Abstrakt

Bakteryjne konsorcjum jelitowe ma kluczowe znaczenie w utrzymaniu homeostazy układu odpornościowego u ssaków. Znaczącą rolę pełnią powstające w wyniku fermentacji polisacharydów metabolity bakteryjne – krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (short-chain fatty acids, SCFA). W badaniach mikrobiomu uwzględnia się głównie kwas masłowy, propionowy i octowy, występujące w określonym stosunku molowym, proporcje te mogą ulegać zmianom w zależności od diety, wieku, chorób i innych czynników.

SCFA stanowią rodzaj komunikatorów między mikrobiomem i układem odpornościowym i odpowiadają za utrzymanie równowagi w reakcji przeciw- i prozapalnej, m.in. przez przekazywanie sygnału za pomocą zespołu receptorów wolnych kwasów tłuszczowych (GPR). Szczególną właściwością krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych jest indukcja komórek T-regulatorowych (Treg), odbywająca się przez inhibicję enzymu deacetylazy histonowej. Największym potencjałem inhibitorowym charakteryzuje się kwas masłowy, wywołujący proliferację i zwiększenie funkcjonalnych możliwości komórek Treg.

Manipulacja składem mikrobiomu jelitowego i poziomem SCFA stanowi obiecujące narzędzie m.in. we wspomaganiu leczenia przewlekłych chorób przewodu pokarmowego, przebiegających ze stanem zapalnym, czy w dysbiozach spowodowanych antybiotykoterapią.

O krytycznym znaczeniu bakteryjnego konsorcjum jelitowego w utrzymaniu homeostazy układu odpornościowego u ssaków świadczy wiele danych płynących z badań eksperymentalnych oraz obserwacji klinicznych.

U osób stosujących typową dietę typu zachodniego masa bakterii zasiedlających kątnicę i okrężnicę to 250-750 g (przy założeniu 1010-1011 cfu/g). Biomasa bakteryjna stanowi aż 40-55% stałej masy stolca, a w przybliżeniu 15 g masy bakteryjnej jest dziennie wydalane.

Wiele procesów biochemicznych, w tym fermentacji, odbywa się w kątnicy i proksymalnej części okrężnicy ze względu na dostępność węglowodanów i wody [111]. Podstawową reakcją fermentacji w jelicie grubym jest bowiem hydroliza pochodzących z diety polisacharydów, oligosacharydów i disacharydów do cukrów prostych, które stanowią substrat do dalszej hydrolizy przez bakteryjny aparat enzymatyczny. Fermentacja węglowodanów w proksymalnej części okrężnicy powoduje wytwarzanie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA), H2 i CO2 [59,80,111], natomiast w wyniku fermentacji aminokwasów lub białek powstają rozgałęzione SCFA, H2, CO2, CH4, fenole i aminy [80,111].

Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (short-chain fatty acids, SCFA), kwasy organiczne składające się z 1-6 atomów węgla w łańcuchu alifatycznym [111], to m.in. kwas octowy, propionowy, masłowy, walerianowy i kapronowy [94]. SCFA są głównymi, a zarazem końcowymi, produktami metabolizmu bakterii bytujących w świetle jelita grubego u ssaków [59]. Podstawowym substratem bakterii jelitowych do wytwarzania SCFA są polisacharydy (skrobiowe, skrobiopodobne oraz bezskrobiowe), które nie zostały wcześniej strawione przez enzymy układu pokarmowego [94].

Stężenie SCFA zmienia się w zależności od umiejscowienia: w dystalnym odcinku okrężnicy jest niższe (20-70 mM), zaś wyższe w proksymalnym (70-140 mM), co wynika ze wzrastającej dostępności węglowodanów i wody w proksymalnej części jelita grubego [59]. Stosunek molowy octanu, propionianu i maślanu wytwarzanych w okrężnicy wynosi odpowiednio 60:25:15, ale proporcje te mogą ulegać modulacji [18,96,111] i zmieniają się w poszczególnych odcinkach jelita w zależności od wielu czynników, w tym diety, wieku i ewentualnego schorzenia [32,100]. Znaczące zmiany w stężeniu SCFA dotyczą szczególnie maślanu.

Warto podkreślić, że tylko około 5% wytworzonych w jelicie grubym SCFA jest wydalanych z kałem, a pozostałe 95% jest absorbowanych przez komórki nabłonka jelitowego [81,100].

Prawidłowo funkcjonujący mikrobiom w organizmie gospodarza jest niezbędny do poprawnego rozwoju układu immunologicznego. Podkreślana jest ważna rola metabolitów bakteryjnych dolnych odcinków układu pokarmowego w modulacji układu odpornościowego. Udowodniono, że myszy pozbawione flory bakteryjnej (germ-free) charakteryzują się wieloma defektami immunologicznymi, cieńszą warstwą śluzu nabłonka i/lub upośledzoną strukturą narządów limfoidalnych [25,27,30,82,91,93].

Prawidłowe konsorcjum bakteryjne odgrywa ważną rolę już na najwcześniejszych etapach rozwoju. U noworodków i osesków aktywność znajdujących się w mleku matczynym przeciwciał klasy IgA, zapewniających ochronę immunologiczną, jest uzupełniana przez oligosacharydy – substraty promujące ekspansję zdefiniowanych mikroorganizmów, np. z rodzaju Bifidobacterium [8,63]. Ponadto u myszy podczas ciąży i laktacji wzrasta bakteryjna translokacja jelitowa oraz ilość składników bakteryjnych transportowanych do gruczołu piersiowego za pomocą komórek jednojądrzastych, co przyczynia się do imprintingu immunologicznego u noworodków [8,75].

Skład konsorcjum bakteryjnego oraz ilość i zróżnicowanie jego metabolitów zmienia się z wiekiem, podobnie jak tempo jelitowej fermentacji bakteryjnej, które u noworodków jest dużo wolniejsze niż u osób dorosłych [100]. U noworodków bifidobakterie pojawiają się już po dwóch dniach od narodzin i stają się dominującym taksonem [100]. Z wiekiem i zmianą diety ilość bifidobakterii maleje: u dorosłych stanowią jedynie 3-6% flory fekalnej [56,86]. Dla bifidobakterii skrobia i jej hydrolizaty są preferowanym źródłem węgla. Wraz ze zmianą składu mikrobiomu jelitowego modulacji ulega też stężenie wytwarzanych metabolitów bakteryjnych, np. u noworodków karmionych mlekiem matki występuje głównie kwas octowy, mniej kwasu propionowego, a kwas masłowy jest nieobecny [89,111].

Fermentacja węglowodanów przez bakterie jelitowe i wytwarzanie SCFA

U osób zdrowych polisacharydy skrobiowe i skrobiopodobne są zazwyczaj w całości trawione w jelicie cienkim z wytworzeniem glukozy. Pozostałe cukry złożone, niestrawione bądź strawione częściowo, podlegają fermentacji bakteryjnej przez bakterie beztlenowe w okrężnicy. Cukry te, tradycyjnie nazywane fermentującymi, są klasyfikowane jako polisacharydy bezskrobiowe (non-starch polysaccharides, NSP), błonnik pokarmowy oraz skrobia oporna (RS, resistant starch). Inny podział polisacharydów podkreśla budowę fizyczną polisacharydów i wyróżnia błonnik nierozpuszczalny i rozpuszczalny, przy czym pierwszy jest szczególnie korzystnym substratem dla bakterii fermentujących i bogatym źródłem krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych.

Warto zaznaczyć, że kwasy SCFA o różnej długości łańcucha alifatycznego powstają z różnych polisacharydów, np. skrobia oporna dostarcza najwięcej kwasu masłowego [22,94], a najbardziej wydajnym źródłem kwasu propionowego są błonnik pokarmowy i skrobia oporna [1]. Kwas propionowy powstaje przede wszystkim w wyniku fermentacji obecnych w diecie produktów mlecznych, zawierających bakterie propionowe zdolne do wytwarzania tego kwasu.

Wytwarzanie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych przez bakterie jelitowe zależy w dużej mierze od dostępnych substratów, na co największy wpływ ma dieta. Składniki nietrawionego przez organizm człowieka pożywienia są rozkładane przez bakterie jelitowe [111]. Ilość i rodzaj wytwarzanych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych zmienia się w zależności od typu diety, co szczególnie dobrze jest widoczne u osób stosujących dietę wegetariańską, u których stężenie SCFA we krwi obwodowej jest stosunkowo wysokie w porównaniu do niskiej ekstrakcji trzewnej i znacznego tempa absorpcji do kwiobiegu [100]. Stosowanie popularnej „diety paleolitycznej”, bogatej w owoce i warzywa, skutkuje znacznie wyższym stężeniem kałowych SCFA i bakterii fermentujących cukry oraz niższym odsetkiem występowania chorób zapalnych u osób ją stosujących [20].

Zmiana diety może istotnie wpłynąć na metabolizm bakterii jelitowych, jednak na temat przyjmowania preparatów zawierających prebiotyki, np., inulina czy oligofruktoza, zdania są podzielone. W licznych pracach wykazano, że podawanie prebiotyków wpływa na zmianę stężenia SCFA w kale [2,60,103], a jednocześnie dodatek prebiotyków ma wpływ na zmianę składu konsorcjum jelitowego u ludzi, np. podawanie inuliny, stymulowało wzrost bakterii fekalnych z rodzajów Bacteroides, Lactobacillus, Bifidobacteria oraz niektórych szczepów Clostridium w większym stopniu niż przy podaniu celulozy i w grupie kontrolnej. W badaniach in vitro wykazano, że suplementacja celulozą znacząco zwiększała liczbę enterobakterii, w tym Escherichia coli w porównaniu do suplementacji inuliną [44].

Weitkunat i wsp. wykazali, że w grupie myszy utrzymywanych na diecie wysokotłuszczowej, suplementacja inuliną (podlegającą fermentacji) prowadziła do intensywnego namnażania bakterii i w związku z tym do wzrostu stężenia SCFA w kale, a także do poprawy procesu trawienia diety oraz zmniejszenia energii zakumulowanej w kale [kJ/dzień] w porównaniu do osobników kontrolnych suplementowanych celulozą (niepodlegającą fermentacji). Myszy nie spożywały zwiększonej ilości paszy, a ich masa nie uległa zmianie, całkowite stężenie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w kale jednak wzrosło, a jednocześnie nastąpiła zmiana proporcji octanu do propionianu. Autorzy postawili tezę o pozytywnym wpływie inuliny na intensyfikację metabolizmu lipidów, co wskazuje na możliwe zastosowanie np. w leczeniu otyłości [109].

Trawienie wcześniej niestrawionych produktów białkowych pochodzących z diety może powodować powstawanie wielu toksycznych metabolitów, np. amoniaku, amin biogennych, siarkowodoru, indolii lub związków fenolowych. Niektóre z tych produktów mogą uszkodzić integralność nabłonka jelit lub wywoływać reakcje zapalne. Nieprawidłowa dieta, w tym bogata w białko, może wpływać na rozwój chorób jelit indukowanych przez enteropatogeny. Dobrym sposobem zapobiegania temu zjawisku jest dodanie do diety większej ilości fermentowalnych węglowodanów, co pozwala na zmniejszenie ilości metabolitów pochodzących z fermentacji białek w świetle przewodu pokarmowego.

Pieper i wsp. [76] badali wpływ poziomu białka i węglowodanów w diecie na rodzaj i stężenie wytwarzanych metabolitów bakteryjnych w przewodzie pokarmowym u świń, w celu stworzenia diety prowadzącej do powstawania jak najmniejszych ilości metabolitów pochodzenia białkowego. Wykazano, że fermentowalne węglowodany (w postaci pulpy buraczanej) były preferowane przez bakterie jako źródło energii w porównaniu do białek, i w następstwie powodowały obniżenie ilości metabolitów pochodzących z fermentacji białka w świetle jelit. Warto zauważyć, że przez trzykrotne zwiększenie dziennej dawki fermentowalnych węglowodanów (z 10 do 30 g), rosło stężenie SCFA w kale. W konsekwencji obserwowano zwiększoną masę kału oraz krótszy czas jego transportu przez przewód pokarmowy.

Istnieją różne opinie dotyczące wpływu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych na wartość pH w jelicie grubym. Sugerowano, że spożycie dużej ilości substancji, które są substratami jelitowych bakterii fermentujących, np. laktulozy czy fruktooligosacharydów, obniża pH [55,70], ale w innych pracach nie odnotowano takich zmian [44]. U szczurów bez sprecyzowanej diety pH w jelicie ślepym wynosiło 6,14 oraz 6,87 w dystalnym odcinku okrężnicy, a po 24-godzinnej głodówce odpowiednio 7,40 i 7,11 [10,100], można zatem wnioskować, że krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe powstające w wyniku fermentacji beztlenowej wpływają na obniżenie pH, co jest korzystną zmianą środowiska, prowadzącą do usunięcia niektórych patogenów [100]. Obecność SCFA w świetle jelita grubego może hamować wzrost patogenów na różne sposoby [106], np. wzrost Salmonella Typhimurium w obecności propionianu i/lub maślanu hamuje ekspresję inwazyjnych genów kodujących wyspy patogenności Salmonella SPI-1 oraz zapobiega atakowi na komórki w tkankowej hodowli in vitro [29,39,53].

Metabolizm krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych u bakterii konsorcjum jelitowego

Octan jest najobficiej występującym SCFA w jelicie grubym i stanowi ponad połowę wszystkich SCFA wykrywanych w kale. Za wytwarzanie octanu przez mikrobiotę jelitową odpowiadają głównie dwie ścieżki metaboliczne: • w wyniku fermentacji węglowodanów przez bakterie jelitowe,

• jedna trzecia octanu pochodzi od bakterii octowych, które są zdolne do jego syntezy z wodoru i dwutlenku węgla lub z kwasu mrówkowego przez ścieżkę Wood-Ljungdahla [50,57,79].

Synteza propionianu przez bakterie jelitowe odbywa się na trzech ścieżkach biochemicznych: bursztynianowej, akrylanowej i propanodiolowej. Wydaje się, że głównym torem jest ścieżka bursztynianowa ze względu na znaczną obecność Bacteroidetes, skorelowaną ze stężeniem propionianu kałowego [50,57,78,79].

Maślan jest syntezowany na dwóch szlakach: kinazowym, angażującym transbutyrylazę fosforanową i kinazę maślanową w celu przekształcenia butyrylo-CoA do maślanu i/lub w wyniku przekształcania butyrylo-CoA do maślanu przez pojedynczą reakcję enzymatyczną, przeprowadzaną przez bakterie wytwarzające maślan [50,57,79].

W konsorcjum jelitowym często występuje zajwisko „cross-feeding”, polegające na tym, że produkt metabolizmu jednej grupy bakterii jest substratem do wytwarzania innego metabolitu przez kolejną grupę bakterii. „Cross-feeding” w SCFA najczęściej przebiega od octanu do maślanu, w mniejszym stopniu między propionianem i maślanem, i prawie nie istnieje w przypadku propionianu i octanu [57].

Maślan jest wytwarzany głównie przez bakterie z rodzajów Clostridium, Eubacterium i Fusobacterium (np. Clostridium butyricum, Eubacterium limosum) [9,37]. Szczególnie efektywnymi producentami kwasu masłowego są Clostridium leptum, Roseburia spp., Faecalibacterium prausnitzii i Coprococcus spp. [33]. Szlak biochemiczny prowadzący do powstania SCFA jest procesem dynamicznym, w którym wytworzone wcześniej maślan i propionian mogą być degradowane do octanu przez Acetobacterium, Acetogenium, Eubacterium i Clostridium spp. [110]. Zaobserwowany proces może zostać odwrócony, jeżeli wzrośnie liczba bakterii wytwarzających maślan, jak Faecalibacterium prausnitzii czy Roseburia spp. [21]. Uważa się, że w konsorcjum bakteryjnym pozostającym w homeostazie kwas octowy wytwarzany przez Bacteroidetes może być wykorzystany następnie do wytwarzania kwasu masłowego i propionowego przez przedstawicieli Firmicutes [62].

Podobny proces dotyczy zdolności niektórych bakterii do konwersji laktozy do maślanu, co wykazano we współhodowli Eubacterium limosum i Bifidobacterium longum [45,46]. Natomiast Megasphaera elsdenii, bytująca w ludzkiej okrężnicy, może przekształcać mleczan do maślanu, a suplementacja hodowli fruktooligosacharydami powoduje wzrost wytwarzania maślanu [15,35]. Metabolizm mleczanu przebiega różnymi szlakami – bakterie bytujące w jelicie człowieka mogą przekształcać oba izomery: L- i R-mleczan do maślanu [9]. Większość maślanu, bo aż 70-90%, jest metabolizowana przez kolonocyty, dla których jest podstawowym źródłem energii [13], natomiast około 90% propionianu jest metabolizowane w wątrobie; reszta przechodzi do krwi obwodowej [1].

Degradacja powstałych w procesie fermentacji bakteryjnej krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w organizmie człowieka odbywa się w trzech miejscach:

• w komórkach nabłonka okrężnicy, gdzie głównym substratem jest maślan – podstawowe źródło energii dla kolonocytów;

• w komórkach wątroby, które metabolizują większość (50-70%) octanu oraz pozostały po procesie glukoneogenezy maślan i propionian;

• w mięśniach, które generują energię przez utlenienie pozostałego octanu [80].

Absorpcja SCFA przez komórki nabłonka przebiega w wyniku dyfuzji uprotonowanych kwasów oraz przez wymianę anionów [13]. Aktywny transport SCFA przez błonę śluzową odbywa się za pośrednictwem izoformy 1 transportera kwasów monokarboksylowych (MCT-1, monocarboxylate transporter 1) oraz izoformy 1 transportera kwasów monokarboksylowych związanego z sodem (SMCT-1, sodium-coupled monocarboxylate transporter 1). Oba transportery są ekspresjonowane na kolonocytach [42], a MCT-1 także na limfocytach, co umożliwia transport SCFA do wnętrza tych komórek [34].

Kwas octowy jest łatwy do oznaczania ilościowego we krwi obwodowej, toteż stosuje się go do monitorowania zmian stężenia SCFA w okrężnicy. Przypuszcza się, że kwas octowy i propionowy, w połaczeniu z L-mleczanem, pełnią istotną rolę w regulacji metabolizmu lipidów i cholesterolu [1]. Kwas octowy jest także pierwszorzędowym substratem w syntezie cholesterolu [94,111].

Badania SCFA na modelach zwierzęcych

W badaniach krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych najczęściej stosowanymi modelami zwierzęcymi są psy, szczury, myszy i świnie. Zwierzęta dobiera się głównie ze względu na objętość jelita grubego, zwłaszcza jej proporcję do całego przewodu pokarmowego. Z tego powodu dobrym modelem są psy, ich jelito grube stanowi 14% całkowitej objętości przewodu pokarmowego, porównywalnie do ludzkiego przewodu pokarmowego (17%); u świń proporcja wynosi 48%, a u szczurów 61% [52,100].

Oszacowanie wielkości wytwarzania krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych jest problematyczne i skomplikowane z powodu: szybkiego wychwytu przez kolonocyty oraz wykorzystywania ich do własnego metabolizmu przez drobnoustroje jelitowe. Najbardziej dostępnym materiałem do badań jest surowica i kał, jednak należy pamiętać, że w świetle jelita grubego z początkowej ilości SCFA zaledwie około 5% jest wydalanych z kałem, a pozostałe 95% absorbują kolonocyty.

Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe w układzie immunologicznym i procesach przeciwzapalnych

HDAC – deacetylaza histonowa

Ekspresja DNA jest regulowana przez acetylację i deacetylację histonów. Deacetylaza histonów jest enzymem odpowiedzialnym za usunięcie grupy acetylowej z ε-N-acetylolizyny w histonie, co umożliwia lepsze owinięcie histonów przez DNA. Jest to ważny proces, wpływający na ekspresję genów, ponieważ jedynie hiperacetylowana chromatyna jest aktywna transkrypcyjnie. Wyróżnia się cztery klasy białek HDAC, w tym tzw. klasyczne HDAC klasy I, II i IV, których aktywność hamowana jest przez trichostatynę A.

Inhibicja HDAC przez krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe zależy od typu SCFA oraz od rodzaju komórek i tkanek, w których proces ten zachodzi [94]. Najsilniejszym inhibitorem HDAC jest kwas masłowy, który mimo że produkowany w mniejszych ilościach, odgrywa najważniejszą rolę w regulacji aktywności deacetylazy histonowej. Mniejszym wpływem na HDAC charakteryzują się kolejno kwas propionowy i kwas octowy. Hamowanie deacetylazy histonowej może się odbywać bezpośrednio w wyniku wiązania się dwóch cząsteczek kwasu masłowego w hydrofobowej kieszeni enzymu [16] lub pośrednio przez receptory GPR41, GPR43 i GPR109 [94]. Należy pamiętać, że SCFA hamują aktywność deacetylazy histonowej zarówno w komórkach układu odporności wrodzonej, jak i adaptacyjnej [94].

Szczególną właściwością krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych jest indukcja komórek T-regulatorowych (Treg) z naiwnych prekursorów komórek T CD4+, właśnie przez inhibicję HDAC [3,26]. Największym potencjałem inhibitorowym charakteryzuje się kwas masłowy, który hamuje aktywność HDAC9, a w następstwie wywołuje wzrost ekspresji czynnika transkrypcyjnego FOXP3, proliferację i zwiększenie funkcjonalnych możliwości komórek Treg [58,94,95].

Przeciwzapalne działanie n-maślanu na makrofagi jelitowe również opiera się na zahamowaniu aktywności HDAC, a w jej wyniku akumulacji acetylacji histonu H3 lizyny 9 [12]. Akumulacja acetylacji histonu H3 w regionie Foxp3 CNS1 powoduje wzrost ekspresji FOXP3 [3,26,36] i obniżenie wytwarzania mediatorów prozapalnych: tlenków azotu, IL-6 i IL-12 [12]. Podobny skutek wywołuje ekspozycja in vitro ludzkich makrofagów na 1 mM roztwór octanu: znacząco obniża się aktywność HDAC, a następnie wzrosta acetylacja histonów. W rezultacie następuje spadek wytwarzania cytokin prozapalnych: TNF-α, IL-6 i IL-8 [49,94].

Przeciwzapalne działanie SCFA (maślanu i propionianu) w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej, powoduje redukcję aktywności NF-κB, co prawdopodobnie również jest wywołane przez inhibicję HDAC. Proces zachodzi podobnie jak podczas inhibicji trichostatyną A, która jest naturalnym inhibitorem HDAC [94,101]. Ponadto w obecności krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w neutrofilach gryzoni zaobserwowano redukcję aktywności HDAC in vitro, a najskuteczniejszym inhibitorem okazał się maślan [94,105].

Zespół receptorów wolnych kwasów tłuszczowych (GPRs)

Receptor wolnych kwasów tłuszczowych 2 sprzężony z białkami G – FFAR2/GPR43

Receptor wolnych kwasów tłuszczowych 2 (FFAR2/GPR43) sprzężony z białkami G jest kodowany przez gen FFAR2. GPR43 odpowiada za wiązanie SCFA, w tym octanu, propionianu, maślanu, kapronianu i walerianianu. Najsilniejszym aktywatorem GPR43 jest propionian, natomiast octan jest aktywatorem najbardziej selektywnym [54,94].

GPR43 jest ekspresjonowany w całym przewodzie pokarmowym, m.in. na komórkach wewnątrzwydzielniczych L w jelicie krętym i okrężnicy oraz na kolonocytach i enterocytach jelita cienkiego i grubego, a także na komórkach układu odpornościowego i układu nerwowego [94,99,104]. Komórki wewnątrzwydzielnicze L odpowiadają za uwalnianie peptydu YY (PYY) i glukagonopodobnego peptydu-1 (GLP-1). Uważa się, że przez indukcję ich wydzielania SCFA mogą modulować masę oraz redukować ilość spożywanego pokarmu [94].

Receptory GPR43 występują na powierzchni komórek immunokompetentnych [48,64]: są ekspresjonowane na eozynofilach, bazofilach, neutrofilach, monocytach, komórkach dendrytycznych i komórkach tucznych śluzówki [17,47,54,94]. Znaczna ekspresja GPR43 jest obserwowana także w tkankach krwiotwórczych, takich jak szpik kostny czy śledziona [64,88,94], a także w myometrium (błona mięśniowa macicy) i błonach płodowych, gdzie obecność receptorów może zapobiec przedwczesnemu porodowi w wyniku powstałej infekcji i uruchomieniu odpowiedzi przeciwzapalnej przebiegającej za pośrednictwem GPR43 [94,107].

Receptor wolnych kwasów tłuszczowych 3 sprzężony z białkami G – FFAR3/GPR41

Receptor wolnych kwasów tłuszczowych 3 (FFAR3/GPR41) jest, podobnie jak GPR43, receptorem sprzężonym z białkami G, kodowanym przez gen FFAR3. GPR41 wykazuje powinowactwo do kwasu octowego i propionowego, mniejsze natomiast do masłowego. W niewielkim stopniu rozpoznaje również kwasy kapronowy i walerianowy [94].

Receptor GPR41 jest ekspresjonowany m.in. w tkance tłuszczowej i w obwodowym systemie nerwowym. Wykazano ekspresję mRNA gpr41 w mysich jelitowych komórkach wewnątrzwydzielniczych L, które uwalniają hormony inkretynowe, np. GLP-1 i PYY [71,99]. GPR41 jest ekspresjonowany w komórkach enterocytów i komórkach endokrynnych nabłonka okrężnicy zawierających PYY, ale nie serotoninę i GPR43. Ten sam autor donosi, że w mięśniach gładkich okrężnicy obecność SCFA indukuje fazowy skurcz mięśni w sposób zależny od GPR41 (z powinowactwem propionian>maślan>octan) [94,97].

GPR41 może być ekspresjonowany na komórkach tkanki tłuszczowej, gdzie indukuje uwalnianie leptyny – hormonu, który aktywowany przez SCFA może mieć znaczny wpływ na masę ciała [94,112], chociaż inni badacze donoszą, że hormon ten działa pośrednio przez GPR43, a nie przez GPR41 [38,94].

Aktywacja GPR41 przez SCFA poprawia tolerancję glukozy przez indukcję glukoneogenezy jelitowej, wykorzystując oś jelito-mózg układu nerwowego. Ponadto wykryto mRNA gpr41 we włóknach nerwowych żyły wrotnej [20,41], a receptory GPR41 są ekspresjonowane w trzustce na komórkach Langerhansa, w śledzionie oraz na komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), ich rola w tych organach nie jest jednak znana.

Receptor NIACR1/GPR109A

Receptor GPR109A wykazuje bardzo duże powinowactwo do niacyny (witaminy B3), ale nieznaczne do maślanu w stężeniu milimolarnym [94,98]. GPR109A jest ekspresjonowany na adipocytach (jego ilość maleje z wiekiem [98]) oraz w mniejszym stopniu na komórkach układu odpornościowego, m.in. na powierzchni skórnych komórek dendrytycznych, monocytach, makrofagach i neutrofilach [94,108]. Do receptora GPR109A ekspresjonowanego na okrężniczych limfocytach śródbłonka jelitowego (IEC) i komórkach wrodzonego układu odpornościowego wiąże się swoiście kwas masłowy [28]. Oddziaływanie między GPR109A a kwasem masłowym powoduje wydzielanie IL-10 i dehydrogenazy aldehydowej (ALDH1, aldehyde dehydrogenase 1 family) przez makrofagi i komórki dendrytyczne, a przez to wspiera proces różnicowania komórek Treg i komórek T wytwarzających IL-10 [90].

Aktywność SCFA w procesach chroniących organizm człowieka przejawia się w hamowaniu aktywności deacetylazy histonowej (HDAC) oraz przekazywaniu sygnału przez zespół receptorów wolnych kwasów tłuszczowych – receptory sprzężone z białkami G (GPRs, G Protein-Coupled Receptors) [94].

Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe w aktywacji komórek T regulatorowych (Treg)

Komórki Treg są subpopulacją limfocytów odpowiedzialną za wyciszanie zbyt nasilonej lub autoreaktywnej odpowiedzi immunologicznej w sposób swoisty lub nieswoisty w zależności od antygenu. Mogą regulować homeostazę obwodową, ale również homeostazę błon śluzowych. Komórki Treg FOXP3+ powstają przez różnicowanie komórek grasicy, jak również w przewodzie pokarmowym w obecności odpowiedniego środowiska cytokinowego. Naturalne limfocyty T regulatorowe (nTreg, CD4+ CD25+ Foxp3+) [24,83] pochodzą z grasicy; istnieją również inne populacje komórek Treg mające zmienną ekspresję FOXP3 oraz opcję wydzielniczą cytokin przeciwzapalnych, w tym IL-10. Populacja ta, często nazywana komórkami Treg indukowanymi (iTreg), nieobecna w środowisku grasiczym, jest indukowana w tkankach (m.in. w jelicie) [23,24,83]. W ich indukcji biorą udział wyspecjalizowane populacje komórek prezentujących antygen, np. komórki dendrytyczne CD103+ CD11b+. Komórki te są zdolne do wytwarzania czynników zaangażowanych w indukcję komórek T: TGF-β i kwasu retinolowego [8,14,43,66,67].

U myszy gnotobiotycznych (pozbawionych flory jelitowej, germ-free) ekspresja genów dla jelitowych komórek Treg i IL-10 jest znacząco zredukowana w porównaniu do myszy konwencjonalnych [6,30]. Myszy gnotobiotyczne mają zredukowaną liczbę komórek T CD4+ w blaszce właściwej [61], limfocytach śródnabłonkowych (IELs) [40] i okrężniczych Treg [27,30,83], co wskazuje na zasadniczą rolę mikrobiomu w regulacji odpowiedzi immunologicznej. Potwierdzają to wyniki otrzymane dla szczepów komensalnych, np. Bifidobacterium infantis 35624, którego podanie osobom zdrowym powodowało indukcję komórek Treg, a następnie redukcję wytwarzania cytokin prozapalnych i proliferację komórek T, a także zmniejszoną ekspresję cząsteczek kostymulujących komórki dendrytyczne i obniżenie aktywności NF-κB [51].

Adaptywny transport komórek T CD4+25+ in vivo do myszy hamował aktywację NF-κB w odpowiedzi na podanie LPS [72], a mutualistyczna adaptacja komórek T była obserwowana po podaniu zmienionej flory Schaedlera (zestawu bakterii symulujących bakteryjne konsorcjum jelitowe), która powodowała generację de novo i aktywację komórek Treg okrężnicy [30]. Pod wpływem szczepów z rodzaju Clostridium izolowanych od myszy konwencjonalnych zmianom ulegała liczba i funkcja komórek Treg CD4+ FOXP3+ blaszki właściwej błony śluzowej w okrężnicy [6].

Warto zauważyć, że w mikrobiomie jelitowym dziecka po zaprzestaniu karmienia piersią dominują przedstawiciele Clostridium, a ich stały poziom utrzymuje się w wieku dorosłym, w przeciwieństwie do Enterobacteriaceae czy bakterii z rodzaju Lactobacillus, które są powszechne w okresie niemowlęcym, ale z wiekiem następuje gwałtowny spadek ich liczby. Clostridium klastrów IV i XIVa występują najobficiej w jelicie ślepym i okrężnicy, co doskonale koreluje z dystrybucją komórek Treg [6].

Atarashi i wsp. [6] udowodnili, że indukcja komórek Treg jest swoista dla organizmów skolonizowanych szczepami Clostridium, w przeciwieństwie do kolonizacji Lactobacillus i Bacteroides. Suplementacja Clostridium u myszy nie miała wpływu na komórki Th1, obserwowano jedynie słabą indukcję Th17 w okrężnicy. Ta sama grupa badaczy wyizolowała z kału osobników zdrowych siedemnaście szczepów bakteryjnych należących do Clostridium klastrów IV, XIVa oraz XVIII. Podanie tych szczepów myszom gnotobiotycznym miało wpływ na różnicowanie, akumulację i funkcjonowanie komórek Treg w okrężnicy, powodowało indukcję cytokin przeciwzapalnych, w tym IL-10 oraz kostymulatora komórek T (ICOS). Wybrane szczepy zapewniały dostępność antygenów bakteryjnych i środowisko bogate w TGF-β, co wspomagało ekspansję i różnicowanie komórek Treg [5].

Zarówno ekstrakty kałowe z dużą zawartością SCFA, jak też oczyszczone związki octanu, maślanu i propionianu podane in vitro do środowiska komórek nabłonkowych jelita na podobnym poziomie indukowały TGF-β1 [4,5,6]. Podsumowując, uważa się, że to właśnie wytwarzane przez Clostridium w jelicie grubym krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe najbardziej przyczyniają się do wzrostu liczby komórek Treg [4].

Analizy metabolomiczne prowadzone przez Furusawę i wsp. [26] za pomocą NMR wykazały, że stężenie SCFA w świetle jelita koreluje z liczbą komórek Treg w okrężnicy. Liczne doniesienia potwierdzają znaczący potencjał przeciwzapalny SCFA oraz ich zdolność do zahamowania odpowiedzi prozapalnej realizowanej przez makrofagi jelitowe [4,12], np. zaobserwowano, że podawanie myszom gnotobiotycznym wody z dodatkiem SCFA już po trzech tygodniach wywoływało wzrost liczby komórek Treg w okrężnicy, ale nie powodowało zmiany w komórkach Treg śledziony, krezki, węzłów chłonnych czy grasicy [92]. SCFA wywoływały wzrost liczby komórek T CD4+, nie wpływały jednak znacząco na okrężnicze komórki Th1 i Th17 [92].

Istotny jest wpływ antybiotykoterapii na proliferację komórek Treg: u myszy wolnych od patogenów (specific pathogen-free, SPF), po podaniu wankomycyny liczba komórek Treg w okrężnicy była bardzo zredukowana i porównywalna do myszy gnotobiotycznych, to niekorzystne zjawisko znosiło dodanie do antybiotyku preparatu mieszaniny SCFA; jednocześnie nie zaobserwowano zmian w liczbie komórek Treg w jelicie cienkim [92].

SCFA kontrolują różnicowanie Treg, m.in. przez wiązanie z receptorami GPR, np. GPR43 wiąże SCFA na neutrofilach i eozynofilach w czasie tłumienia jelitowej odpowiedzi zapalnej [64,114]. Zaobserwowano, że komórki Treg w jelicie grubym ekspresjonują GPR43, co promuje ich ekspansję w odpowiedzi na SCFA [92]. Zdania na temat pobudzania komórek Treg przez SCFA są podzielone. Niektórzy badacze twierdzą, że SCFA mogą promować proces różnicowania naiwnych komórek T CD4+ w komórki Treg [3,26], inni natomiast uważają, że SCFA jedynie wpływają na indukcję w okrężnicy już obecnych grasiczych komórek Treg [92]. Dobrze obrazują to przeciwstawne badania: Arpaia i Rudensky [4] wykazali, że maślan i propionian, wytwarzane przez komensalne mikroorganizmy flory jelitowej, powodują różnicowanie komórek Treg (pozagrasiczych, zależnych od konserwatywnej sekwencji niekodującej 1 (CNS1)), natomiast Nastasi i wsp. [68] dowiedli, że maślan i propionian redukują ekspresję genów cytokin prozapalnych indukowanych LPS, takich jak IL-6 i IL12B (podjednostka interleukiny -12 i -23). Sugeruje się, że zredukowane wytwarzanie tych cytokin może zmienić polaryzację populacji naiwnych komórek T przez redukcję prozapalnych fenotypów Th1 i Th17 oraz przeniesienie równowagi w kierunku populacji komórek przeciwzapalnych (np. komórek Treg), jak wykazano to u myszy [3,73].

Podsumowując, SCFA odpowiadają za utrzymanie równowagi odpowiedzi przeciw- i prozapalnej, stanowiąc swego rodzaju komunikatory między komensalnym konsorcjum jelitowym a układem odpornościowym. Wykazano, że SCFA mogą bezpośrednio promować różnicowanie do komórek T wytwarzających IL-17, IFN-γ i/lub IL-10 w zależności od środowiska cytokinowego. Wpływ krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych na komórki T jest pośredni zależny od GPR41 i GPR43, ale bezpośrednio zależy od inhibicji wcześniej opisanej aktywności deacetylazy histonowej (HDAC). SCFA mogą dzięki temu stymulować różnicowanie komórek T zarówno do komórek efektorowych, jak i regulatorowych, promując odpowiedź prozapalną lub przeciwzapalną, w zależności od środowiska immunologicznego [74].

Swoiste właściwości krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w utrzymywaniu homeostazy układ odpornościowy-mikrobiom

Kwas octowy

Kwas octowy ma kluczowe znaczenie w utrzymywaniu równowagi między konsorcjum jelitowym i układem immunologicznym gospodarza. Może być zarówno wiązany przez GPR43, jak i przez GPR41, np. w warunkach zapalenia octan może hamować migrację neutrofili w sposób zależny od GPR43 [94,105]. Octan wpływa na neutrofile przez promowanie wydzielania wolnych rodników tlenowych (ROS), zależnych od aktywacji GPR43 [64,94]. Podany dootrzewnowo powoduje utratę apetytu, co wskazuje, że może przekraczać barierę krew-mózg. Octan znakomicie akumuluje się w podwzgórzu i wywołuje aktywację karboksylazy acetylo-koenzymu A oraz zmianę profilu ekspresji neuropeptydów regulatorowych, co prowadzi do supresji apetytu. Odpowiednie wykorzystanie tego mechanizmu może być przydatne w leczeniu otyłości [25].

Kwas propionowy

Kwas propionowy może być wiązany przez receptory GPR43 i GPR41, podobnie jak kwas octowy – w zależności od środowiska w jakim się znajduje. Unikalną właściwością propionianu jest jego wpływ na regulatory ciśnienia krwi, przez zdolność do silnego wiązania się propionianu do receptorów Olfr78 (olfactory receptor 78, członek rodziny receptorów GPR) i GPR41: GPR41 ma związek z hipotensyjnym działaniem propionianu, natomiast Olfr78 w połączeniu z propionianem przeciwnie – podwyższa ciśnienie krwi [77].

Kwas masłowy

Kwas masłowy również może działać przez GPR41 i GPR43, ale najczęściej wchodzi w interakcje z receptorem GPR109A, wykazuje także silne właściwości inhibicji deacetylazy histonowej (HDAC). Należy zauważyć, że w porównaniu z pozostałymi SCFA maślan ma najsilniejszy wpływ immunomodulujący, m.in. silnie promując pozagrasicze różnicowanie komórek Treg [4].

W ludzkich monocytach maślan działa przeciwzapalnie przez inhibicję wytwarzania IL-12 i zwiększenie wytwarzania IL-10 [84,94], represję wytwarzania cząsteczek prozapalnych (tlenki azotu, IL-1b, TNF-α) oraz redukcję aktywności NF-κB (z zachowaniem zależności NF-κB maślan>propionian>octan) [69,87,94]. Makrofagi, które są najczęściej występującym typem komórek immunologicznych w blaszce właściwej, w obecności maślanu redukują wydzielanie prozapalnych mediatorów indukowanych przez LPS, takich jak IL-6 i IL-12, ale nie wykazuje wpływu na TNF-α lub MCP-1. Zachodzi to niezależnie od receptorów Toll-podobnych (TLR) i receptorów GPR, ale udowodniono, że zależy od inhibicji deacetylazy histonowej [12].

SCFA promują integralność nabłonka jelitowego, szczególnie suplementacja maślanem komórek Caco-2 tworzących monowarstwę powodowała wzrost odporności transepitelialnej (TER), która jest markerem odporności jelitowej. Było to spowodowane przyspieszeniem gromadzenia białka strefy zamykającej ZO-1 (tight junction proteins) oraz aktywacją AMPK (5’AMP-activated protein kinase) zależną od okludyn, bez zmiany poziomu jej ekspresji [94,99].

Maślan stymuluje adipogenezę i akumulację lipidów, najprawdopodobniej przez zwiększone pobieranie glukozy, lipogenezę de novo oraz inne procesy. Może także hamować lipolizę, najprawdopodobniej na ścieżce zależnej od receptora GPR41. Wykazano, że adipocyty są zdolne do utylizacji maślanu powodując wzrost ekspresji adiponektyny w celu wychwytu glukozy i poprawę wrażliwości insulinowej. Inhibicja lipolizy, stymulacja wychwytu glukozy i indukcja syntezy triglicerydów przez maślan sugeruje jego potencjalną rolę w zapobieganiu lub odwracaniu hiperglikemii i hiperlipidemi [113].

Maślan wpływa również pośrednio na wydzielanie hormonu wzrostu. Badania z wykorzystaniem szczurzej linii nowotworowej stabilnie ekspresjonującej ludzki receptor GHRP (growth hormone-releasing peptide) wykazały, że wprowadzenie maślanu do medium hodowlanego promuje syntezę surowiczego hormonu wzrostu oraz poprawia podstawową i indukowaną funkcję wydzielniczą GHRP. Maślan działając poprzez receptory GPR41 i GPR43 zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom wolnego cytosolowego Ca2+, a to wiąże się ze wzrostem wydzielania hormonu wzrostu. Wydaje się jednak, że maślan jest jedynie produktem przejściowym, który przyczynia się do uwalniania i metabolicznego działania hormonu wzrostu na czczo (w czasie głodu) [65].

Przeszczepy mikrobiomu jelitowego

Wiele nadziei na zastosowanie w leczeniu przewlekłej dysbiozy spowodowanej antybiotykoterapią budzi w ostatnich latach doodbytniczy transfer prawidłowej flory bakteryjnej lub suplementowanie krótkołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi. Zabieg ma zmieniać profil konsorcjum bakteryjnego, a przez to wspomagać odbudowę nabłonka i korzystnie wpływać na zahamowanie uciążliwych objawów choroby, w tym zakażeń Clostridium difficile. Dotychczas podejmowane interwencje polegają na podaniu mieszaniny octanu, maślanu lub propionianu, ale wyniki nie były jednoznaczne: niekiedy obserwowano zmianę profilu SCFA w kale bądź krwi i złagodzenie przebiegu niektórych chorób oraz przyspieszenie odnowy nabłonka jelitowego [7,11,102]; w innych pracach nie zaobserwowano jednak zmian w porównaniu z grupą kontrolną [85].

Podsumowanie

Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe jako produkty metabolizmu bakterii na wiele sposobów odpowiadają za utrzymanie homeostazy w organizmie człowieka. Szczególne znaczenie ma wpływ SCFA na funkcjonowanie układu odpornościowego, który jest modulowany na różnych etapach przez obecność octanu, propionianu lub maślanu. Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe nie tylko mają wpływ na aktywność komórek układu immunologicznego, ale także na ich migrację do miejsca zapalenia, wykazując znaczny potencjał przeciwzapalny. Manipulacja składem mikrobiomu jelitowego, a tym samym poziomem SCFA może się stać obiecującym narzędziem w leczeniu chorób przebiegających ze stanem zapalnym, w dysbiozie spowowodowaej antybiotykoterapią, czy alergii [5].

Pełna treść artykułu