fitzgerald K.A.: AIM2 recognizes cytosolicdsDNA and forms a caspase-1-activating inflammasome with ASC. Nature,2009; 458: 514-518
  Google Scholar
• 30. Hornung V., Rothenfusser S., Britsch S., Krug A., Jahrsdorfer B.,Giese T., Endres S., Hartmann G.: Quantitative expression of Toll-likereceptor 1-10 mRNA in cellular subsets of human peripheral bloodmononuclear cells and sensitivity to CpG oligodeoxynucleotides. J. Immunol.,2002; 168: 4531-4537
  Google Scholar
• 31. Jin M.S., Lee J.O.: Structures of the toll-like receptor family and itsligand complexes. Immunity., 2008; 29: 182-191
  Google Scholar
• 32. Jurk M., Heil F., Vollmer J., Schetter C., Krieg A.M., Wagner H., LipfordG., Bauer S.: Human TLR7 or TLR8 independently confer responsivenessto the antiviral compound R-848. Nat. Immunol., 2002; 3: 499
  Google Scholar
• 33. Jurk M., Kritzler A., Schulte B., Tluk S., Schetter C., Krieg AM.,Vollmer J.: Modulating responsiveness of human TLR7 and 8 to smallmolecule ligands with T-rich phosphorothiate oligodeoxynucleotides.Eur. J. Immunol., 2006; 36: 1815-1826
  Google Scholar
• 34. Kang D.C., Gopalkrishnan R.V., Lin L., Randolph A., Valerie K., PestkaS., Fisher P.B.: Expression analysis and genomic characterization of humanmelanoma differentiation associated gene-5, mda-5: a novel typeI interferon-responsive apoptosis-inducing gene. Oncogene, 2004; 23:1789-1800
  Google Scholar
• 35. Kang J.I., Kwon S.N., Park S.H., Kim Y.K., Choi S.Y., Kim J.P., Ahn B.Y.:PKR protein kinase is activated by hepatitis C virus and inhibits viralreplication through translational control. Virus Res., 2009; 142: 51-56
  Google Scholar
• 36. Kato H., Takeuchi O., Mikamo-Satoh E., Hirai R., Kawai T., MatsushitaK., Hiiragi A., Dermody T.S., Fujita T., Akira S.: Length-dependent recognitionof double-stranded ribonucleic acids by retinoic acid-induciblegene-I and melanoma differentiation-associated gene 5. J. Exp. Med.,2008; 205: 1601-1610
  Google Scholar
• 37. Kato H., Takeuchi O., Sato S., Yoneyama M., Yamamoto M., MatsuiK., Uematsu S., Jung A., Kawai T., Ishii K.J., Yamaguchi O., Otsu K., TsujimuraT., Koh C.S., Reis e Sousa C., Matsuura Y., Fujita T., Akira S.: Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNAviruses. Nature, 2006; 441: 101-105
  Google Scholar
• 38. Kawai T., Akira S.: The roles of TLRs, RLRs and NLRs in pathogenrecognition. Int. Immunol., 2009; 21: 317-337
  Google Scholar
• 39. Kowalinski E., Lunardi T., McCarthy A.A., Louber J., Brunel J., GrigorovB., Gerlier D., Cusack S.: Structural basis for the activation of innateimmune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell,2011; 147: 423-435
  Google Scholar
• 40. Koyama S., Ishii K.J., Kumar H., Tanimoto T., Coban C., Uematsu S.,Kawai T., Akira S.: Differential role of TLR – and RLR-signaling in theimmune responses to influenza a virus infection and vaccination. J.Immunol., 2007; 179: 4711-4720
  Google Scholar
• 41. Lafon M., Megret F., Lafage M., Prehaud C.: The innate immune facetof brain – human neurons express TLR-3 and sense viral dsRNA. J. Mol.Neurosci., 2006; 29: 185-194
  Google Scholar
• 42. Ling Z., Tran K.C., Teng M.N.: Human respiratory syncytial virusnonstructural protein NS2 antagonizes the activation of beta interferontranscription by interacting with RIG-I. J. Virol., 2009; 83: 3734-3742
  Google Scholar
• 43. Liu L., Botos I., Wang Y., Leonard J.N., Shiloach J., Segal D.M., DaviesD.R.: Structural basis of toll-like receptor 3 signaling with doublestrandedRNA. Science, 2008; 320: 379-381
  Google Scholar
• 44. Liu X., Bennett R.L., Cheng X., Byrne M., Reinhard M.K., May W.S.Jr.:PKR regulates proliferation, differentiation, and survival of murine hematopoieticstem/progenitor cells. Blood, 2013; 121: 3364-3374
  Google Scholar
• 45. Loo Y.M., Fornek J., Crochet N., Bajwa G., Perwitasari O., Martinez-Sobrido L., Akira S., Gill M.A., García-Sastre A., Katze M.G., Gale M. Jr.:Distinct RIG-I and MDA5 signaling regulation by RNA viruses in innateimmunity. J. Virol., 2008; 82: 335-345
  Google Scholar
• 46. Loo Y.M., Gale M. Jr.: Immune signaling by RIG-I-like receptors. Immunity,2011; 34: 680-692
  Google Scholar
• 47. Luo D., Ding S.C., Vela A., Kohlway A., Lindenbach B.D., Pyle A.M.:Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell, 2011; 147: 409-422
  Google Scholar
• 48. Maharaj N.P., Wies E., Stoll A., Gack M.U.: Conventional protein kinaseC-α (PKC-α) and PKC-β negatively regulate RIG-I antiviral signaltransduction. J. Virol., 2012; 86: 1358-1371
  Google Scholar
• 49. Marcotrigiano J., Gingras A.C., Sonenberg N., Burley S.K.: Cocrystalstructure of the messenger RNA 5› cap-binding protein (eIF4E) boundto 7-methyl-GDP. Cell, 1997; 89: 951-961
  Google Scholar
• 50. Marsh M., Helenius A.: Virus entry: open sesame. Cell, 2006; 124:729-740
  Google Scholar
• 51. Matsumoto M., Kikkawa S., Kohase M., Miyake K., Seya T.: Establishmentof a monoclonal antibody against human Toll-like receptor 3 thatblocks double-stranded RNA-mediated signaling. Biochem. Biophys.Res. Commun., 2002; 293: 1364-1369
  Google Scholar
• 52. Matsumoto M., Seya T.: TLR3: Interferon induction by doublestrandedRNA including poly(I:C). Adv. Drug Deliv. Rev., 2008; 60: 805-812
  Google Scholar
• 53. Meurs E., Chong K., Galabru J., Thomas N.S., Kerr I.M., Williams B.R.,Hovanessian A.G.: Molecular cloning and characterization of the humandouble-stranded RNA-activated protein kinase induced by interferon.Cell, 1990; 62: 379-390
  Google Scholar
• 54. Meylan E., Curran J., Hofmann K., Moradpour D., Binder M.,Bartenschlager R., Tschoop J.: Cardif is an adaptor protein in the RIGIantiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. Nature, 2005;437: 1167-1172
  Google Scholar
• 55. Myong S., Cui S., Cornish P.V., Kirchhofer A., Gack M.U., Jung J.U.,Hopfner K.P., Ha T.: Cytosolic viral sensor RIG-I is a 5’-triphosphatedependenttranslocase on double-stranded RNA. Science, 2009; 323:1070-1074
  Google Scholar
• 56. Norden R., Nystrom K., Olofsson S.: Activation of host antiviralRNA-sensing factors necessary for herpes simplex virus type 1-activated transcription of host cell fucosyltransferase genes FUT3, FUT5,and FUT6 and subsequent expression of sLe(x) in virus-infected cells.Glycobiology, 2009; 19: 776-788
  Google Scholar
• 57. Oldenburg M., Kruger A., Ferstl R., Kaufmann A., Nees G., SigmundA., Bathke B., Lauterbach H., Suter M., Dreher S., Koedel U., Akira S.,Kawai T., Buer J., Wagner H., Bauer S., Hochrein H., Kirschning C.J.:TLR13 recognizes bacterial 23S rRNA devoid of erythromycin resistanceformingmodification. Science, 2012; 337: 1111-1115
  Google Scholar
• 58. Opitz C.A., Litzenburger U.M., Lutz C., Lanz T.V., Tritschler I., KoppelA., Tolosa E., Hoberg M., Anderl J., Aicher W.K., Weller M., Wick W.,Platten M.: Toll-like receptor engagement enhances the immunosuppressiveproperties of human bone marrow-derived mesenchymal stemcells by inducing indoleamine-2,3-dioxygenase-1 via interferon-b andprotein kinase R. Stem Cells, 2009; 27: 909-919
  Google Scholar
• 59. Paz S., Sun Q., Nakhaei P., Romieu-Mourez R., Goubau D., JulkunenI., Lin R., Hiscott J.: Induction of IRF-3 and IRF-7 phosphorylation followingactivation of the RIG-I pathway. Cell Mol. Biol., 2006; 52: 17-28
  Google Scholar
• 60. Pfaller C.K., Radeke M.J., Cattaneo R., Samuel C.E.: Measles virusC protein impairs production of defective copyback double-strandedviral RNA and activation of protein kinase R. J. Virol., 2014; 88: 456-468
  Google Scholar
• 61. Plumet S., Duprex W.P., Gerlier D.: Dynamics of viral RNA synthesisduring measles virus infection. J. Virol., 2005; 79: 6900-6908
  Google Scholar
• 62. Powers C., DeFilippis V., Malouli D., Frueh K.: Cytomegalovirus immuneevasion. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2008; 325: 333-359
  Google Scholar
• 63. Rehwinkel J., Tan C.P., Goubau D., Schulz O., Pichlmair A., Bier K.,Robb N., Vreede F., Barclay W., Fodor E., Reis e Sousa C.: RIG-I detectsviral genomic RNA during negative-strand RNA virus infection. Cell,2010; 140: 397-408
  Google Scholar
• 64. Rua R., Lepelley A., Gessain A., Schwartz O.: Innate sensing of foamyviruses by human hematopoietic cells. J. Virol., 2012; 86: 909-918
  Google Scholar
• 65. Runge S., Sparrer K.M., Laessig C., Hembach K., Baum A., Garcia-Sastre A., Söding J., Conzelmann K.K., Hopfner K.P.: In vivo ligands ofMDA5 and RIG-I in measles virus-infected cells. PLoS Pathog., 2014;10: e1004081
  Google Scholar
• 66. Rutz M., Metzger J., Gellert T., Luppa P., Lipford G.B., Wagner H., BauerS.: Toll-like receptor 9 binds single-stranded CpG-DNA in a sequence– and pH-dependent manner. Eur. J. Immunol., 2004; 34: 2541-2550
  Google Scholar
• 67. Sadler A.J., Williams B.R.: Structure and function of the protein kinaseR. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2007; 316: 253-292
  Google Scholar
• 68. Saito T., Hirai R., Loo Y.M., Owen D., Johnson C.L., Sinha S.C., AkiraS., Fujita T., Gale M. Jr: Regulation of innate antiviral defenses througha shared repressor domain in RIG-I and LGP2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2007; 104: 582-587
  Google Scholar
• 69. Sarvestani S.T., Stunden H.J., Behlke M.A., Forster S.C., McCoy C.E.,Tate M.D., Ferrand J., Lennox K.A., Latz E., Williams B.R., Gantier M.P.:Sequence-dependent off-target inhibition of TLR7/8 sensing by syntheticmicroRNA inhibitors. Nucleic Acids Res., 2015; 43: 1177-1188
  Google Scholar
• 70. Satoh T., Kato H., Kumagai Y., Yoneyama M., Sato S., Matsushita K.,Tsujimura T., Fujita T., Akira S., Takeuchi O.: LGP2 is a positive regulatorof RIG-I – and MDA5-mediated antiviral responses. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 2010; 107: 1512-1517
  Google Scholar
• 71. Schulz O., Pichlmair A., Rehwinkel J., Rogers N.C., Scheuner D., KatoH., Takeuchi O., Akira S., Kaufman R.J., Reis e Sousa C.: Protein kinase Rcontributes to immunity against specific viruses by regulating interferonmRNA integrity. Cell Host Microbe, 2010; 7: 354-361
  Google Scholar
• 72. Sen G.C., Sarkar S.N.: Transcriptional signaling by double-strandedRNA: role of TLR3. Cytokine Growth Factor Rev., 2005; 16: 1-14
  Google Scholar
• 73. Shi Z., Cai Z., Sanchez A., Zhang T., Wen S., Wang J., Yang J., Fu S.,Zhang D.: A novel Toll-like receptor that recognizes vesicular stomatitisvirus. J. Biol. Chem., 2011; 286: 4517-4524
  Google Scholar
• 74. Signorino G., Mohammadi N., Patane F., Buscetta M., Venza M.,Venza I., Mancuso G., Midiri A., Alexopoulou L., Teti G., Biondo C., Beninati C.: Role of Toll-like receptor 13 in innate immune recognition ofgroup B streptococci. Infect. Immun., 2014; 82: 5013-5022
  Google Scholar
• 75. Silva A.M., Whitmore M., Xu Z., Jiang Z.F., Li X.X., Williams B.R.:Protein kinase R (PKR) interacts with and activates mitogen-activatedprotein kinase kinase 6 (MKK6) in response to double-stranded RNAstimulation. J. Biol. Chem., 2004; 279: 37670-37676
  Google Scholar
• 76. Sun L., Wu J., Du F., Chen X., Chen Z.J.: Cyclic GMP-AMP synthaseis a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway.Science, 2013; 339: 786-791
  Google Scholar
• 77. Takada E., Okahira S., Sasai M., Funami K., Seya T., Matsumoto M.:C-terminal LRRs of human Toll-like receptor 3 control receptor dimerizationand signal transmission. Mol. Immunol., 2007; 44: 3633-3640
  Google Scholar
• 78. Tolle L.B., Standiford T.J.: Danger-associated molecular patterns(DAMPs) in acute lung injury. J. Pathol., 2013; 229: 145-156
  Google Scholar
• 79. Triantafilou K., Vakakis E., Orthopoulos G., Ahmed M.A., SchumannC., Lepper P.M., Triantafilou M.: TLR8 and TLR7 are involved in thehost’s immune response to human parechovirus 1. Eur. J. Immunol.,2005; 35: 2416-2423
  Google Scholar
• 80. Vercammen E., Staal J., Beyaert R.: Sensing of viral infection andactivation of innate immunity by toll-like receptor 3. Clin. Microbiol.Rev., 2008; 21: 13-25
  Google Scholar
• 81. Vijay-Kumar M., Gentsch J.R., Kaiser W.J., Borregaard N., OffermannM.K., Neish A.S., Gewirtz A.T.: Protein kinase R mediates intestinal epithelialgene remodeling in response to double-stranded RNA and liverotavirus. J. Immunol., 2005; 174: 6322-6331
  Google Scholar
• 82. Wei T., Gong J., Jamitzky F., Heckl W.M., Stark R.W., Roessle S.C.:Homology modeling of human Toll-like receptors TLR7, 8, and 9 ligandbindingdomains. Protein Sci., 2009; 18: 1684-1691
  Google Scholar
• 83. Wies E., Wang M.K., Maharaj N.P., Chen K., Zhou S., Finberg R.W.,Gack M.U.: Dephosphorylation of the RNA sensors RIG-I and MDA5 bythe phosphatase PP1 is essential for innate immune signaling. Immunity,2013; 38: 437-449
  Google Scholar
• 84. Wu B., Peisley A., Richards C., Yao H., Zeng X., Lin C., Chu F., Walz T.,Hur S.: Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, andantiviral signal activation by MDA5. Cell, 2013; 152: 276-289
  Google Scholar
• 85. Xing J., Wang S., Lin R., Mossman K.L., Zheng C.: Herpes simplexvirus 1 tegument protein US11 downmodulates the RLR signaling pathwayvia direct interaction with RIG-I and MDA-5. J. Virol., 2012; 86:3528-3540
  Google Scholar
• 86. Xu H., He X., Zheng H., Huang L.J., Hou F., Yu Z., de la Cruz M.J.,Borkowski B., Zhang X., Chen Z.J., Jiang Q.X.: Structural basis for theprion-like MAVS filaments in antiviral innate immunity. Elife, 2014;3: e01489
  Google Scholar
• 87. Yoneyama M., Fujita T.: Structural mechanism of RNA recognitionby the RIG-l-like receptors. Immunity, 2008; 29: 178-181
  Google Scholar
• 88. Yoneyama M., Kikuchi M., Matsumoto K., Imaizumi T., MiyagishiM., Taira K., Foy E., Loo Y.M., Gale M. Jr., Akira S., Yonehara S., Kato A.,Fujita T.: Shared and unique functions of the DExD/H-box helicasesRIG-I, MDA5, and LGP2 in antiviral innate immunity. J. Immunol., 2005;175: 2851-2858
  Google Scholar
• 89. Yoneyama M., Kikuchi M., Natsukawa T., Shinobu N., Imaizumi T.,Miyagishi M., Taira K., Akira S., Fujita T.: The RNA helicase RIG-I has anessential function in double-stranded RNA-induced innate antiviralresponses. Nat. Immunol., 2004; 5: 730-737
  Google Scholar
• 90. Zucchini N., Bessou G., Traub S., Robbins S.H., Uematsu S., Akira S.,Alexopoulou L., Dalod M.: Cutting edge: Overlapping functions of TLR7and TLR9 for innate defense against a herpesvirus infection. J. Immunol.,2008; 180: 5799-5803
  Google Scholar

Pełna treść artykułu